CN113453756A - 拮抗剂 - Google Patents

拮抗剂 Download PDF

Info

Publication number
CN113453756A
CN113453756A CN201980083914.XA CN201980083914A CN113453756A CN 113453756 A CN113453756 A CN 113453756A CN 201980083914 A CN201980083914 A CN 201980083914A CN 113453756 A CN113453756 A CN 113453756A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
fragment
sequence
amino acid
optionally
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201980083914.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113453756B (zh
Inventor
艾伦·布兰得利
梁琪
李仪强
刘力颖
黄宇辉
陈彦举
陈立慈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kymab Ltd
Original Assignee
Kymab Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kymab Ltd filed Critical Kymab Ltd
Publication of CN113453756A publication Critical patent/CN113453756A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113453756B publication Critical patent/CN113453756B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(Proprotein Convertase Subtilisin Kexin type 9；PCSK9)拮抗剂，例如抗体和片段；以及方法、用途和组合。

Description

拮抗剂
技术领域
本发明涉及前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(Proprotein ConvertaseSubtilisin Kexin type 9；PCSK9)拮抗剂，例如抗体和片段；以及方法、用途和组合。
背景技术
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)为涉及调节低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor；LDLR)蛋白质的水平的丝氨酸蛋白酶(Horton等人，2007；Seidah和Prat，2007)。活体外实验已显示，添加PCSK9到HepG2细胞降低细胞表面LDLR的水平(Benjannet等人，2004；Lagace等人，2006；Maxwell等人，2005；Park等人，2004)。小鼠实验已显示，增加PCSK9蛋白水平降低肝脏中的LDLR蛋白的水平(Benjannet等人，2004；Lagace等人，2006；Maxwell等人，2005；Park等人，2004)，而PCSK9基因敲除小鼠在肝脏中的LDLR水平增加(Rashid等人，2005)。另外，已鉴别出各种导致增加或降低血浆LDL水平的人类PCSK9突变(Kotowski等人，2006；Zhao等人，2006)。PCSK9已显示直接与LDLR蛋白相互作用，与LDLR一起被吞噬，且在内体路径中与LDLR共免疫荧光(Lagace等人，2006)。
PCSK9为丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶(S8)家族中的前激素-前蛋白转化酶(Seidah等人，2003)。人类具有可在S8A和S8B子族之间划分的九种前激素-前蛋白转化酶(Rawlings等人，2006)。弗林(furin)、PC1/PC3、PC2、PACE4、PC4、PC5/PC6和PC7/PC8/LPC/SPC7归类于S8B子族中。来自小鼠弗林和PC1的不同域的晶体和NMR结构公开枯草杆菌蛋白酶样前域(pro-domain)和催化域，且P域直接位于催化域的C端(Henrich等人，2003；Tangrea等人，2002)。基于此子族内的氨基酸序列相似性，预测所有七个成员具有类似结构(Henrich等人，2005)。SKI-1/S1P和PCSK9归类于S8A子族中。与此些蛋白质的序列比较也表明存在枯草杆菌蛋白酶样前域和催化域(Sakai等人，1998；Seidah等人，2003；Seidah等人，1999)。在此些蛋白中，位于催化域的C端的氨基酸序列更可变，且并不表明P域的存在。
前激素-前蛋白转化酶以酶原形式表达，且其通过多步骤过程成熟。在此过程中，前域的功能为两倍。前域首先充当伴侣蛋白，且为催化域的适当折迭所需(Ikemura等人，1987)。一旦催化域折迭，那么在前域与催化域之间发生自催化。此初始裂解反应之后，前域仍与催化域结合，其接着充当催化活性的抑制剂(Fu等人，2000)。当条件恰当时，在前域内的位点处经第二自催化事件进行成熟(Anderson等人，1997)。在此第二裂解事件发生之后，前域和催化域解离，从而产生活性蛋白酶。
PCSK9酶原的自催化发生在Gln152与Ser153(VFAQ|SIP(SEQ ID NO:67))之间(Naureckiene等人，2003)，且已显示为其从细胞分泌所需(Seidah等人，2003)。尚未观测到在PCSK9的前域内的位点处的第二自催化事件。纯化的PCSK9由可通过非还原SDS-PAGE分离的两种物种制成；为17Kd的前域和65Kd的催化域加C端域。尚未分离出不具有其抑制性前域的PCSK9，且PCSK9的催化活性的测量值已为可变的(Naureckiene等人，2003；Seidah等人，2003)。
在某些实施例中，PCSK9多肽包含末端残基，例如(但不限于)前导序列残基、靶向残基、氨基端甲硫氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。“PCSK9”也已称为FH3、NARC1、HCHOLA3、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/克新(kexin)9型和神经凋亡调节转化酶1。PCSK9基因编码属于分泌枯草杆菌酶(subtilase)家族的蛋白酶K子族的前蛋白转化酶蛋白。术语“PCSK9”表示前蛋白和前蛋白自催化之后生成的产物两者。当仅提及自催化产物(例如与裂解PCSK9结合的抗原结合蛋白或配位体)时，蛋白可称为“成熟”、“裂解”、“经加工”或“活性”PCSK9。当仅提及非活性形式时，蛋白可称为PCSK9的“无活性”、“前形式”或“未加工”形式。术语PCSK9还涵盖并入PCSK9氨基酸序列的翻译后修饰的PCSK9分子，例如已经糖基化的PCSK9序列、信号序列已从其裂解掉的PCSK9序列、其前域已从催化域裂解但未与催化域分离的PCSK9序列(参见例如US20120093818A1的图1A和1B)。
PCSK9通过促进低密度脂蛋白(low-density lipoprotein；LDL)受体的溶酶体降解来控制所述受体在肝脏中的表达。PCSK9的抑制引起肝细胞LDL受体表达增加，且通过增加肝对LDL颗粒的清除而引起血浆胆固醇水平降低。在诊断患有对于士他汀(statin)治疗无反应的高脂质血症或高胆固醇血症的患者中，用针对PCSK9的单克隆抗体进行的治疗为临床上成功的治疗性干预。抗PCSK9抗体阿利库单抗(alirocumab)由RegeneronPharmaceuticals,Inc以PraluentTM商品名出售。抗PCSK9抗体依伏库单抗(evolocumab)由Amgen,Inc以RepathaTM商品名出售。
发明内容
在第一配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其包括与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括由来源于人类VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组的核苷酸序列编码的VH域，其中所述VH基因区段选自IGHV4-31、IGHV4-59、IGHV4-4和IGHV3-9。
在第二配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合且包括根据本发明的抗PCSK9抗体的CDRH3序列，或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列。
在第三配置中，本发明提供：
一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述序列。
在第四配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其包括与PCSK9特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VH域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
在第五配置中，本发明提供：
一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其包括与PCSK9特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括VL域，所述VL域由来源于人类VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码，其中所述VL基因区段选自IGKV3-11、IGKV2-28和IGKV2-29。
在第六配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合且包括本发明抗PCSK9抗体的CDRL3序列，包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRL3序列。
在第七配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合且包括VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述序列。
在第八配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其包括与PCSK9特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VL域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
在第九配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合且包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的重链氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
在第十配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合且包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的轻链氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
在第十一配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其与人类PCSK9表位特异性结合，所述表位与本发明抗体(例如CL-274711或CL-148219QLT)所结合的表位一致。
在第十二配置中，本发明提供：
一种抗体或片段，其与本发明抗体竞争与人类PCSK9结合。
在第十三配置中，本发明提供：
一种本发明的抗PCSK9抗体或片段，其用于治疗或预防个体的PCSK9介导的疾病或病状(任选地高脂质血症或高胆固醇血症)。
在第十四配置中，本发明提供：
一种一定量的抗PCSK9抗体或片段和一定量的士他汀的组合(任选地包括多个剂量的所述抗体和/或士他汀)，其中所述抗体或片段是根据本发明。
一种一定量的抗PCSK9抗体或片段和一定量的ANGPTL3抑制剂(例如抗ANGPTL3抗体，例如恩维纳单抗(evinacumab))的组合(任选地包括多个剂量的所述抗体和/或士他汀)，其中所述抗体或片段是根据本发明。任选地，所述组合还包括士他汀。
在第十五配置中，本发明提供：
一种本发明的抗体、片段或组合的用途，其用于制造用于向个体给药用来治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状，任选地高脂质血症或高胆固醇血症的药剂。
在第十六配置中，本发明提供：
一种治疗或预防个体的PCSK9介导的疾病或病状(任选地高脂质血症或高胆固醇血症)的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的本发明的抗体、片段或组合，其中由此治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状。
在第十七配置中，本发明提供：
一种药物组合物，其包括本发明的抗体、片段或组合，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在第十八配置中，本发明提供：
一种核酸，其编码本发明的抗体或片段的VH域和/或VL域
在第十九配置中，本发明提供：
一种核酸，其编码VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VH域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
在第二十配置中，本发明提供：
一种核酸，其编码本发明的抗体或片段的重链和/或轻链。
在第二十一配置中，本发明提供：
一种载体，其包括核酸；任选地其中所述载体为CHO或HEK293载体。
在第二十二配置中，本发明提供：
一种宿主细胞，其包括核酸或载体。
在第二十三配置中，本发明提供：
一种抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、用途或方法，其如本文所描述。
附图说明
图1：相对于基准测试抗体的CL-148219hPCSK9中和；
图2：相对于基准测试抗体，LDL吸收的CL-148219恢复；
图3：相对于基准测试抗体的CL-148219亲和力；
图4：相对于基准测试抗体的CL-148219血浆非HDL降低；
图5：相对于基准测试抗体的CL-148489hPCSK9中和；
图6：相对于基准测试抗体，LDL吸收的CL-148489恢复；
图7：相对于基准测试抗体的CL-148489亲和力；
图8：相对于基准测试抗体的CL-148489血浆非HDL降低；
图9：研究设计；
图10：总胆固醇；
图11：总非HDL胆固醇；
图12：HDL胆固醇；
图13：甘油三酯；
图14：磷脂和胆固醇概况；
图15：显示单一1mg/kg皮下剂量的CL-148219QLT、基准测试抗体F(市售抗体)或单一皮下剂量的10mg/kg同型对照对于APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠中的总胆固醇水平(±SEM)的效果，所述小鼠喂食含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食；
图16：显示单一3mg/kg皮下剂量的CL-148219QLT、基准测试抗体F或单一皮下剂量的10mg/kg同型对照对于APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠中的总胆固醇水平(±SEM)的效果，所述小鼠喂食含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食；
图17：显示单一10mg/kg皮下剂量的CL-148219QLT、基准测试抗体F或同型对照对于APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠中的总胆固醇水平(±SEM)的效果，所述小鼠喂食含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食；
图18：显示单一1mg/kg皮下剂量的CL-148219QLT，与1和3mg/kg剂量的基准测试抗体F对于APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠中的总胆固醇水平(±SEM)的效果的比较，所述小鼠喂食含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食；
图19：显示单一3mg/kg皮下剂量的CL-148219QLT，与3和10mg/kg剂量的基准测试抗体F对于APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠中的总胆固醇水平(±SEM)的效果的比较，所述小鼠喂食含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食；
图20：显示单一1mg/kg(A)、3mg/kg(B)或10mg/kg(C)皮下剂量的CL-148219QLT/基准测试抗体F，1和3mg/kg的CL-274711(A，B)或10mg/kg同型对照对于APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠中的非HDL胆固醇水平(±SEM)的效果，所述小鼠喂食含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食；
图21：单一1mg/kg(A)和3mg/kg(B)皮下剂量的CL-148219QLT，与1和3(A)或3和10mg/kg(B)剂量的基准测试抗体F对于APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠中的非HDL胆固醇水平(±SEM)的效果的比较，所述小鼠喂食含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食；
图22：显示在单一皮下1、3或10mg/kg剂量的基准测试抗体F/CL-148219QLT，3或10mg/kg的CL-274711或10mg/kg剂量的同型对照之后，APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠中的脂蛋白概况(A：VLDL胆固醇；B：VLDL磷脂；C：LDL胆固醇；D：LDL磷脂)，所述小鼠喂食含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食；和
图23：显示在单一3mg/kg皮下剂量的基准测试抗体F、CL-148219QLT或CL-274711之后，随着时间推移，雄性C57/Bl6小鼠中的抗体浓度(±SEM)。
图1.在活体外基于细胞的分析中，CL-148219使人类PCSK9内化神经化大于基准。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-148219存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlexTM流式细胞仪检测AF647的荧光信号。
图24.在活体外基于细胞的分析中，CL-148219使人类PCSK9内化神经化大于基准。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-148219存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlexTM流式细胞仪检测AF647的荧光信号。
图25：在活体外基于细胞的分析中，相比于基准，CL-148219增加的LDL吸收更优选。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-148219存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlex流式细胞仪检测BODIPY的荧光信号。
图26：CL-148219的亲和力。通过KD来确定亲和力。通过ProteonTM SPR分析系统，测量在pH7.6下，CL-148219针对人类和小鼠PCSK9的KD。
图27：在高脂质血症小鼠模型(E3L.CETP小鼠)中，相较于基准，CL-148219显示降低非HDL胆固醇的优良功能。E3L.CETP小鼠用西方饮食处理4周，随后进行抗体注射。在Ab注射后的不同时间，收集血液，且测量血浆HDL和总胆固醇的量。接着，通过从总胆固醇减去HDL来计算血浆非HDL胆固醇的量。
图28：在活体外基于细胞的分析中，CL-148219QLT使人类PCSK9内化神经化大于基准。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-148219QLT存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlex流式细胞仪检测AF647的荧光信号。
图29：在活体外基于细胞的分析中，相比于基准，CL-148219QLT增加的LDL吸收更优选。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-148219QLT存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlex流式细胞仪检测BODIPY的荧光信号。
图30：CL-148219QLT的亲和力。通过KD来确定亲和力。通过Proteon SPR分析系统，测量在pH7.6下，CL-148219QLT针对人类和小鼠PCSK9的KD。
图30：在高脂质血症小鼠模型(E3L.CETP小鼠)中，相较于基准，CL-148219QLT显示降低非HDL胆固醇的优良功能。E3L.CETP小鼠用西方饮食处理4周，随后进行抗体注射。在Ab注射后的不同时间，收集血液，且测量血浆HDL和总胆固醇的量。接着，通过从总胆固醇减去HDL来计算血浆非HDL胆固醇的量。
图32：在活体外基于细胞的分析中，CL-148489使人类PCSK9内化中等神经化。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-148489存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlex流式细胞仪检测AF647的荧光信号。
图33：在活体外基于细胞的分析中，相比于基准，CL-148489增加的LDL吸收更优选。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-148489存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlex流式细胞仪检测BODIPY的荧光信号。
图34：CL-148489的亲和力。通过KD来确定亲和力。通过Proteon SPR分析系统，测量在pH7.6下，CL-148489针对人类和小鼠PCSK9的KD。
图35：在高脂质血症小鼠模型(E3L.CETP小鼠)中，相较于基准，CL-148489显示降低非HDL胆固醇的优良功能。E3L.CETP小鼠用西方饮食处理4周，随后进行抗体注射。在Ab注射后的不同时间，收集血液，且测量血浆HDL和总胆固醇的量。接着，通过从总胆固醇减去HDL来计算血浆非HDL胆固醇的量。
图36：在活体外基于细胞的分析中，CL-274698使人类PCSK9内化神经化大于基准。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-274698存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlex流式细胞仪检测AF647的荧光信号。
图37：在活体外基于细胞的分析中，相比于基准，CL-274698增加的LDL吸收更优选。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-274698存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlex流式细胞仪检测BODIPY的荧光信号。
图38：CL-274698的亲和力。通过KD来确定亲和力。通过Proteon SPR分析系统，测量在pH7.6下，CL-274698针对人类和小鼠PCSK9的KD。
图39：在高脂质血症小鼠模型(E3L.CETP小鼠)中，相较于基准，CL-274698显示降低非HDL胆固醇的优良功能。E3L.CETP小鼠用西方饮食处理4周，随后进行抗体注射。在Ab注射后的不同时间，收集血液，且测量血浆HDL和总胆固醇的量。接着，通过从总胆固醇减去HDL来计算血浆非HDL胆固醇的量。
图40：在活体外基于细胞的分析中，CL-274711使人类PCSK9内化神经化大于基准。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-274711存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlex流式细胞仪检测AF647的荧光信号。
图41：在活体外基于细胞的分析中，相比于基准，CL-274711增加的LDL吸收更优选。HepG2细胞在同型对照、基准或CL-274711存在下，用经AF647标记的人类PCSK9功能获得型突变体处理，随后用BODIPY LDL处理。接着，收集细胞，且通过CytoFlex流式细胞仪检测BODIPY的荧光信号。
图42：CL-274711的亲和力。通过KD来确定亲和力。通过Proteon SPR分析系统，测量在pH7.6下，CL-274711针对人类和小鼠PCSK9的KD。
图43：在高脂质血症小鼠模型(E3L.CETP小鼠)中，相较于基准，CL-274711显示降低非HDL胆固醇的优良功能。E3L.CETP小鼠用西方饮食处理4周，随后进行抗体注射。在Ab注射后的不同时间，收集血液，且测量血浆HDL和总胆固醇的量。接着，通过从总胆固醇减去HDL来计算血浆非HDL胆固醇的量。
具体实施方式
定义
除非本文中另外定义，否则科学和技术术语应具有所属领域中的一般技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包含复数且复数术语应包含单数。
除非上下文另外明确指示，否则单数术语“一(a/an)”和“所述(the)”包含多个指示物。类似地，除非上下文另外明确指示，否则词语“或”打算包含“和”。尽管类似或等效于本文所描述的那些的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁语例如(exempli gratia)，且在本文中用以指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
在说明书和权利要求书中，术语“约”用于修饰例如以下的数量：组合物中的成分、浓度、体积、处理温度、处理时间、产量、流速、压力和类似值和其范围，所述值和范围用于描述本发明的实施例。术语“约”是指数值数量例如可通过以下所发生的变化：通过通常测量和用于制备化合物、组合物、浓缩物的操作程序或使用调配物；通过此些程序中的无意误差；通过用于进行所述方法的起始材料或成分的制造、来源或纯度上的差异；以及类似考虑因素。术语“约”还涵盖归因于调配物的老化而与特定初始浓度或混合物不同的量，和归因于混合或处理调配物而与特定初始浓度或混合物不同的量。当通过术语“约”修饰时，在此随附的权利要求书包含此些量的等效物。
如本文所用，“给药(administer/administration)”是指注射或以其它方式将如存在于体外的物质(例如本文提供的抗hPCSK9抗体)物理地递送到患者的动作，例如通过黏膜、皮内、静脉内、肌肉内递送，和/或本文所描述或所属领域中已知的任何其它物理学递送方法。当治疗疾病或其症状时，物质的给药通常发生在疾病或其症状发作之后。当预防疾病或其症状时，物质的给药通常发生在疾病或其症状发作之前。
术语“抗体”、“免疫球蛋白”或“Ig”可在本文中互换使用，且意谓通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别目标(例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂质或前述的组合)且与所述目标特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(例如双特异性抗体(包含双重结合抗体))、嵌合抗体、人类化抗体、人类抗体、包括抗体的抗原决定部分的融合蛋白，和任何其它包括抗原识别位点的经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体呈现所需生物活性即可。术语“抗体”也可指分子量为大致150kDa，由以下四条多肽链构成的Y形糖蛋白：两条轻(L)链和两条重(H)链。存在五种类型的哺乳动物Ig重链同型，由希腊字母alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)表示。重链的类型定义抗体的类别，即分别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。基于恒定域序列和功能的差异，γ和α类别进一步分成子类，例如IgG1、hIgG2、mIgG2A、mIgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在哺乳动物中，存在两种类型的免疫球蛋白轻链，λ和κ。抗体的“可变区”或“可变域”是指抗体的重链或轻链的氨基端域。重链和轻链的可变域可分别称为“VH”和“VL”。此些域一般为抗体的最可变部分(相对于相同类别的其它抗体来说)且含有抗原结合位点。抗体的实例为仅重链(即H2)抗体，其包括重链(5′-VH-(任选的铰链)-CH2-CH3-3′)的二聚体且不含轻链。
本文所描述的抗体可为寡克隆、多克隆、单克隆(包含全长单克隆抗体)、骆驼源化、嵌合、CDR移植、多特异性、双特异性(包含双重结合抗体)、催化、嵌合、人类化、完全人类、抗个体基因型抗体，包含可单独或与通过已知技术提供的其它氨基酸序列组合，以可溶或结合形式标记的抗体以及其片段、变体或衍生物。抗体可来自任何物种。本文所描述的抗体可为裸抗体或与例如毒素、放射性同位素等其它分子结合。
术语“抗原结合位点”、“抗原结合域”、“抗原结合区”、“抗原结合片段”和类似术语是指抗体中包括与抗原相互作用的氨基酸残基且赋予结合剂其针对抗原(例如互补决定区(CDR))的特异性和亲和力的部分。抗原结合区可来源于任何动物物种，例如啮齿动物(例如兔、大鼠或仓鼠)和人类。优选地，抗原结合区将为人源性的。
本文所描述的抗原结合片段可包含单链Fv(scFv)、单链抗体、单域抗体、域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、呈现所需生物活性的抗体片段、二硫键稳定的可变区(dsFv)、二聚体可变区(双功能抗体)、抗个体基因型(抗Id)抗体(包含例如针对抗体的抗Id抗体)、胞内抗体、线性抗体、单链抗体分子，和由抗体片段与以上中的任一种的表位-结合片段形成的多特异性抗体。确切来说，本文所描述的抗体和抗体片段可包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有抗原结合位点的分子。用酶(番木瓜蛋白酶)消化抗体，产生两个相同的抗原结合片段(也称为“Fab”片段和“Fc”片段)，所述两个抗原结合片段无抗原结合活性但具有结晶能力。当在本文中使用时，“Fab”是指包含重链和轻链中的每一个的一个恒定域和一个可变域的抗体片段。术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包含原生序列Fc区和变异Fc区。“Fc片段”是指通过二硫键结合在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应功能由Fc区中的序列决定，所述区也由在某些类型的细胞上所发现的Fc受体(FcR)识别。通过酵(胃蛋白酶)消化抗体，产生F(ab′)2片段，其中抗体分子的两个臂保持键联且包括两个抗原结合位点。F(ab′)2片段具有交联抗原的能力。
关于基因区段，术语“来源于...的重组”将对于熟练技术人员容易地显而易见，其应理解，B细胞重组其可变区基因区段，以产生可变域的编码序列。举例来说，“来源于人类VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组”涉及将一个人类VH基因区段与一个DH基因区段和一个JH基因区段重组在一起，以形成编码重链抗体可变域的重排VDJ序列。连接和体细胞超突变也可为所述过程的特征，由此所得重组VDJ序列包含生殖系V、D和J序列不包括的一个或多个核苷酸添加、取代或缺失(例如p添加和/或n添加)。等效物将表述为κ轻链可变域的Vκ和Jκ基因区段，和λ轻链可变域的Vλ和Jλ。打算，可变域中可另外涵盖任何翻译后修饰。
当在本文中使用时，“Fv”是指抗体中保留抗原识别位点和抗原结合位点两者的最小片段。此区由紧密非共价或共价结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成。在此配置中，各可变域的三个CDR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同地赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单一可变域(或仅包括三个对抗原具有特异性的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，但亲和力比整个结合位点低。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指获自大体上均质抗体的群体的抗体，即除可能天然存在的突变和/或可能少量存在的翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，包括群体的个别抗体为一致的。单克隆抗体为高度特异性的且针对单一抗原决定子或表位。相比之下，多克隆抗体制剂通常包含针对不同抗原决定子(或表位)的不同抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(scFv)突变体、包括抗体部分的融合蛋白，和包括抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以多种方式产生的此类抗体，包含(但不限于)融合瘤、噬菌体选择、重组表达和转殖基因动物。
单克隆抗体在本文中可包含“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类别的抗体中的对应序列一致或与其同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的对应序列一致或与其同源，以及呈现所需生物活性的此类抗体的片段。
术语“人源化抗体”是指嵌合抗体的子集，其中来自非人类免疫球蛋白(供体抗体)的“高变区”置换来自人类免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区的残基。一般来说，人类化抗体将包含大体上所有至少一个且通常两个可变域，其中所有或大体上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白序列的那些高变环，且所有或大体上所有构架区为人类免疫球蛋白序列的那些构架区，但构架区可包含改进抗体性能，例如结合亲和力、异构化、免疫原性等的一个或多个取代。
术语“双特异性抗体”意谓包括针对两种目标分子的特异性且包含(但不限于)例如以下型式的抗体：DVD-Ig(参见DiGiammarino等人,“《用于双重特异性靶向的DVD-IgTM分子的设计和产生(Design and generation of DVD-IgTM molecules for dual-specifictargeting)》”,《分子生物学方法(Meth.Mo.Biol.)》2012,889,145-156)；mAb2(参见WO2008/003103，mAb2型式的描述以引用的方式并入本文中)；FIT-Ig(参见WO2015/103072，FIT-Ig骨架的描述以引用的方式并入本文中)；mAb-dAb；锁钥结构(dock and lock)；Fab-臂交换；SEED体；三功能单抗；LUZ-Y；Fcab；κλ体；正交Fab；sc双功能抗体(diabody)-Fc；双功能抗体-Fc；串联scFv-Fc；Fab-scFv-Fc；Fab-scFv；胞内抗体；BiTE；双功能抗体；DART；TandAb；sc双功能抗体；sc双功能抗体-CH3；双功能抗体-CH3；三重体(Triple body)；微型抗体(Miniantibody)；微型抗体(minibody)；TriBi微型抗体；scFv-CH3 KIH；scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv；scFv-KIH；Fab-scFv-Fc；四价HCab；ImmTAC；杵-臼；具有共有轻链的杵-臼；具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼；DT-IgG；DutaMab；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFv-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；和zy体。关于双特异性型式的综述，参见Spiess,C.等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》(2015)。在另一实施例中，双特异性分子包括与另一非Ig型式融合的抗体，所述另一非Ig型式例如：T细胞受体结合域；免疫球蛋白超家族域；阿格纳森(agnathan)可变淋巴球受体；纤维结合蛋白域(例如AdnectinTM)；抗体恒定域(例如CH3域，例如FcabTM的CH2和/或CH3)，其中恒定域不为功能性CH1域；scFv；(scFv)2；sc-双功能抗体；scFab；来源于选自CTLA-4(EvibodyTM)的骨架的生替林(centyrin)和表位结合域；脂质运载蛋白域；蛋白A，例如蛋白A的Z域(例如AffibodyTM或SpA)；A域(例如AvimerTM或MaxibodyTM)；热休克蛋白(例如和来源于GroEI和GroES的表位结合域)；运铁蛋白域(例如反式体(trans-body))；锚蛋白重复蛋白质(例如DARPinTM)；肽适体；C型凝集素域(例如TetranectinTM)；人类γ-晶体蛋白或人类泛素(阿菲林(affilin))；PDZ域；蝎毒素；和人类蛋白酶抑制剂的孔尼兹(kunitz)类型域。关于杵-臼技术的非限制性实例，参见例如US5,731,568和WO98/50431(两者以引用的方式并入本文中)。
原理为，工程改造杂二聚体重链的成对CH3域，使得一个CH3域含有“杵”且另一个CH3域在空间上相反位置处含有“臼”。杵通过在CH3域之间的界面处置换小氨基酸侧链产生，而臼通过用较小者置换较大侧链产生。杵设计成插入到臼中，以有利于不同CH3域的杂二聚作用同时使均二聚体形成去稳定化。在组装形成双特异性抗体的抗体重链和轻链的混合物中，因此增加具有成对杂二聚体重链的IgG分子的比例，从而提高活性分子的产量和回收率
可包含突变Y349C和/或T366W，以在IgG CH3域中形成“杵”。可包含突变E356C、T366S、L368A和/或Y407V，以在IgG CH3域中形成“臼”。可将杵和臼引入到任何人类IgG CH3域中，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3域。优选实例为IgG4。如所提及，IgG4可包含其它修饰，例如“P”和/或“E”突变。a型IgG4(“ra”)序列含有取代Y349C和T366W(“杵”)，且b型IgG4(“γb”)序列含有取代E356C、T366S、L368A和Y407V(“臼”)。ra和γb两者也在铰链中的位置228处含有“P”取代(S228P)，以使重链的铰链区稳定。ra和γb两者也在CH2区中在位置235处含有“E”取代(L235S)，以消除与FcγR的结合。因此，IgG4-PE重链的相关序列为ppcpPcpapefEggps。
双特异性IgG工程改造中的其它进展为使用共有轻链的想法，如WO98/50431中所描述。描述包括两个重链-轻链对的双特异性抗体，其中两个重链-轻链对的可变轻链具有共有序列。WO98/50431描述将共有轻链方法与重链杂二聚作用界面中的特异性互补相互作用(例如杵-臼)组合，以促进杂二聚体形成且妨碍均二聚体形成。组合起来，相对于非所需杂二聚体和均二聚体，此些方法增强所需杂二聚体的形成。
尽管杵-臼技术涉及工程改造氨基酸侧链以在双特异性杂二聚体中的成对CH3域的界面处产生互补分子形状，但促进杂二聚体形成且妨碍均二聚体形成的另一方式为工程改造氨基酸侧链以具有相反电荷。重链杂二聚体中的CH3域的结合有利于带相反电荷残基的配对，而成对正电荷或成对负电荷将使得均二聚体形成在能量上不那么有利。WO2006/106905描述一种用于产生由多于一种类型的多肽(例如两条不同抗体重链的杂二聚体)构成的杂多聚体的方法，所述杂多聚体在氨基酸残基中包括取代，从而在所述多肽之间形成界面，使得杂多聚体结合将受到调节，所述方法包括：
(a)修饰编码在从初始核酸的多肽之间形成界面的氨基酸残基的核酸，使得形成一个或多个多聚体的多肽之间的结合将在可形成两种或更多种多聚体类型的杂多聚体中受到抑制；
(b)培养宿主细胞，使得表达通过步骤(a)经修饰的核酸序列；和
(c)从宿主细胞培养物回收所述杂多聚体，
其中步骤(a)的修饰为修饰初始核酸，使得在界面处的一个或多个氨基酸残基被取代，使得形成界面的两个或更多个氨基酸残基(包含突变残基)将携带相同类型的正或负电荷。
此的实例为通过在重链均二聚体的界面处引入静电排斥来抑制重链之间的结合，例如通过修饰在CH3域的界面处彼此接触的氨基酸残基，所述氨基酸残基包含：
位置356和439
位置357和370
位置399和409，
残基编号是根据EU编号系统。
通过修饰此些残基对中的一个或多个以在第一重链的CH3域中具有类似电荷(两个均为正电荷或两个均为负电荷)，重链均二聚体的配对受静电排斥抑制。通过工程改造第二(不同)重链的CH3域中的相同残基对或残基对以相较于第一重链中的对应残基具有相反电荷，第一与第二重链的杂二聚体配对受静电引力促进。
重链恒定区CH3界面处的氨基酸被修饰，以引入电荷对，所述突变在WO2006/106905的表1中列出。据报道，修饰在重链位置356、357、370、399、409和439处的氨基酸，以在CH3界面处引入电荷诱导的分子排斥，具有增加形成预期双特异性抗体功效的效果。举例来说，一个重链恒定区可为含有突变K439E(带正电Lys被带负电Glu置换)的IgG4恒定区，且另一重链恒定区可为含有突变E356K(带负电Glu被带正电Lys置换)的IgG4恒定区，使用EU编号。“电荷配对”由从此两个恒定区的杂二聚作用所组装的Fc区中的残基439和356空间邻近性产生。
当使用两个不同重链恒定区时，此些可在任一取向上与抗体的两个不同VH域连接。
WO2006/106905还例示双特异性IgG抗体，其中IgG4的CH3域被工程改造具有杵-臼突变。a型a型(IgG4γa)为在Y349C和T366W处被取代的IgG4，且b型(IgG4γb)为在E356C、T366S、L368A和Y407V处被取代的IgG4。
在另一实例中，抗体VH和VL域中的电荷对的引入用于抑制“不正确”VH-VL对(来自一个抗体的VH与另一抗体的VL配对)的形成。在一个实例中，将VH和VL中的Q残基改变成K或R(正)或改变成E或D(负)，以抑制Q侧链之间的氢键键且和引入静电排斥。
电荷对的其它实例在WO2013/157954中公开，其描述一种用于从单一细胞产生包括杂二聚体CH3域的分子的方法，所述分子包括能够形成界面的两个CH3域。所述方法包括在细胞中提供
(a)编码包括第一CH3域的多肽链的第一核酸分子，根据EU编号系统，此链在位置366处包括K残基，和
(b)编码包括第二CH3域的多肽链的第二核酸分子，根据EU编号系统，此链在位置351处包括D残基，
所述方法进一步包括培养宿主细胞的步骤，从而允许表达两个核酸分子和从培养物收获包括杂二聚体CH3域的分子。
在WO2011/143545中描述在多肽链中工程改造静电相互作用以相对于均二聚体形成促进杂二聚体形成的其它方法。
在CH3-CH3界面处工程改造的另一实例为链交换工程改造的域(SEED)CH3杂二聚体。CH3域由人类IgA和IgG CH3序列的交替区段构成，所述区段形成互补SEED杂二聚体对，称为“SEED体”[WO2007/110205]。
也已产生具有杂二聚化重链的双特异性抗体，所述杂二聚化重链在CH3域中进行不同修饰以改变其与纯化试剂(例如蛋白A)的结合的亲和力。WO2010/151792描述一种杂二聚体双特异性抗原结合蛋白，其包括
第一多肽，其从N端到C端包括选择性地结合第一表位的第一表位结合区、包括选自IgG1、IgG2和IgG4的人类IgG的第一CH3区的免疫球蛋白恒定区；和第二多肽，其从N端到C端包括选择性地结合第二表位的第二表位结合区、包括选自IgG1、IgG2和IgG4的人类IgG的第二CH3区的免疫球蛋白恒定区，其中第二CH3区包括降低或消除第二CH3域与蛋白A的结合的修饰。
因此，Fc区可包括一个或多个突变，以促进从均二聚体物种差异纯化出活性杂二聚体。一个重链恒定区的CH3可包含突变His435Arg和/或Tyr436Phe(EU编号)[]，而另一重链恒定区的CH3缺乏所述突变。举例来说，艾美赛珠单抗(Emicizumab)包括Fc区，其中一个CH3包括His435且另一个CH3包括His435Arg。
本发明的双特异性抗体可视需要采用此些双特异性技术和分子型式中的任一种。
在一个实施例中，双特异性抗体为mAb2。mAb2包括来自与经修饰的恒定区融合的完整抗体的VH和VL域，其已经工程改造以形成抗原结合位点，被称为“Fcab”。Fcab/mAb2型式后的技术更详细地描述于WO2008/003103中，且mAb2型式的描述以引用的方式并入本文中。
在另一实施例中，双特异性抗体为“双重结合抗体”。如本文所用，术语“双重结合抗体”为双特异性抗体，其中两个抗原结合域通过VH/VL配对形成，且包含以下：FIT-Ig(参见WO2015/103072，以引用的方式并入本文中)；mAb-dAb；锁钥结构；Fab-臂交换；SEED体；三功能单抗；LUZ-Y；Fcab；κλ体；正交Fab；sc双功能抗体-Fc；双功能抗体-Fc；串联scFv-Fc；Fab-scFv-Fc；Fab-scFv；胞内抗体；BiTE；双功能抗体；DART；TandAb；sc双功能抗体；sc双功能抗体-CH3；双功能抗体-CH3；三重体；微型抗体(Miniantibody)；微型抗体(minibody)；scFv-CH3 KIH；scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv；scFv-KIH；Fab-scFv-Fc；四价HCab；ImmTAC；杵-臼；具有共有轻链的杵-臼；具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼；DT-IgG；DutaMab；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFv-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv和scFv4-Ig。
术语“高变区”、“CDR区”或“CDR”是指抗体可变域中序列具有高变性和/或形成结构上限定的环的区域。一般来说，抗体的抗原结合位点包含六个高变区：三个在VH中(CDRH1、CDRH2、CDRH3)，且三个在VL中(CDRL1、CDRL2、CDRL3)。抗体重链和轻链的此些区赋予抗体抗原结合特异性。CDR可根据Kabat系统定义(参见Kabat,E.A.等人,1991,“《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》”,第5版,NIH公开第91-3242号,美国卫生与人群服务部(U.S.Department of Health and HumanServices))。其它系统可用于定义CDR，如以下系统：通过Chothia等人设计的系统(参见Chothia,C.&Lesk,A.M.,1987,“《免疫球蛋白高变区的典型结构(Canonical structuresfor the hypervariable regions of immunoglobulins)》”,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,196,901-917)和IMGT系统(参见Lefranc,M.P.,1997,“《免疫遗传分析的独特数据库编号系统(Unique database numbering system for immunogeneticanalysis)》”,《当今免疫学(Immunol.Today)》,18,50)。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。术语一个或多个CDR在此用于指示此些区中的一个或数个。所属领域中的熟练技术人员能够容易地比较不同命名系统且确定是否可将特定序列定义为CDR。
“人类抗体”为拥有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或已使用用于制备人类抗体的任一种技术制备的抗体，且确切来说排除包括非人类抗原结合残基的人类化抗体。术语“与...特异性结合”是指可测量和可再现的相互作用，例如目标与抗体之间的结合，其在分子，包含生物分子的异质群存在下由目标的存在决定。举例来说，与目标(其可为表位)特异性结合的抗体为以比其与其它目标结合更高的亲和力、亲和性、容易性和/或持续时间结合此目标的抗体。在一个实施例中，抗体与无关目标结合的程度小于约抗体与目标结合的10％，如例如通过放射免疫分析(radioimmunoassay；RIA)测量。
与hPCSK9抗原特异性结合的抗体或其片段可与相关抗原具有交叉反应性。优选地，与hPCSK9抗原特异性结合的抗体或其片段不与其它抗原交叉反应(但可任选地与不同物种(例如恒河猴或鼠类)的PCSK9交叉反应)。可例如通过免疫分析、BIAcoreTM或所属领域中的熟练技术人员已知的其它技术，来鉴别出与hPCSK9抗原特异性结合的抗体或其片段。在抗体或其片段以比与任何交叉反应性抗原更高的亲和力与hPCSK9抗原结合时，如使用实验技术(例如放射免疫分析(radioimmunoassay；RIA)和酶联免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbent assays；ELISA))所测定，所述抗体或其片段与PCSK9抗原特异性结合。通常，特异性或选择性反应将为背景信号或噪声的至少两倍，且更通常大于背景的10倍(例如大于15倍、大于20倍、大于50倍或大于100倍)。关于抗体特异性的论述，参见例如Paul编,1989,《基础免疫学第二版(Fundamental Immunology Second Edition)》,Raven Press,纽约,第332-336页。
术语“脂肪族氨基酸”意谓，氨基酸R基团为非极性和疏水性的。疏水性随着烃链中的C原子数目增加而增加。甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸和异白氨酸为脂肪族氨基酸。
术语“芳香族氨基酸”意谓，氨基酸R基团含有芳环系统。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸为芳香族氨基酸。
术语“含羟基氨基酸”意谓，氨基酸R基团含有羟基且为亲水性的。丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸为含羟基氨基酸。
术语“碱性氨基酸”意谓，氨基酸R基团为含氮的且在中性pH下为碱性的。组氨酸、赖氨酸和精氨酸为碱性氨基酸。
术语“环状氨基酸”意谓，氨基酸R基团具有脂肪族环状结构。脯氨酸为唯一的环状脂肪族氨基酸。
术语“酸性氨基酸”意谓，氨基酸R基团为极性的且于生理pH下带负电。天冬氨酸和谷氨酸为酸性氨基酸。
术语“酰胺氨基酸”意谓，氨基酸R基团含有酰氨基。天冬酰胺和谷氨酰胺为酰胺氨基酸。
如本文所使用，“授权编号”或“销售授权编号”是指通过监管机构在所述机构确定特定医学产物和/或组合物可在所述机构的司法管辖权下的区域中出售和/或提供用于销售时颁予的编号。如本文所使用，“监管机构”是指负责评价(例如医学产物和/或组合物的安全性和功效)和控制此类产物和/或组合物在既定区域中的出售/销售的机构中的一种。美国的食品与药物管理局(Food and Drug Administration；FDA)和欧洲的欧洲药物管理局(European Medicines Agency；EPA)仅为此类监管机构的两个实例。其它非限制性实例可包含SDA、MPA、MHPRA、IMA、ANMAT、中华人民共和国香港特别行政区卫生署药物办公室、CDSCO、Medsafe和KFDA。
如本文所用，“缓冲剂”是指能够吸收某一数量的酸或碱而pH不进行强变化的化学剂。
如本文所用，术语“载体”是指与治疗剂一起给药的稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(Freund′sadjuvant)(完全和不完全))、赋形剂或媒剂。此类医药学载体可为无菌液体，例如水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和其类似物。当静脉内给药药物组合物时，水为优选的载体。还可采用盐水溶液和右旋糖与甘油水溶液作为液体载体，尤其用于可注射溶液。
如本文所用，术语“组合物”打算涵盖含有任选地规定量的规定成分(例如本发明抗体)的产物，以及由任选地规定量的规定成分的组合直接地或间接产生的任何产物。
如本文所用，术语“包括(comprising/comprises)”在提及抗体、片段、用途、组合物、方法和其各别组分时使用，所述各别组分对于所述方法或组合物来说为必需的，而对于未指定的要素纳入来说为开放的，不论其必需与否。
术语“由...组成”是指如本文所描述的抗体、片段、用途、组合物、方法和其各别组分，其排除实施例的所述描述中未叙述的任何要素。
如本文所用，术语“基本上由…组成”是指既定实施例所需的那些要素。所述术语准许并不显著影响彼实施例的基本的和新颖的或功能性特征的要素的存在。
在多肽的情形下，如本文所用，术语“衍生物”包含包括以下的氨基酸序列的多肽：hPCSK9多肽、hPCSK9多肽的片段或与hPCSK9多肽特异性结合的抗体或片段，所述衍生物多肽已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加改变。如本文所用，术语“衍生物”还包含已例如通过将任何类型的分子与多肽共价连接进行化学修饰的hPCSK9多肽、hPCSK9多肽的片段或与hPCSK9多肽特异性结合的抗体。举例来说但无限制性，hPCSK9多肽、hPCSK9多肽的片段或hPCSK9抗体可例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/封端基团进行的衍生化、蛋白质裂解、与细胞配位体或其它蛋白质的连接等进行化学修饰。衍生物以与天然存在的或起始肽或多肽不同(在所连接的分子的类型或位置方面)的方式修饰。衍生物进一步包含天然存在于肽或多肽上的一个或多个化学基团的缺失。hPCSK9多肽、hPCSK9多肽的片段或hPCSK9抗体的衍生物可通过化学修饰，使用所属领域中的熟练技术人员已知的技术来进行化学修饰，所述技术包含(但不限于)特异性化学裂解、乙酰化、调配、衣霉素的代谢合成等。此外，hPCSK9多肽、hPCSK9多肽的片段或hPCSK9抗体的衍生物可含有一个或多个非经典氨基酸。多肽衍生物拥有与本文所描述的hPCSK9多肽、hPCSK9多肽的片段或hPCSK9抗体类似或相同的功能。
如本文所用，术语“效应功能(effector function)”(或“具效应子功能(effector-enabled)”)是指以下中的一种或多种：抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性(antibody dependant cell mediated cytotoxic activity；ADCC)、补体依赖性细胞毒活性(complement-dependant cytotoxic activity；CDC)介导的反应、Fc介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody dependant cellular phagocytosis；ADCP)和抗体通过FcRn受体的再循环。
“有效量”是指在所需剂量和时间段下，可有效达成所需效果，包含治疗或预防结果的量。“治疗有效量”是指实现可测量改进或预防特定病症所需的最小浓度。本文中的治疗有效量可根据例如以下的因素而变化：患者的疾病状态、年龄、性别和体重，和抗体引起个体中的所需反应的能力。治疗有效量也为抗体的治疗有利效果超过其毒性或不利效果的量。“预防有效量”是指在所需剂量和时间段下，可有效达成所需预防结果的量。在一些实施例中，本发明抗体的有效量为约0.1mg/kg(mg抗体/kg个体重量)到约100mg/kg。在某些实施例中，其中提供的抗体的有效量为约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg(或其中的范围)。在一些实施例中，如本文所用，“有效量”也指本发明抗体达成规定结果(例如抑制细胞的hPCSK9生物活性)的量。
如本文所用，术语“表位”是指抗原表面上的局部化区，例如hPCSK9多肽或hPCSK9多肽片段，所述区域能够与抗体的一个或多个抗原结合区结合，且在动物中，优选地哺乳动物，且最优选地在人类中具有抗原或免疫原性活性，即能够引起免疫反应。具有免疫原性活性的表位为在动物中引起抗体反应的多肽的一部分。具有抗原活性的表位为抗体与其特异性结合的多肽的一部分，如通过所属领域中熟知的任何方法所测定，例如通过本文所描述的免疫分析。抗原性表位无需必须为免疫原性。表位通常由化学活性表面分子群组(例如氨基酸或糖侧链)组成，且通常具有特定三维结构特征以及荷质比特征。促成表位的多肽区域可为多肽的连续氨基酸，或表位可由多肽的两个或更多个非连续区域聚集在一起。表位可为或可不为抗原的三维表面特征。在某些实施例中，hPCSK9表位为hPCSK9多肽的三维表面特征(例如呈hPCSK9多肽的三聚合形式)。在其它实施例中，hPCSK9表位为hPCSK9多肽的线性特征(例如呈hPCSK9多肽的三聚合形式或单体形式)。本文所提供的抗体可与以下特异性结合：hPCSK9的单体(变性)形式的表位、hPCSK9的三聚合(原生)形式的表位，或hPCSK9的单体(变性)形式和三聚合(原生)形式两者。在特定实施例中，本文所提供的抗体与hPCSK9的三聚合形式的表位特异性结合，但不特异性结合hPCSK9的单体形式。
如本文所用，术语“赋形剂”是指惰性物质，其常用作药物的稀释剂、媒剂、防腐剂、黏合剂或稳定剂，且包含但不限于蛋白质(例如血清白蛋白等)、氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)、脂肪酸和磷脂(例如磺酸烷基酯、辛酸酯等)、表面活性剂(例如SDS、聚山梨醇酯、非离子性表面活性剂等)、糖(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)和多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇、等)。还参见《雷明顿氏药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)》(1990)Mack Publishing Co.,宾夕法尼亚州，伊斯顿，其以全文引用的方式并入本文中。
如本文所使用，“授权编号”或“销售授权编号”是指通过监管机构在所述机构确定特定医学产物和/或组合物可在所述机构的司法管辖权下的区域中出售和/或提供用于销售时颁予的编号。如本文所用，“监管机构”是指负责评价(例如医学产物和/或组合物的安全性和功效)和控制此类产物和/或组合物在既定区域中的出售/销售的机构中的一种。美国的食品与药物管理局(FDA)和欧洲的欧洲药物管理局(EPA)仅为此类监管机构的两个实例。其它非限制性实例可包含SDA、MPA、MHPRA、IMA、ANMAT、中华人民共和国香港特别行政区卫生署药物办公室、CDSCO、Medsafe和KFDA。
如本文所用，“注射装置”是指设计用于进行注射的装置，注射包含暂时流体偶联所述注射装置到人的组织(通常皮下组织)的步骤。注射进一步包含给药一定量的液体药物到组织中且从所述组织去解偶联或去除所述注射装置。在一些实施例中，注射装置可为静脉内装置或IV装置，其为当目标组织为循环系统内的血液(例如静脉中的血液)时使用的注射装置的类型。注射装置的常见但非限制性实例为针和注射器。
如本文所用，“缓冲剂”是指能够吸收某一数量的酸或碱而pH不进行强变化的化学剂。
如本文所用，“包装”是指如何将组分组织和/或约束到适于分配和/或使用的单元中。包装可包含例如盒、袋、注射器、安瓿、小瓶、试管、贝壳掀盖式包装、屏障和/或容器以维持无菌性、标记等。
如本文所用，“说明书”是指制品的实时容器上显示的书面、印刷或图形事项，例如显示于含有药物活性剂的小瓶上的书面材料或包含于含有所关注的组合物的试剂盒中的关于组合物和产物的用途的详情。说明书阐述给药或进行如预期的治疗的方法。
在肽或多肽的情形下，如本文所用，术语“片段”是指包括小于全长氨基酸序列的肽或多肽。此类片段可例如来源于氨基端处的截断、羧基端处的截断，和/或来自氨基酸序列的残基的内部缺失。片段可例如来源于替代性RNA剪接或活体内蛋白酶活性。在某些实施例中，PCSK9片段包含多肽，所述多肽包括具有以下的氨基酸序列：hPCSK9多肽或与hPCSK9多肽特异性结合的抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基。在一特定实施例中，hPCSK9多肽或与hPCSK9抗原特异性结合的抗体的片段保留所述多肽或抗体的至少1个、至少2个或至少3个功能。
术语“游离”可以指与缓冲液组合的多肽，例如PCSK9或其片段和变体，其中所述多肽不与细胞表面或细胞膜结合。因此，术语“游离”可以指能够表面表达(即，包含一个或多个跨膜域或膜结合域)但以其存在状态不在细胞表面上表达或与细胞表面上表达的蛋白质结合的多肽。游离多肽也可指游离重组或原生或未结合多肽。在噬菌体呈现的情形下，可在溶液中选择游离抗原(在本文中称为“可溶性选择”)或将游离抗原吸附到表面，例如吸附到96孔盘的表面(在本文中称为“生物淘选选择”)。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指包括抗体的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(即，通常不为抗体(例如非抗PCSK9抗原抗体)的一部分的多肽或蛋白质)的氨基酸序列的多肽。当关于PCSK9或抗PCSK9抗体使用时，术语“融合”是指将肽或多肽或其片段、变体和/或衍生物与异源肽或多肽接合。优选地，融合蛋白保留PCSK9或抗PCSK9抗体的生物活性。在某些实施例中，融合蛋白包括PCSK9抗体VH域、VL域、VH CDR(一个、两个或三个VH CDR)和/或VL CDR(一个、两个或三个VL CDR)，其中融合蛋白与PCSK9表位特异性结合。
当提及抗体使用时，基于重链恒定域的氨基酸序列，术语“重链”是指五种不同类型，称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。此些不同类型的重链为熟知的且产生抗体的五种类别，分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包含IgG的四个子类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。优选地，重链为人类重链。在人类群体中，存在各免疫球蛋白或免疫球蛋白子类别的多个重链恒定区等位基因。此些等位基因变体的核苷酸和氨基酸序列可在公开可获得的数据库，例如IMGT、ENSEMBL Swiss-Prot和Uniprot获得。等位基因变体也可在各种基因组定序项目中鉴别。在一个实施例中，本文所公开的抗体和抗体片段包括由IgG1恒定区等位基因编码的重链，其包含(但不限于)人类IGHG1*01(SEQ ID No:340、341和537)、IGHG1*02(SEQ ID No:340、341和537)、IGHG1*03(SEQ ID No:523和524)、IGHG1*04(SEQ IDNo:525和526)和IGHG1*05(SEQ ID No:340、341和537)。在一个实施例中，本文所公开的抗体和抗体片段包括由IgG2恒定区等位基因编码的蛋白质，其包含(但不限于)人类IGHG2*01(SEQ ID No:527和528)、IGHG2*02(SEQ ID No:529和530)、IGHG2*03(SEQ ID No:527和528)、IGHG2*04(SEQ ID No:531和532)、IGHG2*05(SEQ ID No:527和528)和IGHG2*06(SEQID No:533和534)。在一个实施例中，本文所公开的抗体或抗体片段包括由IgG3恒定区等位基因编码的蛋白质，其包含(但不限于)人类IGHG3*01、IGHG3*02、IGHG3*03、IGHG3*04、IGHG3*05、IGHG3*06、IGHG3*07、IGHG3*08、IGHG3*09、IGHG3*10、IGHG3*11、IGHG3*12、IGHG3*13、IGHG3*14、IGHG3*15、IGHG3*16、IGHG3*17、IGHG3*18和IGHG3*19。在一个实施例中，本文所公开的抗体或抗体片段包括由IgG4恒定区等位基因编码的蛋白质，其包含(但不限于)人类IGHG4*01(参见例如本文中的序列表)、IGHG4*02(参见例如本文中的序列表)、IGHG4*03(参见例如本文中的序列表)和IGHG4*04(参见例如本文中的序列表)。在另一实例中，重链为失能IgG同型，例如失能IgG4。在某些实施例中，本发明的抗体包括人类γ4恒定区。在另一实施例中，重链恒定区不结合Fc-γ受体，且例如包括Leu235Glu突变。在另一实施例中，重链恒定区包括Ser228Pro突变以增加稳定性。在另一实施例中，重链恒定区为IgG4-PE(参见例如本文中的序列表)。在另一实施例中，本文所公开的抗体和抗体片段包括由鼠类IgG1恒定区等位基因编码的重链恒定区，其包含(但不限于)小鼠IGHG1*01或IGHG1*02。在一个实施例中，本文所公开的抗体和抗体片段包括由鼠类IgG2恒定区等位基因编码的重链恒定区，其包含(但不限于)小鼠IGHG2A*01、IGHG2A*02、IGHG2B*01、IGHG2B*02、IGHG2C*01、IGHG2C*02或IGHG2C*03。在一个实施例中，本文所公开的抗体或抗体片段包括由鼠类IgG3恒定区等位基因编码的蛋白质，其包含(但不限于)小鼠IGHG3*01。
如本文所用，术语“宿主”是指动物，优选地哺乳动物，且最优选地人类。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的特定个体细胞和此种细胞的后代或潜在后代。归因于继代中可能存在突变或环境影响或核酸分子集成到宿主细胞基因组中，因此此种细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不一致。
术语“组合(in combination)”在给药其它疗法的情形下是指使用多于一种疗法。使用术语“组合”不限制向患有疾病的个体给药疗法的次序。可在向已患有、正患有或易罹患PCSK9介导的疾病的个体给药第二疗法之前(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)给药第一疗法。任何额外疗法可以任何次序与其它额外疗法给药。在某些实施例中，本发明的抗体可与目前为了预防、治疗、控制和/或改善PCSK9介导的疾病而给药的一种或多种疗法(例如不为本发明的抗体的疗法)组合给药。可与本发明抗体组合给药的疗法的非限制性实例包含镇痛剂、麻醉剂、抗生素或免疫调节剂或《美国药典(U.S.Pharmacopoeia)》和/或《医师参考案(Physician′s Desk Reference)》中列举的任何其它药剂。
如本文所用，“注射装置”是指设计用于进行注射的装置，注射包含暂时流体偶联所述注射装置到人的组织(通常皮下组织)的步骤。注射进一步包含给药一定量的液体药物到组织中且从所述组织去解偶联或去除所述注射装置。在一些实施例中，注射装置可为静脉内装置或IV装置，其为当目标组织为循环系统内的血液(例如静脉中的血液)时使用的注射装置的类型。注射装置的常见但非限制性实例为针和注射器。
如本文所用，“说明书”是指制品的实时容器上显示的书面、印刷或图形事项，例如显示于含有药物活性剂的小瓶上的书面材料或包含于含有所关注的组合物的试剂盒中的关于组合物和产物的用途的详情。说明书阐述给药或进行如预期的治疗的方法。
“经分离”或“经纯化”抗体或蛋白质为已从其产生环境的组分鉴别、分离和/或回收的抗体(例如天然或重组)。举例来说，抗体或蛋白质大体上不含来自抗体所来源的细胞或组织来源的细胞材料或其它杂质蛋白质，或当化学合成时大体上不含化学前体或其它化学物质。语言“大体上不含细胞材料”包含抗体与从其中分离或重组地产生所述抗体的细胞的细胞组分分离的抗体制剂。因此，大体上不含细胞材料的抗体包含具有小于约30％、20％、10％或5％(干重)异源蛋白质(在本文中也被称作“杂质蛋白质”)的抗体制剂。当抗体以重组方式产生时，其也优选地大体上不含培养基，即培养基占小于约蛋白质制剂体积的20％、10％或5％。当通过化学合成产生抗体时，其优选地大体上不含化学前体或其它化学物质，即其与涉及合成所述蛋白质的化学前体或其它化学物质分离。因此，此类抗体制剂具有少于约30％、20％、10％或5％(干重)的除所关注抗体以外的化学前体或化合物。在一优选实施例中，本发明的抗体为经分离或经纯化的。
术语“Kabat编号”和类似术语在所属领域中为公认的，且是指对氨基酸残基进行编号的系统，所述氨基酸残基比抗体重链可变区或其抗原结合部分中的其它氨基酸残基更可变(即，高变)(Kabat等人,(1971)《纽约科学学院年刊(Ann.NY Acad.Sci.)》,190:382-391和Kabat等人(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》,第五版,美国卫生与人群服务部,NIH公开第91-3242号)。对于重链可变区，高变区通常在CDR1的氨基酸位置31到35、CDR2的氨基酸位置50到65和CDR3的氨基酸位置95到102的范围内。
如本文所用，“标签(Label)”或“标记(labelled)”是指向多肽添加可检测部分，例如放射性标签、荧光标签、酶标签、化学发光标签或生物素基或金。放射性同位素或放射性核种可包含3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、115In、125I、131I，荧光标签可包含若丹明(rhodamine)、镧系磷光体或FITC，且酶标签可包含辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶。借助于说明而非限制，额外标签包含：酶，例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化酶；染料(例如花青染料，例如Cy5TM、Cy5.5TM.或Cy7TM)；额外荧光标签或荧光剂包含，例如荧光素和其衍生物、荧光染料、GFP(GFP代表“绿色荧光蛋白”)、其它荧光蛋白(例如mCherry、mTomato)、丹磺酰基(dansyl)、伞酮(umbelliferone)、藻红素、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺；荧光团，例如镧系穴状化合物和螯合物，例如铕等(PerkinElmer和Cisbio分析)；静默变化标签或静默变化剂(chemiluminescer)，例如异鲁米诺(isoluminol)、流明诺(luminol)和二氧杂环丁烷；敏化剂；辅酶；酶底物；颗粒，例如乳胶或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞等，其可进一步用染料、催化剂或其它可检测基团标记；分子，例如生物素、洋地黄毒苷(digoxygenin)或5-溴去氧尿苷；毒素部分，例如选自以下的组的毒素部分：绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE，或其细胞毒性片段或突变体)、白喉毒素或其细胞毒性片段或突变体、肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F、蓖麻毒素(ricin)或其细胞毒性片段(例如蓖麻毒素A)、相思子毒素(abrin)或其细胞毒性片段、沙泊宁或其细胞毒性片段、美洲商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段和榄香胶素(bryodin)1或其细胞毒性片段。
当在提及抗体中使用时，术语“轻链”是指免疫球蛋白轻链，其在哺乳动物中存在两种类型lambda(λ)和kappa(κ)。优选地，轻链为人类轻链。优选地，轻链恒定区为人类恒定区。在人类群体中，存在多个轻链恒定区等位基因。此些等位基因变体的核苷酸和氨基酸序列可在公开可获得的数据库，例如IMGT、ENSEMBL、Swiss-Prot和Uniprot获得。在一个实施例中，本文所公开的抗体或抗体片段包括由人类κ恒定区等位基因编码的蛋白质，其包含(但不限于)IGKC*01(参见例如本文中的序列表)、IGKC*02(参见例如本文中的序列表)、IGKC*03(参见例如本文中的序列表)、IGKC*04(参见例如本文中的序列表)和IGKC*05(参见例如本文中的序列表)。在一个实施例中，本文所公开的抗体或抗体片段包括由人类λ恒定区等位基因编码的蛋白质，其包含(但不限于)IGLC1*01(参见例如本文中的序列表)、IGLC1*02(参见例如本文中的序列表)、IGLC2*01(参见例如本文中的序列表)、IGLC2*02(参见例如本文中的序列表)、IGLC2*03(参见例如本文中的序列表)、IGLC3*01(参见例如本文中的序列表)、IGLC3*02(参见例如本文中的序列表)、IGLC3*03(参见例如本文中的序列表)、IGLC3*04(参见例如本文中的序列表)、IGLC6*01(参见例如本文中的序列表)、IGLC7*01(参见例如本文中的序列表)、IGLC7*02(参见例如本文中的序列表)、IGLC7*03(参见例如本文中的序列表)。在另一实施例中，本文所公开的抗体和抗体片段包括由小鼠κ恒定区等位基因编码的轻链恒定区，其包含(但不限于)IGKC*01、IGKC*03或IGKC*03。在另一实施例中，本文所公开的抗体和抗体片段包括由小鼠λ恒定区等位基因编码的轻链恒定区，其包含(但不限于)IGLC1*01、IGLC2*01或IGLC3*01。
相对于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”和“同源性”定义为，在比对序列且必要时引入间隙以达成最大序列一致性百分比，且不考虑任何保守性取代作为序列一致性的一部分之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以在所属领域中的技能范围内的各种方式达成，例如使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。在一个实施例中，同源性％为约70％。在一个实施例中，同源性％为约75％。在一个实施例中，同源性％为约80％。在一个实施例中，同源性％为约85％。在一个实施例中，同源性％为约90％。在一个实施例中，同源性％为约92％。在一个实施例中，同源性％为约95％。在一个实施例中，同源性％为约97％。在一个实施例中，同源性％为约98％。在一个实施例中，同源性％为约99％。在一个实施例中，同源性％为100％。
术语“天然存在”在结合生物学材料(例如核酸分子、多肽、宿主细胞和其类似物)使用时，是指发现于自然界中且未经人类操纵的那些。
如本文所用，“包装”是指如何将组分组织和/或约束到适于分配和/或使用的单元中。包装可包含例如盒、袋、注射器、安瓿、小瓶、试管、贝壳掀盖式包装、屏障和/或容器以维持无菌性、标记等。
如本文所用，术语“药学上可接受”意谓经联邦或州政府的监管机构批准或列于《美国药典(U.S.Pharmacopia)》、《欧洲药典(European Pharmacopia)》或其它公认药典中用于动物，且更确切来说人类。
如本文所用，术语“聚核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”和其它类似术语可互换使用，且包含DNA、RNA、mRNA和其类似物。
如本文所用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指给药本文所提供的疗法或组合疗法(例如预防剂或治疗剂组合，例如本发明抗体)而使得hPCSK9介导的疾病和/或与其相关症状的发展、复发、发作或扩散被完全或部分抑制。
术语“可溶”是指发现以原生或膜结合形式的缺乏一个或多个跨膜或细胞质域的多肽，例如PCSK9和其变体或片段。在一个实施例中，PCSK9的“可溶”形式缺乏跨膜域和细胞质域两者。
术语“个体”或“患者”是指任何动物，包含(但不限于)哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指哺乳其幼体且生出活幼体(真哺乳亚纲或胎盘哺乳动物)或产卵(后兽亚纲或非胎盘哺乳动物)的任何脊椎动物。哺乳动物物种的实例包含(但不限于)：人类和其它灵长类动物，包含非人类灵长类动物，例如黑猩猩和其它猿和猴物种；农畜，例如牛、羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如犬和猫；实验室动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠(包含棉鼠)和天竺鼠；鸟类，包含家养、野生和猎鸟，例如鸡、火鸡和其它鹑鸡类鸟、鸭、鹅和其类似物。
如本文所用，“大体上所有”是指至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。
如本文所用，术语“治疗剂”是指可用于治疗、控制或改善PCSK9介导的疾病和/或与其相关症状的任何药剂。在某些实施例中，术语“治疗剂”是指本发明抗体。在某些其它实施例中，术语“治疗剂”是指除本发明抗体以外的药剂。优选地，治疗剂为已知适用于或曾用于或目前正用于治疗、控制或改善PCSK9介导的疾病或与其相关的一种或多种症状的药剂。在特定实施例中，治疗剂为完全人类抗PCSK9抗体，例如完全人类抗PCSK9单克隆抗体。
如本文所用，术语“疗法”是指可用于预防、控制、治疗和/或改善PCSK9介导的疾病(例如癌症)中的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施例中，术语“疗法(therapies/therapy)”是指所属领域中的熟练技术人员(例如医疗人员)已知的适用于预防、控制、治疗和/或改善PCSK9介导的疾病的生物疗法、支持疗法和/或其它疗法。
术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指因给药一种或多种疗法(包含(但不限于)给药一种或多种预防剂或治疗剂，例如本发明抗体)而降低或改善hPCSK9介导的疾病(例如癌症)的进展、严重程度和/或持续时间。在特定实施例中，此类术语是指降低或抑制hPCSK9与BMP受体或HJV的结合，和/或抑制或降低与PCSK9介导的疾病(例如高脂质血症或高胆固醇血症)相关的一种或多种症状。
术语“可变区”或“可变域”是指轻链和重链的一部分，通常重链中的约氨基端120到130个氨基酸和轻链中的约100到110个氨基酸，其在抗体间在序列上广泛地不同，且用于各特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性中。序列中的可变性集中于称为互补决定区(complimentarily determining region；CDR)的那些区中，而可变域中的更高度保守的区称为构架区(framework region；FR)。PCSK9和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。本文所用的氨基酸位置的编号是根据EU索引，如在Kabat等人(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of proteins of immunological interest)》.(美国卫生与人群服务部，华盛顿特区)第5版(“Kabat等人”)。在优选实施例中，可变区为人类可变区。
细胞生物学和分子生物学中的常见术语的定义可见于以下中：“《默克诊断和疗法手册(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy)》”,第19版,由Merck研究实验室出版,2006(ISBN 0-911910-19-0)；Robert S.Porter等人(编),《分子生物学丛书(TheEncyclopedia of Molecular Biology)》,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；Benjamin Lewin,Genes X,由Jones&Bartlett Publishing出版,2009(ISBN-10:0763766321)；Kendrew等人(编),《分子生物学和生物技术：综合参考书(Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference)》,由VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)和《2009年目前蛋白质科学方案(Current Protocols in Protein Sciences 2009)》,Wiley Intersciences,Coligan等人编。
除非另外陈述，否则本发明使用如例如在以下中描述的标准程序进行：Sambrook等人,《分子选殖：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第4版),ColdSpring Harbor Laboratory Press,美国纽约冷泉港(2012)；Davis等人,《分子生物学基础方法(Basic Methods in Molecular Biology)》,Elsevier Science Publishing,Inc.,美国纽约(1995)；或《酶学方法：分子选殖技术指南(Methods in Enzymology:Guide toMolecular Cloning Techniques)》第152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmel编,Academic PressInc.,美国圣地亚哥(1987)；《目前蛋白质科学方案(Current Protocols in ProteinScience(CPPS))》(John E.Coligan等人编,John Wiley and Sons,Inc.),《目前细胞生物学方案(Current Protocols in Cell Biology(CPCB))》(Juan S.Bonifacino等人编,JohnWiley and Sons,Inc.)，和《动物细胞的培养：基础技术手册(Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique)》，R.Ian Freshney,Publisher:Wiley-Liss；第5版(2005)，《动物细胞培养方法(Animal Cell Culture Methods)》(《细胞生物学方法(Methods inCell Biology)》,第57卷,Jennie P.Mather and David Barnes editors,AcademicPress,第1版,1998)，所述文献全部均以全文引用的方式并入本文中。
其它术语在本文中定义于本发明的各种方面的描述中。
抗PCSK9抗体和片段
本发明提供各种抗PCSK9抗体和片段(例如Fab或scFv片段)、用途、方法和组合(例如与士他汀)。实例在以下编号条项中阐述。
1.一种抗体或片段，其包括与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括由来源于人类VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段重组的核苷酸序列编码的VH域，其中所述VH基因区段选自IGHV4-59和IGHV3-9。
举例来说，VH基因区段为IGHV4-59*01，且DH基因区段和JH基因区段为人类基因区段。举例来说，VH基因区段为IGHV3-9*01，且DH基因区段和JH基因区段为人类基因区段。
在一实例中，特异性结合具有如下文进一步描述的KD、Koff和/或Kon。在一实例中，特异性结合具有1pM到5nM的KD。
熟练技术人员熟悉人类和其它物种的抗体基因区段的数据库和其它来源。举例来说，IMGT数据库(www.IMGT.org)为合适的来源，例如如在2018年9月1日的版本。
参考实例，显示基于IGHV4-59和IGHV3-9的抗体。出乎意料地，此人类VH基因区段产生具有所需抗PCSK9特性的抗PCSK9抗体，例如在例如实例中所描述的那些。
举例来说，本发明的抗体或片段向个体给药，以用于以剂量依赖性方式降低个体中的血浆总胆固醇和血浆非HDL-胆固醇。
举例来说，本发明的抗体或片段向个体给药，以用于降低个体中的血浆总胆固醇。
举例来说，本发明的抗体或片段向个体给药，以降低(任选地以剂量依赖性方式)个体中的血浆非HDL-胆固醇。
举例来说，本发明的抗体或片段用于向个体给药向给药，以降低个体中的血浆三酸甘油酯水平)。
在此些实例中的任一个的一实施例中，个体中的HDL-胆固醇未降低或未显著降低。
实例显示相较于阿利库单抗基准测试，有益给药本发明的抗体。举例来说，本发明的抗体或片段用于向个体给药，以用于治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状(例如杂合性家族性高胆固醇血症(heterozygous familial hypercholesterolaemia；HeFH)或纯合性家族性高胆固醇血症(homozygous familial hypercholesterolaemia；HoFH))，其中抗体或片段以小于75mg/2周或300mg/4周的剂量给药。举例来说，本发明的抗体或片段用于向个体给药，以用于治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状(例如杂合性家族性高胆固醇血症(HeFH)或纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH))，其中抗体或片段以小于140mg/2周或小于420mg/4周的剂量给药。举例来说，本发明的抗体或片段用于向个体给药，以用于治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状(例如杂合性家族性高胆固醇血症(HeFH)或纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH))，其中抗体或片段以小于每2周一次剂量的普路恩(Praluent)或雷帕萨(Repatha)的剂量给药。举例来说，本发明的抗体或片段用于向个体给药，以用于治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状(例如杂合性家族性高胆固醇血症(HeFH)或纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH))，其中抗体或片段以小于每4周一次剂量的普路恩或雷帕萨的剂量给药。举例来说，本发明的抗体或片段用于向个体给药，以用于治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状(例如杂合性家族性高胆固醇血症(HeFH)或纯合性家族性高胆固醇血症(HoFH))，其中抗体或片段以小于70、65、60、50、40、30或25mg的每2周一次剂量或每4周一次剂量的剂量给药。
所以PraluentTM的推荐起始剂量为75mg，每2周一次皮下给药，这是由于大部分患者以此剂量达成足够LDL-C降低，或2×150mg/4周。
在患有确立心血管疾病的成年人中或在患有原发性高脂质血症(包含杂合性家族性高胆固醇血症[HeFH])的成年人中，基于患者对于给药频率和注射体积的偏好，RepathaTM的推荐皮下剂量为140mg/2周或420mg每月一次。在患有HoFH的患者中，RepathaTM的推荐皮下剂量为420mg每月一次。
举例来说，所述抗体或片段包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；和任选地所述所选择抗体的CDRL3。举例来说，抗体或片段包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH1和CDRH3序列；和任选地所述所选择抗体的CDRL2。举例来说，抗体或片段包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH1和CDRH2序列。举例来说，抗体或片段包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH2和CDRH3序列。举例来说，抗体或片段包括抗PCSK9结合位点，其中所述结合位点包括与CL-58838的VL域配对的VH域，所述VH域包括CL-58838的CDRH3序列。
举例来说，抗体或片段包括抗PCSK9结合位点，其中结合位点包括任选地与包括分别SEQ ID NO:33的VL域配对的VH域，所述VH域包括SEQ ID NO:1。举例来说，抗体或片段包括抗PCSK9结合位点，其中结合位点包括与包括SEQ ID NO:95的VL域配对的VH域，所述VH域包括SEQ ID NO:65。
举例来说，抗体或片段包括抗PCSK9结合位点，其中结合位点包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VH域，任选地所述VH域与所选择抗体的VL域配对。举例来说，抗体或片段包括抗PCSK9结合位点，其中所述结合位点包括与CL-58838的VL域配对的CL-58838的VH域。
2.根据条项1所述的抗体或片段，其中(i)所述VH基因区段为IGHV4-59(例如IGHV4-59*01)，且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD3-10(例如IGHD3-10*01)；或(ii)所述VH基因区段为IGHV3-9(例如IGHV3-9*01)，且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD3-9(例如IGHD3-9*01)。
3.根据条项1或2所述的抗体或片段，其中所述JH基因区段为人类基因区段IGHJ6(例如JH6*02)。
4.一种抗体或片段，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合，且包括根据前述条项中任一项所述的抗PCSK9抗体的CDRH3序列。
5.一种抗体或片段，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合，且包括VH域，所述VH域包括本文所公开的任何抗PCSK9抗体(例如CL-148219或CL-148489)的CDRH3序列，或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列。
6.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合，且包括VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述序列。
任选地，VH域包括选自本文所公开的CDRH3序列的CDRH3序列，或包括3、2或1个氨基酸取代的所述所选择序列。
7.根据条项6所述的抗体或片段，其中所述VH域包括：(i)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列；和(ii)所述所选择抗体的CDRH1序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH1序列。
8.根据条项6或7所述的抗体或片段，其中所述VH域包括：(iii)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列；和(iv)所述所选择抗体的CDRH2序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH2序列。
9.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其包括与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VH域的氨基酸序列；或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的氨基酸。
举例来说，一致性为至少85％。举例来说，一致性为至少90％。举例来说，一致性为至少95％。
任选地，抗体或片段的VH域包括本文所公开的VH氨基酸序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的重链可变域氨基酸序列。举例来说，一致性为至少85％。举例来说，一致性为至少90％。举例来说，一致性为至少95％。
10.根据前述条项中任一项所述的抗体或片段，其包括所述VH域的第一拷贝和第二拷贝。
在一实例中，抗体或片段包括结合位点，所述结合位点包括与本发明的VL域配对的本发明的VH域，其中所述结合位点能够与PCSK9(例如成熟PCSK9，例如人类和/或食蟹猕猴PCSK9)特异性结合。举例来说，抗体或片段包括此类结合位点中的两者。
11.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其包括与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括由来源于人类VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码的VL域，其中所述VL基因区段选自IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)和IGKV2-29(例如IGKV2-29*01)。
12.根据条项11所述的抗体或片段，其中所述VL为Vκ，且所述JL基因区段为选自IGKJ3和IGKJ4的人类基因区段。
任选地，所述JL基因区段选自IGKJ3*01和IGKJ4*01。
13.一种抗体或片段，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合，且包括根据条项11或12所述的抗PCSK9抗体的CDRL3序列。
14.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合，且包括VL域，所述VL域包括本文所公开的任何抗PCSK9抗体(例如CL-148219或CL-148489)的CDRL3序列，或包括3、2或1个氨基酸取代的所述所选择CDRL3序列。
15.根据条项14所述的抗体或片段，其包括VH域，所述VH域包括所述所选择抗体的CDRH3序列。
16.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合，且包括VL域，所述VL域包括选自本文所公开的CDRL3序列的CDRL3序列，或包括3、2或1个氨基酸取代的所述所选择CDRL3序列。
17.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合，且包括VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述序列。
18.根据条项17所述的抗体或片段，其中所述VL域包括：(i)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3序列(和任选地CDRH3)；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR3序列；和(ii)所述所选择抗体的CDRL1(和任选地CDRH1)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR1序列。
19.根据条项17或18所述的抗体或片段，其中所述VL域包括：(iii)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR3序列；和(iv)所述所选择抗体的CDRL2(和任选地CDRH2)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR2序列。
20.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其包括与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VL域的氨基酸序列；或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的氨基酸。
举例来说，一致性为至少85％。举例来说，一致性为至少90％。举例来说，一致性为至少95％。
21.根据前述条项中任一项所述的抗体或片段，其包括所述VL域的第一拷贝和第二拷贝。
在一实例中，所述抗体或片段包括结合位点，所述结合位点包括与VH域配对的本发明的VL域，其中所述结合位点能够与PCSK9(例如成熟PCSK9，例如人类和/或食蟹猕猴PCSK9)特异性结合。举例来说，抗体或片段包括此类结合位点中的两者。
22.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合，且包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的重链氨基酸序列；或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的氨基酸。
在一实例中，重链序列包括与本文所公开的抗体重链恒定区(例如IgG4-PE恒定区，例如SEQ ID NO:3)融合的CL-148219或CL-148489的VH氨基酸序列。另外或替代地，在一实例中，轻链序列包括与本文所公开的抗体轻链恒定区(例如κ恒定区，例如SEQ ID NO:156)融合的CL-148219或CL-148489的VL氨基酸序列。
举例来说，一致性为至少85％。举例来说，一致性为至少90％。举例来说，一致性为至少95％。
23.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合，且包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的轻链氨基酸序列；或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的氨基酸。
举例来说，一致性为至少85％。举例来说，一致性为至少90％。举例来说，一致性为至少95％。
24.根据条项23所述的抗体或片段，其包括所述所选择抗体的轻链氨基酸序列；或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的氨基酸。
举例来说，一致性为至少85％。举例来说，一致性为至少90％。举例来说，一致性为至少95％。
25.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其与人类PCSK9表位特异性结合，所述表位与根据前述条项中任一项所述的抗体所结合的表位一致。
26.根据条项25所述的抗体或片段，其中所述表位通过无关氨基酸扫描，或通过X射线结晶学来鉴别。
涉及抗体与抗原相互作用的接触氨基酸残基可通过所属领域中的熟练技术人员已知的各种方法确定。
在一个实施例中，用另一无关氨基酸(在PCSK9的此情况下，用丙氨酸(也称为丙氨酸扫描))依序置换抗原序列的氨基酸(使用标准分子生物学技术以使抗原的编码序列的DNA突变)，可提供其突变将降低或去除抗体识别所讨论的抗原的能力的残基。结合可使用标准技术，例如(但不限于)SPR、HTRF、ELISA评定(其在本文中的其它地方描述)。可进行其它取代，以增强对结合的破坏，例如改变抗原序列氨基酸的侧链上的电荷(例如赖氨酸变为谷氨酸)，交换极性与非极性残基(例如丝氨酸变为白氨酸)。可对重组可溶抗原进行丙氨酸扫描或其它氨基取代方法，或当目标为细胞膜目标时，直接在细胞上使用瞬时或稳定表达突变型形式。
在一个实施例中，蛋白质结晶学可用于确定抗体与抗原之间的接触残基(即，以确定抗体所结合的表位)，结晶学允许直接观测涉及抗体-抗原相互作用的接触残基。如同标准X射线结晶学一样，低温电子显微术已用于确定抗体与HIV衣壳蛋白之间的接触残基(参见Jeong Hyun等人“《针对gp41上的构形表位的抗体通过使Env刺突蛋白去稳定化而中和HIV-1。(Antibodies to a conformational epitope on gp41 neutralize HIV-1bydestabilizing the Env spike.)》”,《自然通信(Nature communications)》,6,(2015))。
在一个实施例中，如果抗体识别线性表位，那么可产生基于抗原序列的短肽，且抗体与此些肽的结合可使用标准技术，例如(但不限于)SPR、HTRF、ELISA评定(其本文中的其它地方描述)。表位的进一步研究可通过对于显示结合的任何肽执行丙氨酸扫描提供。线性肽的替代物，构形扫描可使用肽扫描技术(http://www.pepscan.com/)使用其肽与骨架的化学连接来进行，其已用于确定CD20靶向抗体上的不连续表位(Niederfellner,Gerhard等人“《GA101的表位表征和晶体结构为CD20抗体的I/II型区别提供分子基础见解(Epitopecharacterization and crystal structure of GA101 provide insights into themolecular basis for type I/II distinction of CD20 antibodies.)》”,《血液(Blood)》,118.2,(2011),358-367)。
在一个实施例中，限制性蛋白水解消化和质谱法可用于鉴别结合表位。抗体-抗原复合物由蛋白酶，例如(但不限于)胰蛋白酶消化。将消化的复合肽与单独抗体和单独抗原消化质谱进行比较，以确定特定表位是否受复合保护。接着，涉及氨基酸取代、竞争结合的其它工作可用于缩小到涉及相互作用的个别氨基酸残基(参见例如Suckau,Detlev等人“《通过限制性蛋白质水解固定的抗原-抗体复合物和质谱肽定位鉴别分子表位(Molecularepitope identification by limited proteolysis of an immobilized antigen-antibody complex and mass spectrometric peptide mapping.)》”,《国家科学院会议论文(Proceedings of the National Academy of Sciences)》,87.24,(1990),9848-9852)。
因此，在一个实施例中，利用无关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)鉴别表位的接触残基。在另一实施例中，无关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)使用选自以下的技术来进行：SPR、HTRF、ELISA、X射线结晶学、低温电子显微术和限制性蛋白水解消化与质谱法的组合。在一个实施例中，无关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)使用HTRF来进行。在一个实施例中，无关氨基酸扫描(例如丙氨酸扫描)使用ELISA来进行。
当用ELISA或HTRF进行丙氨酸扫描时，如果信号降低为至少25％，那么氨基酸残基鉴别为有助于表位。在一个实施例中，信号降低为至少30％。在一个实施例中，信号降低为至少35％。在一个实施例中，信号降低为至少40％。在一个实施例中，信号降低为至少45％。在一个实施例中，信号降低为至少50％。在一个实施例中，信号降低为至少55％。在一个实施例中，信号降低为至少60％。在一个实施例中，信号降低为至少70％。在一个实施例中，信号降低为至少75％。在一个实施例中，信号降低为至少80％。在一个实施例中，信号降低为至少85％。在一个实施例中，信号降低为至少90％。
当用SPR进行丙氨酸扫描时，如果亲和力降低至少10倍，那么氨基酸残基鉴别为有助于表位。在一个实施例中，亲和力降低为至少15倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少20倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少30倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少40倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少50倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少100倍。
在一个实施例中，通过X射线结晶学鉴别表位的接触残基。在一个实施例中，通过低温电子显微术鉴别表位的接触残基。在一个实施例中，通过限制性蛋白水解消化与质谱法的组合鉴别表位的接触残基。
27.根据条项26所述的抗体或片段，其中通过在无关氨基酸扫描，例如丙氨酸扫描中，如通过SPR所测定亲和力降低至少10倍，来定义表位的接触残基。
在一个实施例中，亲和力降低为至少15倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少20倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少30倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少40倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少50倍。在一个实施例中，亲和力降低为至少100倍。
可如本文所描述进行SPR。
28.一种抗体或片段(任选地根据前述条项中任一项所述的)，其与根据前述条项中任一项所述的抗体竞争与人类PCSK9结合。
任选地，通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance；SPR)或ELISA来测定竞争。举例来说，所属领域的熟练技术人员将熟悉此些技术和标准条件。
在一个实施例中，抗体或片段(例如以剂量依赖性方式)与hPCSK9(或其融合蛋白)竞争与细胞表面表达的hPCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段(例如以剂量依赖性方式)与hPCSK9(或其融合蛋白)竞争与可溶hPCSK9结合。
任选地，使用SPR进行对与hPCSK9的结合的竞争。可如本文所描述进行SPR。
29.根据前述条项中任一项所述的抗体或片段，其与以下特异性结合：人类PCSK9，其SEQ ID NO:189-192中的任一个；和/或食蟹猕猴PCSK9，其包括SEQ ID NO:193；和/或小鼠PCSK9，其包括SEQ ID NO:194。
任选地，本发明的抗体或片段与SEQ ID NO:189的氨基酸序列特异性结合。任选地，本发明的抗体或片段与SEQ ID NO:193的氨基酸序列特异性结合。任选地，本发明的抗体或片段与SEQ ID NO:194的氨基酸序列特异性结合。
在一实例中，本文中的PCSK9为人类、小鼠或食蟹猕猴PCSK9。
在一个实施例中，抗体或片段以小于1nM(例如1nM到0.01pM、或1nM到0.1pM或1nM到1pM)的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以小于10nM(例如10nM到0.01pM、或10nM到0.1pM或10nM到1pM)的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以小于0.1nM(例如0.1nM到0.01pM、或0.1nM到0.1pM或0.1nM到1pM)的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以小于0.01nM(例如0.011nM到0.01pM或0.01nM到0.1pM)的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。
在一个实施例中，抗体或片段以在针对hPCSK9的亲和力的2倍内的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以在针对hPCSK9的亲和力的4倍内的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以在针对hPCSK9的亲和力的5倍内的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以在针对hPCSK9的亲和力的6倍内的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以在针对hPCSK9的亲和力的8倍内的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以在针对hPCSK9的亲和力的10倍内的亲和力，与食蟹猕猴PCSK9结合。
本文中的“hPCSK9”为人类PCSK9，例如本文所公开的人类PCSK9，例如包括SEQ IDNO:562。
在一个实施例中，抗体或片段不可检测地与食蟹猕猴PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段不可检测地与鼠类(例如小鼠和/或大鼠)PCSK9结合。
在一个实施例中，抗体或片段以小于1nM(例如1nM到0.01pM、或1nM到0.1pM或1nM到1pM)的亲和力，与鼠类(例如小鼠和/或大鼠)PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以小于10nM(例如10nM到0.01pM、或10nM到0.1pM或10nM到1pM)的亲和力，与鼠类PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以小于0.1nM(例如0.1nM到0.01pM、或0.1nM到0.1pM或0.1nM到1pM)的亲和力，与鼠类PCSK9结合。在一个实施例中，抗体或片段以小于0.01nM(例如0.011nM到0.01pM或0.01nM到0.1pM)的亲和力，与鼠类PCSK9结合。
任选地，抗体或片段包括具效应子功能的恒定区或效应子失能恒定区，例如人类恒定区，例如缺失效应子的人类恒定区，例如IgG4恒定区或IgG1恒定区，任选地其中所述恒定区为IgG4-PE或失能IgG1。任选地，抗体或片段包括鼠类(例如小鼠和/或大鼠)恒定区。任选地，抗体或片段包括本文所描述的重链恒定区序列中的任一个。
任选地，恒定区具有CDC和/或ADCC活性。
30.根据前述条项中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段包括人类恒定区，例如IgG4恒定区或IgG1恒定区。
举例来说，恒定区包括本文所公开的重链恒定区。
在一实例中(任选地除根据上一段的重链区以外)，恒定区包括轻链恒定区，所述轻链恒定区包括本文所公开的轻链恒定区氨基酸序列。
31.根据条项30所述的抗体或片段，其中所述恒定区为IgG4-PE恒定区。
根据本发明的抗PCSK9抗体或片段可包括恒定区，例如人类恒定区，例如缺失效应子的人类恒定区，例如IgG4恒定区或IgG1恒定区，任选地其中所述恒定区为IgG4-PE或如本文中的序列表中所定义的失能IgG1。
在其它实施例中，抗体或片段为如本文所定义的同型或恒定区中的任一种。在一个实施例中，恒定区为野生型人类IgG1。举例来说，恒定区为具效应子功能的IgG1恒定区，任选地具有ADCC和/或CDC活性。在一个实施例中，恒定区被工程改造以用于增强ADCC和/或CDC和/或ADCP。在另一实施例中，恒定区被工程改造以用于增强效应功能。
所述IgG4恒定区可为IgG4恒定区氨基酸序列中的任一个，或由本文中的序列表的核酸序列中的任一个编码。重链恒定区可为包括Leu235Glu突变和Ser228Pro突变两者的IgG4。此“IgG4-PE”重链恒定区(参见例如序列表)为效应子缺失的。
替代性缺失效应子的人类恒定区为失能IgG1，其为包括L235A和/或G237A突变的IgG1*01等位基因(例如LAGA，参见序列表)。在一个实施例中，本文所公开的抗体或抗体片段包括IgG1重链恒定区，其中所述序列在位置235和/或237处含有丙氨酸(EU索引编号)。
Fc介导的效果的性能可通过如将对于熟练技术人员显而易见的技术中的任一种工程改造Fc域来增强。在另一实施例中，本文所公开的抗体和片段可包括增强与FcRn的结合的三重突变(M252Y/S254T/T256E)。
32.根据前述条项中任一项所述的抗体或片段(例如双特异性抗体)，其进一步包括特异性结合另一目标抗原(例如ANGPTL3，例如人类ANGPTL3)的抗原结合位点。
在一实例中，所述其它结合位点为针对所述另一抗原的促效剂结合位点。在一实例中，所述其它结合位点为针对所述另一抗原的拮抗剂结合位点。
在一实例中，所述其它结合位点为包括VH和VL的抗体结合位点；抗体恒定域所包括的结合位点(例如Fcab结合位点)或非免疫球蛋白结合位点(例如纤维结合蛋白域)。任选地，抗原结合位点为本文所公开的任何抗原结合位点。
举例来说，所述抗体或片段为双特异性抗体或片段。举例来说，所述抗体或片段为双重结合抗体或片段，或包括根据任一前述条项中所定义的抗体或其片段。双重结合抗体具有如上文所阐述的含义。
在一实例中，所述抗体或片段包括选自以下的双特异性型式：DVD-Ig、mAb2、FIT-Ig、mAb-dAb、锁钥结构、SEED体、sc双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、sc双功能抗体、sc双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、微型抗体、杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼，确切来说mAb2、杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对的杵-臼，和FIT-Ig，例如mAb2和FIT-Ig。
在一个实施例中，双特异性型式选自以下：DVD-Ig、mAb2、FIT-Ig、mAb-dAb、锁钥结构、Fab-臂交换、SEED体、三功能单抗、LUZ-Y、Fcab、κλ-体、正交Fab、sc双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、sc双功能抗体、sc双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、三重体、微型抗体(Miniantibody)、微型抗体(minibody)、TriBi微型抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zy体。
在一个实施例中，双特异性型式选自以下：DVD-Ig、FIT-Ig、mAb-dAb、锁钥结构、Fab-臂交换、SEED体、三功能单抗、LUZ-Y、Fcab、κλ-体、正交Fab、sc双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、sc双功能抗体、sc双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、三重体、微型抗体(Miniantibody)、微型抗体(minibody)、TriBi微型抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zy体，例如DVD-Ig、FIT-Ig、mAb-dAb、锁钥结构、SEED体、sc双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、sc双功能抗体、sc双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、微型抗体、杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼，确切来说杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对的杵-臼，和FIT-Ig，例如FIT-Ig。
在一个实施例中，双特异性型式选自以下：DVD-Ig、mAb2、mAb-dAb、锁钥结构、Fab-臂交换、SEED体、三功能单抗、LUZ-Y、Fcab、κλ-体、正交Fab、sc双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、sc双功能抗体、sc双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、三重体、微型抗体(Miniantibody)、微型抗体(minibody)、TriBi微型抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zy体，例如DVD-Ig、mAb2、mAb-dAb、锁钥结构、SEED体、sc双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、sc双功能抗体、sc双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、微型抗体、杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼，确切来说mAb2、杵-臼、具有共有轻链和电荷对的杵-臼，和具有共有轻链的杵-臼，例如mAb2。
在一个实施例中，双特异性型式选自以下：DVD-Ig、mAb-dAb、锁钥结构、Fab-臂交换、SEED体、三功能单抗、LUZ-Y、Fcab、κλ-体、正交Fab、sc双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、sc双功能抗体、sc双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、三重体、微型抗体(Miniantibody)、微型抗体(minibody)、TriBi微型抗体、scFv-CH3 KIH、scFv-CH-CL-scFv、F(ab′)2-scFv、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCab、ImmTAC、杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼、DT-IgG、DutaMab、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig和zy体，例如DVD-Ig、mAb-dAb、锁钥结构、SEED体、sc双功能抗体-Fc、双功能抗体-Fc、串联scFv-Fc、Fab-scFv-Fc、Fab-scFv、胞内抗体、BiTE、双功能抗体、DART、TandAb、sc双功能抗体、sc双功能抗体-CH3、双功能抗体-CH3、微型抗体、杵-臼、具有共有轻链的杵-臼、具有共有轻链和电荷对、电荷对、电荷对与共有轻链的杵-臼，确切来说杵-臼、具有共有轻链和电荷对的杵-臼，和具有共有轻链的杵-臼。
33.一种如在任一前述条项中所定义的抗PCSK9抗体或片段，其用于治疗或预防个体的PCSK9介导的疾病或病状(例如高脂质血症或高胆固醇血症)。
在一实例中，个体为人类。在一替代性例中，个体为非人类动物。在一实例中，个体为成人。在一实例中，个体为儿科人类。在一实例中，个体为在进行透析治疗的人类CKD患者。在一实例中，个体为患有末期肾病的人类。
在一实例中，本文中的抗体或片段用于治疗或预防选自以下的疾病或病状：高胆固醇血症、高脂质血症、高胆固醇血症、血脂异常、胆汁郁积性肝病、肾病综合征、甲状腺功能减退、肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化或心血管疾病。在一实例中，所述疾病或病状选自脂质失调、高脂蛋白血症、高脂质血症；血脂异常；高胆固醇血症、心脏病发作、中风、冠心病、动脉粥样硬化、外周血管疾病、跛行、II型糖尿病、高血压和心血管疾病或病状。举例来说，所述疾病或病状为高脂质血症。举例来说，所述疾病或病状为高胆固醇血症。举例来说，所述疾病或病状为糖尿病。举例来说，所述疾病或病状为中风。举例来说，所述疾病或病状为动脉粥样硬化。举例来说，所述疾病或病状为CNS病症。举例来说，所述疾病或病状为神经病症。举例来说，所述疾病或病状为抑郁。
在一实例中，所述疾病或病状是在人类中。在一实例中，所述疾病或病状是在动物中。
在一实例中，PCSK9介导的疾病或病状为例如选自以下的神经退化性疾病、病症或病状：阿尔茨海默氏症(Alzheimer′s disease)、肌肉萎缩性侧索硬化、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、原发性进行性多发性硬化症、继发性进行性多发性硬化症、皮质基底核退化症、雷特氏综合征(Rett syndrome)、选自老年性黄斑变性和色素性视网膜炎的视网膜变性病症；前部缺血性眼神经病、青光眼、葡萄膜炎、抑郁、创伤相关的应激或创伤后应激障碍、额颞叶型痴呆、路易体痴呆(Lewy bodydementias)、轻度认知损伤、后皮层萎缩、原发性进行性失语和进行性核上麻痹或老年性痴呆，确切来说，神经退化性疾病、病症或病况选自阿尔茨海默氏症、肌肉萎缩性侧索硬化、帕金森氏病和亨廷顿氏病，例如阿尔茨海默氏症。
在一实例中，向个体静脉内给药本发明的抗体、片段、组合；或其用于向个体静脉内给药。在一实例中，向个体皮下给药本发明的抗体、片段、组合；或其用于向个体皮下给药。
34.根据条项33所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段与士他汀同时或依序向个体给药。
35.一种一定量的抗PCSK9抗体或片段和一定量的士他汀的组合(例如包括多个剂量的所述抗体和/或士他汀)，其中所述抗体或片段是根据条项1到34中的任一项。
还提供：一种医学试剂盒，其包括所述组合、含所述量的抗体或片段的第一无菌容器和含所述量的士他汀的第二无菌容器，和任选地关于使用所述组合来治疗个体的高脂质血症或高胆固醇血症的说明书。
还提供：一种医学试剂盒，其包括所述组合、含所述量的抗体或片段的第一无菌容器和含所述量的ANGPTL3抑制剂的第二无菌容器，和任选地关于使用所述组合来治疗个体的高脂质血症或高胆固醇血症的说明书。
在一实例中，所述组合用于治疗或预防个体的高脂质血症或高胆固醇血症，其中在4个连续周时段内，以X:Y的比率，向所述个体给药总剂量的所述抗体和总剂量的士他汀，其中X为10到2×106且Y＝4，例如X为10到2×106微克且Y＝4微克。
36.根据本发明的抗体、片段或组合，其用于治疗或预防先前已以第一剂量以士他汀治疗方案治疗的个体的高胆固醇血症的方法中，其中所述方法包括降低向个体给药的士他汀的剂量或不向个体给药士他汀，其中所述方法包括向个体给药所述抗体或片段。
37.根据条项35或36所述的组合，其中其包括日剂量为10到20mg(例如10mg)；或<60mg(例如40mg)的士他汀。
38.根据前述条项中任一项所述的抗体、片段或组合，其用于向罹患胆固醇升高的人类或动物个体给药，以用于在个体已接受抗PCSK9抗体或片段之后，降低个体中的血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。
39.一种如前述条项中任一项所定义的抗体、片段或组合的用途，其用于制造用于向个体给药用来治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状，例如高脂质血症或高胆固醇血症的药剂。
40.一种治疗或预防个体的PCSK9介导的疾病或病状(例如高脂质血症或高胆固醇血症)的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的如条项1到38中任一项中所定义的抗体、片段或组合，其中由此治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状。
所述疾病或病状可为本文所公开的任一种。
41.根据条项39所述的用途或根据条项40所述的方法，其中所述PCSK9介导的疾病或病状为高脂质血症或高胆固醇血症。
42.根据条项33到41中任一项的抗体、片段、组合、用途或方法，其进一步包括向个体给药其它疗法，例如其它治疗剂，任选地其中所述其它治疗剂选自以下组成的组：
a.士他汀；
b.ANGPTL3抑制剂(例如抗ANGPTL3抗体，例如恩维纳单抗)
c.非贝特；
d.胆酸螯隔剂；
e.烟碱酸；和
f.烟酸。
本发明实际上包含商标药物的通用形式，且此些通用药物的公开内容以引用的方式包含于本文中以用于本发明中的可能用途，例如作为组合的一部分。
43.一种药物组合物，其包括如条项1到38和42中任一项中所定义的抗体、片段或组合，和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体和任选地与选自上文(例如在条项42中)提及的那些的其它治疗剂组合。
44.根据条项43所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防PCSK9介导的病状或疾病，例如高脂质血症或高胆固醇血症。
45.根据条项43或44所述的药物组合物，其与标签或使用说明书组合，以治疗和/或预防人类的所述疾病或病状；任选地其中所述标签或说明书包括销售授权编号(例如FDA或EMA授权编号)；任选地其中所述试剂盒包括含所述抗体或片段的IV或注射装置。
46.一种核酸，其编码如条项1到32中任一项中所定义的抗体或片段的VH域和/或VL域。
47.一种核酸，其编码VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VH域的氨基酸序列；或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的氨基酸。
举例来说，一致性为至少85％。举例来说，一致性为至少90％。举例来说，一致性为至少95％。
任选地，提供一种核酸，其编码VH域，所述VH域包括SEQ ID NO:114的氨基酸序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的氨基酸。举例来说，一致性为至少85％。举例来说，一致性为至少90％。举例来说，一致性为至少95％。
48.一种核酸，其编码VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VL域的氨基酸序列；或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的氨基酸。
任选地，所述核酸也编码VH域，所述VH域包括所选择抗体的VH域的氨基酸序列；或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的氨基酸。举例来说，一致性为至少85％。举例来说，一致性为至少90％。举例来说，一致性为至少95％。
49.一种核酸(例如在宿主细胞中，例如CHO或HEK293或Cos细胞)，其包括与SEQ IDNO:2或66的序列至少70％一致的核苷酸序列。
在本文中，在其中提及一致性％的任何例子中，在一实例中存在100％一致性。
50.一种核酸，其编码如条项1到32中任一项中所定义的抗体或片段的重链和/或轻链。
51.一种核酸，其编码重链，所述重链包括：与SEQ ID NO:22或66至少70％一致的VH氨基酸序列；和与IGHG4序列至少70％一致，任选地与SEQ ID NO:3或152至少70％一致的C区氨基酸序列。
52.一种核酸，其编码轻链，所述轻链包括：与SEQ ID NO:93或95至少70％一致的VL氨基酸序列；和与IGKC序列至少70％一致，任选地与SEQ ID NO:156至少70％一致的C区氨基酸序列。
53.一种核酸(例如在宿主细胞中，例如CHO或HEK293或Cos细胞)，其包括
a.核苷酸序列，其与选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的重链序列至少70％一致；和/或
b.核苷酸序列，其与分别选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的轻链序列至少70％一致。
54.一种载体，其包括核酸(例如根据条项46到53中任一项所述的核酸)；任选地其中所述载体为CHO或HEK293载体。
本文中本发明的所有核酸均为可在宿主细胞中表达的，所述宿主细胞例如CHO或HEK293或Cos细胞，例如以表达本发明的抗体或片段的可变域或链。
55.一种宿主细胞，其包括核酸(例如根据条项46到53中任一项所述的核酸)或根据条项54所述的载体。
在一实例中，所述抗体或片段包括长度为9、10、11或12个残基的HCDR3，例如10个，例如11个。在一实例中，所述抗体或片段包括长度为7、8或9个残基的LCDR3，例如8个，例如9个。在一实例中，所述抗体或片段的各VH域包括1-11个非生殖系残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个非生殖系残基。在一实例中，所述抗体或片段的各VL域包括3-8个非生殖系残基，例如3、4、5、6、7或8个非生殖系残基。
在一实施例中，本文中的CDR序列是根据Kabat确定。在替代性例中，所述CDR序列是根据IMGT确定。
在一实例中，所选择抗体为CL-148219。在一实例中，所选择抗体为CL-148489。
在一实例中，所选择抗体包括CL-148219或CL-148489的重链。
在一实例中，本发明的抗体或片段的重链为人类γ-1、γ-2、γ-3、γ-4、μ、δ、ε或α同型，优选地γ同型(例如IgG4同型)。在一实例中，本发明的抗体或片段的轻链包括人类κ恒定区。可替代地，在一实例中，本发明的抗体或片段的轻链包括人类λ恒定区。
任选地，所述抗体为包括重链二聚体与轻链二聚体结合的4链抗体。在一实例中，重链包括如本文所公开的一个或多个重链CDR或CDR组合，和/或轻链包括如本文所公开的一个或多个重链CDR或CDR组合，例如来自相同所选择抗体。在一实例中，重链包括如本文所公开的VH域，和/或轻链包括如本文所公开的VL，例如来自相同所选择抗体。在一实例中，重链和轻链来自相同所选择抗体，例如本文中的序列表或本文中的实例中的表中所公开的任何抗体。
在一实例中，所选择抗体包括CL-148219或CL-148489的轻链(和任选地重链)。
在一实例中，所选择抗体包括CL-148219或CL-148489的可变域。
在一实例中，所选择抗体包括CL-148219或CL-148489的VH域。
在一实例中，所选择抗体包括CL-148219或CL-148489的VH和VL域。
任选地，VH是由来源于人类IGHV4-59(例如IGHV4-59*01)、D基因区段(例如IGHD3-10，例如IGHD3-10*01)和IGHJ6(例如IGHJ6*02)基因区段的重组的核苷酸序列编码。任选地，另外或替代地，VL是由来源于人类IGKV2-28(例如IGKV2-28*01)和IGKJ3(例如IGKJ3*01)的重组的核苷酸序列编码。
任选地，VH是由来源于人类IGHV3-9(例如IGHV3-9*01)、D基因区段(例如IGHD3-9，例如IGHD3-9*01)和IGHJ6(例如IGHJ6*02)基因区段的重组的核苷酸序列编码。任选地，另外或替代地，VL是由来源于人类IGKV2-29(例如IGKV2-29*01或IGKV2D-29*01)和IGKJ4(例如IGKJ4*01)的重组的核苷酸序列编码。
在一实例中，所述抗体或片段包括长度为9-12个残基的HCDR3，和/或所述抗体或片段包括长度为7-9个残基的LCDR3。在一实例中，所述抗体或片段包括长度为9、10、11或12个残基的HCDR3，例如10个，例如11个。在一实例中，所述抗体或片段包括长度为7、8或9个残基的LCDR3，例如8个，例如9个。在一实例中，所述抗体或片段的各VH域包括1-11个非生殖系残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个非生殖系残基。在一实例中，所述抗体或片段的各VL域包括3-8个非生殖系残基，例如3、4、5、6、7或8个非生殖系残基。
任选地，抗体或片段与CL-148219(例如呈IgG型式的CL-148219，例如IgG4-PE)竞争与PCSK9(例如人类PCSK9)结合，如通过SPR所测定。
任选地，抗体或片段与CL-148489(例如呈IgG型式的CL-148489，例如IgG4-PE)竞争与PCSK9(例如人类PCSK9)结合，如通过SPR所测定。
任选地，氨基酸取代为保守性氨基酸取代，任选地其中各保守性取代为组(1)到(6)：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异白氨酸(I)、白氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文中的任何SPR例如为在37℃和pH 7.6下的表面等离子体共振(SPR)。
任选地，本文中的任何PCSK9为(例如在活体外测试中)人类PCSK9。
在一实例中，本发明的抗体或片段以例如5×106M-1×s-1；或约5×106M-1×s-1的Ka与人类PCSK9结合。在一实例中，本发明的抗体或片段以例如4或5s-1；或约4或5s-1的Kd与人类PCSK9结合。在一实例中，本发明的抗体或片段以例如0.07或0.14nM；或约0.07或0.14nM的KD与人类PCSK9结合。在一实施例中，片段为Fab片段。在一实施例中，片段为scFv。
如本文所用，如本文所用的“抑制(inhibits/inhibition/inhibiting)”和其类似物，是指拮抗剂(例如抗体或其片段)与表位(例如hPCSK9的表位)结合的能力，所述能力部分地或完全预防另一抗原的结合，如果拮抗剂所结合的表位完全阻断配位体的结合位点，那么完全预防配位体结合(在重迭表位的情况下，其可为物理阻断；或在拮抗剂为较大的情况下，为空间阻断，使得其预防与其不同表位的配位体结合)，且不从循环去除配位体。因此，循环配位体的浓度可呈现为增加。如果拮抗剂所结合的表位部分地阻断配位体的结合位点，那么配位体可以能够结合，但仅为弱结合(在部分抑制的情况下)，或在不同取向上阻断天然结合相互作用。在此情况下，可从循环去除一些配位体，但不如在配位体结合位点完全游离且可用于结合时那么多。因此，抑制是指配位体与受体的物理相互作用。抑制可通过在本文中的其它地方和Mathis(1995)《临床化学(Clinical Chemistry)》41(9),1391-1397中更详细描述的HTRF测量。抑制也可通过流式细胞测量术(在受体在细胞上表达的情况下)或通过ELISA(在受体吸附到培养盘上的情况下)来测量。
任选地，本发明抗体针对结合PCSK9具有1pM到5nM的亲和力(KD)，任选地其中结合通过SPR，使用所述抗体的Fab，在37℃、pH 7.6下来测定。
任选地，抗体针对结合PCSK9具有1×10-5到1×10-3S-1的解离速率(Koff)，任选地其中结合通过SPR，使用所述抗体的Fab，在37℃、pH 7.6下来测定。
任选地，抗体针对结合PCSK9具有1×105到1×107M-1S-1的结合速率(Kon)，任选地其中结合通过SPR，使用所述抗体的Fab在37℃、pH 7.6下来测定。
在一实例中，抗体(例如如Fab)或片段针对结合PCSK9(例如人类PCSK9)具有以下的亲和力(KD)：
(a)2、3、4、5或10pM到3、4或5nM；
(b)1-10pM到5nM；
(c)10pM到3、4或5nM；
(d)50或80pM到200nM；
(e)50或80pM到150nM；或
(f)50或80pM到100nM。
在一实例中，KD为(或为约)5-15pM(例如10pM)。在一实例中，KD为(或为约)2-5nM(例如3nM)。在一实例中，KD为(或为约)100-400pM(例如140或390pM)。
在一实例中，抗体(例如如Fab)或片段针对结合PCSK9(例如人类PCSK9)具有以下的解离速率(Koff)：
(a)1×10-5到5×10-4S-1；
(b)1×10-5到6×10-4S-1；
(c)1×10-5到7×10-4S-1；
(d)1×10-5到8×10-4S-1；
(e)2×10-5到1×10-3S-1；
(f)2×10-5到5×10-4S-1；
(g)2×10-5到6×10-4S-1；
(h)2×10-5到7×10-4S-1；或
(i)2×10-5到8×10-4S-1。
在一实例中，Koff为(或为约)5×10-4S-1(例如当KD为(或为约)2nM到400pM时；当KD为(或为约)2-5nM(例如3nM)时；或当KD为(或为约)100-400pM(例如140或390pM)时)。在一实例中，Koff为(或为约)3×10-5S-1(例如当KD为(或为约)5-15pM(例如10pM)时)。
在一实例中，抗体(例如如Fab)或片段针对结合PCSK9(例如人类PCSK9)具有以下的结合速率(Kon)：
(a)1×105到1×106M-1S-1；
(b)1×105到2×106M-1S-1；
(c)1×105到3×106M-1S-1；
(d)1×105到4×106M-1S-1；
(e)1×105到5×106M-1S-1；
(f)2×105到5×106M-1S-1；
(g)3×105到5×106M-1S-1；
(h)4×105到5×106M-1S-1；
(i)5×105到5×106M-1S-1；或
(j)6×105到5×106M-1S-1。
在一实例中，Kon为(或为约)1或2×10-5M-1S-1(例如当KD为2-5nM(例如3nM)时)。在一实例中，Kon为(或为约)1-4、1、2、3或4×10-6M-1S-1(例如当KD为(或为约)5-400pM(例如140或390pM)或5-15pM(例如10pM)时)。
如条项或本文中的其它方面中所提供，抗PCSK9抗体或片段可以小于50nM、小于40nM、小于30nM的KD(如通过表面等离子体共振所测定)与PCSK9，例如人类PCSK9结合。另一实施例，抗PCSK9抗体或片段可以小于20nM、小于15nM、小于10nM的KD(如通过表面等离子体共振所测定)与PCSK9，例如人类PCSK9结合。抗PCSK9抗体或片段可以小于8nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM或小于1nM的KD(如通过表面等离子体共振所测定)与PCSK9，例如人类PCSK9结合。KD可为0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小、0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小或0.1nM或更小。
在另一实施例中，KD在0.01到1nM范围内，或在0.05到2nm范围内或在0.05到1nM范围内。KD可为关于hPCSK9、食蟹猕猴(即“cyno”)PCSK9和/或小鼠PCSK9。
在另一实施例中，本文所描述的抗PCSK9抗体具有大致0.5到10μM，例如大致1到8μM或大致1到7μM的KON速率(例如如通过SPR所测量，例如在25℃下或在37℃下)。在另一实施例中，KON速率为大致1到5μM，例如大致1μM、大致1.5μM、大致2μM、大致2.5μM或大致3μM。在另一实施例中，KON速率为大致3.5μM、大致4μM、大致4.5μM、大致5μM或大致5.5μM。
在另一实施例中，本文所描述的抗PCSK9抗体具有大致0.01到100mM，例如大致0.1到50mM或大致0.5到50mM的KOFF速率(例如如通过SPR所测量，例如在25℃下或在37℃下)。在另一实施例中，KOFF速率为大致0.5到10mM或大致0.5到10mM，例如大致1mM、大致2mM、大致3mM、大致4mM或大致5mM。在另一实施例中，KOFF速率为大致0.6mM、大致0.7mM、大致0.8mM或大致0.9mM。
任选地，本发明抗体包括人类IgG4恒定区。
优选地，与hPCSK9特异性结合的抗体或其片段不与其它抗原交叉反应(但可任选地与不同PCSK9物种(例如恒河猴、食蟹猕猴或鼠类)交叉反应)。与PCSK9抗原特异性结合的抗体或其片段可例如通过免疫分析、BIAcoreTM或所属领域中的熟练技术人员已知的其它技术鉴别。在抗体或其片段以比与任何交叉反应性抗原更高的亲和力与hPCSK9抗原结合时，如使用实验技术(例如放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析(ELISA))所测定，所述抗体或其片段与hPCSK9抗原特异性结合。通常，特异性或选择性反应将至少为背景信号或噪声的两倍，且更通常大于背景的10倍。关于抗体特异性的论述，参见例如Paul编,1989,《基础免疫学第二版(Fundamental Immunology Second Edition)》,Raven Press,纽约,第332-336页。
涉及抗体与抗原(例如PCSK9)的相互作用的接触氨基酸残基可通过所属领域中的熟练技术人员已知的各种方法确定。
在一个实施例中，如果抗体识别线性表位，那么可产生基于抗原序列的短肽且抗体与此些肽的结合可使用标准技术评定。
在一个实施例中，限制性蛋白水解消化和质谱法可用于鉴别结合表位。
在一个实施例中，通过X射线结晶学鉴别表位的接触残基。在一个实施例中，通过低温电子显微术鉴别表位的接触残基。在一个实施例中，通过限制性蛋白水解消化与质谱法的组合鉴别表位的接触残基。
在另一实施例中，相对于其它抗PCSK9抗体和片段，本文中所描述的抗PCSK9抗体(和片段)提供改进的短暂表达水平。因此，在一个实施例中，抗PCSK9抗体(或片段)，以大致100μg/mL或在大致100到350μg/mL范围内的表达水平，在HEK293细胞，例如HEK293T细胞中表达。在另一实施例中，表达水平高于大致350μg/mL。
在另一实施例中，抗PCSK9抗体(或片段)，以大致100μg/mL或在大致100到350μg/mL范围内的表达水平，在CHO细胞，例如Expi-CHO细胞中表达。在另一实施例中，表达水平高于大致350μg/mL。
在另一实施例中，抗PCSK9抗体(或片段)，以大致100μg/mL或在大致100到350μg/mL范围内的表达水平，在CHO细胞，例如Expi-CHO细胞或CHO-E7 EBNA细胞中表达。在另一实施例中，表达水平高于大致350μg/mL。抗体例如包括形式化为人类IgG1或人类IgG4(例如IgG4-PE)的CL-58838中的任一种的VH和VL域。
在此些表达系统中的任一种中，以在大致0.5mL与3mL之间，例如在大致0.5mL与2mL之间的规模进行表达。在此些表达系统中的任一种中，抗PCSK9抗体(或片段)可从pTT5载体表达。在此些表达系统中的任一种中，抗PCSK9抗体(或片段)可结合脂质转染试剂一起表达，且可任选地在CHO细胞，例如Expi-CHO细胞中表达。在此些表达系统中的任一种中，抗PCSK9抗体(或片段)可结合PEI转染试剂一起表达，且可任选地在CHO细胞，例如CHO-E7EBNA细胞中表达。在此些表达系统中的任一种中，抗PCSK9抗体(或片段)可结合辅助质体(例如AKT辅助质体)一起表达，且可任选地在CHO细胞，例如CHO-E7 EBNA细胞中表达。
在此些表达系统中的任一种中，表达水平在大致100μg/mL与大致1500μg/mL之间，例如在大致100μg/mL与大致1000μg/mL之间、或在大致200μg/mL与大致1000μg/mL之间或在大致350μg/mL与大致1000μg/mL之间。在此些表达系统中的任一种中，表达的下限可为大致100μg/mL、大致200μg/mL、大致300μg/mL或大致400μg/mL。在另一实施例中，表达的下限可为大致500μg/mL、大致600μg/mL、大致700μg/mL或大致800μg/mL。在此些表达系统中的任一种中，表达的上限可为大致2000μg/mL、大致1800μg/mL、大致1600μg/mL或大致1500μg/mL。在另一实施例中，表达的上限可为大致1250μg/mL、大致1000μg/mL、大致900μg/mL或大致800μg/mL。
在另一实施例中，表达系统为Lonza表达系统，例如Lonza
Figure GDA0003210125960000511
系统。在Lonza表达系统中，可以大致30mL到2L，例如50mL到1L或1L到2L的规模，进行表达。在Lonza表达系统中，抗PCSK9抗体(或片段)可结合电穿孔表达，且任选地无任何辅助质体。在Lonza表达系统中，抗PCSK9抗体(或片段)可以大致1g/L、或大致900mg/L、或大致800mg/L或大致700mg/L的水平表达。在另一实施例中，在Lonza表达系统中，抗PCSK9抗体(或片段)可以大致600mg/L或大致500mg/L或大致400mg/L的水平表达。在Lonza表达系统中，抗PCSK9抗体(或片段)可以在大致400mg/L与大致2g/L之间，例如在大致500mg/L与大致1.5g/L之间或在大致500mg/L与大致1g/L之间的水平表达。在另一实施例中，表达水平高于1g/L。在另一实施例中，相对于其它抗PCSK9抗体，抗PCSK9抗体提供改进的半衰期。
在一个实施例中，抗体或片段为人类抗体或片段。在一个实施例中，抗体或片段为完全人类抗体或片段。在一个实施例中，抗体或片段为完全人类单克隆抗体或片段。
在一个实施例中，抗体或片段为人源化抗体或片段。在一个实施例中，抗体或片段为人源化单克隆抗体或片段。
涉及抗体与抗原相互作用的接触氨基酸残基可通过所属领域中的熟练技术人员已知的各种方法确定，例如丙氨酸扫描、蛋白质结晶学、质谱法或如将对于熟练人士显而易见的任何其它技术。
在一个实施例中，所叙述CDR包括一个氨基酸取代，其可为保守性氨基酸取代。在一个实施例中，所叙述CDR包括两个氨基酸取代，其可为保守性氨基酸取代。在一个实施例中，所叙述CDR包括三个氨基酸取代，其可为保守性氨基酸取代。在一个实施例中，所叙述CDR包括四个氨基酸取代，其可为保守性氨基酸取代。在一个实施例中，所叙述CDR包括五个氨基酸取代，其可为保守性氨基酸取代。在一个实施例中，所叙述CDR包括六个氨基酸取代，其可为保守性氨基酸取代。
氨基酸取代包含用不同的天然存在的氨基酸残基置换氨基酸的变化。在用具有类似的与极性、侧链官能团或尺寸有关的特征的其它天然存在的氨基酸置换多肽中所含的氨基酸残基的情况下，此类取代可归类为“保守性”的。此类保守性取代为所属领域中众所周知的。当存在于肽中的氨基酸残基被具有不同特性的氨基酸(例如来自不同群组的天然存在的氨基酸)取代(例如用丙氨酸取代带电或疏水性氨基酸)时，或替代地当天然存在的氨基酸被非常规氨基酸取代时，本发明所涵盖的取代也可为“非保守性”的。
在一个实施例中，保守性氨基酸取代如本文所描述。举例来说，取代可为F取代Y、S或K取代T、A取代P、D或Q取代E、D或G取代N、K取代R、N或A取代G、S或K取代T、N或E取代D、L或V取代I、Y取代F、T或A取代S、K取代R、N或A取代G、R取代K，S、K或P取代A。在另一实施例中，保守性氨基酸取代可为以下：其中F取代Y、A或S取代T、L或V取代I、Y取代W、L取代M、D取代N、A取代G、A或S取代T、N取代D、L或V取代I、Y或L取代F、A或T取代S，和S、G、T或V取代A。
在一实施例中，本发明提供一种药物组合物，其包括本发明的抗PCSK9拮抗剂(例如抗体或其PCSK9结合片段)和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。更确切来说，本发明的组合物进一步包括一种或多种额外治疗剂，例如士他汀。如本文中所提及，“士他汀”(也称为HMG-CoA还原酶抑制剂)为酶HMG-coA还原酶的抑制剂，所述酶介导肝脏中的胆固醇产生。通过竞争性结合HMG-CoA还原酶，士他汀阻止HMG-CoA与酶结合且因此抑制还原酶的活性(例如甲羟戊酸的产生)。士他汀的非限制性实例可包含阿托伐他汀(atorvastatin)(LIPITORTM)、氟伐他汀(fluvastatin)(LESCOLTM)、洛伐他汀(lovastatin)(MEVACORTM、ALTOCORTM)、匹伐他汀(pitavastatin)(LIVALOTM)、普伐他汀(pravastatin)(PRAVACHOLTM)、罗素他汀(rosuvastatin)(CRESTORTM)和辛伐他汀(simvastatin)(ZOCORTM)。士他汀可与其它试剂组合给药，例如依泽替米贝(ezetimibe)与辛伐他汀(simvastatin)的组合。
在一实例中，抗PCSK9拮抗剂、抗体或片段以小于约1×10-8M，优选地小于约1×10-9M的KD与PCSK9结合，所述KD如通过所属领域中已知的常见方法，例如通过在37℃下使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器所测定。
“有效量”意谓研究人员、医生或其它临床医师正寻求的本发明的拮抗剂(例如抗体)或本发明的药物组合物将引起个体、哺乳动物或人类的生物学或医学反应反应或所需治疗效果的量。有效量可根据例如以下的因素变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，和抗体和/或士他汀引起个体中的所需反应的能力。有效量也为治疗有利效果超过任何毒性或不利效果的量。
本发明的抗PCSK9拮抗剂抗体或其抗原结合片段、包括其的组合或药物组合物，可通过肠胃外途径(例如皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内或经皮)给药。可以单次或多次剂量，单独或与药学上可接受的载体和/或稀释剂组合，向个体给药。本发明的药物组合物、组合或拮抗剂可通过所属领域中熟知的方法来制备(例如《雷明顿：科学和药学实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第19版(1995),A.Gennaro等人,MackPublishing Co.)，且可包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂或与其组合。
在一实施例中，个体为人类男性，例如成年人或婴儿。在一实施例中，个体为人类女性，例如成年人或婴儿，例如非妊娠女性或妊娠女性。在一实例中，人类为透析患者。婴儿可为>1月龄的人类。在一实例中，个体为患有确立心血管疾病或患有原发性高脂质血症(例如杂合性家族性高胆固醇血症[HeFH])的成人。在一实例中，个体为患有HoFH的人类，例如成人。
个体可为先前已诊断患有或鉴别为罹患或患有需要治疗的病状或与此类病状相关的一种或多种并发症的个体，且任选地所述个体已针对所述病状或与所述病状相关的一种或多种并发症进行治疗。可替代地，个体也可为先前尚未诊断为患有病状或与所述病状相关的一种或多种并发症的个体。举例来说，个体可为呈现病状或与所述病状相关的一种或多种并发症的一个或多个危险因素的个体，或并未呈现危险因素的个体。
本发明可包括同时或依序给药抗PCSK9拮抗剂和士他汀。在一实例中，拮抗剂和士他汀给药相隔不大于1个月、4周、3周、2周、1周、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天。如本文中所例示，如果相隔不大于7天(例如不大于一天)，那么给药拮抗剂和士他汀可为有效的。在一实例中，相隔不大于10、14、21或28天，向个体给药抗PCSK9拮抗剂和士他汀。
在一实例中，每周2、3或4次给药士他汀。在另一实例中，每月或在8周时段中1、2、3或4次，给药士他汀。
在一实例中，向个体静脉内或皮下给药士他汀和/或抗体或片段。
在一实例中，高脂质血症或高胆固醇血症是在接受或已接受士他汀治疗的个体中，例如对于士他汀治疗的反应低或无反应的患者。
在一实施例中，本发明提供一种抗PCSK9拮抗剂与士他汀的用途，其用于药剂制造。在又一实施例中，本发明提供一种抗PCSK9拮抗剂和士他汀的用途，其用于制造用于治疗或预防例如个体的高脂质血症或高胆固醇血症，例如中度到重度高脂质血症或高胆固醇血症的药剂，所述个体对于士他汀治疗的反应低或无反应。
在一实例中，本发明的抗PCSK9抗体为在HTRF分析中与参考抗体竞争的抗体。举例来说，其中在HTRF分析中，本发明抗体为与人类PCSK9一起预培育且随后与未经标记的参考抗体组合(根据I或II部分)的经标记的抗体，其中抗体之间的竞争通过分析检测。在一实例中，分析使用经AlexaFluorTM 647标记的本发明抗体。在一替代例中，人类PCSK9为经标记的(例如用AlexaFluorTM 647标记，对于与Eu3+穴状化合物-抗生蛋白链菌素的结合，测试抗体用生物素标记，且参考抗体未经标记)。实例参考抗体优选地为CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)。替代物为阿利库单抗或依伏库单抗。
任选地，本发明的抗PCSK9抗体(测试抗体)在HTRF分析中与参考抗体竞争结合人类PCSK9(或结合与参考抗体相同的人类PCSK9的表位)，其中所述分析使用直接地或间接地经标记的测试抗体，所述测试抗体用供体(例如Eu3+穴状化合物)或受体荧光团(例如AlexaFluorTM647)直接地或间接地标记，和使用经供体或受体荧光团标记的目标PCSK9，使得能够在供体与受体之间进行能量传递，由此产生荧光信号且进行检测。在一实例中，其中使用AlexaFluorTM 647标记，通过当测试抗体是在参考抗体存在下时在665nM下荧光信号相对于无参考抗体时的信号降低至少20％，检测竞争。任选地，在665nM下的信号降低至少20、30、40、50、60、70、80或90％。
在一实例中，抗体或片段用于降低在4周时段内向人类或动物个体给药来治疗或预防高脂质血症或高胆固醇血症或本文所公开的任何其它疾病或病状的总剂量。
在一实例中，抗体或片段用于降低到对照个体中所需的1/2到1/3总剂量，除向人类或动物个体给药士他汀而不给药抗PCSK9拮抗剂(例如抗体或片段)来治疗或预防高脂质血症或高胆固醇血症或本文所公开的任何其它疾病或病状以外，所述对照个体在4周时段内接受一致治疗。
在一实例中，抗体或片段用于在治疗期内，例如4周时段，将向人类或动物个体给药的士他汀的给药减量1/2到1/3，以用于治疗或预防高脂质血症或高胆固醇血症骨质疏松或本文所公开的任何其它疾病或病状。
任选地，抗体为IgG4抗体。
任选地，向个体给药的士他汀的剂量在不存在抗PCSK9拮抗剂(例如本发明的抗体或片段)下给药时无效。
在一实例中，本文中的个体难以用士他汀剂量治疗，但当给药本发明的抗体或片段与士他汀剂量时对于高脂质血症或高胆固醇血症或另一疾病或病状的治疗有反应。
因此，在一实例中，本发明的抗体或片段与士他汀剂量组合给药到人类或动物个体，以用于治疗个体的PCSK9相关疾病或病状，其中个体用所述组合治疗，但不可通过在不给药所述抗体或片段下给药士他汀剂量治疗所述疾病或病状。
疾病或病状可为高脂质血症或高胆固醇血症或本文所公开的任何其它疾病或病状，例如选自脂质失调、高脂蛋白血症、高脂质血症；血脂异常；高胆固醇血症、心脏病发作、中风、冠心病、动脉粥样硬化、外周血管疾病、跛行、II型糖尿病、高血压和心血管疾病或病状。
本发明提供一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合。任选地，抗体或片段包括如本文所公开的CDRH1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。任选地，抗体或片段包括如本文所公开的CDRH2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。任选地，抗体或片段包括如本文所公开的CDRH3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。任选地，抗体或片段包括如本文所公开的CDRL1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。任选地，抗体或片段包括如本文所公开的CDRL2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。任选地，抗体或片段包括如本文所公开的CDRL3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。
任选地，抗体或片段包括：CL-148219的CDRH1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148219的CDRH2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；和CL-148219的CDRH3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。任选地，抗体或片段包括：CL-148219的CDRL1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148219的CDRL2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；和CL-148219的CDRL3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。
任选地，抗体或片段包括：CL-148489的CDRH1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148489的CDRH2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；和CL-148489的CDRH3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。任选地，抗体或片段包括：CL-148489的CDRL1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148489的CDRL2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；和CL-148489的CDRL3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。
任选地，抗体或片段包括：CL-148219的VH FR1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148219的VH FR2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148219的VH FR3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；和CL-148219的VH FR4序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。另外或替代地，任选地抗体或片段包括：CL-148219的VL FR1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148219的VL FR2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148219的VL FR3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；和CL-148219的VL FR4序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。
任选地，抗体或片段包括：CL-148489的VH FR1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148489的VH FR2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148489的VH FR3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；和CL-148489的VH FR4序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。另外或替代地，任选地抗体或片段包括：CL-148489的VL FR1序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148489的VL FR2序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；CL-148489的VL FR3序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列；和CL-148489的VL FR4序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。
在一实例中，本文中的各CDR和FR1-4是根据IMGT命名法。在一替代例中，本文中的各CDR和FR1-4是根据Kabat命名法。
任选地，抗体或片段包括人类γ-1重链恒定区，所述恒定区例如包括本文所公开的γ-1重链恒定区序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。举例来说，所述C区包括SEQ ID NO:126，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。
任选地，抗体或片段包括人类γ-2重链恒定区，所述恒定区例如包括序列本文所公开的γ-2重链恒定区序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。举例来说，所述C区包括SEQ ID NO:136，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。
任选地，抗体或片段包括人类γ-3重链恒定区。
任选地，抗体或片段包括人类γ-4重链恒定区，所述恒定区例如包括序列本文所公开的γ-4重链恒定区序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。举例来说，所述C区包括SEQ ID NO:3、144、152或154，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。
任选地，抗体或片段包括人类κ轻链恒定区，所述恒定区例如包括本文所公开的κ轻链恒定区序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。举例来说，所述C区包括SEQ ID NO:156，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。在一实施例中，抗体或片段包括人类γ-4重链恒定区，例如IgG4-PE恒定区。
任选地，抗体或片段包括人类λ轻链恒定区，所述恒定区例如包括本文所公开的λ轻链恒定区序列，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。举例来说，所述C区包括SEQ ID NO:166，或与其至少70、80、85、90、95、96、97、98或99％一致的序列。在一实施例中，抗体或片段包括人类γ-4重链恒定区，例如IgG4-PE恒定区。
目标结合能力、特异性和亲和力(Kd、Koff和/或Kon)可通过所属领域中的任何常规方法来测定，例如通过表面等离子体共振(SPR)。如本文所用，术语“Kd”打算指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常量。
在一个实施例中，表面等离子体共振(SPR)是在25℃下进行。在另一实施例中，SPR是在37℃下进行。
在一个实施例中，SPR是在生理pH下进行，例如约pH7或在pH7.6(例如使用pH7.6的Hepes缓冲盐水(也称为HBS-EP))下。
在一个实施例中，SPR是在生理学盐水平下进行，例如150mM NaCl。
在一个实施例中，SPR是在以体积计不大于0.05％的清洁剂水平下进行，例如在0.05％的P20(聚山梨醇酯20；例如Tween-20TM)和3mM的EDTA存在下。
在一个实例中，SPR是在25℃或37℃下在pH7.6的缓冲液中、150mM NaCl、0.05％清洁剂(例如P20)和3mM EDTA下进行。缓冲液可含有10mM Hepes。在一个实例中，SPR是在25℃或37℃下在HBS-EP中进行。HBS-EP获自Teknova Inc(加利福尼亚；目录号H8022)。
在一个实例中，配位体(例如抗体)的亲和力通过以下步骤使用SPR来测定：
1.将抗小鼠(或物种匹配的其它相关人类、大鼠或非人类脊椎动物抗体恒定区)IgG(例如BiacoreTM BR-1008-38)与生物传感器芯片(例如GLM芯片)偶合，例如通过伯胺偶合；
2.使抗小鼠IgG(或其它匹配物种抗体)暴露于测试IgG抗体以捕获芯片上的测试抗体；
3.使测试抗原在1024nM、256nM、64nM、16nM、4nM以及0nM(即，仅缓冲液)下在芯片的捕获表面上穿过；和
4.和例如在如上文所论述的SPR条件(例如在25℃下在生理缓冲液中)下使用表面等离子体共振测定测试抗体与测试抗原的结合的亲和力。SPR可使用任何标准SPR设备进行，例如通过BiacoreTM或使用ProteOn XPR36TM
Figure GDA0003210125960000581
捕获表面的再生可使用在pH1.7下的10mM甘氨酸进行。此去除所捕获的抗体且使得表面可用于其它相互作用。结合数据可使用标准技术拟合到固有1:1模型，例如使用ProteOn XPR36TM分析软件固有的模型。
在一实例中，本发明的拮抗剂(例如抗体或片段)含于医学容器中，例如小瓶、注射器、IV容器或注射装置(例如眼内或玻璃体内注射装置)。在一实例中，拮抗剂为活体外的，例如在无菌容器中。在一实例中，本发明提供一种试剂盒，其包括本发明的拮抗剂、包装和用于治疗或预防或诊断人类的由PCSK9介导的疾病或病状的使用说明书。在一实例中，说明书指示人类应在向人类给药拮抗剂之前对本发明的PCSK9变体序列进行基因分型。在一实例中，说明书指示人类应在向人类给药配位体之前对本发明的PCSK9变体进行表型分型。在一实例中，人类为中国(例如汉)民族且说明书为中文(例如国语)。
在一实例中，拮抗剂为(或已测定为)PCSK9的中和剂。在一实例中，在人类中(例如在临床试验中)进行测定。在一实例中，在非人类中，例如在小鼠、大鼠、兔、猪、犬、绵羊或非人类灵长类(例如食蟹猕猴、恒河猴或狒狒)中进行测定。
PCSK9的变体可包含WO2015092393中描述为a、f、c、r、p、m、e、h、aj和q的形式。其中和表1、2或6中提供此些变体的序列，参见例如SEQ ID NO:1-27。此参考文献的公开内容和此些序列以引用的方式并入本文中，以可能用于本发明中。在一实例中，拮抗剂与WO2015092393中所公开的PCSK9变体特异性结合。在一实例中，另外或替代地，人类个体表达此种PCSK9变体。
在一实例中，拮抗剂与包括E670G氨基酸的PCSK9变体特异性结合。在一实例中，另外或替代地，人类个体表达此种PCSK9变体。
在一实例中，拮抗剂与包括I474V氨基酸的PCSK9变体特异性结合。在一实例中，另外或替代地，人类个体表达此种PCSK9变体。
本发明的拮抗剂适用于例如特异性结合分析、将人类基因分型或表型分型、PCSK9的亲和纯化和筛选分析以鉴别PCSK9活性的其它拮抗剂。本发明的一些拮抗剂适用于抑制PCSK9与同源人类受体或蛋白的结合，或抑制PCSK9介导的活性。
本发明涵盖具有经修饰的糖基化模式的抗PCSK9(例如PCSK9)抗体拮抗剂。在一些应用中，去除非所需糖基化位点的修饰可为有用的，或例如去除海藻糖部分以增加抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277:26733)。在其它应用中，可进行半乳糖基化修饰以便调节补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一实例中，本发明提供一种药物组合物，其包括本发明的拮抗剂，其中所述拮抗剂为或包括特异性结合PCSK9(例如如本文所描述的罕见变体)的重组人类抗体或其片段，和药学上可接受的载体。在一个实施例中，本发明提供一种组合物，其为本发明抗体的抗体拮抗剂或抗原结合片段与第二治疗剂的组合。第二治疗剂可为以下中的任一种：抗炎剂、抗血管生成剂、止痛剂、利尿剂、化学治疗剂、抗赘生剂、血管舒张剂、血管收缩剂、士他汀、β阻断剂、营养剂、佐剂、抗肥胖剂和抗糖尿病剂。
在一实例中，本发明提供一种用于使用本发明的抗PCSK9拮抗剂(例如本发明抗体或本发明抗体的抗原结合部分)抑制PCSK9活性的方法，其中所述治疗方法包括给药治疗有效量的包括拮抗剂的药物组合物。所治疗的病症为通过去除、抑制或降低PCSK9活性来改进、改善、抑制或预防的任何疾病或病状。
段落：
本发明提供在段落1等中阐述的以下方面。
1.一种抗体或片段，其包括与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(PCSK9)特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括由来源于将人类VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段重组的核苷酸序列编码的VH域，其中所述VH基因区段选自IGHV4-31、IGHV4-59、IGHV4-4和IGHV3-9。
2.根据段落1所述的抗体或片段，其中(i)所述VH基因区段为IGHV4-31且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD3-9；或(ii)所述VH基因区段为IGHV4-59且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD3-10；或(iii)所述VH基因区段为IGHV4-4且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD2-15；或(iv)所述VH基因区段为IGHV3-9且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD3-9。
3.根据段落1或2所述的抗体或片段，其中所述JH基因区段为人类基因区段IGHJ6。
4.根据前述段落中任一项所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括选自SEQ IDNO:271、285、15、77、29、91、211和225的CDRH3序列。
5.根据前述段落中任一项所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括VH域，所述VH域包括SEQ ID NO:259、1、65或199。
6.根据前述段落中任一项所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括与包括SEQID NO:289的VL域配对的VH域，所述VH域包括SEQ ID NO:259。
7.根据段落1到5如中任一项所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括与包括SEQ ID NO:349的VL域配对的VH域，所述VH域包括SEQ ID NO:319。
8.一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合且包括根据前述段落中任一项所述的抗PCSK9抗体的CDRH3序列，或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列。
9.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述序列。
10.根据段落9所述的抗体或片段，其中所述VH域包括：(i)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列；和(ii)所述所选择抗体的CDRH1序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH1序列。
11.根据段落9或10所述的抗体或片段，其中所述VH域包括：(iii)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列；和(iv)所述所选择抗体的CDRH2序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH2序列。
12.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其包括与PCSK9特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VH域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
13.根据段落9、10、11或12所述的抗体或片段，其中所述所选择抗体为CL-274711或CL-148219QLT。
14.根据前述段落中任一项所述的抗体或片段，其包括所述VH域的第一拷贝和第二拷贝。
15.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其包括与PCSK9特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括由来源于人类VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码的VL域，其中所述VL基因区段选自IGKV3-11、IGKV2-28和IGKV2-29。
16.根据段落15所述的抗体或片段，其中所述JL基因区段为选自IGKJ4、IGJK3和IGKJ1的人类基因区段。
17.一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合且包括根据前述段落中任一项所述的抗PCSK9抗体的CDRL3序列，或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRL3序列。
18.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括VL域，所述VL域包括选自SEQ ID NO:301、315、47、107、61、121、241和255的CDRL3序列，或包括3、2或1个氨基酸取代的所述所选择CDRL3序列。
19.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述序列。
20.根据段落19所述的抗体或片段，其中所述VL域包括：(i)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3序列(和任选地CDRH3)；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR3序列；和(ii)所述所选择抗体的CDRL1(和任选地CDRH1)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR1序列。
21.根据段落19或20所述的抗体或片段，其中所述VL域包括：(iii)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR3序列；和(iv)所述所选择抗体的CDRL2(和任选地CDRH2)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR2序列。
22.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其包括与PCSK9特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VL域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
23.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的重链氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
24.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的轻链氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
25.根据段落23所述的抗体或片段，其包括所述所选择抗体的轻链氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
26.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其与人类PCSK9表位特异性结合，所述表位与前述段落中任一项所述的抗体所结合的表位一致。
27.根据段落26所述的抗体或片段，其中所述表位通过无关氨基酸扫描，或通过X射线结晶学鉴别。
28.根据段落27所述的抗体或片段，其中通过在无关氨基酸扫描，例如丙氨酸扫描中，如通过SPR所测定亲和力降低至少10倍，来定义所述表位的接触残基。
29.一种抗体或片段(任选地根据前述段落中任一项所述的)，其与根据前述段落中任一项所述的抗体竞争与人类PCSK9结合。
30.根据前述段落中任一项所述的抗体或片段，其与包括选自SEQ ID NO:189-194的氨基酸序列的PCSK9特异性结合。
31.根据前述段落中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段包括人类恒定区，任选地IgG4恒定区或IgG1恒定区。
32.根据段落31所述的抗体或片段，其中所述恒定区为IgG4-PE恒定区，任选地所述恒定区包括SEQ ID NO:3或152的氨基酸序列。
33.根据前述段落中任一项所述的抗体或片段，其进一步包括特异性结合另一目标抗原，任选地ANGPTL3的抗原结合位点。
34.一种如在前述段落任一项中所定义的抗PCSK9抗体或片段，其用于治疗或预防个体的PCSK9介导的疾病或病状(任选地高胆固醇血症)。
35.根据段落34所述的抗PCSK9抗体或片段，其中所述疾病或病状选自高胆固醇血症、高脂质血症、高胆固醇血症、血脂异常、胆汁郁积性肝病、肾病综合征、甲状腺功能减退、肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化或心血管疾病。
36.根据段落34或35所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段与士他汀同时或依序向所述个体给药。
37.一种一定量的抗PCSK9抗体或片段和一定量的士他汀的组合(任选地包括多个剂量的所述抗体和/或士他汀)，其中所述抗体或片段是根据段落1到36中的任一项。
38.根据段落1到37中任一项所述的抗体、片段或组合，其用于治疗或预防先前已以第一剂量以士他汀治疗方案治疗的个体的高胆固醇血症的方法中，其中所述方法包括降低向所述个体给药的士他汀的剂量或不向所述个体给药士他汀，其中所述方法包括向所述个体给药所述抗体或片段。
39.根据段落37或38所述的组合，其中包括日剂量为10到20mg(例如10mg)；或<60mg(例如40mg)的士他汀。
40.根据前述段落中任一项所述的抗体、片段或组合，其用于向罹患胆固醇升高的人类或动物个体给药，以用于在所述个体已接受抗PCSK9抗体或片段之后降低个体中的血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。
41.一种如前述段落中任一项所定义的抗体、片段或组合的用途，其用于制造用于向个体给药用来治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状，任选地高胆固醇血症的药剂。
42.一种治疗或预防个体的PCSK9介导的疾病或病状(任选地高胆固醇血症)的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的如段落1到40中任一项中所定义的抗体、片段或组合，其中由此治疗或预防所述PCSK9介导的疾病或病状。
43.根据段落41所述的用途或根据段落42所述的方法，其中所述PCSK9介导的疾病或病状为高胆固醇血症。
44.根据段落34到43中任一项所述的抗体、片段、组合、用途或方法，其进一步包括向所述个体给药其它疗法，例如其它治疗剂，任选地其中所述其它治疗剂选自以下组成的组：
a.士他汀；
b.ANGPTL3抑制剂(例如抗ANGPTL3抗体，例如恩维纳单抗)
c.非贝特；
d.胆酸螯隔剂；
e.烟碱酸；和
f.烟酸。
45.一种药物组合物，其包括如段落1到40和44中任一项中所定义的抗体、片段或组合，和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，和任选地与选自段落44中所叙述的药剂的其它治疗剂组合。
46.根据段落45所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防PCSK9介导的病状或疾病，任选地高胆固醇血症。
47.根据段落45或46所述的药物组合物，其与标签或使用说明书组合，以治疗和/或预防人类的所述疾病或病状；任选地其中所述标签或说明书包括销售授权编号(任选地FDA或EMA授权编号)；任选地其中所述试剂盒包括含所述抗体或片段的IV或注射装置。
48.一种核酸，其编码如段落1到33中任一项中所定义的抗体或片段的VH域和/或VL域。
49.一种核酸，其编码VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VH域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
50.一种核酸，其编码VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VL域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
51.一种核酸，其包括与SEQ ID NO:260或320的序列至少70％一致的核苷酸序列。
替代地：
一种核酸，其包括与SEQ ID NO:2、66或200的序列至少70％一致的核苷酸序列。
52.一种核酸，其编码如段落1到33中任一项中所定义的抗体或片段的重链和/或轻链。
53.一种核酸，其编码重链，所述重链包括：与SEQ ID NO:259或319至少70％一致的VH氨基酸序列；和与IGHG4序列至少70％一致，任选地与SEQ ID NO:3或152至少70％一致的C区氨基酸序列。
替代地：
一种核酸，其编码重链，所述重链包括：与SEQ ID NO:1、65、至少70％一致的VH氨基酸序列；和与IGHG4序列至少70％一致，任选地与SEQ ID NO:3或152至少70％一致的C区氨基酸序列。
54.一种核酸，其编码轻链，所述轻链包括：与SEQ ID NO:289或349至少70％一致的VL氨基酸序列；和与IGKC序列至少70％一致，任选地与SEQ ID NO:156至少70％一致的C区氨基酸序列。
替代地：
一种核酸，其编码轻链，所述轻链包括：与SEQ ID NO:33、95和229至少70％一致的VL氨基酸序列；和与IGKC序列至少70％一致，任选地与SEQ ID NO:156至少70％一致的C区氨基酸序列。
55.一种核酸(例如在宿主细胞中，例如CHO或HEK293或Cos细胞)，其包括
a.核苷酸序列，其与选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的重链序列至少70％一致；和/或
b.核苷酸序列，其与分别选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的轻链序列至少70％一致。
56.一种载体，其包括核酸(例如根据段落48到55中任一项所述的核酸)；任选地其中所述载体为CHO或HEK293载体。
57.一种宿主细胞，其包括核酸(例如根据段落48到55中任一项所述的核酸)或根据段落56所述的载体。
58.一种如本文所描述的抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、用途或方法。
在本文中的任何实施例中，优选地所选择抗体为CL-274711。
治疗性给药和调配物
本发明提供治疗性组合物，其包括抗PCSK9拮抗剂，例如本发明的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的治疗性组合物的给药将与适合的载体、赋形剂和并入调配物中以提供改进的转移、递送、耐受性和其类似物的其它药剂一起给药。可于所有医药化学家已知的处方集中查询众多适当调配物：《雷明顿氏医药科学(Remington′s PharmaceuticalSciences)》,Mack Publishing Company,宾夕法尼亚州伊斯顿。此些调配物包含例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子型)的小泡(例如LIPOFECTINTTM)、DNA结合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。还参见Powell等人“《用于肠胃外调配物的赋形剂的概要(Compendium of excipients for parenteralformulations)》”PDA(1998)《药学科学技术杂志(J Pharm Sci Technol)》52:238-311。
剂量可视年龄和待给药的个体的身材、目标疾病、病状、给药途径和其类似物而变化。当使用拮抗剂，例如本发明的抗体来治疗成年患者的与PCSK9相关的各种病状和疾病时，有利的是，通常以约0.01到约20mg/kg体重的单一剂量静脉内给药本发明的抗体，更优选地约0.02到约7、约0.03到约5或约0.05到约3mg/kg体重。视病状的严重程度而定，可调整治疗的频率和持续时间。
已知各种递送系统，且可用以给药本发明的拮抗剂或药物组合物，例如通过例如包封于脂质体、微米粒子、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞中经受体介导的内吞作用提供的拮抗剂(参见例如Wu等人(1987)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》262:4429-4432。引入方法包含(但不限于)皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。拮抗剂或组合物可通过任何便利途径给药，例如通过输注或快速注射，通过经上皮或黏膜皮肤内层(例如，口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收，且可连同其它生物活性剂一起给药。给药可为全身性或局部的。
拮抗剂或药物组合物也可在小泡中，确切来说脂质体中递送(参见Langer(1990)《科学(Science)》249:1527-1533；Treat等人(1989)，《以脂质体，感染性疾病和癌症的疗法(Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer)》,Lopez Berestein和Fidler(编),Liss,纽约,第353-365页；Lopez-Berestein,同上,第317-327页；一般参见同上)。
在某些情况中，拮抗剂或药物组合物可在控制释放系统中递送。在一个实施例中，可使用泵(参见Langer，见上文；Sefton(1987)《生物医学工程评论(CRCCrit.Ref.Biomed.Eng)》.14:201)。在另一实施例中，可使用聚合材料；参见《控制释放的医学应用(Medical Applications of Controlled Release)》,Langer和Wise(编),CRCPres.,佛罗里达州博卡拉顿(1974)。在又另一实施例中，可将控制释放系统接近组合物的目标放置，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,《控制释放的医学应用(Medical Applications of Controlled Release)》中,见上文,第2卷,第115-138页,1984)。
可注射制剂可包含用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射；滴液输液等的剂型。此些可注射制剂可通过众所周知的方法制备。举例来说，可注射制剂可例如通过将上文所描述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于常规地用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助剂的等张溶液等，其可与适当的增溶剂组合使用，增溶剂为例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物)]等，作为用于注射液的水性介质。采用例如芝麻油、大豆油等作为油性介质，其可与增溶剂(例如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等)组合使用。优选将由此制备的注射液填充于适当安瓿中。本发明的药物组合物可用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外，就皮下递送来说，笔式递送装置易于应用于递送本发明的药物组合物。此类笔式递送装置可为可再使用的或抛弃式的。可再使用的笔式递送装置一般利用含有药物组合物的可更换套筒。在套筒内的所有药物组合物已给药且套筒为空后，空套筒可容易地丢弃且用含有药物组合物的新套筒更换。接着可再使用笔式递送装置。在抛弃式笔式递送装置中，不存在可更换套筒。实际上，抛弃式笔式递送装置预填充有保存于装置内的储集器中的药物组合物。在清空储集器的药物组合物后，丢弃整个装置。
许多可再用的笔式和自助注射器递送装置应用于皮下递送本发明的拮抗剂或药物组合物。仅举数例，实例包含(但当然不限于)AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.，英国伍德斯托克)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems，瑞士伯格多夫)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.，印第安纳州印第安纳波利斯)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk，丹麦哥本哈根)、NOVOPEN JUNIORTM(NovoNordisk，丹麦哥本哈根)、BDTM笔(Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖)、OPTIPENTTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTTM(Sanofi-Aventis，德国法兰克福)。应用于皮下递送本发明的药物组合物的抛弃式笔式递送装置的实例包含(但当然不限于)SOLOSTARTM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)。
有利地，上文所描述的用于口服或肠胃外用途的药物组合物制备成适于配合拮抗剂剂量的单位剂量的剂型。此类呈单位剂量的剂型包含例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含有的前述抗体的量一般为每单位剂量的剂型约5到约500mg；尤其在注射液形式中，优选的是，前述抗体含于约5到约100mg和约10到约250mg另一剂型中。
为方便起见，下文提供本说明书、实例和随附权利要求书中所用的一些术语和短语的含义。除非另外陈述或上下文暗示，否则以下术语和短语包含下文所提供的含义。提供所述定义以辅助描述特定实施例，且不打算限制所主张的发明，因为本发明的范围仅由权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。如果在所属领域中术语的用法与本文提供的其定义之间存在显而易见的不一致，那么应以本说明书内提供的定义为准。
为方便起见，此处收集本文中、说明书、实例和随附权利要求书中采用的某些术语。
“降低(decrease/reduced/reduction)”在本文中均用以意谓降低统计学上显著的量。在一些实施例中，“降低(reduce/reduction/decrease)”通常意谓相较于参考水平(例如不存在既定治疗)降低至少10％，且可包含例如降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“降低”并不涵盖相较于参考水平完全降低。降低可优选地降至对于无既定病症的个体来说正常范围内可接受的水平。举例来说，然而出于减少或降低胆固醇水平的目的，例如降低约5-10个点可视为“降低(decrease/reduction)”。
在本发明的所有实施例的某些方面中，使用术语“抑制”。抑制是指相较于参考水平(例如不存在既定治疗)降低至少10％，且可包含例如降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多，包含相较于参考水平100％抑制。“完全抑制”是指相较于参考水平100％抑制。
术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中均用于意谓增加统计学上显著的量。在一些实施例中，术语“增加(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”可意谓相较于参考水平增加至少10％，例如相较于参考水平增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或到多且包含100％增加，或相较于参考水平在10％-100％之间的任何增加，或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或相较于参考水平在2倍与10倍之间的任何增加或更大。在标记物或症状的上下文中，“增加(increase)”为此类水平的统计学上显著的增加。
如本文所用，术语“大体上”是指呈现所关注的特征或特性的全部或接近全部界限或程度的定性状况。生物领域中的一般技术人员应理解，生物和化学现象很少(如果曾经)进行完全和/或继续进行到完全或达成或避免绝对结果。因此本文中使用术语“大体上”以获得许多生物和化学现象中所固有的完整性的可能缺乏。为了去除疑问，“大体上”可指所关注的特征或特性的至少90％界限或程度，例如至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或更大。
本申请通篇所引用的所有专利和其它公开，包含参考文献、所颁予的专利、公开专利申请和同在申请中的专利申请，均以引用的方式明确并入本文中，目的在于描述和公开例如此类公开中所描述的可结合本文所描述的技术使用的方法。此些公开仅提供其在本申请的申请日之前的公开内容。就此而言，不应理解为承认本发明人因先前发明或任何其它原因而无权先于此公开。关于日期的所有陈述或关于此些文献的内容的表述是基于本申请人可用的信息且不构成任何关于此些文献的日期或内容的正确性的承认。
本发明的实施例的描述并不打算为穷尽性的或将公开内容限制于所公开的确切形式。虽然本文中出于说明性目的描述本发明的特定实施例和实例，但相关领域的熟练技术人员将认识到，在本发明的范围内可进行各种等效修改。举例来说，虽然方法步骤或功能以指定次序呈现，但替代实施例可以不同次序执行功能，或可大体上同时执行功能。本文所提供的本发明教示内容可视需要应用于其它程序或方法。可组合本文所描述的各种实施例以提供其它实施例。本发明的方面可被修改(如果需要)以采用以上参考文献和申请的组合物、功能和概念，得到本发明的其它实施例。此外，由于生物学功能等效性考虑因素，因此可对蛋白质结构进行一些变化而不影响生物学或化学作用的种类或量。可鉴于实施方式来对本发明进行此些和其它变化。所有此类修改均打算包含在随附权利要求书的范围内。
前述实施例中任一个的的特定要素可加以组合或取代成其它实施例中的要素。此外，虽然与本发明的某些实施例相关的优点已在此些实施例的上下文中描述，但其它实施例也可呈现此类优点，且并非所有实施例必定需要呈现属于本发明范围内的此类优点。
应理解，本文所描述的特定配置、方面、实例、条项和实施例以说明方式显示且并不作为本发明的限制。可在不背离本发明的范围的情况下在各种实施例中采用本发明的主要特征。所属领域中的熟练技术人员应认识到或能够仅使用常规研究确定本文所描述的特定程序的许多等效物。此类等效物视为在本发明的范围内且由权利要求书所涵盖。本说明书中提及的所有公开和专利申请指示本发明所属的所属领域中的熟练技术人员的技术水平。所有公开和专利申请均以引用的方式并入本文中，其程度如同各个别公开或专利申请特定且单独地指示为以引用的方式并入一般。当与术语“包括”结合用于权利要求书和/或说明书中时，词语“一(a/an)”的使用可意谓“一个(one)”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义相符。尽管本发明支持涉及仅替代和“和/或”的定义，但除非明确指示为仅替代或替代相互排斥，否则术语“或”在权利要求书中的使用用于意谓“和/或”。在本申请通篇中，术语“约”用于指示值包含装置、用以测定所述值的方法的固有偏差或研究个体当中存在的偏差。
如本说明书和权利要求书中所用，词语“包括(comprising)”(和包括的任何形式，例如“包括(comprise/comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，例如“具有(have/has)”)、“包含(including)”(和包含的任何形式，例如“包含(includes/include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，例如“含有(contains/contain)”)为包括性或开放性的，且不排除额外未列出的要素或方法步骤
除非从上下文另外显而易见，否则本发明的任何部分可与本发明的任何其它部分组合阅读。
本文中所公开或主张的所有组合物和/或方法可根据本发明在无不当实验的情况下制备和执行。虽然已根据优选实施例描述本发明的组合物和方法，但所属领域中的熟练技术人员应清楚变化可在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下应用于本文所描述的组合物和/或方法和方法的步骤或步骤顺序中。对所属领域中的熟练技术人员显而易见的所有此类类似取代和修改均视为在由随附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。
在以下非限制性实例中更详细地描述本发明
实例
血浆LDL胆固醇(Plasma LDL cholesterol；LDL-C)为心血管病的主要危险因素，在欧洲心血管病每年导致4百万人死亡。血浆LDL-C的清除主要在肝中通过LDL受体(LDLreceptor；LDLR)进行。LDLR不断地将LDL-C从血浆内化到肝细胞中，且通过再循环返回到细胞表面继续进行LDL-C吸收。LDLR的表面水平受PCSK9负调节，所述PCSK9直接与LDLR结合且促进溶酶体介导的LDLR降解。LDLR表面暴露于LDL-C减少降低LDL-C内化于肝细胞中，且因此增加血浆LDL-C，此会引起斑块形成和血流堵塞。近年来，靶向PCSK9成为一种控制血浆LDL-C水平的有前景的策略。
我们研发出阻断PCSK9功能且具有治疗潜能的单克隆抗体。我们首先用人类和小鼠PCSK9蛋白免疫KymiceTM(参见例如WO2011/004192和Lee等人,《自然生物技术学刊(NatBiotechnol.)》2014年4月；32(4):356-63.doi:10.1038/nbt.2825.电子版2014年3月16日,“《小鼠免疫球蛋白基因座的完全人类化实现有效治疗抗体研究(Complete humanizationof the mouse immunoglobulin loci enables efficient therapeutic antibodydiscovery)》”，产生交叉反应性抗体。为了避免His标签的非所需效果，我们制作一种细胞系，所述细胞系主动分泌不具有His标签的人类和小鼠PCSK9蛋白的原生形式用于免疫。在免疫之后，通过下一代定序检索来自抗原特异性B细胞的抗体序列且进行计算机分析以鉴别进展的有利抗体。在表达之后，通过依序活体外筛选级联，基于交叉反应性结合、亲和力和功能，筛选和选择抗体。确认与人类PCSK9变体的结合，以确保在大部分人类群体中的功效。根据可发展性的观点，表征所选择抗体的生理特征。在高脂质血症的小鼠模型中，相较于基准测试抗体，两种突出抗体(CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT))在降低血浆非HDL胆固醇而不改变HDL胆固醇上显示优良功能，且持续作用时间更长。总之，我们成功地诱发针对PCSK9的交叉反应性抗体，且鉴别出活体外和活体内阻断PCSK9功能的至少两种优良完全人类单克隆抗体。
实例1：通过活体外分析对抗体的鉴别
在KymiceTM中进行五次免疫活动，且进行活体外分析，包含以下选择标准：
(a)选择针对人类PCSK9(human PCSK9；hPCSK9)、食蟹猕猴PCSK9(cynomolgusmonkey PCSK9；cynoPCSK9)和小鼠PCSK9(mouse PCSK9；mPCSK9)的交叉反应性结合剂；
(b)测定针对hPCSK9a和mPCSK9的抗体亲和力，且优先处理具有较高亲和力的抗体；
(c)在活体外基于细胞的分析中，证实抗体的中和降低人类肝细胞系(HepG2)中的荧光hPCSK9的内化；和
(d)同时，在与(c)相同的活体外基于细胞的分析中，确定抗体恢复HepG2细胞中的LDL吸收的功能。
两种抗体(CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT))在活体外和活体内显示尤其有前景的功能(实例2)。
CL-148219
相较于基准，CL-148219显示更强的中和活性以及更高的恢复活体外LDL吸收的能力，从而表明CL-148219可直接阻断PCSK9与LDLR之间的相互作用。在高脂质血症的小鼠模型(E3L.CETP小鼠；de Knijff,Westerterp,Ason,van den Hoek和Kühnast)中，CL-148219降低血浆非HDL胆固醇的效果优于基准测试Ab，且具有更长的作用持续时间。参见图1-4。
CL-148489
在活体外基于细胞的分析中，CL-148489中等中和hPCSK9但具有显著的恢复LDL吸收的能力，从而表明此抗体可间接干扰PCSK9与LDLR的结合，可能是通过阻断HSPG与PCSK9结合。在高脂质血症的小鼠模型(E3L.CETP小鼠)中，此抗体也比基准更优选地降低血浆非HDL胆固醇，具有类似作用持续时间。参见图5-8。
基准为：阿利库单抗hIgG4-PE(SEQ ID No:195和196)和“Regeneron pH-D”(一种pH依赖性(内部与外部溶酶体的差异PCSK9结合)抗PCSK9 hIgG4-PE抗体)(SEQ ID No:197和198)。
抗体的VH和VL区来源于以下基因区段的重组：
Figure GDA0003210125960000721
参考文献：
de Knijff,P.等人,1991,“《在扩展多代家谱中，与脂蛋白元E3-Leiden相关联的家族性异常β-脂蛋白血症(Familial dysbetalipoproteinemia associated withapolipoprotein E3-Leiden in an extended multigeneration pedigree)》”,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》88:643-655；
Westerterp,M.等人,2006,“《在APOE*3-Leidenmice中，胆甾醇酯转移蛋白降低高密度脂蛋白且严重加重动脉粥样硬化(Cholesteryl ester transfer protein decreaseshigh-density lipoprotein and severely aggravates atherosclerosis in APOE*3-Leidenmice)》”,《动脉粥样硬化、血栓形成和血管生物学(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.)》26:2552-2559；
Ason,B.等人,2011,“《在不存在ApoE下，PCSK9抑制无法改变肝LDLR、循环胆固醇和动脉粥样硬化(PCSK9 inhibition fails to alter hepatic LDLR,circulatingcholesterol,and atherosclerosis in the absence of ApoE)》”,《脂质研究杂志(JLipid Res.)》2011年4月,52(4):679-687；
van den Hoek AM.等人,2014,“《APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠作为医药治疗代谢综合征的模型(APOE*3Leiden.CETP transgenic mice as model forpharmaceutical treatment of the metabolic syndrome)》”,《糖尿病肥胖与代谢(Diabetes Obes Metab.)》2014年6月；16(6):537-44；和
Kühnast,S等人,2014,“《阿利库单抗抑制动脉粥样硬化，改进斑块形态且增强士他汀的效果(Alirocumab inhibits atherosclerosis,improves the plaquemorphology,and enhances the effects of a statin)》”,《脂质研究杂志(J LipidRes.)》2014年10月,55(10):2103-2112。
实例2：活体内分析
在此研究中，我们使用APOE*3Leiden.胆甾醇酯转移蛋白(cholesteryl estertransfer protein；CETP)小鼠，其含有小鼠ApoE、人类突变体APOE3*Leiden和功能性LDLR。此些小鼠已显示极佳的翻译价值，其中模型中所见的胆固醇增加可通过在患者中有效的相同疗法治疗，且显示与可在临床中获得的那些类似的最大LDL水平降低。
对CETP小鼠喂食高脂饮食4周，且接着在第0天接受单一剂量的抗体、同型对照或标准护理(阿利库单抗，一种经FDA批准的PCSK9抑制剂)。接着，在第18天，小鼠接受第二较高剂量(半对数)。在第0、3、7、14、21和28天，测量个别动物胆固醇水平。在第28天，对来自末端放血的合并群组样本进行完全脂质概况分析。
在我们的所测试抗体的10种中，两种(CL-148219和CL148489)降低胆固醇水平大于等效剂量的阿利库单抗，其中一种CL-148219显示更长作用持续时间。总之，我们已鉴别出在PCSK9抑制剂类别中潜在最优选的两者。
方法
关于研究设计，参见图9。将一百二十八只雌性8-14周龄APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠置于含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食(Western-type diet；WTD)中。在4周磨合期之后，将24只低反应小鼠移出研究，且将动物分组(n＝6-8)，在4h禁食之后(t＝0)，进行年龄、体重、血浆胆固醇、甘油三酯和HDL-胆固醇匹配。在t＝0时，对小鼠皮下给药3mg/kg的同型对照、基准测试或我们的抗PCSK9抗体。我们的抗体中的四种(先前活体外筛选鉴别为极佳的)，在t＝0时具有额外1mg/kg剂量组。在t＝18天，小鼠以比第一剂量高1/2对数剂量(即，第一剂量3mg/kg，第2剂量10mg/kg)接受第2皮下剂量的相同抗体。
每周两次测量体重和食物摄入。在初始剂量后第0、3、7、14、21和28天，收集4h禁食血浆样本以用于测定血浆总胆固醇、HDL-胆固醇和甘油三酯。计算血浆非HDL-胆固醇值。在t＝28天，在最后血液收集之后，处死小鼠，且收集血浆和肝组织。测定关于来自群组合并血浆样本的FPLC分数的脂蛋白概况。
统计数据：双向annova和Dunnetts事后分析-Graphpad PrismTM。
结果
总胆固醇(图10)
在研究期间，同型对照组显示16-22mmol/L的血浆总胆固醇水平。
相较于同型对照抗体，在第3天，在3mg/kg剂量(-34.9％)中；和在第21和28天(分别在第二次注射后3和10天)，在10mg/kg剂量(分别为-33.2％和-32.3％)中，阿利库单抗显著地降低总胆固醇。
在第3天，在1和3mg/kg剂量(分别为-36.4％和-47.0％)中；和在第7天，在3mg/kg剂量(-32.6％)中，CL-148219显著地降低总胆固醇。在第二剂量之后，在第21天和第天，在3mg/kg剂量(分别为-33.4％和-27.1％)和10mg/kg剂量(分别为-46.3％和-49.6％)中，CL-148219显著地降低总胆固醇。
在第3天和第21天(在第二次注射后3天)，在3mg/kg剂量(分别为47.3％和-32.3％)中；和在第二剂量之后，在第21天和第28天，在10mg/kg剂量(分别为-42.9％和-56.0％)中，CL-148489显著地降低总胆固醇。
总非HDL胆固醇(图11)
在研究期间，同型对照组显示15.2-21.3mmol/L的非HDL-胆固醇水平。
相较于同型对照抗体，在第3天，在3mg/kg剂量(-36.5％)中；和在第21和28天(分别在第二次注射后3和10天)，在10mg/kg剂量(分别为-35.5％和34.3％)中，阿利库单抗显著地降低非HDL-胆固醇。
在第3天，在1和3mg/kg剂量(分别为-37.7％和-49.1％)中；和在第7天，在3mg/kg剂量(-33.5％)中，CL-148219显著地降低非HDL-胆固醇。在第二次注射之后，在第21天和第28天，在3mg/kg(分别为-34.4％和-29.2％)和10mg/kg剂量(分别为-49.6％和-51.8％)中，CL-148219显著地降低非HDL-胆固醇。
在第3天和第21天(在第二次注射后3天)，在3mg/kg剂量(分别为-49.4％和-35.0％)中；和在第二剂量之后，在第21天和第28天，在10mg/kg剂量(分别为-45.5％和-58.5％)中，CL-148489显著地降低非HDL-胆固醇。
HDL胆固醇(图12)
抗体中无一种对于HDL胆固醇具有效果。
甘油三酯(图13)
在研究期间，同型对照组中的血浆三酸甘油酯水平保持稳定。虽然相较于同型对照组CL-148219，抗体中无一种显著地影响血浆甘油三酯，但Cl-148489和阿利库单抗在第28天显示降低三酸甘油酯水平的趋势。
磷脂和胆固醇概况(图14)
合并样本的磷脂(A)和胆固醇(B)概况显示如下：分数4-8视为VLDL，9-15视为LDL且16-24视为HDL。未进行统计，这是因为每组使用一个合并样本进行测量。脂蛋白概况确认，阿利库单抗、CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)降低VLDL-胆固醇和LDL-胆固醇，且对于HDL-胆固醇无效果。
结论
·我们的抗体对于动物具有良好耐受性，在研究期间显示正常行为且无不适迹象；
·组织切片显示无大体病理学；
·体重和食物摄入不受抗体中的任一种显著影响；
·肝重量不受抗体中的任一种显著影响；
·相较于同型对照组，CL-148219和CL-148489以剂量依赖性方式显著地降低血浆总胆固醇和血浆非HDL-胆固醇。在用此些抗体处理的小鼠中，脂蛋白概况显示血浆VLDL-胆固醇降低；
·相较于同型对照组，我们的抗体中无一种显著影响HDL-胆固醇。
·抗体中无一种显著地影响血浆三酸甘油酯水平，尽管相较于同型对照组，阿利库单抗、CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)显示降低血浆三酸甘油酯水平的趋势。
实例3和4
小鼠
对于实例3，培育雌性APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠。将小鼠圈养于动物室中的马卡龙(macrolon)笼(3或4只小鼠/笼)中；相对湿度40-70％，温度20-24℃，光循环7am到7pm。向小鼠随意供应食物和灭菌自来水。
对于实例4，使用在实验当天体重为18-22g的C57BL/6小鼠。将动物以2-4组圈养于在标准条件下的聚砜笼(底板面积＝1500cm2)：室温(22±2℃)，湿度(55±10％)，光/暗循环(12h/12h)，空气置换(15-20体积/小时)，水和食物随意取用。
血浆胆固醇、脂蛋白和三酸甘油酯分析
总血浆胆固醇使用胆固醇CHOD-PAP试剂盒(Roche，德国曼海姆)测定，且三酸甘油酯使用三酸甘油酯GPO-PAP试剂盒(Roche，德国曼海姆)测定。为了测定血浆HDL-胆固醇，含ApoB的脂质使用PEG-6000/甘氨酸沉淀，随后使用胆固醇CHOD-PAP试剂盒(Roche，德国曼海姆)进行定量。使用AKTA设备(GE Healthcare)，通过FPLC分析来测量脂蛋白概况。对于合并群组合并样本进行分析。基于滞留时间收集级分(Fraction)，且使用来自(Roche，德国曼海姆)的胆固醇CHOD-PAP试剂盒和磷脂试剂盒(Instruchemie，荷兰代尔夫宰尔)测量各级分中的胆固醇与磷脂。
血清抗体浓度
使用捕获ELISA测定血清抗体浓度。在2-8℃下，用抗人类IgG(Fc特异性)抗体涂覆培养盘隔夜。第二天，使用培养盘洗涤器，以300微升/孔的PBS+0.1％Tween(PBS-T)洗涤分析培养盘三次。接着，在室温下，用250微升/孔2.5％牛奶/孔阻断培养盘至少1小时。在Eppendorf管中制备标准品和QC。接着，将标准品、样本和QC以1/20稀释于Eppendorf管中的分析缓冲液中。使用培养盘洗涤器，以300微升/孔的PBS-T洗涤培养盘三次。按照培养盘图谱，以100微升/孔的标准曲线，将样本和QC添加到分析培养盘中。在RT、300RPM振荡下，培育培养盘1小时。使用培养盘洗涤器，以300微升/孔的PBS-T洗涤培养盘五次，且将100μL以1/5000稀释于PBS中的抗人类IgG(Fc特异性)-过氧化酶添加到各孔，且接着在RT、300RPM振荡下培育培养盘1小时。接着，使用培养盘洗涤器，用300μL PBS-T洗涤培养盘五次。将100μLTMB底物添加到各孔，且在室温下在暗处培育培养盘15分钟。接着，以100微升/孔，将停止溶液(1M硫酸)添加到各孔，且使用设定为450nm的微量盘读取器测定光密度，其中参考读数是在540nm下。接着，使用读盘器软件，从450nm读数减去参考读数。接着，利用回归分析和4PL曲线拟合，使用Softmax Pro来分析数据。根据标准曲线测量浓度。
实例3
将雌性8-14周龄APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠置于含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食(WTD)中。在4周磨合期之后，将低反应小鼠移出研究。将其余小鼠针对年龄、体重、血浆胆固醇和三酸甘油酯进行匹配。将动物分成6组(同型对照组)或10组。
在第0天，动物接受皮下注射(5mL/kg)。以1、3或10mg/kg，给药抗体(同型对照、基准测试抗体F、CL-148218和CL-274711)。在治疗后第0、3、7、14、18、21和28天，在禁食4小时之后，从动物尾部静脉获取血液样本。使用含有EDTA-二钾盐的CB 300K2Emicrovettes(Sarstedt，德国纽布瑞赫特)收集血液，以用于总胆固醇、三酸甘油酯(第0、7和28天)和HDL-胆固醇测量。紧接着，将试管或毛细管置于冰上。在4℃下离心(10min，6000rpm)之后，获得EDTA血浆。紧接在最后尾部静脉血液采样点之后，在第28天，通过CO2窒息处死小鼠。对于第28天样本，确认群组脂蛋白概况。
此实验的目的是为了评价在喂食含有0.15％胆固醇和15％饱和脂肪的西方类型饮食的APOE*3Leiden.CETP转殖基因小鼠中，抗体CL-274711、CL-148219QLT和基准测试抗体F的剂量反应对于总/非HDL胆固醇和脂蛋白概况的药效学效果。
所有三种抗体均在所有所测试剂量下降低胆固醇水平(参见图15-17)，且增加剂量增加所见胆固醇降低和作用持续时间。在1和3mg/kg下，CL-148219QLT比基准测试抗体F对于降低胆固醇水平更有效；且在所有所测试剂量下，CL-148219QLT比基准测试抗体F具有更长的作用持续时间(图15-17)。其它分析显示，CL-148219QLT降低胆固醇水平的效果与高3倍的基准测试抗体F剂量一样好，且具有与所述较高剂量的基准测试抗体F相同的作用持续时间(图18-19)。CL-274711降低胆固醇水平到与相同剂量的基准测试抗体F所见的那些相同的水平，但具有更长的作用持续时间(图16-17)。
抗体显示在所有所测试剂量下等效的非HDL胆固醇水平降低(参见图20)，其中增加剂量引起非HDL胆固醇降低递增增加和反应持续时间递增增加。在1和3mg/kg下，CL-148219QLT比基准测试抗体F对于降低胆固醇水平更有效；且在所有所测试剂量下，CL-148219QLT比基准测试抗体F具有更长的作用持续时间(图20)。其它分析显示，CL-148219QLT降低胆固醇水平的效果与高3倍的基准测试抗体F剂量一样好，且具有与所述较高剂量的基准测试抗体F相同的作用持续时间(图21)。CL-274711降低胆固醇水平到与相同剂量的基准测试抗体F所见的那些相同的水平，但具有更长的作用持续时间(图21)。
在第28天的磷脂概况的评价(图22)显示，CL-274711和CL-148219QLT均以剂量依赖性方式降低VLDL/LDL胆固醇和磷脂。与基准测试抗体F相比，在10mg/kg下，CL-274711和CL-148219QLT对降低VLDL/LDL胆固醇和磷脂更有效
实例4
使用在实验当天体重为18-22g的雄性C57BL/6小鼠(JANVIER LABS,C.S.4105,Saint-Berthevin F-53941,France)。在第0天，动物接受皮下注射3mg/kg CL-148219QLT、CL-274711或基准测试F(10mL/kg)。在给药后1、3、7、14、21和28天，进行血液采样(n＝3/采样点)。接着，从各血液样本制备血清，所述血清接着用于测定在每一时间点的抗体浓度。
所述实验的目的是为了评价在28天时程内，CL-148219QLT、CL-274711和基准测试抗体F的药物动力学。PK概况的评价显示，CL-274711和CL-148218均比基准测试抗体F具有更高的初始血清抗体浓度，且此更高血清抗体浓度在28天研究中保留(图23)。CL-148219QLT最初具有比CL-274711高的血清抗体浓度，但CL-274711具有从血清更慢的清除。
其它数据：
参考从图24开始的图，其显示本发明的抗体的功效。还参考表1，其显示在中性pH(7.6)与酸性pH(5.8)下，针对人类PCSK9变体、食蟹猕猴PCSK9和小鼠PCSK9的抗体亲和力。通过ProteOnTM SPR分析系统来测量KD。
我们包含六种PCSK9基准测试抗体作为用于比较的对照。三种基准测试抗体为出售抗体形式(基准测试抗体A、B和F)，且三种是选自临床试验中的抗体(基准测试抗体C、D和E)。基准测试抗体A、B、C、D和E制备为人类IgG4PE型式。基准测试抗体F为人类IgG1型式。
用于免疫和/或筛选的抗原包含4种人类PCSK9变体、食蟹猕猴PCSK9和小鼠PCSK9。在此，我们将4种人类PCSK9变体如下称为：人类PCSK9参考(hPCSK9 Ref)、人类PCSK9变体(hPCSK9a)、人类PCSK9变体b(hPCSK9b)和人类PCSK9 D374Y功能获得型突变体(hPCSK9GOF)。相对于人类PCSK9参考序列，人类变体具有V474I和G670E氨基酸取代，且人类变体b具有A53V、V474I和G670E氨基酸取代。我们包含此些4种人类变体以用于分析筛选，以便找到能够在人类群体中中和所有4种变体和突变体的抗体。
CL-148219
相较于基准，CL-148219显示更强的中和活性以及更高的恢复活体外LDL吸收的能力，从而表明CL-148219可直接阻断PCSK9与LDLR之间的相互作用。在高脂质血症的小鼠模型(E3L.CETP小鼠；de Knijff,Westerterp,Ason,van den Hoek和Kühnast)中，CL-148219降低血浆非HDL胆固醇的效果优于基准测试Ab，且具有更长的作用持续时间。参见图24-27和表1。
CL-148219 QLT突变体
通过计算机分析序列，在CL-148219的重链中发现N-糖基化基元。位于重链的构架3区中的NLT基元可经糖基化，且可对可显影性具有不良影响。稍后通过质谱分析确认，CL-148219中的NLT基元实际上经N-糖基化。因此，我们通过用Q残基置换N，而将突变引入到NLT基元，从而产生破坏糖基化的CL-148219QLT突变体。通过质谱分析，进一步确认糖基化的去除。当相较于亲本CL-148219时，CL-148219QLT突变体显示类似的亲和力和活体外功能性。类似于亲本CL-148219，在高脂质血症小鼠模型(E3L.CETP小鼠)中，QLT突变体降低血浆非HDL胆固醇优于基准，以及更长的作用持续时间。参见图27-31和表1。
CL-148489
在活体外基于细胞的分析中，CL-148489中等中和hPCSK9但具有显著的恢复LDL吸收的能力，从而表明此抗体可间接干扰PCSK9与LDLR的结合，可能是通过阻断HSPG与PCSK9结合。在高脂质血症的小鼠模型(E3L.CETP小鼠)中，此抗体也比基准更优选地降低血浆非HDL胆固醇，具有类似作用持续时间。参见图32-35和表1。
CL-274698
不同于来源于具有人类化抗体基因座且未基因敲除PCSK9基因的小鼠的CL-148219和CL-148489，CL-274698来源于PCSK9基因敲除小鼠。在不存在PCSK9下，小鼠产生针对免疫原的高亲和力抗体，包含人类和小鼠PCSK9两者。因此，产生CL-274698且进行筛选。CL-274698不仅显示针对PCSK9的高亲和力，其中KD在低于nM的范围内，且也呈现活体外中和hPCSK9且恢复LDL吸收的优良功能。在通过使用E3L.CETP小鼠的活体内功效研究中，在Ab注射后3天内，CL-274698降低血浆非HDL胆固醇大于基准，其中事实为，在第7天之后，非HDL胆固醇的水平类似于基准。参见图36-39和表1。
CL-274711
类似于CL-274698，通过免疫PCSK9基因敲除小鼠，产生CL-274711。在活体外基于细胞的分析中，CL-274711中和hPCSK9且恢复LDL吸收比基准更优选。在通过使用E3L.CETP小鼠的活体内功效分析中，相较于基准，CL-274711显示略微优良的降低血浆非HDL胆固醇功能与更长的作用持续时间。参见图40-43和表1。
方法
活体外基于细胞的功能分析
以6×104个细胞/孔，将HepG2细胞接种到96孔透明平底细胞培养盘(Costar)的完全培养基中，所述完全培养基在MEMα中含有10％FBS、1×青霉素/链霉素和1×NEAA。为了允许附着，在37℃下在5％CO2培育箱中培育细胞24小时。次日，培养基用无血清培养基(含1×NEAA和1×青霉素/链霉素的MEMα)置换，且将细胞保持在培育箱中隔夜(16-18小时)。第二天，细胞用各种浓度的抗PCSK9单克隆抗体处理，所述单克隆抗体已与5μg/ml经AF647标记的hPCSK9 GOF抗原一起预培育。用3倍系列稀释液，将抗体从60μg/ml进行稀释。在与hPCSK9GOF加抗PCSK9抗体一起培育1小时之后，以10μg/ml的最终浓度，将BODIPY LDL(Invitrogen)添加到细胞。通过培育细胞额外3小时，允许LDL吸收。在处理结束时，细胞通过阿库酶(accutase；BD)剥离，且随后在4℃下用稀释于PBS(Alfa Aesar)中的2％多聚甲醛固定隔夜。在洗涤之后，将细胞再悬浮于含有5mM EDTA的PBS中，且通过CytoFlex流式细胞测量术检测荧光细胞。
ProteOn SPR分析
使用ProteOnTM XPR36(Bio-Rad)来测量在25℃下，在中性(HBS-EP+，pH7.6)和酸性缓冲液(30mM乙酸钠，150mM NaCl，0.05％P20，pH5.8)中，针对抗原(人类PCSK9变体、食蟹猕猴PCSK9和小鼠PCSK9)的抗体结合亲和力。使用固定有抗人类Fc抗体的GLC芯片(Bio-Rad)，进行SPR运行。以2μg/ml，将分析物人类抗体捕获在芯片表面上。注射100nM、25nM、6.25nM、1.56nM、0.39nM的PCSK9蛋白180秒，且监测在30μL/min的流速下的解离600秒。使用在30μl/min下，两次注射10mM甘氨酸pH 1.5 160秒，再生芯片表面。接着，用1:1模型(Langmuir动力学模型)拟合感测图谱，其中拟合ka和kd，且通过ProteOn软件计算KD。
表1：
Figure GDA0003210125960000801
Figure GDA0003210125960000811
*1e-5为检测下限
**KD不能准确测定。
可变区序列概述
Figure GDA0003210125960000821
Figure GDA0003210125960000831
Figure GDA0003210125960000841
恒定区序列概述
Figure GDA0003210125960000842
Figure GDA0003210125960000851
Figure GDA0003210125960000861
序列：
CL-148219
CL-148219重链
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
Figure GDA0003210125960000871
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:2)
caggtgcacctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacgtgcactgtctctggtggctccatcagtagttactactggagctggatccggcagtacccaggaaagggactggagtggattggatatatctcttacagtgggagcagcaattataatccctccctcaagaggcgagtcaccatatcacgagacacgtccaagaaccagttctccctgaatctgacctctgtaatcgctgcggacacggccgtttattactgtgcgagaaatcttatgattcggggagcctacggcatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
Q V H L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C T V S
FR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:6)
CAGGTGCACCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACGTGCACTGTCTCT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
G G S I S S Y Y
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:8)
GGTGGCTCCATCAGTAGTTACTAC
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
W S W I R Q Y P G K G L E W I G Y
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:10)
TGGAGCTGGATCCGGCAGTACCCAGGAAAGGGACTGGAGTGGATTGGATAT
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:11)
I S Y S G S S
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:12)
ATCTCTTACAGTGGGAGCAGC
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
N Y N P S L K R R V T I S R D T S K N Q F S L N L T S V I A A D T A VY Y C
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:14)
AATTATAATCCCTCCCTCAAGAGGCGAGTCACCATATCACGAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAATCTGACCTCTGTAATCGCTGCGGACACGGCCGTTTATTACTGT
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
A R N L M I R G A Y G M D V
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:16)
GCGAGAAATCTTATGATTCGGGGAGCCTACGGCATGGACGTC
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:17)
W G Q G T T V T V S S
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:18)
TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:19)
Q V H L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C T V S G G S I S
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:20)
CAGGTGCACCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACGTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGT
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
S Y Y W S
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:22)
AGTTACTACTGGAGC
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:23)
W I R Q Y P G K G L E W I G
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:24)
TGGATCCGGCAGTACCCAGGAAAGGGACTGGAGTGGATTGGA
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
Y I S Y S G S S N Y N P S L K R
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:26)
TATATCTCTTACAGTGGGAGCAGCAATTATAATCCCTCCCTCAAGAGG
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:27)
R V T I S R D T S K N Q F S L N L T S V I A A D T A V Y Y C A R
FR3-KABAT核苷酸(SEQ ID NO:28)
CGAGTCACCATATCACGAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAATCTGACCTCTGTAATCGCTGCGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGA
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:29)
N L M I R G A Y G M D V
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:30)
AATCTTATGATTCGGGGAGCCTACGGCATGGACGTC
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:31)
W G Q G T T V T V S S
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:32)
TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
CL-148219轻链κ
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:33)
Figure GDA0003210125960000891
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:34)
gatactgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagtaatggatacaattatttggattggtacctgcagaaggcaggacagtctccacaactcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtgtatcaggcacagatttcacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttgggatttattactgcatgcaagctctacaaactccattcactttcggccctgggaccaaagtggatatcaaa
C区氨基酸序列(SEQ ID NO:35)
Figure GDA0003210125960000901
C区核苷酸序列(SEQ ID NO:36)
cgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccttccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgt
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:37)
D T V M T Q S P L S L P V T P G E P A S I S C R S S
FR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:38)
GATACTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:39)
Q S L L H S N G Y N Y
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:40)
CAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAATTAT
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:41)
L D W Y L Q K A G Q S P Q L L I Y
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:42)
TTGGATTGGTACCTGCAGAAGGCAGGACAGTCTCCACAACTCCTGATCTAT
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:43)
L G S
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:44)
TTGGGTTCT
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:45)
N R A S G V P D R F S G S V S G T D F T L K I S R V E A E D V G I Y YC
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:46)
AATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGTATCAGGCACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGC
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:47)
M Q A L Q T P F T
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:48)
ATGCAAGCTCTACAAACTCCATTCACT
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:49)
F G P G T K V D I K
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:50)
TTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:51)
D T V M T Q S P L S L P V T P G E P A S I S C
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:52)
GATACTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:53)
R S S Q S L L H S N G Y N Y L D
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:54)
AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAATTATTTGGAT
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:55)
W Y L Q K A G Q S P Q L L I Y
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:56)
TGGTACCTGCAGAAGGCAGGACAGTCTCCACAACTCCTGATCTAT
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:57)
L G S N R A S
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:58)
TTGGGTTCTAATCGGGCCTCC
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:59)
G V P D R F S G S V S G T D F T L K I S R V E A E D V G I Y Y C
FR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:60)
GGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGTATCAGGCACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGC
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:61)
M Q A L Q T P F T
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:62)
ATGCAAGCTCTACAAACTCCATTCACT
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:63)
F G P G T K V D I K
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:64)
TTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
CL-148489
CL-148489重链
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:65)
Figure GDA0003210125960000931
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:66)
gaagtgcagctggtagagtctgggggaggcttggtacagcctggcaggtccctgagactctcctgtacagcctctggattcacctttgctgattatgtcatgcactgggtccggcaaactccagggaagggcctggagtgggtctcaggtattagttggaatagttatagtataaattatgcggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgcccagaactccctgtatctgcaaatgaacagtctgagagctgaggacacggccttgtatttttgtgcaaaagatataacttacgatcttttgactggttataactacaactacggtttagacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:67)
E V Q L V E S G G G L V Q P G R S L R L S C T A S
FR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:68)
GAAGTGCAGCTGGTAGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:69)
G F T F A D Y V
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:70)
GGATTCACCTTTGCTGATTATGTC
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:71)
M H W V R Q T P G K G L E W V S G
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:72)
ATGCACTGGGTCCGGCAAACTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGT
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:73)
I S W N S Y S I
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:74)
ATTAGTTGGAATAGTTATAGTATA
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:75)
N Y A D S V K G R F T I S R D N A Q N S L Y L Q M N S L R A E D T A LY F C
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:76)
AATTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCCAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTTTTGT
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:77)
A K D I T Y D L L T G Y N Y N Y G L D V
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:78)
GCAAAAGATATAACTTACGATCTTTTGACTGGTTATAACTACAACTACGGTTTAGACGTC
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:79)
W G Q G T T V T V S S
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:80)
TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:81)
E V Q L V E S G G G L V Q P G R S L R L S C T A S G F T F A
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:82)
GAAGTGCAGCTGGTAGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCTTTGCT
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:83)
D Y V M H
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:84)
GATTATGTCATGCAC
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:85)
W V R Q T P G K G L E W V S
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:86)
TGGGTCCGGCAAACTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCA
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:87)
G I S W N S Y S I N Y A D S V K G
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:88)
GGTATTAGTTGGAATAGTTATAGTATAAATTATGCGGACTCTGTGAAGGGC
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:89)
R F T I S R D N A Q N S L Y L Q M N S L R A E D T A L Y F C A K
FR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:90)
CGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCCAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTTTTGTGCAAAA
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:91)
D I T Y D L L T G Y N Y N Y G L D V
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:92)
GATATAACTTACGATCTTTTGACTGGTTATAACTACAACTACGGTTTAGACGTC
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:93)
W G Q G T T V T V S S
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:94)
TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
CL-148489轻链κ
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:95)
Figure GDA0003210125960000951
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:96)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctacatagtgatggaaagacctatttgtattggtacctgcagaagcccggccagcctccacagctcctgatctatgaagtttccaaccgtttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaagatcagccgggtggaggctgaagatgttggcctttattactgcatgcaaagtatacagcttccgctcactttcggcggagggaccaaggtagagatcaaa
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:97)
D I V M T Q T P L S L S V T P G Q P A S I S C R S S
FR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:98)
GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:99)
Q S L L H S D G K T Y
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:100)
CAGAGCCTCCTACATAGTGATGGAAAGACCTAT
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:101)
L Y W Y L Q K P G Q P P Q L L I Y
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:102)
TTGTATTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCACAGCTCCTGATCTAT
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:103)
E V S
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:104)
GAAGTTTCC
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:105)
N R F S G V P D R F S G S G S G T D F T L K I S R V E A E D V G L Y YC
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:106)
AACCGTTTCTCTGGAGTGCCAGATAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCTGAAGATGTTGGCCTTTATTACTGC
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:107)
M Q S I Q L P L T
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:108)
ATGCAAAGTATACAGCTTCCGCTCACT
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:109)
F G G G T K V E I K
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:110)
TTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGAGATCAAA
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:111)
D I V M T Q T P L S L S V T P G Q P A S I S C
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO：112)
GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCTCTCTGTCCGTCACCCCTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGC
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:113)
R S S Q S L L H S D G K T Y L Y
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:114)
AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACATAGTGATGGAAAGACCTATTTGTAT
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:115)
W Y L Q K P G Q P P Q L L I Y
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO：116)
TGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCACAGCTCCTGATCTAT
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:117)
E V S N R F S
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:118)
GAAGTTTCCAACCGTTTCTCT
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:119)
G V P D R F S G S G S G T D F T L K I S R V E A E D V G L Y Y C
FR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:120)
GGAGTGCCAGATAGGTTCAGTGGCAGCGGGTCAGGGACAGATTTCACACTGAAGATCAGCCGGGTGGAGGCTGAAGATGTTGGCCTTTATTACTGC
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:121)
M Q S I Q L P L T
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:122)
ATGCAAAGTATACAGCTTCCGCTCACT
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:123)
F G G G T K V E I K
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:124)
TTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGAGATCAAA
CL-274698
CL-274698重链
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:199)
QVQLQESGPG LVKPSGTLSL TCAVSGGSIS SSKWWSWVRQ PPGKGLEWIG ETHYSGSTNYNPSLKSRVTI SVDKSKNQFS LKLRSVTAAD TAVYYCARVG ATENFWGQGT LVTVSS
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:200)
Figure GDA0003210125960000991
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:201)
QVQLQESGPG LVKPSGTLSL TCAVS
FR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:202)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:203)
GGSIS SSKW
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:204)
GGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAAATGG
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:205)
WSWVRQ PPGKGLEWIG E
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:206)
TGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAA
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:207)
THYSGST
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:208)
ACCCATTATAGTGGGAGCACC
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:209)
NY NPSLKSRVTI SVDKSKNQFS LKLRSVTAAD TAVYYC
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:210)
AACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGGTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTTTATTACTGT
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:211)
ARVG ATENF
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:212)
GCGAGAGTGGGTGCTACTGAGAACTTC
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:213)
WGQGT LVTVSS
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:214)
TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:215)
QVQLQESGPG LVKPSGTLSL TCAVSGGSIS
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:216)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGC
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:217)
SSKWWS
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:218)
AGTAGTAAATGGTGGAGT
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:219)
WVRQ PPGKGLEWIG
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:220)
TGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGG
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:221)
ETHYSGSTNY NPSLKS
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:222)
GAAACCCATTATAGTGGGAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGT
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:223)
RVTI SVDKSKNQFS LKLRSVTAAD TAVYYCAR
FR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:224)
CGAGTCACCATATCAGTAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGGTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGA
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:225)
VG ATENF
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:226)
GTGGGTGCTACTGAGAACTTC
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:227)
WGQGT LVTVSS
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:228)
TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
CL-274698轻链κ
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:229)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVF RYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASTRATDIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPTFGQ GTKVEIK
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:230)
Figure GDA0003210125960001011
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:231)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASFR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:232)
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:233)
QSVF RY
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:234)
CAGAGTGTTTTCAGGTAC
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:235)
LAWYQQKP GQAPRLLIY
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:236)
TTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:237)
D AS
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:238)
GATGCATCC
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:239)
TRATDIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:240)
ACCAGGGCCACTGACATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGT
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:241)
QQ RSNWPPT
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:242)
CAGCAACGTAGCAACTGGCCTCCGACG
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:243)
FGQ GTKVEIK
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:244)
TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:245)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:246)
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:247)
RASQSVF RYLA
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:248)
AGGGCCAGTCAGAGTGTTTTCAGGTACTTAGCC
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:249)
WYQQKP GQAPRLLIY
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:250)
TGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:251)
D ASTRAT
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:252)
GATGCATCCACCAGGGCCACT
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:253)
DIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC
FR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:254)
GACATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGT
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:255)
QQ RSNWPPT
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:256)
CAGCAACGTAGCAACTGGCCTCCGACG
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:257)
FGQ GTKVEIK
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:258)
TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
CL-274711
CL-274711重链
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:259)
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGGSIS SGGYYWSWIR QHPGKGLEWI GHIFYSGSTYYNPSLKSRVT ISVDTSKNQF SLKLNSVTAADTAVYYCASE GGYYDIPDVW GQGTTVTVSS
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:260)
Figure GDA0003210125960001041
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:261)
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVS
FR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:262)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:263)
GGSIS SGGYY
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:264)
GGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTAC
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:265)
WSWIR QHPGKGLEWI GH
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:266)
TGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGCAC
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:267)
IFYSGST
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:268)
ATCTTTTACAGTGGGAGCACC
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:269)
Y YNPSLKSRVT ISVDTSKNQF SLKLNSVTAA DTAVYYC
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:270)
TACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTTGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGT
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:271)
ASE GGYYDIPDV
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:272)
GCGAGCGAGGGAGGGTATTACGATATTCCGGACGTC
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:273)
W GQGTTVTVSS
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:274)
TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:275)
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGGSIS
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:276)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGC
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:277)
SGGYYWS
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:278)
AGTGGTGGTTACTACTGGAGC
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:279)
WIR QHPGKGLEWI G
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:280)
TGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGG
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:281)
HIFYSGSTY YNPSLKS
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:282)
CACATCTTTTACAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGT
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:283)
RVT ISVDTSKNQF SLKLNSVTAA DTAVYYCAS
FR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:284)
CGAGTTACCATATCAGTTGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGC
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:285)
E GGYYDIPDV
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:286)
GAGGGAGGGTATTACGATATTCCGGACGTC
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:287)
W GQGTTVTVSS
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:288)
TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
CL-274711轻链κ
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:289)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS NYLAWYQQKP GQAPRLLISD ASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAIYYCQQ RSNWPLTFGG GTKVEIK
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:290)
Figure GDA0003210125960001061
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:291)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRAS
FR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:292)
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:293)
QSVS NY
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:294)
CAGAGTGTTAGCAACTAC
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:295)
LAWYQQKP GQAPRLLIS
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:236)
TTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTCT
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:297)
D AS
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:298)
GATGCATCC
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:299)
NRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAIYYC
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:300)
AACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAATTTATTACTGT
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:301)
QQ RSNWPLT
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:302)
CAGCAGCGTAGCAACTGGCCGCTCACT
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:303)
FGG GTKVEIK
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:304)
TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:305)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:306)
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:307)
RASQSVS NYLA
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:308)
AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAACTACTTAGCC
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:309)
WYQQKP GQAPRLLIS
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:310)
TGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTCT
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:311)
D ASNRAT
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:312)
GATGCATCCAACAGGGCCACT
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:313)
GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAIYYC
FR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:314)
GGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAATTTATTACTGT
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:315)
QQ RSNWPLT
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:316)
CAGCAGCGTAGCAACTGGCCGCTCACT
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:317)
FGG GTKVEIK
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:318)
TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
CL-148219QLT
CL-148219QLT重链
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:319)
QVHLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIS SYYWSWIRQY PGKGLEWIGY ISYSGSSNYNPSLKRRVTIS RDTSKNQFSL QLTSVIAADT AVYYCARNLM IRGAYGMDVW GQGTTVTVSS
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:320)
Figure GDA0003210125960001091
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:321)
QVHLQESGPG LVKPSETLSL TCTVS
FR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:322)
CAGGTGCACCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACGTGCACTGTCTCT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:323)
GGSIS SYY
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:324)
GGTGGCTCCATCAGTAGTTACTAC
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:325)
WSWIRQY PGKGLEWIGY
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:326)
TGGAGCTGGATCCGGCAGTACCCAGGAAAGGGACTGGAGTGGATTGGATAT
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:327)
ISYSGSS
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:328)
ATCTCTTACAGTGGGAGCAGC
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:329)
NYN PSLKRRVTIS RDTSKNQFSL QLTSVIAADT AVYYC
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:330)
AATTATAATCCCTCCCTCAAGAGGCGAGTCACCATATCACGAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGACCTCTGTAATCGCTGCGGACACGGCCGTTTATTACTGT
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:331)
ARNLM IRGAYGMDV
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:332)
GCGAGAAATCTTATGATTCGGGGAGCCTACGGCATGGACGTC
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:333)
W GQGTTVTVSS
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:334)
TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:335)
QVHLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSI
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:336)
CAGGTGCACCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACGTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATC
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:337)
S SYYWS
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:338)
AGTAGTTACTACTGGAGC
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:339)
WIRQY PGKGLEWIG
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:340)
TGGATCCGGCAGTACCCAGGAAAGGGACTGGAGTGGATTGGA
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:341)
Y ISYSGSSNYN PSLKR
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:342)
TATATCTCTTACAGTGGGAGCAGCAATTATAATCCCTCCCTCAAGAGG
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:343)
RVTIS RDTSKNQFSL QLTSVIAADT AVYYCAR
FR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:344)
CGAGTCACCATATCACGAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGACCTCTGTAATCGCTGCGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGA
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:345)
NLM IRGAYGMDV
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:346)
AATCTTATGATTCGGGGAGCCTACGGCATGGACGTC
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO：347)
W GQGTTVTVSS
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:348)
TGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
CL-148219QLT轻链κ
可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:349)
DTVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDW YLQKAGQSPQ LLIYLGSNRASGVPDRFSGS VSGTDFTLKI SRVEAEDVGI YYCMQALQTP FTFGPGTKVD IK
可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:350)
Figure GDA0003210125960001111
FR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:351)
DTVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSS
FR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:352)
GATACTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT
CDR1-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:353)
QSLL HSNGYNY
CDR1-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:354)
CAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAATTAT
FR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:355)
LDW YLQKAGQSPQ LLIY
FR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:356)
TTGGATTGGTACCTGCAGAAGGCAGGACAGTCTCCACAACTCCTGATCTAT
CDR2-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:357)
LGS
CDR2-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:358)
TTGGGTTCT
FR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:359)
NRA SGVPDRFSGS VSGTDFTLKI SRVEAEDVGI YYC
FR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:360)
AATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGTATCAGGCACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGC
CDR3-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:361)
MQALQTP FT
CDR3-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:362)
ATGCAAGCTCTACAAACTCCATTCACT
FR4-IMGT氨基酸序列(SEQ ID NO:363)
FGPGTKVD IK
FR4-IMGT核苷酸序列(SEQ ID NO:364)
TTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
FR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:365)
DTVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISC
FR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:366)
GATACTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC
CDR1-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:367)
RSSQSLL HSNGYNYLD
CDR1-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:368)
AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAATTATTTGGAT
FR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:369)
W YLQKAGQSPQ LLIY
FR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:370)
TGGTACCTGCAGAAGGCAGGACAGTCTCCACAACTCCTGATCTAT
CDR2-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:371)
LGSNRA S
CDR2-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:372)
TTGGGTTCTAATCGGGCCTCC
FR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:373)
GVPDRFSGS VSGTDFTLKI SRVEAEDVGI YYC
FR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:374)
GGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGTATCAGGCACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGC
CDR3-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:375)
MQALQTP FT
CDR3-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:376)
ATGCAAGCTCTACAAACTCCATTCACT
FR4-KABAT氨基酸序列(SEQ ID NO:377)
FGPGTKVD IK
FR4-KABAT核苷酸序列(SEQ ID NO:378)
TTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
本发明的抗体和片段的恒定区
Figure GDA0003210125960001131
Figure GDA0003210125960001141
Figure GDA0003210125960001151
Figure GDA0003210125960001161
Figure GDA0003210125960001171
Figure GDA0003210125960001181
Figure GDA0003210125960001191
Figure GDA0003210125960001201
Figure GDA0003210125960001211
Figure GDA0003210125960001221
Figure GDA0003210125960001231
Figure GDA0003210125960001241
Figure GDA0003210125960001251
Figure GDA0003210125960001261
Figure GDA0003210125960001271
Figure GDA0003210125960001281
Figure GDA0003210125960001291
Figure GDA0003210125960001301
Figure GDA0003210125960001311
C区氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
Figure GDA0003210125960001312
L S L S L G K
C区核苷酸序列(SEQ ID NO:4)
gccagcaccaagggcccttccgtgttccccctggccccttgcagcaggagcacctccgaatccacagctgccctgggctgtctggtgaaggactactttcccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcgctctgacatccggcgtccacacctttcctgccgtcctgcagtcctccggcctctactccctgtcctccgtggtgaccgtgcctagctcctccctcggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaaaccctccaacaccaaggtggacaaacgggtcgagagcaagtacggccctccctgccctccttgtcctgcccccgagttcgaaggcggacccagcgtgttcctgttccctcctaagcccaaggacaccctcatgatcagccggacacccgaggtgacctgcgtggtggtggatgtgagccaggaggaccctgaggtccagttcaactggtatgtggatggcgtggaggtgcacaacgccaagacaaagccccgggaagagcagttcaactccacctacagggtggtcagcgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtcagcaataagggactgcccagcagcatcgagaagaccatctccaaggctaaaggccagccccgggaacctcaggtgtacaccctgcctcccagccaggaggagatgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggattctacccttccgacatcgccgtggagtgggagtccaacggccagcccgagaacaattataagaccacccctcccgtcctcgacagcgacggatccttctttctgtactccaggctgaccgtggataagtccaggtggcaggaaggcaacgtgttcagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacccagaagtccctgagcctgtccctgggaaag
>PCSK9参考序列(SEQ ID NO:189)
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ
>PCSK9变体a(SEQ ID NO:190)
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAIARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEEAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ
>PCSK9变体b(SEQ ID NO:191)
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLVEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAIARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEEAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ
>PCSK9 GOF突变体(SEQ ID NO:192)
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSYCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ
>PCSK9食蟹猕猴(SEQ ID NO:193)
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLADAPEHGATATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHRSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHHLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPARYRADEYQPPKGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFESVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGAGLRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVFNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSRSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHRAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAQDEELLSCSSFSRSGKRRGERIEAQGGKRVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQVNCSVHTAPPAGASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVIVACEDGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEEAVAAVAICCRSRHLVQASQELQ
>PCSK9小鼠(SEQ ID NO:194)
QDEDGDYEELMLALPSQEDGLADEAAHVATATFRRCSKEAWRLPGTYIVVLMEETQRLQIEQTAHRLQTRAARRGYVIKVLHIFYDLFPGFLVKMSSDLLGLALKLPHVEYIEEDSFVFAQSIPWNLERIIPAWHQTEEDRSPDGSSQVEVYLLDTSIQGAHREIEGRVTITDFNSVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGTSLHSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLIQPSGPLVVLLPLAGGYSRILNAACRHLARTGVVLVAAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGKDIIGASSDCSTCFMSQSGTSQAAAHVAGIVARMLSREPTLTLAELRQRLIHFSTKDVINMAWFPEDQQVLTPNLVATLPPSTHETGGQLLCRTVWSAHSGPTRTATATARCAPEEELLSCSSFSRSGRRRGDWIEAIGGQQVCKALNAFGGEGVYAVARCCLVPRANCSIHNTPAARAGLETHVHCHQKDHVLTGCSFHWEVEDLSVRRQPALRSRRQPGQCVGHQAASVYASCCHAPGLECKIKEHGISGPSEQVTVACEAGWTLTGCNVLPGASLTLGAYSVDNLCVARVHDTARADRTSGEATVAAAICCRSRPSAKASWVQ
阿利库单抗HC(人类IgG4)(SEQ ID NO:195)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMNWVRQAPGKGLDWVSTISGSGGTTNYADSVKGRFIISRDSSKHTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSNWGNFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
阿利库单抗LC(人类κ)(SEQ ID NO:196)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYRSNNRNFLGWYQQKPGQPPNLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
pH依赖性抗体HC(人类IgG4)(SEQ ID NO:197)
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHWMKWVRQAPGKGLEWVANINQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDIVLMVYHMDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
pH依赖性抗体LC(人类κ)(SEQ ID NO:198)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLHHSNGNNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLQTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims (58)

1.一种抗体或片段，其包括与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克新9型(ProproteinConvertase Subtilisin Kexin type 9；PCSK9)特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括由来源于人类VH基因区段、DH基因区段和JH基因区段的重组的核苷酸序列编码的VH域，其中所述VH基因区段选自IGHV4-31、IGHV4-59、IGHV4-4和IGHV3-9。
2.根据权利要求1所述的抗体或片段，其中(i)所述VH基因区段为IGHV4-31且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD3-9；或(ii)所述VH基因区段为IGHV4-59且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD3-10；或(iii)所述VH基因区段为IGHV4-4且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD2-15；或(iv)所述VH基因区段为IGHV3-9且所述DH基因区段为人类基因区段IGHD3-9。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或片段，其中所述JH基因区段为人类基因区段IGHJ6。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括选自SEQ IDNO:271、285、15、77、29、91、211和225的CDRH3序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括含SEQ IDNO:259、1、65或199的VH域。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括与含SEQ IDNO:289的VL域配对的含SEQ ID NO:259的VH域。
7.根据权利要求1到5中任一项所述的抗体或片段，其中所述结合位点包括与含SEQ IDNO:349的VL域配对的含SEQ ID NO:319的VH域。
8.一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合且包括根据前述权利要求中任一项所述的抗PCSK9抗体的CDRH3序列，或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列。
9.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述序列。
10.根据权利要求9所述的抗体或片段，其中所述VH域包括：(i)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列；和(ii)所述所选择抗体的CDRH1序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH1序列。
11.根据权利要求9或10所述的抗体或片段，其中所述VH域包括：(iii)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRH3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH3序列；和(iv)所述所选择抗体的CDRH2序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRH2序列。
12.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其包括与PCSK9特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VH域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
13.根据权利要求9、10、11或12所述的抗体或片段，其中所述所选择抗体为CL-274711或CL-148219QLT。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其包括所述VH域的第一拷贝和第二拷贝。
15.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其包括与PCSK9特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括VL域，所述VL域由来源于人类VL基因区段和JL基因区段的重组的核苷酸序列编码，其中所述VL基因区段选自IGKV3-11、IGKV2-28和IGKV2-29。
16.根据权利要求15所述的抗体或片段，其中所述JL基因区段为选自IGKJ4、IGJK3和IGKJ1的人类基因区段。
17.一种抗体或片段，其与PCSK9特异性结合且包括根据前述权利要求中任一项所述的抗PCSK9抗体的所述CDRL3序列或包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDRL3序列。
18.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括VL域，所述VL域包括选自SEQ ID NO:301、315、47、107、61、121、241和255的CDRL3序列；或包括3、2或1个氨基酸取代的所述所选择CDRL3序列。
19.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括VL域，其包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列；或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述序列。
20.根据权利要求19所述的抗体或片段，其中所述VL域包括：(i)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3序列(和任选地CDRH3)，或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR3序列；和(ii)所述所选择抗体的CDRL1(和任选地CDRH1)序列，或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR1序列。
21.根据权利要求19或20所述的抗体或片段，其中所述VL域包括：(iii)选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的CDRL3(和任选地CDRH3)序列，或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR3序列；和(iv)所述所选择抗体的CDRL2(和任选地CDRH2)序列，或各自包括3、2或1个氨基酸取代的所述CDR2序列。
22.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其包括与PCSK9特异性结合的结合位点，其中所述结合位点包括VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VL域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
23.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的重链氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
24.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其与PCSK9特异性结合且包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的轻链氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
25.根据权利要求23所述的抗体或片段，其包括所述所选择抗体的所述轻链氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
26.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其与人类PCSK9表位特异性结合，所述表位与根据前述权利要求中任一项所述的抗体所结合的表位一致。
27.根据权利要求26所述的抗体或片段，其中所述表位通过无关氨基酸扫描或通过X射线结晶学鉴别。
28.根据权利要求27所述的抗体或片段，其中所述表位的接触残基由在无关氨基酸扫描，例如如通过SPR所测定的丙氨酸扫描中，亲和力降低至少10倍来限定。
29.一种抗体或片段(任选地根据前述权利要求中任一项所述的)，其与根据前述权利要求中任一项所述的抗体竞争与人类PCSK9结合。
30.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其与包括选自SEQ ID NO:189-194的氨基酸序列的PCSK9特异性结合。
31.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段包括人类恒定区，任选地IgG4恒定区或IgG1恒定区。
32.根据权利要求31所述的抗体或片段，其中所述恒定区为IgG4-PE恒定区，任选地所述恒定区包括SEQ ID NO:3或152的氨基酸序列。
33.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或片段，其进一步包括特异性结合另一目标抗原，任选地ANGPTL3的抗原结合位点。
34.一种如在前述权利要求中任一项中所定义的抗PCSK9抗体或片段，其用于治疗或预防个体的PCSK9介导的疾病或病状(任选地高胆固醇血症)。
35.根据权利要求34所述的抗PCSK9抗体或片段，其中所述疾病或病状选自高胆固醇血症、高脂质血症、高胆固醇血症、血脂异常、胆汁郁积性肝病、肾病综合征、甲状腺功能减退、肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化或心血管疾病。
36.根据权利要求34或35所述的抗体或片段，其中所述抗体或片段与士他汀(statin)同时或依序向所述个体给药。
37.一种一定量的抗PCSK9抗体或片段和一定量的士他汀的组合(任选地包括多个剂量的所述抗体和/或士他汀)，其中所述抗体或片段是根据权利要求1到36中的任一项。
38.根据权利要求1到37中任一项所述的抗体、片段或组合，其用于治疗或预防先前已以第一剂量以士他汀治疗方案治疗的个体的高胆固醇血症的方法中，其中所述方法包括降低向所述个体给药的士他汀的剂量或不向所述个体给药士他汀，其中所述方法包括向所述个体给药所述抗体或片段。
39.根据权利要求37或38所述的组合，其中包括日剂量为10到20mg(例如10mg)；或<60mg(例如40mg)的士他汀。
40.根据前述权利要求中任一项所述的抗体、片段或组合，其向罹患胆固醇升高的人类或动物个体给药，用于在所述个体已接受所述抗PCSK9抗体或片段之后降低所述个体中的血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。
41.一种如前述权利要求中任一项所定义的抗体、片段或组合的用途，其用于制造用于向个体给药用来治疗或预防PCSK9介导的疾病或病状，任选地高胆固醇血症的药剂。
42.一种治疗或预防个体的PCSK9介导的疾病或病状(任选地高胆固醇血症)的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的如权利要求1到40中任一项中所定义的抗体、片段或组合，其中由此治疗或预防所述PCSK9介导的疾病或病状。
43.根据权利要求41所述的用途或根据权利要求42所述的方法，其中所述PCSK9介导的疾病或病状为高胆固醇血症。
44.根据权利要求34到43中任一项所述的抗体、片段、组合、用途或方法，其进一步包括向所述个体给药其它疗法，例如其它治疗剂，任选地其中所述其它治疗剂选自以下组成的组：
a.士他汀；
b.ANGPTL3抑制剂(例如抗ANGPTL3抗体，例如恩维纳单抗(evinacumab))
c.非贝特(Fibrate)；
d.胆酸螯隔剂；
e.烟碱酸；和
f.烟酸。
45.一种药物组合物，其包括如权利要求1到40和44中任一项中所定义的抗体、片段或组合，和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，以及任选地与选自权利要求44中所叙述的药剂的其它治疗剂组合。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防PCSK9介导的病状或疾病，任选地高胆固醇血症。
47.根据权利要求45或46所述的药物组合物，其与标签或使用说明书组合，以治疗和/或预防人类的所述疾病或病状；任选地其中所述标签或说明书包括销售授权编号(任选地FDA或EMA授权编号)；任选地其中所述试剂盒包括含所述抗体或片段的IV或注射装置。
48.一种核酸，其编码如权利要求1到33中任一项中所定义的抗体或片段的VH域和/或VL域。
49.一种核酸，其编码VH域，所述VH域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VH域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
50.一种核酸，其编码VL域，所述VL域包括选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的VL域的氨基酸序列；或与其至少70％一致的氨基酸。
51.一种核酸，其包括与SEQ ID NO:260或320的序列至少70％一致的核苷酸序列。
52.一种核酸，其编码如权利要求1到33中任一项中所定义的抗体或片段的重链和/或轻链。
53.一种核酸，其编码重链，所述重链包括：与SEQ ID NO:259或319至少70％一致的VH氨基酸序列；和与IGHG4序列至少70％一致，任选地与SEQ ID NO:3或152至少70％一致的C区氨基酸序列。
54.一种核酸，其编码轻链，所述轻链包括：与SEQ ID NO:289或349至少70％一致的VL氨基酸序列；和与IGKC序列至少70％一致，任选地与SEQ ID NO:156至少70％一致的C区氨基酸序列。
55.一种核酸(例如在宿主细胞中，例如CHO或HEK293或Cos细胞)，其包括
a.核苷酸序列，其与选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的重链序列至少70％一致；和/或
b.核苷酸序列，其与分别选自CL-274711、CL-148219QLT、CL-274698、CL-148219和CL-148489(例如CL-274711或CL-148219QLT)的抗体的轻链序列至少70％一致。
56.一种载体，其包括核酸(例如根据权利要求48到55中任一项所述的核酸)；任选地其中所述载体为CHO或HEK293载体。
57.一种宿主细胞，其包括核酸(例如根据权利要求48到55中任一项所述的核酸)或根据权利要求56所述的载体。
58.一种抗体、片段、组合、载体、宿主细胞、用途或方法，其如本文所描述。
CN201980083914.XA 2018-12-19 2019-12-18 拮抗剂 Active CN113453756B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1820687.0A GB201820687D0 (en) 2018-12-19 2018-12-19 Antagonists
GB1820687.0 2018-12-19
PCT/GB2019/053607 WO2020128467A2 (en) 2018-12-19 2019-12-18 Antagonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113453756A true CN113453756A (zh) 2021-09-28
CN113453756B CN113453756B (zh) 2024-08-02

Family

ID=65147244

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980083914.XA Active CN113453756B (zh) 2018-12-19 2019-12-18 拮抗剂

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20220049017A1 (zh)
EP (1) EP3897830A2 (zh)
JP (1) JP7522113B2 (zh)
KR (1) KR20210105396A (zh)
CN (1) CN113453756B (zh)
AU (1) AU2019411526A1 (zh)
BR (1) BR112021011886A2 (zh)
CA (1) CA3122655A1 (zh)
CO (1) CO2021007653A2 (zh)
GB (1) GB201820687D0 (zh)
IL (1) IL283413A (zh)
MA (1) MA54534A (zh)
MX (1) MX2021007448A (zh)
SG (1) SG11202105784WA (zh)
TW (1) TW202039565A (zh)
WO (1) WO2020128467A2 (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2650016A1 (en) * 2011-01-28 2013-10-16 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treatment based on particular dosage regimens (11565)
US9017678B1 (en) * 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731568A (en) 1995-10-13 1998-03-24 Arctic Fox, Inc. Battery heating device and method
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
EP1870459B1 (en) 2005-03-31 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
JP5474531B2 (ja) 2006-03-24 2014-04-16 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 操作されたヘテロ二量体タンパク質ドメイン
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
PT2564695E (pt) 2009-07-08 2015-06-03 Kymab Ltd Modelos animais e moléculas terapêuticas
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
EA035344B1 (ru) 2012-04-20 2020-05-29 Мерюс Н.В. Способ получения двух антител из одной клетки-хозяина
EP3013422A1 (en) 2013-06-28 2016-05-04 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
CN106062004A (zh) 2013-12-17 2016-10-26 科马布有限公司 人靶标
WO2015092393A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Kymab Limited Human targets
EP4071177A1 (en) 2013-12-30 2022-10-12 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
CN106589127A (zh) 2015-10-16 2017-04-26 钜川生物医药 一种pcsk9抗体及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2650016A1 (en) * 2011-01-28 2013-10-16 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treatment based on particular dosage regimens (11565)
US9017678B1 (en) * 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NOZUE: "Lipid Lowering Therapy and Circulating PCSK9 Concentration", J ATHEROSCLER THROMB, no. 24, pages 895 - 907 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113453756B (zh) 2024-08-02
MA54534A (fr) 2022-03-30
WO2020128467A3 (en) 2020-07-23
JP2022514703A (ja) 2022-02-14
US20220049017A1 (en) 2022-02-17
KR20210105396A (ko) 2021-08-26
TW202039565A (zh) 2020-11-01
GB201820687D0 (en) 2019-01-30
IL283413A (en) 2021-07-29
CO2021007653A2 (es) 2021-09-30
EP3897830A2 (en) 2021-10-27
CA3122655A1 (en) 2020-06-25
MX2021007448A (es) 2021-12-10
BR112021011886A2 (pt) 2021-09-08
JP7522113B2 (ja) 2024-07-24
AU2019411526A1 (en) 2021-06-17
SG11202105784WA (en) 2021-07-29
WO2020128467A2 (en) 2020-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6964090B2 (ja) Ａｎｇｐｔｌ８阻害剤およびａｎｇｐｔｌ３阻害剤を用いて高脂血症を処置するための方法
JP7141333B2 (ja) 抗－ａｎｇｐｔｌ８抗体及びその使用
CN103930444B (zh) 用前蛋白转化酶枯草溶菌素-9(PCSK9)抑制剂降低脂蛋白(a)水平的方法
TWI465249B (zh) 針對ｐｃｓｋ９之高親和性人類抗體
AU2010276544B2 (en) High affinity human antibodies to human angiopoietin-2
JP7034068B2 (ja) レプチン受容体を活性化させる抗原結合タンパク質
JP7133551B2 (ja) 抗ａｎｇｐｔｌ８抗体を用いて肥満を処置する方法
JP7165996B2 (ja) 認知障害を治療または予防するためのヒト化抗体、その製造プロセス、及びそれを用いた認知障害を治療または予防するための薬剤
KR20240019856A (ko) 가족성 고콜레스테롤혈증을 지닌 환자를 치료하는 방법
JP2023093753A (ja) レプチン受容体をアンタゴナイズする抗原結合性タンパク質
CA3199594A1 (en) Antibodies against sars-cov-2 and uses thereof
KR102456731B1 (ko) Pcsk9 억제제를 angptl3 억제제와 병용하여 투여함으로써 고지혈증을 갖는 환자를 치료하기 위한 방법
JP7431750B2 (ja) カンナビノイド受容体１型（ｃｂ１）結合性タンパク質及びその使用
TWI735499B (zh) Ｐｃｓｋ９抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
CN113453756B (zh) 拮抗剂
WO2024137353A1 (en) Methods of treating inflammatory diseases with combination of tl1a inhibitors and s1pr inhibitors
TW202328177A (zh) 治療ｔａｕ病理學之方法
EA040479B1 (ru) Способы лечения гиперлипидемии ингибитором angptl8 и ингибитором angptl3

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant