CN113447607A - 一种利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶活性检测领域，涉及一种利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法。本发明使用浸提法从猪肝中提取过氧化氢酶，利用碘量法和高猛酸钾法测定猪肝中过氧化氢酶的活性，提供了一种准确度高、操作简便、可重复性强的鉴别成年猪肝和乳猪肝的检测方法。实验表明，在同等条件下，乳猪肝的过氧化氢酶活性要显著小于成年猪肝的过氧化氢酶活性，从而可以将猪肝中过氧化氢酶含量大小作为鉴别成年猪肝和乳猪肝的一个指标，本方法可以填补国内检测成年猪肝和乳猪猪肝方法和标准的空白，为药用乳猪肝原材料的检测提供了一种准确度高、操作简便、可重复性强的方法，具有很高的应用价值。

Description

一种利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法
技术领域
本发明涉及一种利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法，属于酶活性检测领域。
背景技术
过氧化氢酶广泛存在于动植物的各个组织、大部分需氧微生物体内，是动植物体内清除自由基的基本酶类。过氧化氢酶的作用是催化细胞内过氧化氢的分解，防止脂质、蛋白质、核酸等生物大分子的氧化损伤。目前提取过氧化氢酶的方法有发酵法和从动物组织中提取。我国生产过氧化氢酶主要还是采用从动物的组织中提取。这种方法有操作门槛低、原料来源丰富的优点。从经济效益和原料获取难度等方面来看，新鲜猪肝是提取过氧化氢酶的重要原料之一。
目前从猪肝脏中可以提取、制备肝素、猪肝酯酶、卵磷脂、肝水解肽等生化药剂，因此猪肝具有较重要的药用价值。其中促肝细胞生长素是从新鲜乳猪肝或未哺乳新生牛新鲜肝脏中提取的一种能够促进肝细胞再生的生物活性物质,实验表明，以乳猪肝为原料制备肝水解肽，与成年猪肝脏对照，考察产品活性及收率差异，结果证明乳猪肝源制品的生物活性远高于成年猪肝源制品，且含量及收率亦有所提高。从临床用药的有效性考虑，以两个月以内的乳猪肝代替成年动物肝脏制备的肝水解肽具有较高的应用价值。
从成本上考虑，成年猪肝脏比乳猪肝脏价格低，且冷藏猪肝仅凭外观难以区分。所以，可能存在企业收购的乳猪肝脏被成年猪肝脏替代的风险，但是，目前国内没有检测成年猪肝脏和乳猪肝脏的标准和方法，造成制药企业收购猪肝的质量检测空白和质量检测监督部门的监管空白。因此，研究一种准确度高、操作简便、可重复性强、适用于常规条件下操作的鉴别成年猪猪肝与2月龄前的乳猪猪肝的检测方法是很有必要的。
近年来一些科技文献公开了一些过氧化氢酶的提取和活性检测方法，如：
中国专利<申请号>CN201410577230.4<发明名称>过氧化氢酶活性的检测方法<申请人> 李勇;刘文斌<联系地址>710000陕西省西安市高新区新型工业园区创业大道6号2幢5层501、502、503室<摘要>本发明涉及一种过氧化氢酶活性的检测方法，属于酶活性检测方法领域。所述的过氧化氢酶活性的检测方法，包括以下步骤：将过氧化氢酶标准品稀释成一系列酶活性浓度的标准液，取10mL过氧化氯磷酸缓冲液于100mL碘量瓶中，置25℃水浴中保温，然后加入2mL酶标准液，准确保温3min，立即加入2mL0.5mol/硫酸终止反应，对照反应液对照管先加2mL0.5mol/L硫酸终止反应后加酶液。然后取上述反应液0.1mL加2.9mL过氧化物酶-邻联茴香胺溶液于测试管中摇匀，在25℃下用分光光度计在436μm处先用空白试测管调零后再测定各反应液测试管的吸光度，得到标准酶活性与吸光度关系曲线。按上述相同的方法处理测试酶，根据其吸光度与标准曲线可得到测试酶的酶活性。本发明所述的检测方法具有准确、实用性强、仪器要求简单，适用于常规条件下的操作的特点，是测定过氧化氢酶活力显色法中一种可靠方法。
中国专利<申请号> CN201610072433.7<发明名称>一种灵敏检测微量细胞及组织中过氧化氢酶活性的检测方法<申请人>施冬云;吴美玲<联系地址>213025江苏省常州市东方东路51号<摘要>一种灵敏检测微量细胞及组织中过氧化氢酶活性的检测方法。过氧化氢酶的检测方法主要可分为化学滴定法，光度计法，电化学法和放射化学测定法等。本发明使用化学发光法检测微量细胞和组织中过氧化氢酶的活性，将细胞和组织中的过氧化氢酶裂解释放，与过氧化氢孵育3分钟后加入pH为8.0的缓冲体系内，并将其加入鲁米诺-过氧化氢酶体系，以此测定过氧化酶的活性，检测灵敏度强，操作方便，耗时较短。以此方法检测细胞裂解液和动物组织匀浆液中过氧化氢酶的活性，可检测出不同干预和处理之间的细微差异，在临床和科研中都有广阔的应用前景。
中国专利<申请号>CN201611093347.0<发明名称>一种测定植物过氧化氢酶活性的方法<申请人>杨兰芳;王燕;韩潇;翁娜;庞静<联系地址>430062湖北省武汉市武昌区友谊大道368号<摘要>本发明提出了一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：试剂配制包括过氧化氢溶液配制、缓冲溶液配制、硫酸溶液配制和高锰酸钾溶液配制；植物样品制备，包括采样、清洗、剪碎、研磨、过滤或离心；标准曲线绘制，包括过氧化氢的标定、标准系列配制、吸光度测定、绘制回归方程；样品测定，包括吸样、加入试剂、控制反应时间、定容、测定吸光度；结果计算,包括计算公式、酶活性的表示单位。本发明解决了当前植物过氧化氢酶活性测定方法方面的不足，为植物过氧化氢酶活性的测定提供了一种简单、快速、精确、廉价的测定方法。
中国专利<申请号> CN02110792.0<发明名称>一种从动物肝脏中提取过氧化氢酶的方法<申请人>汪成富;阮中中<联系地址>215007江苏省苏州市沧浪区人民路48号苏州大学南校区生物技术系<摘要>本发明涉及一种从动物肝脏中提取过氧化氢酶的方法，本方法包括如下步骤：将动物肝脏绞碎后抽提，除去沉淀后用硫酸铵盐析得到沉淀；然后将沉淀溶于含防腐剂的硫酸铵溶液中，再热变性除去杂蛋白；最后加入消泡剂而得到外观和热稳定性均好的过氧化氢酶产品。本发明具有操作简单、成本低和对生产条件要求低的优点。
中国专利<申请号> CN201410408847.3<发明名称>一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法<申请人>张春颖;杨旭锦<联系地址>850000西藏自治区拉萨市经济技术开发区B区拉青路<摘要>本发明公开了一种从牛肝脏中提取过氧化氢酶的方法，以牛肝脏为原料通过超声提取及低温离心等工艺制备得到过氧化氢酶粗提液，采用超滤浓缩和凝胶层析技术进行过氧化氢酶的提取纯化，取代了利用大量有机溶剂或无机盐溶液等进行提取的复杂工艺，一方面使提取工艺更加简单易操作，酶活性及产率均得到大幅度提高，所得过氧化氢酶酶活达到10000U/mg以上，产率达到18%以上，且大大降低了生产成本；另一方面将超滤浓缩产生的透过液重复回收利用，避免了废水的排放，是一种环境友好型生产工艺。
以上发明并未涉及到乳猪肝（2月前）的过氧化氢酶的测定，也未用于乳猪肝与大猪肝的鉴定。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有方法难以区分成年猪肝与乳猪猪肝的问题，旨在提供一种准确度高、操作简便、可重复性强、适用于常规条件下操作的鉴别成年猪猪肝与2月龄前的乳猪猪肝的检测方法。
本发明在整个应用流程中做了很多尝试和比对，最终确认下来的方法步骤具有较高的独特性和应用价值。其中较有优越性的操作步骤有以下几点：
在猪肝的解冻中，采用冰水浴隔水解冻或在4℃的冰箱中解冻，使得猪肝中过氧化氢酶的活性有明显提高。解冻后使用厨房纸巾将猪肝表面的血水抹去，这能有效缩短实验时间和提高实验的准确性。
在缓冲液的选择中，使用1％甘露醇溶液（内含0.1mol/L的磷酸盐），这样的好处是：过氧化氢酶提取后的活性能在较长的时间内无较明显的波动。
在猪肝的匀浆破碎时， 先将猪肝除去膜衣和结缔组织，随后称取所需的质量按比例加入缓冲溶液，置于组织捣碎器内，匀浆。这样做的好处是：减少了由于飞溅或黏着在盖子上的损耗和由于设备发热造成酶液活性的降低，使实验数据更加稳定。
在粗酶液的制取方面，采用将浆液置于洁净1.5mL离心管中，并在离心之前在冰水浴中冰浴10min。在10000r/min的条件下，高速离心10min。之后取其上清液，用相应的、已预冷的缓冲液稀释10倍，最终得到过氧化氢酶粗酶液。这确保了酶液在使用前后的活性不发生明显变化，使实验数据更稳定。
在滴定用量的使用上，过氧化氢浓度采用0.2mol/L，保证了药品使用效率和实验结果的稳定性。过氧化氢粗酶液采用稀释过的粗酶液200ul，避免了反应速度过快，出现气泡的情况，并且减少了实验误差。反应时间采用3min，使得实验结果更加精确
在碘量法的使用上，我们在终止反应后加入三滴钼酸铵溶液（起催化作用），解决了标准硫代硫酸钠溶液滴定时，锥形瓶内的溶液容易反复变蓝，不好判断滴定终点的问题，排除了干扰实验结果的因素。
本发明所述的检测方法中，碘量法是利用H2O2能将I-氧化成I2，以淀粉溶液做为终点指示剂，从而换算出溶液中H2O2的量，通过计算出反应前后H2O2的量和反应的时间计算出过氧化氢酶的酶活。高锰酸钾法是利用高锰酸钾能氧化溶液中的H2O2，自身就有颜色可作为指示剂等特点，通过消耗的高锰酸钾的量换算出H2O2的量，通过计算出反应前后H2O2的量和反应的时间计算出过氧化氢酶的酶活性。
测定过氧化氢酶活性是利用过氧化氢酶能分解过氧化氢的特性，用一定量的粗酶液在25℃的条件下与足量的过氧化氢反应规定时间后，终止其反应。通过测定剩余过氧化氢的量，来计算猪肝中过氧化氢酶的活性。
计算公式：
Figure 185345DEST_PATH_IMAGE001
我们发现，乳猪肝中过氧化氢酶活性一般在4000mg·g-1·min-1-5000mg·g-1·min-1左右，少数个体的酶活性能达到6000mg·g-1·min-1，未发现乳猪肝过氧化氢酶活性超过7000mg·g-1·min-1，成年猪肝的酶活一般在8000mg·g-1·min-1以上，部分活性较低个体酶活也在7000mg·g-1·min-1以上，所以通过测定猪肝中过氧化氢酶的活性大小可以作为鉴别成年猪肝和乳猪肝的一个指标。
本发明最优试剂配比说明
（1）1%甘露醇缓冲溶液（内含0.1mol/L的磷酸盐）的配制：取11.82g NaH2PO4和19.35gNa2HPO4于烧杯中溶解后移入1L容量瓶中，另外称取10g甘露醇于烧杯中溶解，再倒入乘有NaH2PO4和Na2HPO4的1L容量瓶中，用蒸馏水定容。
（2）40g/L钼酸铵溶液的配置：准确称取20g钼酸铵于大烧杯中，加入500ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌，溶解后移入棕色细口瓶中。
（3）0.15mol/L Na2S2O3 标准溶液的配置和标定：
配置：加热煮沸500mL蒸馏水并保持15min左右，冷却待用。称取11.7g Na2S2O3·5H2O、0.1g Na2CO3加入到已冷却的沸水中，用玻璃棒搅拌，溶解后转移到已洗至蒸馏水的棕色试剂瓶中，加蒸馏水保持总体积为500mL。
标定： 准确称取0.1g K2Cr2O7三份，分放在250mL带塞锥形瓶中，加少量水，使其溶解，加1g KI，8mL 6mol·L-1 HCl，塞好塞子后充分混匀，在暗处放5min。稀释至100mL，用Na2S2O3标准溶液滴定。当溶液由棕红色变为淡黄色时，加3mL 5g·L-1淀粉，边旋摇锥形瓶边滴定至溶液蓝色刚好消失即到达终点（滴定终点为亮绿色）。
（4）0.155mol/L KCI溶液：准确称取23.095g KCI于1L烧杯中，加入500ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌，溶解后移入干燥容量瓶中备用。
（5）0.9% NaCI溶液：准确称取4.5g NaCI于1L烧杯中，加入500ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌，溶解后移入干燥容量瓶中备用。
（6）0.1mol/L高锰酸钾标准溶液配置和标定 ：
配置：称取7.9g高锰酸钾于1L烧杯中，加入500ml蒸馏水，盖上表面皿，于电炉中加热煮沸10min,冷却后，于暗处放置5～6天，以带颈的玻璃纹漏斗过滤溶液，移入干燥的 1L棕色容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
标定：称取0.2g（精确至0.0001g）草酸钠于120℃电烘箱中干燥至恒重，置于250ml锥形瓶中。加入40ml蒸馏水和10ml浓硫酸，加热至75℃左右，在恒温水浴锅中用待标定的高锰酸钾溶液滴定至溶液刚好呈粉红色，并且在30秒内不褪色即为终点。
所述的利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法，包括以下步骤：
1.原料的准备
将冷冻的猪肝在冰水浴中隔水解冻或将其提前一夜置于4℃冰箱中自然解冻（也可直接用新鲜猪肝），用厨房纸巾抹干表面血水并剔除膜衣和结缔组织后切成合适大小。
2.粗酶液的制取
将猪肝和pH=7.0的甘露醇缓冲液按1:8的料液比加入干燥洁净的组织匀浆器中，先低速开启匀浆器，之后再慢慢转至高速，以防止溶液飞溅或猪肝附着于盖子上，约30S后关闭匀浆器，将的到的溶液先置于1.5ml离心管中密封好，冰水浴10min，之后将其抹干后，用高速离心机，在10000r/min条件下离心10min，离心后取上层清液，稀释10倍后得到粗酶液。粗酶液未使用时需置于冰水浴中，防止酶活出现变化。
3.过氧化氢酶活性的测定
在4个碘量瓶中分别加入10ml过氧化氢溶液并做好标记，置于25℃恒温水浴锅中水浴5min。先在其中一个碘量瓶中加入1ml浓硫酸，摇匀，1min后加入约50ml蒸馏水，加入三滴钼酸铵溶液，摇匀，加入足量碘化钾，摇匀后置于暗处反应5min，之后用硫代硫酸钠溶液滴定并记录数据。在剩下三个碘量瓶中各加入200ul粗酶液，准确反应3min后，加入1ml浓硫酸终止反应，摇匀，1min后加入约50ml蒸馏水，加入三滴钼酸铵溶液，摇匀，加入足量碘化钾，摇匀后置于暗处反应5min，之后用硫代硫酸钠溶液滴定并记录数据（也可采用高锰酸钾法测定过氧化氢酶活性）。测定需要三组以上，减少实验误差。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例一
1）原料的准备
将冰冻的猪肝在冰水浴中隔水解冻，随后用纸巾抹干表面血水，剔除膜衣和结缔组织并切成小块，称取10g猪肝。
2）粗酶液的制取
将猪肝和80ml甘露醇缓冲液加入干燥洁净的组织匀浆器中，于匀质机中在2000r下搅碎30秒，制得的匀浆液在10000r/min下离心10分钟，取上清液1ml，最后用1%甘露醇磷酸缓冲溶液稀释10倍，制得粗酶液。
3）过氧化氢酶活性的测定
在4个碘量瓶中分别加入10ml过氧化氢溶液并做好标记，置于25℃恒温水浴锅中水浴5min。先在其中一个碘量瓶中加入1ml浓硫酸，摇匀，1min后加入约50ml蒸馏水，加入三滴钼酸铵溶液，摇匀，加入足量碘化钾，摇匀后置于暗处反应5min，之后用硫代硫酸钠溶液滴定并记录数据。在剩下三个碘量瓶中各加入200ul粗酶液，准确反应3min后，加入1ml浓硫酸终止反应，摇匀，1min后加入约50ml蒸馏水，加入三滴钼酸铵溶液，摇匀，加入足量碘化钾，摇匀后置于暗处反应5min，之后用硫代硫酸钠溶液滴定并记录数据。根据数据计算过氧化氢酶的活性。
Figure 102485DEST_PATH_IMAGE001
实例二
1）原料的准备
将冰冻的猪肝在冰水浴中隔水解冻，随后用纸巾抹干表面血水，剔除膜衣和结缔组织并切成小块，称取10g猪肝。
2）粗酶液的制取
将猪肝和80ml甘露醇缓冲液加入干燥洁净的组织匀浆器中，于匀质机中在2000r下搅碎30秒，制得的匀浆液在10000r/min下离心10分钟，取上清液1ml，最后用1%甘露醇磷酸缓冲溶液稀释10倍，制得粗酶液。
3）过氧化氢酶活性的测定
取4个250ml碘量瓶，分别加入10ml0.2mol/L H2O2过氧化氢溶液并做好标记，先用1000ul移液枪在一个碘量瓶中加入1ml浓硫酸，加蒸馏水稀释至50ml，然后在75℃恒温水浴锅中用标定过的高锰酸钾标准溶液缓慢滴定（待颜色褪去后再滴下一滴），直到颜色刚好呈粉红色，并且30s内不褪色即为终点，记录高锰酸钾消耗量。在剩下的三个碘量瓶中，分别加入10ml 约0.2mol/L H2O2，再用200ul移液枪分别快速移入200ul酶液，静置3min后快速准确加入1ml浓硫酸终止，再加蒸馏水稀释至50ml，然后在75℃恒温水浴锅中用标定过的高锰酸钾标准溶液缓慢滴定（待颜色褪去后再滴下一滴），直到颜色刚好呈粉红色，并且30s内不褪色即为终点，记录高锰酸钾消耗量，根据数据计算过氧化氢酶的活性。
Figure 193807DEST_PATH_IMAGE002

Claims (7)

1.一种利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法，该方法由下列步骤组成：
S1，原料的准备：将冷冻的猪肝在冰水浴中隔水解冻或将其提前一夜置于4℃冰箱中自然解冻（也可直接用新鲜猪肝），用厨房纸巾抹干表面血水并剔除膜衣和结缔组织后切成合适大小；
S2，粗酶液的制取：将猪肝和pH=7.0的1%甘露醇缓冲液按1:8的料液比加入干燥洁净的组织匀浆器中，先低速开启匀浆器，之后再慢慢转至高速，以防止溶液飞溅或猪肝附着于盖子上，约30S后关闭匀浆器，将得到的溶液先置于1.5ml离心管中密封好，冰水浴10min，之后将其抹干后，用高速离心机，在10000r/min条件下离心10min，离心后取上层清液，稀释10倍后得到粗酶液，粗酶液未使用时需置于冰水浴中，防止酶活出现变化；
S3，过氧化氢酶活性的测定：在4个碘量瓶中分别加入10ml过氧化氢溶液并做好标记，置于25℃恒温水浴锅中水浴5min；先在其中一个碘量瓶中加入1ml浓硫酸，摇匀，1min后加入约50ml蒸馏水，加入三滴钼酸铵溶液，摇匀，加入足量碘化钾，摇匀后置于暗处反应5min，之后用硫代硫酸钠溶液滴定并记录数据；在剩下三个碘量瓶中各加入200ul粗酶液，准确反应3min后，加入1ml浓硫酸终止反应，摇匀，1min后加入约50ml蒸馏水，加入三滴钼酸铵溶液，摇匀，加入足量碘化钾，摇匀后置于暗处反应5min，之后用硫代硫酸钠溶液滴定并记录数据（也可采用高锰酸钾法测定过氧化氢酶活性）；测定需要三组以上，减少实验误差。
2.如权利要求1所述的利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法，其特征在于解冻的猪肝和新鲜的猪肝都要用纸巾抹干表面血水并剔除膜衣和结缔组织。
3.如权利要求1所述的利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法，其特征在于pH=7的1%甘露醇缓冲溶液（内含0.1mol/L的磷酸盐），配制方法为取11.82g NaH2PO4和19.35gNa2HPO4于烧杯中溶解后移入1L容量瓶中，另外称取10g甘露醇于烧杯中溶解，再倒入乘有NaH2PO4和Na2HPO4的1L容量瓶中，用蒸馏水定容。
4.如权利要求1所述的利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法，其特征在于先将猪肝和1%甘露醇缓冲液按1:8的料液比混合，再进行匀浆。
5.如权利要求1所述的利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法，其特征在于离心前用冰水浴冷却10min，粗酶液使用前后都置于冰水浴中。
6.如权利要求1所述的利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法，其特征在于粗酶液要进行稀释，使用量为200μl，过氧化氢浓度为0.2mol/L,终止反应浓硫酸用量为1ml，反应时间为3min，硫代硫酸钠的浓度在0.14mol/L-0.16mol/L。
7.如权利要求1所述的利用过氧化氢酶活性鉴别乳猪肝和成年猪肝的方法，其特征在于加入浓硫酸终止反应后先加蒸馏水稀释至50ml左右，再加入浓度为30g-40g/L的钼酸铵溶液三滴。
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