CN113456698B - 一种荭草汤剂及其制备方法和含量、特征图谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药技术领域，具体是一种荭草汤剂及其制备方法和含量、特征图谱检测方法。本发明给出了一种荭草汤剂的制备方法，限定了前处理方法、煎煮次数、加水量、煎煮时间等+指标和参数，并采用合适的低温浓缩和冷冻干燥，最大限度保留中药有效成分群。本发明还给出了一种荭草汤剂检测方法，用其测定荭草标准汤剂中荭草素和异荭草素的总含量，结果具有分离效果好、灵敏度高、重现性好等优点。给出了荭草汤剂特征图谱的检测方法，建立了荭草标准汤剂的特征图谱，为荭草汤剂产品提供质量控制手段，既兼顾了荭草的品种特性，能避免大生产部分合格批次的误判，又能对大生产工艺提供重要质量控制参数，从而提高了产品质量及质量控制水平。

Description

一种荭草汤剂及其制备方法和含量、特征图谱检测方法
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体是一种荭草汤剂及其制备方法和含量、特征图谱检测方法。
背景技术
荭草，中药材名。为蓼科植物红蓼Polygonum orientale L.的地上部分。夏、秋割取地上部分，或将打下水红花子后剩下的地上部分收集起来，晒干。功能主治为：祛风利湿，活血止痛。用于风湿性关节炎。
目前已知荭草中主含黄酮类成分，如洋地黄黄酮、月橘素、槲皮苷、荭草素、荭草苷等；尚含木脂素类、柠檬苦素类等多种成分，这些成分均可能是其活性成分。但是目前荭草汤剂的制备方法、检测方法均不够完善，也没有标准的制备工艺流程，并且也未有针对荭草汤剂的特征图谱的研究，目前荭草汤剂质量标准不完善，不能较全面的控制荭草汤剂的内在质量。
中药特征图谱技术是一种表征中药所含成分与其质量关系的有效手段，已成为国内外广泛认可的重要质量评价模式。因此，建立荭草汤剂的快速、高效、高通量直接电喷雾质谱特征图谱方法，从整体上全面反映制剂的内在质量，为其质量控制提供一种提供直观、简便、有效的手段。
目前，有部分针对荭草药材及部分制剂的含量测定方法，如： UPLC法同时测定荭草药材中8种指标成分的含量(《中国中药杂志，第35卷第13期，2010年7月》，王爱民，迟明艳，王永林，李勇军，傅晓钟，(贵阳医学院药学院,贵州贵阳550004))，其是通过对荭草药材用甲醇进行提取，然后用超高效液相色谱进行梯度洗脱，其样品采用甲醇提取，不适于采用水提汤剂的样品的检测；如：UPLC 法同时测定复方荭草冻干粉针中11种指标成分的含量(《中国新药杂志2015年第24卷第5期》李月婷，胡杰，谢玉敏，郑林，兰燕宇，王永林，王爱民(贵阳医学院1贵州省药物制剂重点实验室；2 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心；3药学院，贵阳 550004))，其是通过超高效液相色谱进行测定，该方法用于检测复方制剂中多种成分含量，专属性不强；也有部分针对荭草药材的特征图谱及检测方法，如：荭草药材特征图谱的研究(《中成药，2006 年1月，第28卷第1期》，王爱民，王永林*，兰燕宇，刘丽娜，何迅，李勇军，郑林(贵阳医学院药学院,贵州贵阳550004))；贵州产荭草药材特征图谱的模式识别研究(《中成药，2008年7月，第30卷第7 期》，黄勇，郑林，王爱民，兰燕宇，王永林*，(贵阳医学院药学院,贵州贵阳550004))。目前并没有针对红草汤剂的含量测定方法，荭草汤剂的检测方法和特征图谱检测方法与荭草药材及其他制剂的方法存在较大区别，主要是由于红草汤剂采用水提冻干工艺，最大限度还原和保留药材煎煮的功效，该汤剂可作为衡量配方颗粒产品生产全过程的标准制剂，因此在针对该汤剂的含量测定、特征图谱等检查方法应具有方法简单，一致性强、专属性和重复性等特点，而目前的检测方法都无法达到理想的效果。
因此，寻找一种荭草汤剂及其制备方法和含量、特征图谱检测方法，是目前急需解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种荭草汤剂及其制备方法和含量、特征图谱检测方法，具体如下：
一种荭草汤剂，所述汤剂中含有牡荆苷、槲皮苷、没食子酸、原儿茶酸、异荭草苷、荭草苷、鞣花酸、异牡荆苷、木犀草素、二甲氧基槲皮素、3-甲氧基槲皮素。
一种荭草汤剂制备方法，包括以下步骤：
(1)取荭草药材，置砂锅中，加入14-18倍水浸泡20-40min；
(2)煎煮20-40min，选择250-350目标准筛趁热过滤；
(3)药渣再加12-16倍水，煎煮15-25min，250-350目标准筛趁热过滤，合并两次滤液；
(4)65±5℃减压浓缩至适量，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得荭草标准汤剂。
优选的，上述荭草汤剂制备方法，具体步骤如下：
(1)取荭草药材，置砂锅中，加入16倍水浸泡30min；
(2)煎煮30min，选择300目标准筛趁热过滤；
(3)药渣再加14倍水，煎煮20min，300目标准筛趁热过滤，合并两次滤液；
(4)65±5℃减压浓缩至适量，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得荭草标准汤剂。
进一步优选的，所述减压浓缩，浓缩过程中真空度为-0.08～ -0.09MPa。
进一步优选的，所述减压浓缩至适量，是减压浓缩至密度为 1.02～1.05g/ml。
进一步优选的，所述减压浓缩至适量，浓缩后所得的浓缩液含固量为7.0％～22.0％。
进一步优选的，所述冷冻干燥，其具体冻干参数设定如下：
(1)捕水器温度-50℃，箱体预抽真空-0.15mbar；
(2)预冻温度为-45℃，持续时间4h；
(3)升华干燥温度为-30℃～0℃，持续时间，14h，真空度为 -0.2mbar；
(3)解析干燥温度为0℃～25℃，持续时间，7h，真空度为 -0.2mbar。
荭草汤剂制备方法的具体筛选过程如下：
提取工艺参数研究：
(1)饮片用量考察
根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》(下称”技术要求”)中的”标准汤剂制备”项下建议，每煎使用饮片量一般为 100～200g，考虑到工艺筛选要用到大量饮片，200g药材能满足标准汤剂相关实验研究，也能避免因样品量过少导致的实验误差；因此，荭草标准汤剂提取工艺考察中饮片用量定为200g。
(2)加水量考察
依据《技术要求》和《医疗机构中药煎药室管理规范》国中医药发(2009)3号文，由于中药饮片的质地和吸水率相差较大，应根据不同饮片特性确定加水量，加水量一般以浸过药面2-5厘米为宜。根据以上原则，考察一煎加水量。
表1荭草标准汤剂加水情况考察
Figure GDA0003900116430000051
药材吸水率考察：药材煎煮后，取沥干水分的药材称重，计算药材吸水率。
吸水率％＝(煎煮完成后药材重量-药材取样量)/药材取样量*100％。
表2荭草药材吸水率考察
Figure GDA0003900116430000052
说明荭草药材吸水率约为4倍。参考《技术要求》中关于根及茎叶类中药材饮片煎煮汤剂时的加水倍数并结合液面没过饮片高度情况和饮片吸水率情况，确定荭草提取一煎加水量为16倍，二煎加水量为14倍。
(3)浸泡时间考察
依据《技术要求》：待煎饮片应当先行浸泡，浸泡时间应根据饮片质地确定，一般不少于30分钟。故取50g荭草药材，加入16倍水，根据以上原则，考察饮片浸泡时间。
表3荭草标准汤剂浸泡时间考察
Figure GDA0003900116430000053
根据以上试验结果，荭草药材浸泡30分钟水分渗透到组织内部，药材变软，确定浸泡时间为30分钟。
(4)煎煮时间考察
依据《技术要求》，荭草为茎叶类药材，一煎煮沸后再煎煮30 分钟，二煎适当缩短为20分钟。由于中药材药性、功效、质地及吸水性差异较大，应酌情增减煎煮时间，故取50g荭草药材，根据以上原则，考察煎煮时间。
荭草标准汤剂提取液出膏率结果如下表所示：
表4荭草标准汤剂煎煮结果
Figure GDA0003900116430000061
根据以上实验结果，荭草标准汤剂提取时间为一煎30分钟，二煎缩短为20分钟。
(5)固液分离条件考察
依据《技术要求》，提取液应趁热进行固液分离，滤材目数应在 100目以上。根据以上原则，考察不同滤材目数时提取液过滤情况，比较100目、200目和300目尼龙滤布的过滤效果，选择适宜过滤目数。
表5荭草标准汤剂不同过滤条件考察
Figure GDA0003900116430000062
结果表明：采用300目尼龙滤布过滤时，过滤均顺利，药液澄明，无明显固形沉淀物，故确定尼龙滤布目数为300目。
(6)冷却
过滤后滤液自然冷却至室温。
提取工艺参数确定：
取荭草药材200g，第一次煎煮加16倍量水，浸泡30min分钟，武火煮沸，文火保持微沸再煎煮30min，煎液经300目筛网趁热过滤；第二次煎煮加14倍量水，武火煮沸，文火保持微沸煎煮20min，煎液经 300目筛网趁热过滤，合并两次煎液，待用。
浓缩工艺参数研究：
煎煮时间和固液分离条件考察项下得到的煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压65℃浓缩(真空度：-0.085～ -0.090MPa)至200ml。浸膏粘稠度适中，流动性好，方便转移，含固量在10％-20％之间，适合冻干。因此确定浓缩比例为1:1。
浓缩工艺参数确定：
将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.085～-0.090MPa)至200ml的浸膏。
冷冻干燥参数研究：
根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中“标准汤剂制备”项下建议标准汤剂的干燥一般采用冷冻干燥制备为宜，可保证其质量的稳定和易于溶解及免加辅料。因此，首先选用冷冻干燥为荭草标准汤剂的干燥方法。
将浓缩工艺考察下得到的浓缩液，在磁力搅拌下，分装至10ml 棕色西林瓶中，每瓶分装体积为2ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，即得。荭草真空冷冻干燥机共晶点测试结果为-28.0℃，预冻温度为-45℃，升华干燥温度-30℃～0℃，解析干燥温度为5℃～25℃，干燥过程总时间为25小时。冷冻干燥工艺参数见表6和图1。
表6荭草标准汤剂冷冻干燥参数设置
Figure GDA0003900116430000081
结果表明，荭草浓缩液冷冻干燥顺利，在此条件下干燥后得到质地疏松的棕黄色固体。
冷冻干燥工艺参数确定结果：
在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为 2ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干；冻干参数为：浓缩液预冻温度为-45℃，预冻时间为240分钟，升华干燥温度为 -30℃～0℃，升华干燥时间为840分钟，真空度为0.2mbar；解析干燥温度为5℃～10℃，解析干燥时间为420分钟，真空度为0.2mbar。
一种荭草汤剂多种成分含量测定方法，其具体是：采用高效液相色谱法进行测定，采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(20:80)为流动相，供试品溶液进样量10μL，柱温40℃，流速1mL/min进行洗脱，检测波长为350nm。
优选的，所用的色谱柱是Agilen Eclipse Plus C18(250×4.6mm， 5μm)色谱柱。
优选的，所述供试品溶液是以甲醇为溶剂对荭草汤剂粉末进行溶解得到。
优选的，所述供试品溶液是通过如下方法制备的：取荭草汤剂粉末，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，回流提取4h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
荭草汤剂含量测定分析方法的具体建立过程如下：
本方法结合文献资料，建立高效液相色谱法测定荭草标准汤剂中荭草素和异荭草素的总含量，结果该方法具有分离效果好、灵敏度高、重现性好等优点。
仪器与试药：
Waters高效液相色谱仪；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，KQ-500DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH-4型数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)；纯水系统(Sartorius公司)；乙腈(色谱纯，Thermo Fisher公司)；水为超纯水；磷酸(色谱纯)；其它试剂均为分析纯。
对照品来源及纯度检查：
荭草素对照品和异荭草素对照品购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以100％计，使用前105℃干燥2h。
色谱条件的确定：
参考《贵州省中药材民族药材质量标准》2003版荭草药材含量测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液 (20:80)为流动相，检测波长为350nm，进样量10μL，柱温40℃，流速1mL/min进行洗脱。
实验对异荭草素和荭草素进行全波长扫描，记录其紫外吸收图，结果见图2。结合参考《贵州省中药材民族药材质量标准》2003版荭草药材含量测定的检测波长，选择检测波长为350nm。
对照品溶液的制备：
取荭草素和异荭草素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1mL含荭草素0.02mg和异荭草素0.035mg的溶液，摇匀，即得。供试品溶液的制备：
(1)不同提取方法的考察：
取荭草标准汤剂(批号：20191107-3)0.1g，精密称定，平行2 份，置具塞锥形瓶中，精密加入70％的乙醇溶液50mL，密塞，称定重量，分别超声(功率250W，频率50kHz)处理4h、加热回流 4h、再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀、滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液10μL，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定，得荭草素和异荭草素总含量，如图3与表7。
表7不同提取方法的比较
Figure GDA0003900116430000111
结论表明：超声提取方式所得荭草素和异荭草素总含量较低，回流提取所得荭草素和异荭草素总含量较超声高，因此后期采用回流提取法对荭草标汤进行提取。
(2)不同提取溶剂的考察：
取荭草标准汤剂(批号：20191107-3)0.1g，研细，精密称定 0.1g，平行2份，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇、甲醇各50mL，密塞，称定重量，分别加热回流4h，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀、滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液10μL，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定，得荭草素和异荭草素总含量，结果见表8和图4。
表8不同提取溶剂的比较
Figure GDA0003900116430000112
结论表明：由表8可以看出：采用甲醇作为提取溶剂时，荭草标汤中荭草素和异荭草素总含量高于乙醇提取，故后期试验选用甲醇作为荭草标汤提取溶剂。
(3)提取溶剂不同质量分数的考察：
取荭草标准汤剂(批号：20191107-3)0.1g，研细，精密称定0.1g，平行2份，置具塞锥形瓶中，精密加入100％甲醇、90％甲醇、 80％甲醇、70％甲醇、60％甲醇各50mL，密塞，称定重量，分别加热回流4h，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀、滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液10μL，注入液相色谱仪，按前述色谱条件测定，得荭草素和异荭草素总含量，结果见表9和图5。
表9提取溶剂不同质量分数的比较
Figure GDA0003900116430000121
结论表明：由表9可以看出：采用70％甲醇作为提取溶剂时，荭草标汤中荭草素和异荭草素含量高于其他质量分数的甲醇溶液，故后期试验选用70％甲醇溶液作为提取溶剂。
(4)提取时间的考察：
取荭草标准汤剂(批号：20191107-3)0.1g，研细，精密称定 0.1g，平行2份，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量，分别加热回流1h、2h、3h、4h、5h，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀、滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试液10μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，得荭草素和异荭草素总含量，结果见表10和图6。
表10提取时间的比较
Figure GDA0003900116430000131
结论表明：由表10可以看出：提取时间为4h时，荭草标汤中荭草素和异荭草素含量较高，故后期试验荭草标汤回流提取4h。
(5)供试品溶液制备方法的确定：
根据荭草标汤前处理考察试验结果可知：取荭草标汤适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，回流提取4h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
一种荭草汤剂特征图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取荭草汤剂冻干粉0.20g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取异荭草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含异荭草素0.05mg即得；
(3)色谱条件与系统适用性试验以岛津(Inertsil ODS-32.1× 100mm 2μm)色谱柱(柱长为100mm，内径2.1mm，粒径为2μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表11的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为每分钟0.30ml；检测波长为254nm；理论板数按异荭草素计算应不低于5000；
表11梯度洗脱程序
Figure GDA0003900116430000141
特征图谱分析方法的建立：
仪器、试剂与试药：
Thermo Vanquish超高效液相色谱仪；Thermo-VF-P20-A四元泵；Thermo-VH-A10-A进样器；Thermo-VH-D10-A可变波长检测器； Thermo-VH-C10-A柱温箱；Chromeleam 7.2SR4工作站；超声清洗机(无锡超声电子设备厂)；乙腈为色谱纯；水为重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。
异荭草素对照品购自中国食品药品检定研究院， 111974-201401。荭草标准汤剂由本单位制备提供(15批标汤研究用样品)。
参照物溶液的制备：
取异荭草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含异荭草素0.05mg即得。
色谱条件的确定：
(1)检测波长的确定：
取异荭草素对照品溶液，进样2μl进行分析，记录其紫外吸收图，具体见图44。
结果表明，异荭草素在210、269、348nm处有最大吸收。
取荭草标准汤剂(批号：BT20191126-2)适量，研细。精密称取0.2g，加50％甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，取续滤液作为供试液，记录210～400nm范围内的吸收光谱，具体见图45。
结果表明，在254nm左右，荭草标准汤剂样品溶液可以检测到的色谱峰较多，且各色谱峰的吸收也较高，综合考虑，选择254nm 为检测波长。
(2)流动相及梯度考察：
①大梯度考察
采用岛津(Inertsil ODS-32.1×100mm 2μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表12中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.30ml；检测波长为220nm。梯度如下：
表12
Figure GDA0003900116430000161
由图46中结果可知，荭草样品中大极性成分很多，但全部洗脱的话有机相比例要到60％左右才行。
②调整梯度，并对水相中有机酸种类进行考察。A为有机相，B 为含酸水相。柱温为30℃；流速为每分钟0.30ml；检测波长为254nm。梯度如表13。
表13
Figure GDA0003900116430000162
由图47中结果可知，选择磷酸时的色谱峰情况最好。
③有机相种类考察，A为有机相，B为0.1％磷酸水溶液。柱温为30℃；流速为每分钟0.30ml；检测波长为254nm。梯度如表14。
表14
Figure GDA0003900116430000163
由图48中结果可知，当有机相为乙腈时，荭草标汤中的色谱峰数量最多。
④色谱条件优化，A为乙腈，B为0.1％磷酸水溶液。柱温为25℃；流速为每分钟0.30ml；检测波长为254nm。梯度如表15。
表15
Figure GDA0003900116430000171
结果见图49。
(3)色谱条件的确定：
最终确定了如下色谱条件：岛津(Inertsil ODS-32.1×100mm 2 μm)色谱柱(柱长为100mm，内径2.1mm，粒径为2μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表16中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为每分钟0.30ml；检测波长为254nm。理论板数按异荭草素计算应不低于5000。
表16
Figure GDA0003900116430000172
Figure GDA0003900116430000181
供试品溶液的制备：
(1)提取溶剂考察：
取荭草标准汤剂(批号：BT20191126-2)适量，研细。取约0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入20ml溶剂(水、50％甲醇、 75％甲醇、甲醇、稀乙醇、75％乙醇、乙醇)，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用对应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
如图50、51中的结果表明，除甲醇和乙醇提取率较低外，其他溶剂的提取率差异不大，综合考虑下，最终选择50％甲醇作为提取溶剂。
(2)提取方式考察：
取荭草标准汤剂(批号：BT20191126-2)适量，研细。取约0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入20ml 50％甲醇，称定重量，分别加热回流、超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
如图52、53的结果表明，选择超声提取较好。
(3)提取时间考察：
取荭草标准汤剂(批号：BT20191126-2)适量，研细。取约0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入20ml 50％甲醇，称定重量，分别超声处理15、30、45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
如图54、55结果表明，提取时间在15min至45min虽然差异不明显，但30min的结果较好，因此选择超声提取30min。
(4)供试品溶液制备方法的确定：
根据上述实验结果，荭草标准汤剂样品前处理方法可确定为：取本品约0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入20ml50％甲醇，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(5)共有峰的确定：
通过测定不同批次荭草标准汤剂样品的UPLC图谱，采用国家药典委员会推荐的“中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择其共有峰。
按照上述确定的色谱条件及荭草标准汤剂样品前处理方法测定不同批次荭草标准汤剂样品的UPLC图谱，所得结果如图56，图56 的结果表明荭草标准汤剂的特征图谱中由7个较为明显的共有峰。
最终确定荭草标准汤剂特征图谱标准为：供试品特征图谱中应有7个特征峰，以异荭草素参照物质对应的峰1为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±5％之内，规定值为：1.000(峰1)、1.045(峰2)、1.901(峰3)、 2.832(峰4)、2.899(峰5)、3.172(峰6)、3.269(峰7)；计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对保留保留峰面积应在规定范围内，规定值为：0.752～1.381(峰2)、0.319～0.434(峰3)、 0.036～0.464(峰4)、0.054～0.671(峰5)、0.155～1.569(峰6)、 0.171～2.087(峰7)。
特征峰指认
1、LC-MS分析条件：
UPLC条件：WatersACQUITY UPLC色谱仪；色谱柱：waters T3 色谱柱(2.1*150mm,1.8μm)；流动相系统：乙腈(A)：0.1％甲酸水(B)；按照表17的梯度程序洗脱；流速：0.36mL/min；检测波长270，254，210,330nm；柱温：30℃；进样量：0.8μL；0.5 μL(对照品)。
表17
Figure GDA0003900116430000201
2、质谱检测：
质谱条件：Waters Xevo G2-XS QTOF质谱仪，ESI离子源正负离子检测；源电压：2.5kV，N2流速：800L/h,碰撞气体为氮气；毛细管温度400℃；锥孔气体流速：100L/h；气源温度：120℃；采用全扫描方式，分子量扫描范围50～1500；碰撞诱导解离电压：6V(低能量)、30～60V(高能量)；
供试品处理：取荭草标准汤冻干粉1支(同济堂提供，批号 20190610)，取约0.10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品配制：取牡荆苷、槲皮苷、木犀草苷和槲皮素对照品(批号：DST190306-299，HPLC≥98％，成都德思特生物有限公司)适量，精密称定，置入10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解并定容至10 mL，得混标溶液。
LC-MS分析结果：
荭草标准汤LC-MS图见图7(自上而下分别为BPI模式质谱图和 254nm下紫外色谱图)。
混合对照品LC-MS图见图8(自上而下分别为BPI模式质谱图和 254nm下紫外色谱图,a:牡荆苷；b：木犀草苷；c：槲皮苷；d:槲皮素)。
254nm下紫外色谱峰(1～17)保留时间信息具体如下表18：
表18
Figure GDA0003900116430000211
紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定：
(1)峰1，1.74min:由DAD图谱(图9)显示，最大吸收在271nm 处。由质谱图(图10)显示，该成分的准分子离子峰[M-H]为169.03291； [M-COO]:125.04328,提示分子中含有一分子甲酸，因此推测该成分为没食子酸。
(2)峰2，3.12min:由DAD图谱(图11)显示，最大吸收在 220,259和292nm处。由质谱图(图12)显示，该成分的准分子离子峰[M-H]为153.03817；[M-COO]:109.04827,提示分子中含有一分子甲酸，因此推测该成分为原儿茶酸。
(3)峰3，4.76min:由DAD图谱(图13)显示，最大吸收在254 nm处。由质谱图(图14)显示，该成分的准分子离子峰[M-H]为 349.12641，结构待定。
(4)峰4，8.91min:由DAD图谱(图15)显示，最大吸收在269 和348nm处，提示为黄酮类成分。由质谱图(图16)显示，该成分的准分子离子峰[M-H]为447.10039；[M-90]:357.07355,[M- 120]:327.06455，提示分子中一分子葡萄糖碳苷，提示该化合物为异荭草苷。
(5)峰5，9.21min：由DAD图谱(图17)可见，该色谱峰最大紫外吸收在255,348nm处，提示为黄酮类成分，由质谱(图18)所示，该成分的准分子离子峰[M-H]为447.10035；[M-90]:357.07358,[M- 120]:327.05469，提示分子中一分子葡萄糖碳苷，且与峰4为同分异构体，因此，峰5鉴定为荭草苷。
(6)峰6，11.00min：由DAD图谱(图19)可见，最大吸收波长在267，333nm处，提示为黄酮类成分，由质谱(图20)所示，该成分的准分子离子峰[M-H]为431.10634；[M-90]:341.07896,[M- 120]:311.07003，提示分子中一分子葡萄糖碳苷，结构中且较峰5和峰4少一分子羟基，因此，峰6为牡荆苷，与对照品一致。
(7)峰7，11.45min：由DAD图谱(图21)所知，该成分最大吸收波长在253，363nm处，由质谱图(图22)所示，准离子碎片 m/z 301.01378[M-H],提示为鞣花酸。
(8)峰8，11.60min：由DAD图谱(图23)所示，最大吸收波长在268nm和342nm，提示，该化合物为黄酮类成分。由质谱图(图24) 所示，该成分的准分子离子峰[M-H]为431.10634；[M-90]:341.07882, [M-120]:311.07031，提示分子中一分子葡萄糖碳苷，与峰6为同分异构体，因此，峰8鉴定为异牡荆苷。
(9)峰9，12.23min：DAD图谱(图25)所示，最大吸收波长在255和351nm处，提示为黄酮类成分。质谱图(图26)所示，准分子离子峰为[M-H]:477.07282,苷元碎片为301.04984，结构待定。
(10)峰10，17.06min：由其DAD图谱(图27)所示，最大紫外吸收在255和343nm处，提示为黄酮类成分；质谱图(图28)所示，447.10019为其准分子离子峰[M-H],m/z 301.04911为脱去一分子鼠李糖的离子碎片，提示该化合物为槲皮苷，与对照品一致。
(11)峰11，17.91min：DAD图谱(图29)显示，最大吸收波长253和343nm，提示为黄酮类成分；质谱(图30)显示，593.14823 可能为其准分子离子峰[M-H],结构待定。
(12)峰12，19.45min：DAD图谱(图31)显示最大吸收波长为248nm，质谱(图32)显示，m/z 315.02848为准分子离子峰， 300.00516为其脱去一分子甲基的离子碎片，结构待定。
(13)峰13，24.80min：DAD图谱(图33)显示最大吸收波长为 248和343nm,提示为黄酮类成分，质谱(图34)显示，m/z 285.05595 为准分子离子峰[M-H]，表明该成分为木犀草素。
(14)峰14，25.81min：DAD图谱(图35)显示最大吸收波长为 247和374nm，提示为黄酮醇类成分，由质谱(图36)所示，m/z 329.04360为其准分子离子峰[M-H]，314.02063为脱去一分子甲基的离子碎片，298.99795为脱去另一分子甲基的离子碎片，提示该成分为二甲氧基槲皮素。
(15)峰15，26.41min：由DAD图谱(图37)所示，最大吸收波长在250和358nm处，提示为黄酮醇类成分，由质谱(图38)所示， 315.06505为其准分子离子峰，300.04154为脱去一分子甲基的离子碎片，提示分子中有一分子甲氧基，考虑到紫外吸收的带I明显紫移动，表明该甲氧基取代在3位，因此化合物鉴定为3-甲氧基槲皮素。
(16)峰16，32.05min：由DAD图谱(图39)所示，最大吸收波长在277nm处，疑似木脂素类成分，由质谱(图40)所示，299.14389 为其准分子离子峰，结构待定。
(17)峰17，43.32min：由DAD图谱(图41)所示，最大吸收波长为280，334nm，由质谱(图42)所示m/z 433.12202可能为其准分子离子峰[M-H]，结构待定。
结合以上分析，我们基本鉴定了11个色谱峰，如(图43)所示，具体如表19：
表19
Figure GDA0003900116430000241
Figure GDA0003900116430000251
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
(1)本发明给出了一种荭草汤剂，所述汤剂中含有牡荆苷、槲皮苷、没食子酸、原儿茶酸、异荭草苷、荭草苷、鞣花酸、异牡荆苷、木犀草素、二甲氧基槲皮素、3-甲氧基槲皮素。
(2)本发明给出了一种荭草汤剂的制备方法，限定了前处理方法、煎煮次数、加水量、煎煮时间等指标和参数，并采用合适的低温浓缩和冷冻干燥，最大限度保留中药有效成分群，最终制成荭草标准汤剂的冻干粉。
(3)本发明给出了一种荭草汤剂多种成分含量测定方法，其采用高效液相色谱法进行测定，采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(20:80) 为流动相，供试品溶液进样量10μL，柱温40℃，流速1mL/min进行洗脱，检测波长为350nm。按照本发明的方法测定荭草标准汤剂中荭草素和异荭草素的总含量，结果具有分离效果好、灵敏度高、重现性好等优点。
(4)本发明给出了一种荭草汤剂特征图谱的检测方法，最终建立了荭草标准汤剂的特征图谱，可为荭草汤剂产品提供质量控制手段，既兼顾了荭草的品种特性，能避免大生产部分合格批次的误判，又能对大生产工艺提供重要质量控制参数，从而提高了产品质量及质量控制水平。
附图说明
图1是荭草汤剂冻干曲线图；
图2是异荭草素和荭草素的紫外吸收波长扫描图；
图3是荭草汤剂不同提取方法色谱图对比图；
图4是荭草汤剂不同提取溶剂色谱图对比图；
图5是荭草汤剂以甲醇不同质量分数作为提取溶剂的色谱图对比图；
图6是荭草汤剂不同提取时间的色谱图对比图；
图7是荭草标准汤LC-MS图(自上而下分别为BPI模式质谱图和254nm下紫外色谱图)；
图8是混合对照品LC-MS图(自上而下分别为BPI模式质谱图和254nm下紫外色谱图,a:牡荆苷；b：木犀草苷；c：槲皮苷； d:槲皮素)；
图9是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰 1的DAD图谱及化学结构；
图10是峰1的质谱图；
图11是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰2的DAD图谱及化学结构；
图12是峰2的质谱图；
图13是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰3的DAD图谱；
图14是峰3的质谱图；
图15是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰4的DAD图谱及化学结构；
图16是峰4的质谱图；
图17是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰5的DAD图谱及化学结构；
图18是峰5的质谱图；
图19是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰6的DAD图谱；
图20是峰6的质谱图；
图21是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰7的DAD图谱；
图22是峰7的质谱图；
图23是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰8的DAD图谱及化学结构；
图24是峰8的质谱图；
图25是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰9的DAD图谱；
图26是峰9的质谱图；
图27是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰10的DAD图谱及化学结构；
图28是峰10的质谱图；
图29是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰11的DAD图谱；
图30是峰11的质谱图；
图31是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰12的DAD图谱；
图32是峰12的质谱图；
图33是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰13的DAD图谱；
图34是峰13的质谱图；
图35是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰14的DAD图谱；
图36是峰14的质谱图；
图37是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰15的DAD图谱；
图38是峰15的质谱图；
图39是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰16的DAD图谱；
图40是峰16的质谱图；
图41是荭草标准汤紫外254nm下主要色谱峰的LC-MS鉴定中峰17的DAD图谱；
图42是峰17的质谱图；
图43是荭草的HPLC-UV图谱(254nm)；
图44是异荭草素对照品的紫外吸收图；
图45是荭草标准汤剂样品的DAD-3D图；
图46是大梯度考察图谱；
图47是特征图谱分析中流动相有机酸选择考察对比图；
图48是特征图谱分析中有机相选择考察对比图；
图49是特征图谱分析中色谱条件优化后的图图谱；
图50是特征图谱分析中不同提取溶剂考察的UPLC图谱；
图51是特征图谱分析中不同提取溶剂的提取效率对比图，其中同一峰中从左至右分别为水、50％甲醇、75％甲醇、甲醇、稀乙醇、 75％乙醇、乙醇；
图52是特征图谱分析中不同提取方式考察的UPLC图谱对比图；
图53是特征图谱分析中不同方式的提取效率对比图，其中同一峰中从左至右分别为回流、超声；
图54是特征图谱分析中不同提取时间考察的UPLC图谱；
图55是特征图谱分析中不同时间的提取效率对比图，其中同一峰中从左至右分别为超声15min、超声30min、超声45min；
图56是荭草汤剂的特征图谱，其中积分参数：平滑峰宽0.15，最小峰面积0.1；
图57是荭草汤剂含量测定专属性考察色谱图；
图58是异荭草素和荭草素峰纯度图；
图59是特征图谱方法学验证中不同色谱柱耐用性考察HPLC图；
图60是特征图谱方法学验证中不同色谱柱耐用性考察HPLC图；
图61是特征图谱方法学验证中不同柱温的考察对比图；
图62是特征图谱方法学验证中荭草标准汤剂专属性考察对比图；
图63是荭草汤剂整体性考察图谱；
图64是特征图谱方法学验证中不同柱温的考察对比图；
图65是特征图谱方法学验证中不同流速的考察对比图；
图66是特征图谱方法学验证中不同色谱柱的考察对比图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例：
提取、浓缩工艺验证：
分别称取3份荭草药材，每份约200g，第一煎加16倍水，第二煎加14倍水，浸泡30分钟后开始煎煮。第一煎开武火(500W)，待煮沸后，调为文火(200W)煎煮30分钟。趁热分别300目滤过。第二煎开武火(500W)，待煮沸后，调为文火(200W)分别煎煮 20分钟。趁热分别300目滤过。合并相同目数下的煎液，将煎液在 65℃下浓缩后取样测定出膏率和(指标成分)的转移率。结果如下表。
表20提取工艺验证
Figure GDA0003900116430000301
Figure GDA0003900116430000311
表21浓缩工艺验证
Figure GDA0003900116430000312
干燥工艺验证：
将制备好的浓缩液，调节固含量至10.0％～20.0％，置于烧杯中，磁力搅拌条件下分装至10ml西林瓶中，每瓶分装约2.0ml，按冻干参数进行冻干制得标准汤剂，标准汤剂的收率见表22。
表22冻干工艺验证
Figure GDA0003900116430000313
经3批分别平行3次的验证试验可知，本申请中荭草汤剂的制备工艺稳定可行。
荭草汤剂含量检测方法的方法学验证：
对照品溶液的制备：
对照品溶液制备：取荭草素和异荭草素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1mL含荭草素0.02mg和异荭草素0.035mg的溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取荭草汤剂冻干粉适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，回流提取4h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定方法：采用高效液相色谱法进行测定，采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(20:80)为流动相，供试品溶液进样量10μL，柱温40℃，流速1mL/min进行洗脱，检测波长为350nm。
(1)专属性
按上述供试品溶液制备方法制备供试品、精密吸取供试液、荭草素和异荭草素混合对照品溶液与空白溶剂各10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。结果见图57、表23。
表23色谱峰分离参数
Figure GDA0003900116430000321
Figure GDA0003900116430000331
实验结果表明空白溶剂色谱中在与异荭草素、荭草素相应的保留时间没有色谱峰，说明溶剂对异荭草素、荭草素的测定无干扰，以本法测定荭素标准汤剂中异荭草素、荭草素的含量具有专属性。
(2)峰纯度考察
按上述供试品溶液制备方法制备供试品，精密吸取供试品溶液 10μL、荭草素和异荭草素混合对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件以DAD检测器进行190nm～400nm扫描检测，计算峰纯度。结果见图58及表24。峰纯度符合要求。
表24荭草素和异荭草素峰纯度值
Figure GDA0003900116430000332
(3)精密度试验
精密吸取荭草素和异荭草素对照品(异荭草素0.03512mg/mL、荭草素0.02015mg/mL)溶液各10μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，记录其峰面积测量值，计算相对标准偏差，试验结果见表25、表26。
表25异荭草素精密性考察结果
Figure GDA0003900116430000333
Figure GDA0003900116430000341
表26荭草素精密性考察结果
Figure GDA0003900116430000342
实验结果表明仪器精密度良好。
(4)稳定性试验
取荭草冻干粉样品1份(批号：20191107-3)，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液供试液，考察荭草冻干粉稳定性，测定峰面积值，计算其RSD，共测定24h，试验结果见表27、表28。
表27异荭草素稳定性考察结果
Figure GDA0003900116430000343
表28荭草素稳定性考察结果
Figure GDA0003900116430000344
结果表明：样品供试液在24h内稳定性良好。
(5)重复性考察
取同一批荭草标准汤剂(批号：20191107-3)约0.1g，精密称定，平行称定6份，按供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。每份精密吸取10μL按上述色谱条件测定，测定供试品溶液中荭草素和异荭草素含量，计算RSD，测定结果见表29。
表29重复性考察结果
Figure GDA0003900116430000351
实验结果表明该分析方法的重复性良好。
(6)中间精密度考察
取荭草冻干粉(批号:20191107-3)2份，分别由两个实验员按上述供试品制备方法制备供试品溶液，在同一实验室不同仪器上分别进样10μL，测定荭草素和异荭草素峰面积，计算荭草素和异荭草素含量，计算其RSD，见表30。
表30中间精密度试验
Figure GDA0003900116430000352
结果表明：中间精密度(RSD％＝1.4)。说明不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，荭草素和异荭草素含量结果RSD< 2％，该分析方法中间精密度良好。
(7)耐用性考察
①不同流速考察
取样品1份(批号：20191107-3)，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min 三个流速。
表31不同流速考察
Figure GDA0003900116430000361
图59和表31中的结果表明：三种流速下色谱峰分离效果均较好。但流速为1mL/min时荭草素和异荭草素含量高于0.9mL/min、 1.1mL/min，本实验选择流速为1mL/min。
②不同色谱柱考察
取样品1份(批号：20191107-3)，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别采用Agilen Eclipse Plus C18(250× 4.6mm，5μm)、2-Inertsil ODS-HL(GLSciences，250×4.6mm，5 μm)、3-UItimate XB-C18(Welch，250×4.6mm，5μm)三种色谱柱，对荭草冻干粉样品进行分析。
表32不同色谱柱耐用性考察结果
Figure GDA0003900116430000362
Figure GDA0003900116430000371
表32和图60中分析结果显示，三种色谱柱的分离均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小，且Agilen Eclipse Plus C18柱分离得到的峰峰形较好。本实验采Agilen Eclipse Plus C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱进行荭草冻干粉含量测定。
③柱温考察
取样品1份(批号：20191107-3)，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察20℃、30℃、40℃三个温度。
表33不同柱温的考察
Figure GDA0003900116430000372
表33和图61中结果表明三种柱温下色谱峰分离效果均较好。但柱温在40℃时指标含量较高，因此选择柱温为40℃。
特征图谱分析方法的方法学验证：
专属性：
由图62的结果可知，溶剂对荭草标准汤剂图谱中的特征峰没有干扰。
整体性：
图63的结果表明，荭草标准汤剂在51min后无明显的色谱峰，整体性较好。
精密度：
取同一批号样品(批号：BT20191126-2)，按供试品溶液制备方法制备成供试液，进样6次，每次2μl，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表34精密度实验结果(相对保留时间)
Figure GDA0003900116430000381
表35精密度实验结果(相对峰面积)
Figure GDA0003900116430000382
结果表明：各特征峰相对保留时间及相对峰面积值RSD均小于3％，仪器精密度良好。
稳定性：
取同一批号样品(批号：BT20191126-2)，按供试品溶液制备方法制备成供试液，每隔2小时进样一次，共测定12小时，分别进样2μl，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表36稳定性实验结果(相对保留时间)
Figure GDA0003900116430000391
表37稳定性实验结果(相对峰面积)
Figure GDA0003900116430000392
结果表明：各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3％，供试液在12小时内稳定性良好。
重复性：
取同一批号样品(批号：BT20191126-2)共6份，按供试品溶液制备方法制备成供试液，进样2μl分析，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表38重复性实验结果(相对保留时间)
Figure GDA0003900116430000401
表39重复性实验结果(相对峰面积)
Figure GDA0003900116430000402
结果表明：各特征峰的相对保留时间及相对峰面积值的RSD均小于3％，该方法的重复性良好。
中间精密度：
由本项目组其他分析人员在不同日期和不同色谱仪(安捷伦1290)下操作，取同一批号样品(批号：BT20191126-2)共6份，按供试品溶液制备方法制备成供试液，进样2μl分析，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。
表40荭草标准汤剂特征图谱中间精密度结果(相对保留时间)
Figure GDA0003900116430000411
表41荭草标准汤剂特征图谱中间精密度结果(相对峰面积)
Figure GDA0003900116430000412
实验结果表明，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，相对保留时间RSD＜3.0％，说明该方法中间精密度良好。
耐用性考察：
(1)柱温考察：
用岛津(Inertsil ODS-3，2.1×100mm，2μm)色谱柱，取荭草冻干粉的供试品溶液，分别考察了柱温为20℃、25℃、30℃时的样品分离效果。
图64中结果表明，柱温对荭草标汤的出峰情况有一定影响，其中柱温为25℃时的分离效果最好。
(2)流速考察：
用岛津(Inertsil ODS-32.1×100mm 2μm)色谱柱，取荭草冻干粉的供试品溶液，分别考察了流速为0.25ml/min、0.30ml/min、 0.35ml/min时的样品分离效果。
图65中结果表明，流速对荭草标汤物质的出峰时间影响较大，但对分离效果影响较小，综合考虑选择0.30ml/min。
(3)色谱柱考察：
取荭草冻干粉的供试品溶液，先后比较三种不同填料的色谱柱的分离效果，3支色谱柱分别为：Waters(ACQUITY UPLC HSS T33.0*100mm，1.8μm)、塞默飞(Accucore PhenylHexyl 2.1× 100mm，2.6μm)、岛津(Inertsil ODS-32.1×100mm 2μm)。
图66中结果表明，使用岛津(Inertsil ODS-32.1×100mm 2μm) 的分离度最好，因此选择岛津(Inertsil ODS-32.1×100mm 2μm) 进行研究。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种荭草汤剂多种成分含量测定方法，其特征在于，所述测定方法具体是采用高效液相色谱法进行测定，是采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相，所述流动相的体积比为20:80，供试品溶液进样量10μL，柱温40℃，流速1mL/min进行洗脱，检测波长为350nm，所用的色谱柱是AgilenEclipse Plus C18色谱柱，所述色谱柱的规格为：柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；
所述测定方法可以同时测定荭草汤剂中牡荆苷、槲皮苷、没食子酸、原儿茶酸、异荭草苷、荭草苷、鞣花酸、异牡荆苷、木犀草素、二甲氧基槲皮素、3-甲氧基槲皮素的含量；
所述供试品溶液是通过如下方法制备的：取荭草汤剂粉末，研细，取0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，回流提取4h，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
所述荭草汤剂是通过如下方法制备得到的：
(1)取荭草药材，置砂锅中，加入16倍水浸泡30min；
(2)煎煮30min，选择300目标准筛趁热过滤；
(3)药渣再加14倍水，煎煮20min，300目标准筛趁热过滤，合并两次滤液；
(4)65℃减压浓缩至浓缩后所得浓缩液含固量为10.0％～20.0％，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得荭草汤剂；所述减压浓缩，浓缩过程中真空度为-0.08～-0.09MPa；
所述冷冻干燥，其具体冻干参数设定如下：
(1)捕水器温度-50℃，箱体预抽真空-0.15mbar；
(2)预冻温度为-45℃，持续时间4h；
(3)升华干燥温度为-30℃～0℃，持续时间，14h，真空度为-0.2mbar；
(3)解析干燥温度为0℃～25℃，持续时间，7h，真空度为-0.2mbar。
2.一种荭草汤剂特征图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)色谱条件：以岛津Inertsil ODS-3为色谱柱，所述色谱柱的规格为：柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为2μm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；流速为每分钟0.30ml；检测波长为254nm；理论板数按异荭草素计算应不低于5000；
Figure FDA0003897046130000021
(2)参照物溶液的制备：取异荭草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含异荭草素0.05mg即得；
(3)供试品溶液的制备：取如权利要求1所述的荭草汤剂粉末0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入20ml 50％甲醇，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(4)标准特征图谱的建立：最终确定荭草标准汤剂特征图谱标准为：供试品特征图谱中应有7个特征峰，以异荭草素参照物质对应的峰1为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±5％之内，规定值为：峰1：1.000、峰2：1.045、峰3：1.901、峰4：2.832、峰5：2.899、峰6：3.172、峰7：3.269；计算各特征峰与S峰的相对峰面积，其相对保留峰面积应在规定范围内，规定值为：峰2：0.752～1.381、峰3：0.319～0.434、峰4：0.036～0.464、峰5：0.054～0.671、峰6：0.155～1.569、峰7：0.171～2.087。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1785263A (zh) * 2005-12-09 2006-06-14 贵州益佰制药股份有限公司 复方荭草制剂的质量控制方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101822723A (zh) * 2010-04-21 2010-09-08 贵阳医学院 一种荭草药材的多成分含量测定方法
CN110161135B (zh) * 2018-02-13 2022-03-11 国药集团同济堂（贵州）制药有限公司 续断标准汤剂的制备方法及其检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1785263A (zh) * 2005-12-09 2006-06-14 贵州益佰制药股份有限公司 复方荭草制剂的质量控制方法

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