CN113444679A - 一种人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用。本发明的人泪腺干细胞的保藏编号为CCTCC NO：C202076；该细胞原代分离培养自人的正常泪腺组织，该细胞未导入任何外源基因，可用于人正常细胞的生理学研究，泪腺和泪腺相关疾病包括干眼症、泪液分泌的发病机理研究，环境污染物对泪腺的毒理学研究、药物的药理学研究等，也为人泪腺功能失调等相关疾病的细胞治疗提供了基础。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程领域，涉及一种人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用。
背景技术
泪腺是眼部的重要器官，主要功能为分泌泪液，保持眼部湿润，功能失调会导致干眼症的发生。如果泪腺功能受损或者发生病变，通常会导致人的眼睛患干眼症等疾病。干眼症患者通常伴随角膜炎症，甚至引起角膜细胞受损、形成溃疡、导致患者视力下降，影响其生活质量。对于干眼症患者，目前药物治疗虽可以缓解症状，但尚不能从根本上解决泪腺功能失调的问题。泪腺如果获得能在体外稳定培养传代的人泪腺干细胞，并构建人工泪腺，将使利用患者自身泪腺细胞重建泪腺功能成为可能，对再生医学研究与应用有重大意义。
然而，现有的泪腺干细胞体外培养方法分效率低、数量少，难以持续传代培养，大大限制了其临床应用。因此，需要更加优良的分离方法和培养体系来分离和培养泪腺干细胞。
3D气液界面培养可以培养出类似于体内上皮组织的类器官。由于能在体外模型中培养类似于体内状态的活细胞，气液界面通常用于研究呼吸系统疾病、消化系统疾病方面的研究，包括细胞间的信号传递和疾病建模。但尚未见其用于泪腺干细胞培养的报道。
发明内容
本发明的首要目的在于针对现有技术的不足，提供一种人泪腺干细胞。该细胞分离培养自中国人的正常泪腺组织，该细胞未导入任何外源基因，可以无限增殖、并可以诱导呈现具有腺泡特征。
本发明的另一目的在于提供上述人泪腺干细胞的原代分离培养方法。
本发明的再一目的在于提供上述人泪腺干细胞的无限传代培养方法。
本发明的目的还在于提供上述人泪腺干细胞的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
首先，本发明提供一种泪腺干细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：
(1)提供来源于正常人的泪腺组织样品；
(2)用95～100％(v/v)的乙醇清洗所述泪腺组织样品，用PBS缓冲液清洗，再去除残留脂肪；
(3)将所述泪腺组织样品用消化液消化；
(4)将消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于胰酶-EDTA中消化；
(5)加入含10～15％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清；
(6)再加入含10～15％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；
(7)重悬细胞沉淀于泪腺干细胞培养基中培养，得到所述人泪腺干细胞。
在一些实施例中，所述PBS缓冲液为0.01M，pH 7.4。
在一些实施例中，所述去除残留脂肪的步骤包括再将所述泪腺组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，去除所述泪腺组织样品中残留的脂肪；在一些实施例中，所述的预冷为在冰上预冷。
在一些实施例中，步骤(3)中所述消化液为含胶原酶和分散酶的DMEM培养基；在一些实施例中，以所述消化液的总体积计，所述胶原酶和分散酶的浓度分别为0.2～0.5mg/mL。
在一些实施例中，步骤(3)中所述的消化液的用量优选为10～12倍于组织样品体积。
在一些实施例中，步骤(3)中所述的消化的条件为37℃消化1～3小时。
在一些实施例中，步骤(4)中所述的消化为冰上消化1～3小时或37℃消化10～15分钟。
在一些实施例中，步骤(4)、(5)、(6)中所述的离心为1000～1500rpm离心3～5分钟。
在一些实施例中，步骤(7)中所述泪腺干细胞培养基为：DMEM培养基与F12培养基按体积比3：1混合，并添加5％L-谷氨酰胺，10％胎牛血清、0.1％氢化可的松，8.4ng/mL霍乱毒素(cholera toxin)，10ng/mL表皮生长因子(epithelial growth factor(EGF))，1/50B27，100U/mL青霉素(penicillin)，100μg/mL链霉素(streptomycin)，0.25μg/mL两性霉素B(Fungizone)，30μM法舒地尔(Fasudil)。
优选地，所述培养基经0.22μm孔径滤膜过滤。
在一些实施例中，步骤(7)所述的培养的条件为37℃、5％CO2。
本发明进一步提供上述原代分离培养方法所得到的人泪腺干细胞。
根据本发明，所述人泪腺干细胞，来源于人的正常泪腺干细胞，染色体为二倍体，STR(短串联重复序列)基因型以22个“STR基因座/等位基因长度”来表示：AMEL/X/X，D3S1358/15/16，D13S317/8/12，D7S820/11/12，D16S539/10/11，Penta D/9/12，D2S441/10/11，TPOX/11/12，TH01/7/7，D2S1338/17/17，CSF1PO/11/12，Penta E/14/14，D10S1248/15，D19S433/13/15.2，vWA/14/16，D21S11/29/33.2，D18S51/12/20，D6S1043/10/18，D8S1179/14/15，D5S818/11/11，D12S391/18/21，FGA/19/24。
根据本发明，所述人泪腺干细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202076。
根据本发明，所述的人泪腺干细胞的培养条件为用泪腺干细胞培养基于37℃、5％CO2培养；所述的泪腺干细胞培养基为：DMEM与无血清培养基F12按体积比3:1混合，同时添加5％(v/v)的FBS(胎牛血清)，以及0.4μg/mL皮质醇(hydrocortisone)，5μg/mL胰岛素(insulin)，8.4ng/mL霍乱毒素(cholera toxin)，10ng/mL表皮生长因子(epithelialgrowth factor，EGF)，24μg/mL腺嘌呤(adenine)，100U/mL青霉素(penicillin)，100μg/mL链霉素(streptomycin)，0.25μg/mL两性霉素B(Fungizone)，30μM法舒地尔(Fasudil)，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
本发明还提供上述人泪腺干细胞的传代培养方法，包括如下步骤：
(1)将所述人泪腺干细胞增殖至70～90％丰度时，用PBS缓冲液洗涤细胞，再用胰酶-EDTA溶液消化单层细胞；
(2)加入DMEM培养基中和消化反应；离心去上清，用泪腺干细胞培养基重悬细胞沉淀，进行培养。
在一些实施例中，所述PBS缓冲液为0.01M，pH 7.4，所述胰酶-EDTA溶液中胰酶的质量体积分数为0.05％-0.1％。
在一些实施例中，步骤(1)中所述的消化的时间为2～5分钟。
在一些实施例中，步骤(2)中所述的离心为1000～1500rpm离心3～5分钟。
在一些实施例中，步骤(2)中所述的培养的条件优选为37℃、5％CO2。
本发明进一步提供上述人泪腺干细胞的应用，包括将所述人泪腺干细胞经3D气液培养界面分化培养法进行分化培养，得到人泪腺腺泡器官模型。
在一些实施例中，所述3D气液培养界面分化培养法，包括如下步骤：
(1)将所述人泪腺干细胞铺进细胞培养插件(insert)中，insert内外的泪腺干细胞培养基液面高度保持一致；
(2)培养48小时后，吸弃insert内的培养基；更换insert外的泪腺干细胞培养基为400μl分化培养基，液面与insert高度持平，进行气液培养；
(3)气液培养连续培养7天，每天更换insert外的分化培养基；
(4)更换分化培养基为泪腺干细胞培养基，继续培养3～5天。
在一些实施例中，步骤(1)中所述的insert放置在多孔细胞培养板内，例如24孔板、48孔板或96孔板。
在一些实施例中，步骤(2)中所述的分化培养基为：泪腺干细胞培养基中加入FGF7和FGF10，优选工作浓度为100ng/ml。
在一些实施例中，步骤(3)中所述的气液培养为上层不加培养基并且与空气直接接触；下层加分化培养基为细胞生长分化提供营养。
本发明还提供所述人泪腺干细胞在制备治疗泪腺功能失调相关疾病的药物中的应用。在一些实施例中，所述泪腺功能失调相关疾病为干眼症。
本发明中，正常人是指泪腺功能正常的人类个体，例如其泪腺可正常分泌泪液，泪腺功能未受损也未发生任何病变；相应地，正常泪腺组织是指可正常分泌泪液，泪腺功能未受损也未发生任何病变的泪腺组织。
有益效果：
本发明提供的人泪腺干细胞，原代分离培养自人的正常泪腺组织，该细胞未导入任何外源基因，所述干细胞经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人的正常细胞系；可用于人正常细胞的生理学研究，泪腺和泪腺相关疾病包括干眼症、泪液分泌的发病机理研究，环境污染物对泪腺的毒理学研究、药物的药理学研究等，也为人泪腺功能失调等相关疾病的细胞治疗提供了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1的人泪腺干细胞的细胞形态图。
图2是实施例2人泪腺干细胞的生长曲线图。
图3是实施例3人泪腺干细胞的STR基因分型图。
图4是人正常泪腺组织(图4-A)和实施例5的人泪腺干细胞3D气液培养界面(图4-B)H&E染色图。
图5是实施例6的人泪腺干细胞3D气液培养界面和人正常泪腺组织的AQP5分子表达情况，其中图A、B、C依次为本发明实施例的人泪腺干细胞3D气液培养界面的AQP5抗体标记、DAPI荧光染色、合并荧光染色(Merge)的照片；图D、E、F依次为人正常泪腺组织AQP5抗体标记、DAPI荧光染色、合并荧光染色(Merge)的照片。
图6是实施例7的人泪腺干细胞3D气液培养界面和人正常泪腺组织的CK15分子表达情况，其中图A、B、C依次为本发明实施例的人泪腺干细胞3D气液培养界面的CK15抗体标记、DAPI荧光染色、合并荧光染色(Merge)的照片；图D、E、F依次为人正常泪腺组织CK15抗体标记、DAPI荧光染色、合并荧光染色(Merge)的照片。
图7是实施例8的人泪腺干细胞3D气液培养界面和人正常泪腺组织的DSG-1分子表达情况,其中图A、B、C依次为本发明实施例的人泪腺干细胞3D气液培养界面的DSG-1抗体标记、DAPI荧光染色、合并荧光染色(Merge)的照片；图D、E、F依次为人正常泪腺组织DSG-1抗体标记、DAPI荧光染色、合并荧光染色(Merge)的照片。
图8是实施例9的人泪腺干细胞3D气液培养界面(图8-A)和人正常泪腺组织(图8-B)的腺泡结构。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1人泪腺干细胞的原代分离培养
消化液的配制：分别含0.2mg/mL胶原酶(Collagenase,Type I)和0.2mg/mL分散酶(Dispase II)的泪腺干细胞培养基；其中，泪腺干细胞培养基为：DMEM培养基与F12培养基按体积比3：1混合，同时添加5％L-谷氨酰胺，10％胎牛血清、0.1％氢化可的松，8.4ng/mL霍乱毒素(cholera toxin)，10ng/mL表皮生长因子(epithelial growth factor(EGF))，1/50B27，100U/mL青霉素(penicillin)，100μg/mL链霉素(streptomycin)，0.25μg/mL两性霉素B(Fungizone)，30μM法舒地尔(Fasudil)，上述培养基经0.22μm孔径滤膜过滤。
(1)提供人的正常泪腺离体组织样品，本实施例的组织样本来源于泪腺下垂手术患者经切除的泪腺组织，经病人知情同意并做样品匿名化处理。
(2)用95％(v/v)的乙醇清洗离体组织样品1次，再用PBS(0.01M，pH 7.4)洗第2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪。
(3)将组织样品1～2mm3放入步骤(2)配制含10mL消化液的50mL离心管中，37℃消化2小时；
(4)将消化后的组织低速离心(1000rpm)5分钟，去除上清，得到细胞沉淀；将细胞沉淀重悬于5mL的0.25％(质量体积比)胰酶-EDTA中，置于冰上1小时。
(5)然后加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，低速1000rmp离心5分钟；尽量将上清去除干净。
(6)将细胞沉淀重悬于10ml含10％(v/v)FBS的DMEM的培养基中，之后用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5分钟，去除上清，得到细胞沉淀。
(7)重悬步骤(6)细胞沉淀于泪腺干细胞培养基中，接种于T25的培养瓶培养，培养条件是37℃、5％CO2。
按照上述方法分离培养成功的原代人泪腺干细胞，显微镜下观察细胞的形态如图1(排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的干细胞)。该细胞命名为人泪腺干细胞，已于2020年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C202076。
实施例2人泪腺干细胞的传代培养
(1)当实施例1中在T25培养瓶中培养的人泪腺干细胞增殖至70～90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤细胞两次，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟。
(2)加入10mL完全DMEM培养基中和消化反应1～2分种。
(3)1000rmp离心5分钟，去上清，重悬细胞沉淀于10mL泪腺干细胞培养基中接种培养。
(4)必要时可将1×106干细胞重悬于1～2mL的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％DMSO，v/v)中，储存于液氮中备用。
按照上述方法传代培养人泪腺干细胞，培养建系的细胞生长曲线如图2，连续传代培养80天，本发明的人泪腺干细胞仍能保持增殖状态正常生长。
实施例3人泪腺干细胞的基因分型分析鉴定
(1)贴壁生长的人泪腺干细胞(1×106)，用1×PBS洗涤细胞两次，0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞5分钟，10mL完全DMEM中和消化反应。
(2)10000rpm离心1分钟，倒尽上清，加200μL缓冲液GA(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，振荡至彻底悬浮。
(3)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
(4)加入200μL缓冲液GB(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心。
(5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心。
(6)将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。
(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。
(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。
(9)将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μL洗脱缓冲液TE(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，室温放置5min，12000rpm(13400×g)离心2分钟，将提取的DNA溶液收集到离心管中。
(10)利用
16HS系统(DC2101，promega公司)进行21个基因座(15个STR位点和1个性别位点)的DNA复合扩增。
(11)使用ABI
3100型遗传分析仪(1.1版本数据收集软件)进行扩增片段的检测。
(12)使用
和PowerTyperTM 16Macro软件分析样本数据，进行自动基因分型，STR分型结果图3，检测22个STR基因位点，以“STR基因座/等位基因长度”来表示：AMEL/X/X，D3S1358/15/16，D13S317/8/12，D7S820/11/12，D16S539/10/11，Penta D/9/12，D2S441/10/11，TPOX/11/12，TH01/7/7，D2S1338/17/17，CSF1PO/11/12，Penta E/14/14，D10S1248/15，D19S433/13/15.2，vWA/14/16，D21S11/29/33.2，D18S51/12/20，D6S1043/10/18，D8S1179/14/15，D5S818/11/11，D12S391/18/21，FGA/19/24。
由此可见，本发明的人泪腺干细胞经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人的正常细胞系，是一种新的人泪腺干细胞。
实施例4人泪腺干细胞的3D气液培养界面类器官模型建立
(1)将200μl含有3x105个泪腺干细胞的细胞悬液加入到0.4μl孔径的insert中，置于24孔板内，insert外加入与内部等高的泪腺干细胞培养基，37℃培养48小时。
(2)吸弃insert内的培养基，在insert外加入200μl分化培养基，每2天更换一次，培养7天。分化培养基为：DMEM培养基与F12培养基按体积比3：1混合，同时添加5％L-谷氨酰胺，10％胎牛血清、0.1％氢化可的松，8.4ng/mL霍乱毒素(cholera toxin)，10ng/mL表皮生长因子(epithelial growth factor(EGF))，1/50B27，100ng/ml FGF10，100ng/ml FGF7，100U/mL青霉素(penicillin)，100μg/mL链霉素(streptomycin)，0.25μg/mL两性霉素B(Fungizone)，30μM法舒地尔(Fasudil)，上述培养基经0.22μm孔径滤膜过滤。
(3)更换分化培养基为泪腺干细胞培养基，每两天更换一次培养基，连续培养5天。
(4)将insert用4％多聚甲醛溶液于4℃固定过夜。
(5)将固定后的insert的PE膜及附着其上的泪腺干细胞培养物分离，并进行石蜡脱水包埋。
(6)将包埋好的PE膜及附着其上的泪腺干细胞培养物进行切片(厚度为0.5μm)，制片后进行H&E染色。
(7)于显微镜下观察泪腺干细胞培养物横切面并拍照记录腺泡结构。
腺泡结构见图4，说明本发明的人泪腺干细胞为具有分化为和泪腺组织相似的腺泡结构。
实施例5人正常泪腺组织和3D气液培养界面AQP5分子表达情况
(1)将包埋好的PE膜及附着其上的泪腺干细胞培养物进行切片(厚度为0.5μm)
(2)用AQP5的一抗标记，4℃避光过夜。
(3)PBS洗3次，洗去多余的抗体，用Cy3标记的羊抗人的荧光二抗标记，室温闭光1小时。
(4)PBS洗3次，洗去多余的抗体，加封片剂封片，荧光显微镜进行观察拍照，结果如图5所示。
根据图5，本发明的人泪腺干细胞3D气液培养界面具有和人泪腺组织同样的AQP5分子的表达，其中AQP5是泪腺组织特异性组织标志性蛋白之一。
实施例6人正常泪腺组织和3D气液培养界面CK15分子表达情况
(1)将包埋好的PE膜及附着其上的泪腺干细胞培养物进行切片(厚度为0.5μm)
(2)用CK15的一抗标记，4℃避光过夜。
(3)PBS洗3次，洗去多余的抗体，用Cy3标记的羊抗人的荧光二抗标记，室温闭光1小时。
(4)PBS洗3次，洗去多余的抗体，加封片剂封片，荧光显微镜进行观察拍照，如图6所示。
参见图6可知，本发明的人泪腺干细胞3D气液培养界面具有和人泪腺组织同样的CK15分子的表达，其中CK15是泪腺组织特异性组织标志性蛋白之一。
实施例7人正常泪腺组织和3D气液培养界面DSG-1分子表达情况
(1)将包埋好的PE膜及附着其上的泪腺干细胞培养物进行切片(厚度为0.5μm)
(2)用DSG-1的一抗标记，4℃避光过夜。
(3)PBS洗3次，洗去多余的抗体，用FITC标记的羊抗人的荧光二抗标记，室温闭光1小时。
(4)PBS洗3次，洗去多余的抗体，加封片剂封片，荧光显微镜进行观察拍照，如图7所示。
参见图7可知，本发明的人泪腺干细胞3D气液培养界面具有和人泪腺组织同样的DSG-1分子的表达，其中DSG-1是桥粒连接蛋白，代表细胞发生分化并形成紧密连接。
实施例8人正常泪腺组织和3D气液培养界面腺泡结构观察
(1)将200μl含有3x105个泪腺干细胞的细胞悬液加入到0.4μl孔径的insert中，置于24孔板内，insert外加入与内部等高的培养基，37℃培养48小时。
(2)吸弃insert内的培养基，在insert外加入200μl泪腺细胞培养基，每2天更换一次，培养15天。
(3)将insert用4％多聚甲醛于4℃固定过夜。
(4)用AQP5和Lactoferrin的一抗标记，4℃避光过夜。
(5)PBS洗3次，洗去多余的抗体，用Cy3和FITC标记的羊抗人的荧光二抗标记，室温闭光1小时。
(6)PBS洗3次，洗去多余的抗体，加封片剂封片，激光共聚焦显微镜进行分层扫描，观察拍照，如图8所示。
根据图8可知，本发明的人泪腺干细胞3D气液培养界面具有和人泪腺组织相似的腺泡结构，并且AQP5和Lactoferrin表达和分布具有特异性：Lactoferrin(绿色荧光)主要分布在腺泡结构，AQP5主要在顶端面和腺泡中间的导管位置表达。由此可见，本实施例涉及的3D气液界面分化方法可以用于模拟人泪腺干细胞的组织结构。
以上对本申请实施例所提供的人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
Claims (10)
1.一种泪腺干细胞的原代分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提供来源于正常人的泪腺组织样品；
(2)用95～100％(v/v)的乙醇清洗上述泪腺组织样品，用PBS缓冲液清洗，再去除残留脂肪；
(3)将泪腺组织样品用消化液消化；
(4)将消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于胰酶-EDTA溶液中消化；
(5)加入含10～15％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清；
(6)再加入含10～15％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；
(7)重悬细胞沉淀于泪腺干细胞培养基中培养，得到所述人泪腺干细胞。
2.根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中消化液为含胶原酶和分散酶的DMEM培养基，以所述消化液的总体积计，所述胶原酶和分散酶的浓度分别为0.2～0.5mg/mL；优选地，所述步骤(3)消化液的用量为10～12倍于所述泪腺组织样品体积；优选地，所述步骤(3)消化的条件为37℃消化1～3小时。
3.根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的消化为冰上消化1～3小时或37℃消化10～15分钟。
4.根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，所述步骤(7)中泪腺干细胞培养基为：DMEM培养基与F12培养基按体积比3：1混合，并添加5％L-谷氨酰胺，10％胎牛血清、0.1％氢化可的松，8.4ng/mL霍乱毒素(cholera toxin)，10ng/mL表皮生长因子(epithelial growth factor(EGF))，1/50B27，100U/mL青霉素(penicillin)，100μg/mL链霉素(streptomycin)，0.25μg/mL两性霉素B(Fungizone)，30μM法舒地尔(Fasudil)；
其中，所述步骤(7)中，培养的条件为37℃、5％CO2。
5.权利要求1-4任一项所述的原代分离培养方法所得到的人泪腺干细胞。
6.根据权利要求5所述的人泪腺干细胞，其特征在于，所述人泪腺干细胞来源于人的正常泪腺干细胞，染色体为二倍体，STR(短串联重复序列)基因型以22个“STR基因座/等位基因长度”来表示，包括AMEL/X/X，D3S1358/15/16，D13S317/8/12，D7S820/11/12，D16S539/10/11，Penta D/9/12，D2S441/10/11，TPOX/11/12，TH01/7/7，D2S1338/17/17，CSF1PO/11/12，Penta E/14/14，D10S1248/15，D19S433/13/15.2，vWA/14/16，D21S11/29/33.2，D18S51/12/20，D6S1043/10/18，D8S1179/14/15，D5S818/11/11，D12S391/18/21，FGA/19/24。
7.一种人泪腺干细胞，其特征在于，所述人泪腺干细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202076。
8.如权利要求5-7任一项所述的人泪腺干细胞的传代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将所述人泪腺干细胞增殖至70～90％丰度时，用PBS缓冲液洗涤细胞，再用胰酶-EDTA溶液消化单层细胞；
(2)加入DMEM培养基中和化反应；离心去上清，用泪腺干细胞培养基重悬细胞沉淀，进行培养。
9.如权利要求8所述的人泪腺干细胞的应用，其特征在于，包括将所述人泪腺干细胞经3D气液培养界面分化培养法进行分化培养，得到人泪腺腺泡器官模型。
10.权利要求8任一项人泪腺干细胞在制备治疗泪腺功能失调相关疾病的药物中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111836884A (zh) * | 2018-03-28 | 2020-10-27 | 国立大学法人大阪大学 | 源自干细胞的泪腺组织的制作方法 |
Family Cites Families (5)
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|---|---|---|---|---|
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| US10392602B2 (en) * | 2015-03-25 | 2019-08-27 | Keio University | Method of deriving lacrimal gland epithelial cells from ES cells and other stem cells |
| CN109486766B (zh) * | 2018-11-26 | 2021-05-07 | 中山大学 | 一种泪腺干细胞、泪腺干细胞的培养体系和培养方法 |
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2022
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111836884A (zh) * | 2018-03-28 | 2020-10-27 | 国立大学法人大阪大学 | 源自干细胞的泪腺组织的制作方法 |
| US20210024896A1 (en) * | 2018-03-28 | 2021-01-28 | Osaka University | Method for producing stem cell-derived lacrimal gland tissue |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ACKERMANN P, HETZ S, DIECKOW J, ET AL.: "Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells", 《INVEST OPHTHALMOL VIS SCI.》 * |
| ACKERMANN P, HETZ S, DIECKOW J, ET AL.: "Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells", 《INVEST OPHTHALMOL VIS SCI.》, vol. 56, no. 8, 31 July 2015 (2015-07-31), pages 4350 - 4363, XP093017965, DOI: 10.1167/iovs.15-16475 * |
| HUI LIN ET AL.: "Three Dimensional Culture of Potential Epithelial Progenitor Cells in Human Lacrimal Gland", 《TRANS VIS SCI TECH.》 * |
| HUI LIN ET AL.: "Three Dimensional Culture of Potential Epithelial Progenitor Cells in Human Lacrimal Gland", 《TRANS VIS SCI TECH.》, vol. 8, no. 4, 30 August 2019 (2019-08-30), pages 1 - 7, XP093017970, DOI: 10.1167/tvst.8.4.32 * |
| HUI LIN ET AL.: "Three Dimensional Culture of Potential Epithelial Progenitor Cells in Human Lacrimal Gland", TRANS VIS SCI TECH., vol. 8, no. 4, pages 1 - 7 * |
| 徐威主编: "《药学细胞生物学》", 31 December 2019, 中国医药科技出版社, pages: 362 - 364 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023274043A1 (zh) * | 2021-06-27 | 2023-01-05 | 深圳市眼科医院 | 一种人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用 |
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