CN113454462A - 固相反应芯片和使用该固相反应芯片的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种固相反应芯片和使用该固相反应芯片的测定方法，该固相反应芯片能够克服在内部具备吸液构件的固相反应芯片的缺点，以迅速且简便的操作精度良好地检测检体液中含有的测定对象物质。本发明提供一种固相反应芯片和使用该固相反应芯片的测定方法，该固相反应芯片是通过上盖构件与下盖构件嵌合一体化而形成为旋转体，具有：固定化部，设置于上盖构件或下盖构件中的任一者的内侧底面侧，将对检体液中含有的测定对象物质具有特异性结合能力的多种结合物质进行固定化；开口部，设置于上盖构件上，向固定化部表面供给检体液；以及吸液部，设置于固定化部外侧，对介由开口部供给的检体液进行吸液，固定化部具有由在相对的内侧底面方向侧隆起的隆起部划分的多个固定化区域，在各固定化区域的外缘部包含至少1个顶点。

Description

固相反应芯片和使用该固相反应芯片的测定方法
技术领域
本发明涉及固相反应芯片和使用该固相反应芯片的测定方法。
背景技术
已知引起支气管哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹或过敏性休克等疾病的I型过敏是由特定的抗原(过敏原)与针对其的IgE抗体的过度反应而引起的。在医院等各诊疗现场，在确定作为过敏疾病的原因的原因过敏原的基础上进行检测检体液中含有的IgE抗体的检查。目前，作为检测检体液中含有的过敏原特异性IgE抗体的方法，可使用以免疫荧光法为测定原理的被称为CAP的方法、以免疫化学发光法为测定原理的被称为MAST的方法等。
然而，一直以来，为了高效地检测检体液中含有的核酸、蛋白质、糖脂之类的测定对象物质，可使用将具有与该测定对象物质特异性结合能力的结合物质固定化在固相上，在该固相上进行结合于结合物质的测定对象物质的检测的固相反应芯片。在生物化学领域中，固相反应芯片也被称为生物芯片，例如，已知有mRNA芯片、cDNA芯片、微PCR芯片、蛋白质芯片等。
近年来，对于过敏疾病的诊断，提出了使用抗原抗体反应的免疫分析微芯片，例如在专利文献1中公开了一种生物芯片的分析方法，其使用将多种过敏原的抗原作为相互独立、即间隔放置的斑点而搭载的生物芯片，在采取检体液后，将检体液与抗原的反应检测过程自动化，且能够迅速地得到测定结果。
作为现有技术的CAP原则上是对每1种过敏原进行测定的单项目法，由于每次测定都需要检体液，因此受试者的肉体负担大，并且测定的吞吐量也不好。另一方面，MAST例如是是30种左右的过敏原一次性进行测定的多项目法。虽然与单项目法相比能够同时测定的过敏原数多，但操作繁琐，到得到测定结果为止需要5小时左右的时间。
另外，在上述专利文献1记载的技术中，需要用于抽吸由清洗喷嘴、抗体喷嘴、试剂喷嘴之类的各喷嘴所供给的各液体的抽吸喷嘴，到各液体的抽吸完成为止需要时间，并且也有因吸引泵的故障所致的抽吸力不足，或者附着于抽吸喷嘴的附着物附着于生物芯片而引起污染的顾虑。
鉴于这样的实际情况，本申请申请人开发了一种固相反应芯片，并将其申请专利(专利文献2)，该固相反应芯片在通过层叠第1基座部和第2基座部而形成的旋转体的外周具备吸液构件，且包含收容其的罩构件。专利文献2的发明通过在第2基座部的与第1基座部相对的面上固定化对检体液中含有的测定对象物质具有特异性结合能力的多种结合物质，从而能够以少量的检体液实现同时多项目测定，根据专利文献2的发明，能够以迅速且简便的操作对检体液中含有的测定对象物质进行检测。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-13000号公报
专利文献2：日本特开2016-200431号公报
专利文献3：日本专利第6107244号公报
专利文献4：国际公开WO2018/056454号
发明内容
专利文献2的固相反应芯片中，需要收容通过层叠第1基座部和第2基座部层叠而形成的旋转体的罩构件。罩构件承担形成固相反应芯片外形，并且介由吸液构件来保持旋转体的作用。然而，反复进行试验，结果明确旋转体伴随高速的旋转，在罩构件内部产生位移，对测定精度造成影响。此外，圆形的旋转体与形成为圆环状的吸液构件面接触，因此也有在其接触面产生液滴，吸液能力降低之类的问题。
本发明是为了解决这样的问题而完成的，本发明的课题是提供一种固相反应芯片和使用该固相反应芯片的测定方法，该固相反应芯片能够克服在内部具备吸液构件的固相反应芯片的缺点，以迅速且简便的操作精度良好地检测检体液中含有的测定对象物质。
为了解决上述课题，本发明的固相反应芯片的特征在于，通过上盖构件与下盖构件嵌合一体化而形成为旋转体，具有：固定化部，设置于上述上盖构件或上述下盖构件中的任一者的内侧底面侧，将对检体液中含有的测定对象物质具有特异性结合能力的多种结合物质进行固定化；开口部，设置于上述上盖构件，向上述固定化部表面供给上述检体液；以及吸液部，设置于上述固定化部外侧，对介由上述开口部供给的上述检体液进行吸液，上述固定化部具有由在相对的内侧底面方向侧隆起的隆起部划分的多个固定化区域，在各固定化区域的外缘部包含至少1个顶点。
另外，本发明的测定方法的特征在于，具备如下步骤：结合步骤，介由上述开口部对上述固相反应芯片导入上述检体液，使上述测定对象物质与上述结合物质结合；添加步骤，添加包含生理活性物质的反应液，该生理活性物质对结合于上述结合物质的上述测定对象物质具有特异性结合能力且具备酶活性；除去步骤，介由上述开口部导入清洗液后，使固相反应芯片以规定的转速旋转，从而除去上述清洗液；以及测定步骤，测定上述生理活性物质的上述酶活性。
进而，本发明的测定方法的特征在于，具备如下步骤：第1结合步骤，介由上述开口部对上述固相反应芯片导入上述检体液，使上述测定对象物质与固定化于上述固定化部的上述结合物质结合；第2结合步骤，使对上述测定对象物质具有特异性结合能力且由信号生成物质标记了的标记化物质与利用上述第1结合步骤结合于上述结合物质的上述测定对象物质结合；以及测定步骤，测定由上述信号生成物质产生的信号。
根据本发明，能够提供一种固相反应芯片和使用该固相反应芯片的测定方法，该固相反应芯片能够克服在内部具备吸液构件的固相反应芯片的缺点，以迅速且简便的操作精度良好地检测检体液中含有的测定对象物质。
附图说明
图1为用于说明本实施方式的固相反应芯片100的概观的立体图。
图2为构成固相反应芯片100的各构件的部件图。
图3中的(a)为在内侧底面11侧观察上盖构件10时的俯视图，(b)为上盖构件10的侧面截面图。
图4中的(a)为在内侧底面21侧观察下盖构件20时的俯视图，(b)为下盖构件20的侧面截面图。
图5为图1所示的固相反应芯片100的侧面截面图。
图6为说明本实施方式的测定方法的流程图。
图7为说明自动测定装置200的构成例的框图。
图8中的(a)为说明变形例的上盖构件101的俯视图，(b)为说明变形例的下盖构件301的俯视图。
图9中的(a)为说明变形例的上盖构件102的俯视图，(b)为说明变形例的下盖构件302的俯视图。
图10中的(a)为说明变形例的固相反应芯片50的立体图，(b)为说明变形例的固相反应芯片60的立体图。
图11为表示利用本实施方式的测定方法测定的比色斑点的发色状态的图。
图12为表示利用本实施方式的测定方法测定的比色斑点的发色状态的图。
具体实施方式
以下，参照附图对用于实施本发明的一个方式进行说明。应予说明，本发明并不限定于以下的记述，在不脱离本发明的主旨的范围内，可以适当变更。另外，附图是示意性的，各尺寸的比率等与实际的尺寸比率不同。具体的的尺寸应参考以下的说明进行判断。另外，当然在附图相互之间也包含相互的尺寸关系、比率不同的部分。
本发明的固相反应芯片是通过上盖构件与下盖构件嵌合一体化而形成为旋转体的固体反应芯片，具有：固定化部，设置于上盖构件或下盖构件中的任一者的内侧底面侧，将对检体液中含有的测定对象物质具有特异性结合能力的多种结合物质进行固定化；开口部，设置于上盖构件，向固定化部表面供给检体液；以及吸液部，设置于固定化部外侧，对介由开口部供给的检体液进行吸液，固定化部具有由在相对的内侧底面方向侧隆起的隆起部划分的多个固定化区域，在各固定化区域的外缘部包含至少1个顶点。以下进行详细说明。
图1为用于说明本实施方式的固相反应芯片100的概观的立体图，图2为构成固相反应芯片100的各构件的部件图。本实施方式的固相反应芯片100具备上盖构件10以及与上盖构件10嵌合一体化并与上盖构件10一起形成旋转体的下盖构件20，在通过上盖构件10与下盖构件20嵌合而形成的内部空间30，沿着后述的固定化部23的外周27设置有回收介由开口部14供给的检体液、反应液、清洗液等(以下，有时简称为液体)的吸液构件40。应予说明，以下的说明中，对在下盖构件20的内侧底面21侧设置有固定化部23的构成进行说明，但也可以为与其相反地在上盖构件10的内侧底面11侧的设置有固定化部23的构成。
图3(a)为在内侧底面11侧观察上盖构件10时的俯视图，图3(b)为上盖构件10的侧面截面图。本实施方式的上盖构件10具有大致正圆的形状，以能够与下盖构件20嵌合的方式沿着内侧底面11的周缘(圆周)立设有上盖嵌合壁12。在上盖构件10的内侧底面11形成有具有与下盖构件20的固定化部23的俯视形状相同的四边形状且在固定化部表面24相对的固定化部相对面13。固定化部相对面13通过设置在后述的固定化部表面24上的隆起部26抵接，在与固定化部表面24之间形成空隙，能够将介由开口部14供给的液体在固定化部表面24上展开。应予说明，固定化部相对面13如图3(b)所示，可以从内侧底面11具有规定的突出宽度a而形成，也可以作为平滑面直接形成在内侧底面11表面上。另外，固定化部相对面13的俯视形状可以与固定化部23整体的俯视形状为相同形状，也可以为不同的形状。开口部14设置在上盖构件10的表面大致中央且与下盖构件20的旋转轴同轴上。开口部14具有形成为锥形的开口部分，在固定化部相对面13的面上导通。
图4(a)为在内侧底面21侧观察下盖构件20时的俯视图，图4(b)为下盖构件20的侧面截面图。本实施方式的下盖构件20具有与上盖构件10相同形状的大致正圆的形状，在比内侧底面21的周缘(圆周)更靠内侧以能够与下盖构件10嵌合的方式立置有下盖嵌合壁22。在下盖构件20的内侧底面21形成有俯视形状为四边形状的固定化部23。在固定化部23的固定化部表面24形成有将对测定对象物质具有特异性结合能力的多种结合物质固定化的固定化区域25。本实施方式中，固定化部表面24由相对的在上盖构件10的内侧底面11方向侧隆起的隆起部26划分成4个固定化区域25。如上所述，通过设置在固定化部表面24上的隆起部26与上盖构件10的固定化部相对面13抵接，在固定化部表面24与固定化部相对面13之间形成空隙，介由开口部14供给的液体被导入到该空隙(固定化区域25)。在由隆起部26划分的各固定化区域25的外缘部28包含至少1个顶点230。本实施方式中，示出了在各固定化区域25的外缘部28设置有内角度显示90°的1个顶点230，作为固定化部23的整体的俯视形状具有四边形状的固定化部23的例子。应予说明，固定化区域25的外缘部28所包含的顶点只要显示30°～162°的内角度且顶点数为1个以上就没有特别限定。而且，优选以固定化部23所包含的4个固定化区域25的俯视形状全部为相同形状且成为旋转对象的方式构成。通过使固定化部23所包含的4个固定化区域25为这样的形状，在使固相反应芯片100旋转时能够得到稳定的旋转状态，能够将介由开口部14供给的液体均匀地在固定化部表面24与固定化部相对面13之间的空隙展开。在固定化区域25，每1个区域以4×4列(16个斑点)形成有直径100μm～1mm左右大小的斑点250。应予说明，固定化于固定化区域25的结合物质的数量不限定于上述64种，例如，可以以2×2列(合计16种)～6×6列(合计144种)的方式根据测定项目而适当地变更。另外，结合物质的固定化方法也不依赖于上述斑点，也可以采用使结合物质直接或间接地固定化于设置于与各固定化位置对应的部位的例如具有U形底(球面状)、V形底、平底(圆型、方型)状等底部的凹坑(孔)的方法。
通过使设置在下盖构件20的内侧底面21上的固定化部23的固定化区域25的外缘部28为上述形状，能够减少与吸液构件40的接触面积，其结果，能够减少液滴的产生。此外，如图4(b)所示，从固定化部23的内侧底面21的突出宽度b只要在与固定化部相对面13之间形成的空隙为规定的空隙宽度就没有限制，只要考虑隆起部26的高度，并且根据形成于上盖构件10的固定化部相对面13的突出宽度a而适当地设定即可。
图5为图1所示的固相反应芯片100的侧面截面图。本实施方式中，形成在固定化部表面24与固定化部相对面间13之间的空隙的空隙宽度c优选为0.05mm～0.30mm之间，其中，更优选使空隙宽度c为0.08mm～0.15mm之间。应予说明，如上所述，空隙宽度c可以通过调整固定化部23的突出宽度b、固定化部相对面13的突出宽度a和隆起部26的高度而适当地变更，由此，能够使供给到空隙的液体的液量为期望的液量。
具有上述构成的上盖构件10和下盖构件20只要不透过液体且对蛋白质等具有非吸附性就没有特别限定，例如可以使用聚乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、氯乙烯、聚苯乙烯、ABS树脂、聚酰胺、四氟乙烯、聚丙烯、不饱和聚酯、环氧树脂等塑料原料，并通过例如注射成型、嵌件成型、吹塑成型、挤出成型、压缩成型或传递成型之类的成型方法来制造。对材质的色彩·透过性没有特别限定，上盖构件10优选具有透明性，下盖构件20优选为非透过性以抑制测定时的反射等。而且，上盖构件10与下盖构件20的嵌合一体化没有特别限定，可以通过超声波熔敷、振动熔敷、热板熔敷、高频熔敷、热风熔敷、激光熔敷、焊接等熔敷·焊接、粘接剂、粘接胶带等的粘接、使用自攻螺钉、螺栓和螺母的机械紧固等将上盖构件10的上盖嵌合壁12与下盖构件20的下盖嵌合壁22接合而实现嵌合一体化。
此外，收容于通过上盖构件10与下盖构件20嵌合而形成的内部空间30的吸液构件40可以形成为将形成为细板状的构件以各自的两端部彼此接合的圆环构件，沿着固定化部23的外侧(外周27)设置。吸液构件40是为了对通过伴随旋转而产生的离心力而除去的液体进行吸液而设置的。作为这样的吸液构件40的制造中使用的材质，例如可以使用聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等聚酯纤维，聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃纤维，聚氨酯，或者将它们复合而成的复合纤维，纸浆纤维、棉纤维、麻纤维等植物纤维，丝纤维、人造丝纤维等再生纤维之类的纤维，织布、无纺布、纸等吸水·保水性优异的材质。另外，可以使用以纸浆纤维、人造丝纤维之类的纤维素为主成分的材质、由使乙酸作用于木材纸浆而制成的乙酸酯(乙酰纤维素)之类的多糖类构成的多孔基体。
接下来，使用图6的流程图对使用本实施方式的固相反应芯片100的测定方法进行说明。本测定方法具备如下步骤：结合步骤，介由开口部14对固相反应芯片100导入检体液，使测定对象物质与结合物质结合；添加步骤，添加包含生理活性物质的反应液，该生理活性物质对结合于结合物质的测定对象物质具有特异性结合能力且具备酶活性；除去步骤，以规定的转速使固相反应芯片旋转，从而除去反应液；以及测定步骤，测定生理活性物质的酶活性。
本实施方式的测定法中，对使测定对象物质为特异性地结合于过敏原的IgE抗体的例子进行说明。对于作为在固定化部23的固定化部表面24的固定化区域25作为结合物质而固定化的结合物质的过敏原，没有特别限定，例如只要是屋尘1(2)、屋尘螨、柳杉、日本扁柏、桤木(属)、白桦(属)、鸭茅、豚草、艾蒿、链格孢、曲霉菌、马拉色菌(属)、猫(皮屑)、狗(皮屑)、蟑螂、蛾、胶乳等吸入系·其它过敏原，牛奶、蛋清、卵类粘蛋白、大米、小麦(粒)、荞麦、大豆、花生、苹果、猕猴桃、芝麻、牛肉、鸡肉、虾、蟹、鲭鱼、鲑鱼、金枪鱼等食物系过敏原之类的能够在医疗机构等作为过敏原检査项目而被受诊的过敏原，则可以选择任何过敏原。
过敏原向固定化区域25的固定化可以通过通常使用的物理吸附或化学结合来进行。例如，通过将包含测定项目的过敏原的过敏原溶液点样或压印于固定化区域25的期望的位置、或者例如具有U形底(球面状)、V形底、平底(圆型、方型)状等的底部的凹坑(孔)而将该过敏原固定化于固定化区域25。此时，可以将过敏原直接固定于固定化区域25，也可以为介由隔离物质将过敏原固定化的形态。本实施方式的固定化区域25由于设置有合计64处斑点位置，因此，通过将不同的过敏原固定化于各斑点，能够一次性测定64个测定项目。
另外，作为对作为测定对象物质的IgE抗体具有特异性结合能力且具备酶活性的生理活性物质，没有特别限定，例如优选使用以碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、尿素酶、肌酸激酶、尿酸酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、过氧化物酶等标记了的抗IgE抗体。本实施方式中，对使用以辣根过氧化物酶(HRP)标记抗IgE抗体而得的HRP标记抗体的例子进行说明。在使用HRP标记抗体的情况下，生成的信号依赖于底物，能够作为比色信号、化学发光信号而得到。作为比色信号的生成中使用的底物，例如可以使用四甲基联苯胺和其衍生物、邻苯二胺、三芳基甲烷类、咪唑无色色素类等。另外，对于化学发光信号的生成，例如可举出阿地铵盐类、二氧杂环丁烷类、荧光素、光泽精、草酰氯等。
通过在固定化区域25固定化有过敏原的由下盖构件20和上盖构件10形成的内部空间30收纳吸液构件40后将下盖构件20与上盖构件10嵌合一体化，从而构成固相反应芯片100。
然后，介由上盖构件10的开口部14供给检体液(30μl～60μl)(步骤S100)。作为检体液，可以从全血、血清、血浆、泪液、尿、唾液、脑脊液等生物试样中适当地选择。如果向开口部14供给检体液，则该检体液在固定化区域25整个区域展开，对作为固定化于各斑点的结合物质的过敏原具有特异性结合能力的IgE抗体进行结合。此时，固相反应芯片100优选置于35℃～40℃的范围的温度环境下。例如，通过在能够维持37℃左右的温度的恒温槽内进行一系列操作，能够使IgE抗体与过敏原有效地结合。
接下来，例如，介由开口部14供给包含tween20等表面活性剂的清洗液(30μl～60μl)后，以规定的转速(2000～2500rpm/min)旋转，从而除去清洗液(步骤S101)。
接下来，步骤S102中，介由开口部14供给包含HRP标记抗体的反应液(30μl～60μl)(步骤S102)。在使HRP标记抗体与结合于过敏原的IgE抗体结合后，例如，介由开口部14供给包含tween20等表面活性剂的清洗液(30μl～60μl)后，以规定的转速(2000～2500rpm/min)旋转，从而除去清洗液(步骤S103)。
步骤S103中的清洗完成后，加入四甲基联苯胺(TMB)等底物，使用CCD等摄像装置测定发出比色信号的斑点(步骤S104)。
此外，图6的流程图中说明的测定方法是手动的，但例如也可以通过使用具备图7所示的构成的自动测定装置200而自动地进行该测定。自动测定装置200以如下方式构成，具备：至少能够从设置的试剂盒抽吸·排出溶液的分注单元201，以保持固相反应芯片100的状态以每1分钟规定的转速进行旋转的离心分离部202，具备CCD等摄像装置的摄像部203，具备触摸面板等输入装置、显示装置信息或测定结果等的LCD(Liquid CrystalDisplay)等显示装置的操作部204，对由摄像部203摄像的图像(比色信号发光斑点等)进行解析的图像解析部205，根据图像解析部205的解析结果生成测定结果的测定结果生成部206，以及总体地控制它们的控制部207；除将试剂盒或固相反应芯片100设置于装置以外，不需要检查员的实际操作。
根据上述构成的自动测定装置200，具有如下优点：在约20分左右得到最终的测定结果，因此吞吐量高，另外，可以依照介由操作部204显示的画面直观地进行操作，因此不需要熟练的技术。另外，由于装置自身也能够小型化，因此也能够作为临床现场即时检査用的装置进行应用。
应予说明，上述测定方法的说明中，作为使测定对象物质为特异性地结合于过敏原的IgE抗体的例子，对作为在固定化区域25作为结合物质而固定化的结合物质的过敏原的例子进行了说明，但本发明并不限定于此，例如，也可以使测定对象物质为来自人乳头瘤病毒(HPV)的基因型、作为在第2基座部32的固定化区域32c作为结合物质而固定化的结合物质的来自HPV的基因组DNA探针。此时，可以构建为检测16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、68型等13种被归类为高风险型的HPV的测定体系。
另外，本发明例如也可以使术前传染病检查标志物、肝功能检查标志物、肾功能检查标志物、自身免疫性肝炎标志物、心脏病标志物、败血症标志物、甲状腺标志物或血中含有的特定的药物等为测定对象物质。
这里，表1中，(1)作为术前传染病检査标志物，示出了利用上述测定法对SyphilisTP、HIV Ag/Ab combo、Anti-HCV、HbsAg进行评价而得的结果，(2)作为肝功能检査标志物，示出了利用上述测定法对Anti-HBc、Anti-HBs、Anti-HBe、HBeAg、Anti-HBc IgM进行评价而得的结果，(3)作为肾功能检査标志物，示出了利用上述测定法对BUN、CRE、UA进行评价而得的结果，(4)作为自身免疫性肝炎标志物，示出了利用上述测定法对IgG、抗核抗体进行评价而得的结果，(5)作为心脏病标志物，示出了利用上述测定法对肌钙蛋白、肌红蛋白、CK-MB等生物化学心肌标志物、心脏型脂肪酸结合蛋白进行评价而得的结果，(6)作为败血症标志物，示出了利用上述方法对降钙素原(Procalcitonin)、普莱晒谱星(Presepsin)进行评价而得的结果，(7)作为过敏(过敏原)的典型例，示出了利用上述测定法对屋尘、屋尘螨、猫皮、蛋清、粉尘螨、牛奶、小麦、大豆、日本扁柏、柳杉进行评价而得的结果，(8)作为甲状腺标志物，示出了利用上述测定法对TSH、Free T4、TRAb进行评价而得的结果；(9)作为血中含有的特定的药物，示出了利用上述测定法对VCM、TEIC、ABK进行评价而得的结果。表1中，将与对照组(没有测定对象物质的状态)相比确认到显著的比色信号的测定对象物质评价为“阳性”，将虽然未达到“阳性”但相对于对照组仍确认到显著差异的比色信号的测定对象物质评价为“可疑阳性”。
另外，图11中示出(1)术前传染病检査标志物(1.Syphilis TP，2.HIV Ag/Abcombo，3.Anti-HCV、4.HBsAg)、(2)肝功能检査标志物(1.Anti-HBc，2.Anti-HBs，3.Anti-HBe，4.HBeAg，5.Anti-HBc IgM)、(3)肾功能检査标志物(1.BUN，2.CRE，3.UA)、(4)自身免疫性肝炎标志物(1.IgG，2.抗核抗体)和(5)心脏病标志物(1.肌钙蛋白，2.肌红蛋白，3.CK-MB等生物化学心肌标志物，4.心脏型脂肪酸结合蛋白)各自在测定时得到的比色斑点的发色状态。图12中示出在(6)败血症标志物(1.降钙素原，2.普莱晒谱星)、(7)过敏(过敏原)的典型例(1.屋尘，2.屋尘螨，3.猫皮，4.蛋清，5.粉尘螨，6.牛奶，7.小麦，8.大豆，9.日本扁柏，10.柳杉)、(8)甲状腺标志物(1.TSH，2.Free T4，3.TRAb)和(9)血中含有的特定的药物(1.VCM，2.TEIC，3.ABK)各自在测定时得到的比色斑点的发色状态。
[表1]
Figure BDA0003217372300000111
如表1和图11以及图12所示，对于(1)术前传染病检査标志物中的2.HIV Ag/Abcombo和4.HBsAg、(7)过敏(过敏原)的典型例中的4.蛋清、6.牛奶、7.小麦、8.大豆和9.日本扁柏等一部分的发色状态，是可疑阳性的结果，但对于作为本次测定对象的其它所有项目，与对照组相比，确认到显著的比色信号。根据这些结果，表明使用本发明的固相反应芯片的测定体系是不选择测定对象的适用项目，适于所谓筛选检查的测定体系。
根据具备这样的广范围的适用范围的本发明的固相反应芯片，也可以期待在用作肝功能检査标志物的AST(GOT)、ALT(GPT)、γ-GTP这样的除上述检査标志物以外的对相同疾病的检査标志物中的应用；在肝癌、胃癌、子宫癌、食道癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、大肠癌、肺癌之类的各种癌症标志物，出血热、严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征、禽流感、细菌性痢疾、戊型肝炎、甲型肝炎、流感、病毒性肝炎、急性膜炎等中的1种传染病到5种传染病、新型流感等传染病、指定传染病、新传染病等传染病标志物，或者白细胞、C型反应性蛋白质、血清淀粉样蛋白A之类的炎症标志物等除上述以外的疾病检査标志物中的应用。
进而，不仅是上述疾病相关的检査标志物，本发明还可以考虑在例如杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀菌剂、除草剂、杀虫杀菌剂、杀鼠剂、植物生长调节剂、忌避剂、引诱剂、展布剂之类的农药，兴奋剂、麻醉性镇痛剂、蛋白质同化剂、利尿剂、肽和糖蛋白激素和其同系物、血液兴奋剂、酒精、大麻、局部麻醉剂、皮质类固醇(肾上腺皮质类固醇)、β阻断剂之类的兴奋剂药物的检査·测定中的展开。
到此为止的说明中，作为使用本发明的固相芯片的测定方法的优选例，对使用对测定对象物质具有特异性结合能力且具备酶活性的生理活性物质的例子进行了说明。使用酶标记的测定体系从反应特异性和信号放大之类的观点出发也是优异的测定体系。然而，酶由于分子量大，因此，例如存在对抗原-抗体反应造成影响，或者酶失活时无法作为测定体系发挥功能之类的问题，由于这些因素，信号强度不稳定，有时测定的重现性降低。本发明的固相反应芯片也可以构建使用由除酶以外的信号生成物质标记了的标记化物质的测定体系，以下进行说明。
使用由除酶以外的被信号生成物质标记了的标记化物质的测定方法的特征在于，具备如下步骤：第1结合步骤，介由开口部对固相反应芯片导入检体液，使测定对象物质与固定化于固定化部的结合物质结合；第2结合步骤，使对测定对象物质具有特异性结合能力且由信号生成物质标记了的标记化物质与利用第1结合步骤结合于结合物质的测定对象物质结合；以及测定步骤，测定由信号生成物质产生的信号。此时，也可以在各步骤间或任意的步骤间设置添加清洗液并以规定的转速使固相反应芯片旋转，从而除去该清洗液的清洗步骤。这里，作为对测定对象物质具有特异性结合能力且由信号生成物质标记了的标记化物质，可以使用由放射性同位素、镧系元素、自由基衍生物、化学发光物质或荧光发光物质中的任一者标记了的抗体、蛋白A/G、凝集素、亲和素、链霉亲和素等蛋白质、核酸或它们的片段。信号生成物质与标记化物质的结合没有特别限定，可举出共价键、离子键、氢键、配位键、物理吸附或化学吸附等。另外，为了防止信号生成物质与标记化物质之间的非特异性吸附，例如也可以设置由聚乙二醇链等有机分子构成的连接子。应予说明，与先前的说明同样地，在测定对象物质为IgE抗体的情况下，标记化抗体优选使用由放射性同位素、镧系元素、自由基衍生物、化学发光物质或荧光发光物质中的任一者标记了的抗IgE抗体。
在使用放射性同位素作为信号生成物质的情况下，例如可举出125I、131I、3H等，从灵敏度、半衰期的的观点出发，优选使用125I。如果碘氧化，则作为新电子试剂容易与抗体(蛋白质)中的酪氨酸残基、组氨酸残基等结合，因此，适于标记化。
在使用镧系元素作为信号生成物质的情况下，可举出原子序数57～71的元素(La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu)。其中，原子序数63号的Eu(铕)的螯合物由于激发光(340nm)与放射光(615nm)的波长差大且放射光(荧光)寿命长，因此能够进行时间分解荧光测定。
在使用自由基衍生物作为信号生成物质的情况下，例如可举出哌啶-N-氧化物衍生物、吡咯烷-N-氧化物衍生物、
Figure BDA0003217372300000131
唑烷-N-氧化物衍生物等，可以测定由这些自由基衍生物标记了的标记化抗体的ESR色谱变化作为指标。
在使用化学发光物质作为信号生成物质的情况下，例如可举出鲁米诺衍生物、阿地铵盐类、二氧杂环丁烷类、荧光素、光泽精、草酰氯、吲哚酚衍生物等，可以将由这些化学发光物质标记了的标记化抗体与例如微过氧化物酶、过氧化物酶之类的酶在H2O2共存下或碱条件、H2O2共存下进行化学发光反应，对其进行测定。
在使用荧光发光物质作为信号生成物质的情况下，可以举出荧光色素、量子点或荧光性粒子(珠)中的任一者，该荧光性粒子由粒子与荧光色素或量子点构成。应予说明，这里所说的荧光发光物质在利用200nm～700nm的范围内的波长的紫外光～近红外光进行激发时，显示400nm～1100nm的范围内的波长的可见光～近红外光的放射光(发光)。
作为荧光色素的例子，可举出荧光素系色素分子、罗丹明系色素分子、AlexaFluor(Invitrogen公司制)系色素分子、BODIPY(Invitrogen公司制)系色素分子、级联系色素分子、香豆素系色素分子、曙红系色素分子、NBD系染料分子、芘系色素分子、花青系色素分子、芳香族烃系分子等。
具体而言，可举出5-羧基-荧光素、6-羧基-荧光素、5,6-二羧基-荧光素、6-羧基-2’,4,4’,5’,7,7’-六氯荧光素、6-羧基-2’,4,7,7’-四氯荧光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、萘并荧光素、5-羧基-罗丹明、6-羧基-罗丹明、5,6-二羧基-罗丹明、罗丹明6G、四甲基罗丹明、X-罗丹明、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和ALex Fluor 350、ALexFluor 405、ALex Fluor 430、ALex Fluor 488、ALex Fluor 500、ALex Fluor 514、ALexFluor 532、ALex Fluor 546、ALex Fluor 555、ALex Fluor 568、ALex Fluor 594、ALexFluor 610、ALex Fluor 633、ALex Fluor 635、ALex Fluor 647、ALex Fluor 660、ALexFluor 680、ALex Fluor 700、ALex Fluor 750、BODIPY FL、BODIPY TMR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665(以上为Invitrogen公司制)、甲氧基香豆素、曙红、NBD、芘、Cy5、Cy5.5、Cy7、HiLyte Fluor(注册商标，Anaspec公司制)、Dylight 594(注册商标，ThermoScientific公司制)系色素分子、ATTO 594(注册商标，ATTO-TEC公司制)、MFP 594(注册商标，Mobitec公司制)、5,10,15,20-四苯基卟啉四磺酸、5,10,15,20-四苯基卟啉四磺酸锌、酞菁四磺酸、酞菁四磺酸锌、N,N-双(2,6-二异丙基苯基)-1,6,7,12-(4-叔丁基苯氧基)-苝-3,4,9,10-四甲酸二酰亚胺、N,N-双(2,6-二异丙基苯基)-1,6,7,12-(4-叔丁基苯氧基)-苝-3,4,9,10-四羧基二酰亚胺、苯磺酸、4,4‘,4‘’,4’‘’-[(1,3,8,10-四氢-1,3,8,10-四氧代苝并[3,4-cd：9,10-c‘d’]二吡喃-5,6,12,13-四基)四(氧)]四(4,4‘,4‘’,4‘”-[(1,3,8,10-tetrahydro-1,3,8,10-tetraoxoperylo[3,4-cd:9,10-c‘d’]dipyran-5,6,12,13-tetrayl)tetralis(oxy)]tetrakis)等，除这些之外，还可以举出部花青、作为有机氮化合物的吖啶、荧光黄、亚甲基吡咯、萤光素、DCM(4-(二氰基亚甲基)-2-甲基-6-(4-二甲基氨基苯乙烯基)-4H-吡喃)、芪之类的物质。应予说明，这些荧光色素可以单独使用，也可以组合多种。
作为量子点的例子，可以使用含有II-VI族化合物、III-V族化合物、IV族元素等的量子点，这些化合物可以单独使用，也可以组合多种。
具体而言，可举出CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnS、ZnTe、InP、InN、InAs、InGaP、GaAs、Si、Ge等。应予说明，制备以这些量子点为核并用其它纳米材料壳化而成的核/壳型量子点，进一步用聚乙二醇、两亲性聚合物等生物亲和性高的有机物质对其其表面进行被覆而得的物质也可以在本发明中使用。
作为由粒子与荧光色素或量子点构成的荧光性粒子的例子，可举出在二氧化硅、氧化铝之类的无机粒子或由聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯之类的有机聚合物构成的树脂粒子(树脂聚合物)结合、部分结合上述例示的荧光色素、量子点中的任一者或者将上述例示的荧光色素、量子点中的任一者封入粒子内部的荧光性粒子。荧光色素等对树脂粒子的导入方法没有特别限定，可以采用在使荧光色素结合于作为树脂的原料的单体后，使单体聚合的方法；在形成聚合物后使荧光色素与该聚合物结合的方法；将单体与荧光色素混合，同时进行聚合和荧光色素的结合的方法；使荧光色素自身具有树脂聚合性的方法等。荧光性粒子的平均粒径只要是在免疫反应时不造成影响且可得到充分的亮度的尺寸就没有特别限定，优选为1nm～100μm的范围。应予说明，作为荧光性粒子的例子，只要是在利用紫外光～近红外光进行激发时，放射可见光～近红外光的放射光(发光)的性质的荧光物质与粒子的组合就没有特别限制，例如可以为上述的镧系元素与树脂粒子的组合。
可以在本发明中使用的荧光性粒子可以通过公知的方法而制作，也可以使用市售的荧光性粒子。例如，专利文献3中记载了以共价键以外的方式在由树脂构成的树脂粒子结合有荧光色素的荧光色素标记用树脂粒子的合成方法，通过使用期望的荧光色素，能够制作各种荧光性粒子。
另外，近年来，作为对封入到树脂粒子中的荧光色素的自淬灭(浓度淬灭)的解决方法，具有聚集诱导发光活性的物质受到关注。专利文献4中记载了一种荧光树脂微粒，是由内包1,1-二甲基-2,3,4,5-四苯基噻咯的聚苯乙烯微粒、内包1,1,2,3,4,5-六苯基噻咯的聚苯乙烯微粒、内包1,1-二甲基-2,5-二甲氧苯基-3,4-二苯基噻咯的聚苯乙烯微粒、内包1,1,2,3,4,5-六苯基的内包聚苯乙烯微粒之类的网状聚合物构成的粒子，包含聚集诱导发光活性化合物(噻咯)。作为聚集诱导发光活性化合物，除噻咯以外，例如还已知有四苯基乙烯衍生物等，通过使用将这些化合物内包于网状聚合物而构成的荧光树脂微粒作为本发明的荧光性粒子，比以往的使用π共轭系荧光物质的情况相比，可期待能够高效地进行测定。
如此，通过使用由放射性同位素、镧系元素、自由基衍生物、化学发光物质或荧光发光物质中的任一信号生成物质标记了的标记化物质，能够构建与测定酶活性的体系为相同程度或其以上的高效的测定体系。另外，在使用放射性同位素、镧系元素、自由基衍生物或荧光发光物质作为信号生成物质的情况下，与测定酶活性的体系不同，能够省去在测定步骤中添加底物(溶液)的麻烦，因此，能够更迅速地进行重现性高的测定。
[变形例]
上述实施方式的说明中，对在固定化部23所具备的4个固定化区域25的外缘部28具有内角度为90°的1个顶点且固定化部23整体的俯视形状为四边形状的例子进行了说明。然而，本发明并不限定于该形状，例如也可以是作为固定化部整体的俯视形状为三角形状、八边形状之类的其它多边形等的变形例。图8(a)是形成有开口部141和固定化部相对面131的上盖构件101的例子，图8(b)是能够与上盖构件101嵌合，在3个固定化区域251的各外缘部设置有内角度为60°的1个顶点232，且具备作为整体的俯视形状具有三角形状的固定化部231的下盖构件301的构成例。另外，图9(a)是形成有开口部142和固定化部相对面132的上盖构件102的例子，图9(b)是能够与上盖构件102嵌合，在4个固定化区域252的各外缘部设置有内角度为135°的2个顶点234，且具备作为整体的俯视形状具有八边形状的固定化部233的下盖构件302的构成例。应予说明，图4、图8和图9所示的例子仅是一个例子，本发明中，可以适当地选择顶点内角度、顶点数、构成该顶点的边数、边长的比、直线或曲线之类的边的线型等，基于它们的选择，在固定化部表面所形成的固定化区域的个数也没有限制。
进而，本发明中，上盖构件和下盖构件嵌合一体化的形状也可以适当变更。例如，也可以是如图10(a)所示，俯视形状为四边形状的上盖构件103和下盖构件303嵌合一体化的固相反应芯片50，或者如图10(b)所示，俯视形状为六边形状的上盖构件104和下盖构件304嵌合一体化的固相反应芯片60之类的组合。对于这些固定化部以及盖构件的组合，可以根据测定精度的高低、重现性、制造的容易度、制造成本等各种条件而适当地选择。
如上所述，根据本发明，通过舍弃以往需要的罩构件，构成为在将结合物质固定化的固定化区域的外缘部具有至少1个顶点，从而能够提供能够克服在内部具备吸液构件的固相反应芯片的缺点，以迅速且简便的操作精度良好地检测检体液中含有的测定对象物质的固相反应芯片和使用该固相反应芯片的测定方法。
符号说明
10、101、102、103、104上盖构件，11、21内侧底面，12上盖嵌合壁，13、131、132固定化部相对面，14、141，142开口部，20、301、302，303、304下盖构件，22下盖嵌合壁，23、231、233固定化部，24固定化部表面，25、251、252固定化区域，26隆起部，27外周，28外缘部，30内部空间，40吸液构件，50、60、100固相反应芯片，200自动测定装置，201分注单元，202离心分离部，203摄像部，204操作部，205图像解析部，206测定结果生成部，207控制部，230、232、234顶点，250斑点

Claims (20)

1.一种固相反应芯片，其特征在于，通过上盖构件与下盖构件嵌合一体化而形成为旋转体，具有：
固定化部，设置于所述上盖构件或所述下盖构件中的任一者的内侧底面侧，将对检体液中含有的测定对象物质具有特异性结合能力的多种结合物质进行固定化，
开口部，设置于所述上盖构件，向所述固定化部表面供给所述检体液，以及
吸液部，设置于所述固定化部外侧，对介由所述开口部供给的所述检体液进行吸液；
所述固定化部具有由在相对的内侧底面方向侧隆起的隆起部划分的多个固定化区域，
在各固定化区域的外缘部包含至少1个顶点。
2.根据权利要求1所述的固相反应芯片，其特征在于，各固定化区域的俯视形状均形成为相同形状。
3.根据权利要求1或2所述的固相反应芯片，其特征在于，各固定化区域形成为旋转对称。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述结合物质为诱导I型过敏反应的过敏原。
5.根据权利要求4所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为过敏原特异性抗体。
6.根据权利要求5所述的固相反应芯片，其特征在于，所述过敏原特异性抗体为IgE抗体。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述结合物质为来自人乳头瘤病毒的基因组DNA探针。
8.根据权利要求7所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为来自人乳头瘤病毒的基因型。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为选自Syphilis TP、HIV Ag/Ab combo、Anti-HCV、HBsAg中的术前传染病检査标志物。
10.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为选自Anti-HBc、Anti-HBs、Anti-HBe、HBeAg、Anti-HBcIgM中的肝功能检査标志物。
11.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为选自BUN、CRE、UA中的肾功能检査标志物。
12.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为选自IgG、抗核抗体中的自身免疫性肝炎标志物。
13.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为选自肌钙蛋白、肌红蛋白、生物化学心肌标志物、心脏型脂肪酸结合蛋白中的心脏病标志物。
14.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为选自降钙素原、普莱晒谱星中的败血症标志物。
15.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为选自TSH、Free T4、TRAb中的甲状腺标志物。
16.根据权利要求1～3中任一项所述的固相反应芯片，其特征在于，所述测定对象物质为选自VCM、TEIC、ABK中的血中药物。
17.一种测定方法，其特征在于，具备如下步骤：
结合步骤，对于权利要求1～16中任一项所述的固相反应芯片，介由所述开口部导入所述检体液，使所述测定对象物质与所述结合物质结合，
添加步骤，添加包含生理活性物质的反应液，所述生理活性物质对结合于所述结合物质的所述测定对象物质具有特异性结合能力且具备酶活性，
除去步骤，介由所述开口部导入清洗液后，使固相反应芯片以规定的转速旋转，从而除去所述清洗液，以及
测定步骤，测定所述生理活性物质的所述酶活性。
18.一种测定方法，其特征在于，具备如下步骤：
第1结合步骤，对于权利要求1～16中任一项所述的固相反应芯片，介由所述开口部导入所述检体液，使所述测定对象物质与固定化于所述固定化部的所述结合物质结合，
第2结合步骤，使对所述测定对象物质具有特异性结合能力且由信号生成物质标记了的标记化物质与利用所述第1结合步骤结合于所述结合物质的所述测定对象物质结合，以及
测定步骤，测定由所述信号生成物质产生的信号。
19.根据权利要求18所述的测定方法，其特征在于，所述信号生成物质为放射性同位素、镧系元素、自由基衍生物、化学发光物质或荧光发光物质中的任一者。
20.根据权利要求19所述的测定方法，其特征在于，所述荧光发光物质为荧光色素、量子点或荧光性粒子中的任一者，所述荧光性粒子由粒子与荧光色素或量子点构成。
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