CN113398122A - 三个唑类化合物在制备抗神经胶质瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及三个唑类化合物在制备抗神经胶质瘤药物中的应用，其涉及药物为氟苯达唑、甲苯达唑、芬苯达唑。本发明的三个化合物均能够抑制胶质瘤细胞的增殖。本发明的三个化合物均能够通过诱导细胞凋亡来实现抗肿瘤作用。本发明的三个化合物均能够通过抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭从而抑制肿瘤。本发明的三个化合物均能够通过阻滞细胞周期组织在G2/M期。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及三个抗肿瘤药物，具体涉及三个唑类化合物在制备预防和/或治疗神经胶质瘤药物中的应用。
背景技术
神经胶质瘤(glioma)是一个源自神经上皮的肿瘤，占颅脑肿瘤的40％-50％，是最常见的颅内恶性肿瘤。神经胶质瘤是发病率、复发率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中占恶性胶质瘤发病率50％以上的胶质母细胞瘤的中位生存期仅为10-12个月。目前替莫唑胺是临床上用于治疗神经胶质瘤的一线药物，但由于胶质瘤细胞易对其产生耐药性，导致其临床有效率低于45％。因此寻找有效的治疗神经胶质瘤的药物至关重要。
氟苯达唑(Flubendazole)、甲苯达唑(Mebendazole)、芬苯达唑(Fenbendazole)是三个苯并咪唑类化合物，是安全有效的驱虫药物，通过抑制线虫的微管蛋白聚合进而抑制线虫，广泛地运用于治疗人类胃肠道的寄生虫。此三种化合物均未有抗神经胶质瘤活性的报道。
已报道氟苯达唑：5-(4-氟苯甲酰基)苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯；甲苯达唑：5-苯甲酰-1-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸甲酯；芬苯达唑：5-苯硫基苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯的结构式分别如式Ⅰ、ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ所示：
发明内容
本发明解决的技术问题是提供三个唑类化合物，氟苯达唑、甲苯达唑与芬苯达唑在制备预防和/或治疗神经胶质瘤药物中的应用。
为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明的技术方案提供了一个式Ⅰ、式ⅠⅠ与式ⅠⅠⅠ所示的三个唑类化合物氟苯达唑、芬苯达唑、甲苯达唑或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗神经胶质瘤药物中的应用。所述的三个唑类化合物能够抑制胶质瘤细胞的增殖。进一步的，所述的三个唑类化合物通过抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭从而抑制肿瘤。所述三个唑类化合物通过诱导细胞凋亡来实现抗肿瘤作用。所述的三个唑类化合物通过诱导细胞周期G2M期阻滞从而抑制肿瘤。
上述氟苯达唑、芬苯达唑、甲苯达唑的药学上可接受的盐为其与盐酸、氢溴酸、对甲苯磺酸、酒石酸、马来酸、富马酸、乳酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、苯磺酸、或三氟乙酸所成的盐。
氟苯达唑、芬苯达唑、甲苯达唑或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗神经胶质瘤药物中的应用，也包含其药物组合物，组合物包括有效剂量的氟苯达唑、芬苯达唑、甲苯达唑或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体。
本发明所述的治疗神经胶质瘤的药物，优选的情况下，所述三个唑类化合物的有效浓度为0.01～3μM。
本发明所述的治疗神经胶质瘤的药物，优选的情况下，所述三个唑类化合物的稀释溶剂为二甲基亚砜。
有益技术成果
(1)本发明提出的三个唑类化合物具有显著的抗恶性母细胞瘤的作用，并发现此三个化合物通过诱导神经胶质瘤细胞的凋亡并通过细胞周期阻滞来发挥其抗肿瘤作用。
(2)神经胶质瘤是目前发病率、复发率、死亡率最高的颅内恶性肿瘤。一方面由于其肿瘤生长部位位于脑内深部重要功能区，因此肿瘤难以完全切除；另一方面，脑内存在血脑屏障，药物很难透过血脑屏障进入脑内从而发挥药效，并且胶质瘤细胞对临床一线用药替莫唑胺也极易产生耐药性，因此胶质瘤的治疗效果并不理想。本申请发现此三个化合物具有明显的抗神经胶质瘤活性，可以作为治疗神经胶质瘤的候选药物。
附图说明
图1、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞12、24、48小时对细胞的抑制率；
图2、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞24小时的细胞形态学的改变；
图3、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞24和48小时对U87细胞的细胞毒作用；
图4、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞对细胞迁移能力的影响；
图5、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞对细胞侵袭能力的影响；
图6、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞24小时对DNA复制活性的影响；
图7、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞24小时的细胞凋亡变化；
图8、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞24小时的细胞周期变化；
图9、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞12、24、48小时对细胞的抑制率；
图10、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞24小时的细胞形态学的改变；
图11、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞24和48小时对U251细胞的细胞毒作用；
图12、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞对细胞迁移能力的影响；
图13、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞对细胞侵袭能力的影响；
图14、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞24小时对DNA复制活性的影响；
图15、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞24小时的细胞凋亡变化。
图16、不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞24小时的细胞周期变化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明并不受限于此，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所做的任何变化都应落入本发明权利要求书所限定的范围内。
实施例1～2中所用的生物材料、药品和实验方法如下：
细胞：U87和U251(人神经胶质瘤细胞株)是从中国科学院细胞库北京资源中心获得。
药品：准确称量三个唑类化合物：氟苯达唑、甲苯达唑、芬苯达唑(购自MedChemExpress化合物库)，以二甲基亚砜溶解，分别配成氟苯达唑、甲苯达唑、芬苯达唑浓度为10mmol/L的储备液，在-80℃下保存，使用时用新鲜的培养基稀释到合适的浓度，实施例1～2中使用的培养基为DMEM高糖培养基。
CCK8检测细胞增殖：细胞于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用细胞计数板进行计数。按5000个/孔接种于96孔细胞培养板，每孔200μL，5％CO2、37℃培养箱中培养24小时后分别加入不同浓度梯度的三个唑类化合物，5％CO2、37℃培养箱中分别孵育24小时、48小时、72小时。弃去培养基，每孔加入含有无血清培养基稀释的CCK8溶液(1:10稀释)100μL，37℃分别孵育1小时。用酶标仪进行检测，检测波长为450nm。
LDH检测细胞毒作用：细胞于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO2的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用细胞计数板进行计数。按5000个/孔接种于96孔细胞培养板，每孔200μL，5％CO2、37℃培养箱中培养，24小时后分别加入不同浓度梯度的三个唑类化合物，作用24小时、48小时，高对照加裂解液10μL/孔，37℃孵育30分钟。每孔加100μL工作液，U87细胞孵育30分钟，U251细胞孵育45分钟。每孔加50μL终止液，490nm下检测。
细胞迁移和侵袭检测：
细胞迁移：细胞于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO2的条件下培养。将插入式细胞培养小室用培养基湿润30分钟。将细胞用胰酶消化后，用细胞计数板进行计数，按2×105/孔接种于小室中，每孔300μL，5％CO2、37℃培养4小时，待细胞贴壁后弃上室培养基，分别加入不同浓度梯度由无血清培养基配置的三个唑类化合物，下室加600μL含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养12小时后4％多聚甲醛固定15分钟，清除上室细胞，结晶紫染色30分钟，于显微镜下拍照。
细胞侵袭：细胞于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO2的条件下培养。在插入式细胞培养小室中加入基质胶(1:7稀释，无血清DMEM配置)，在37℃培养箱中凝固30分钟。将细胞用胰酶消化后，用细胞计数板进行计数，按2×105/孔接种小室中，每孔300μL，5％CO2、37℃培养4小时，待细胞贴壁后弃上室培养基，分别加入不同浓度梯度由无血清培养基配置的三个唑类化合物，下室加600μL含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养12小时后4％多聚甲醛固定15分钟，清除上室细胞，结晶紫染色30分钟，于显微镜下拍照。
DNA复制活性检测：细胞用胰酶消化后，细胞计数板进行计数，按5000个/孔接种于96孔细胞培养板，每孔200μL，5％CO2、37℃培养箱中培养24小时后分别加入不同浓度梯度的三个唑类化合物，5％CO2、37℃培养箱中孵育24小时。取出96孔板，每孔加入EdU溶液100μL(1:1000稀释)，37℃培养箱中孵育2小时。PBS洗2次，每孔加入100μL 4％多聚甲醛固定30分钟，PBS洗2次，加入100μLApollo染色反应液，孵育30分钟，PBS洗2次，每孔加Hochest33342溶液100μL(1:1000稀释)，室温避光染色30分钟。PBS洗2次，每孔加100μL生理盐水，荧光显微镜下拍照。
Annexin V/PI(propidium iodide，碘化丙啶)双染检测细胞凋亡：以5×105个/孔的细胞数将细胞种于6cm2的平皿中，于24小时分别加入不同浓度的三个唑类化合物。药物作用24小时，胰酶消化，1200rpm离心5分钟收集细胞。用4℃预冷的PBS洗两次，加入100μL含有5μL Annexin V和PI的结合缓冲液，轻柔的吹散细胞，室温避光孵育15分钟，加入200μL预冷的结合缓冲液。400目的尼龙网过滤后，流式细胞仪检测分析。
细胞周期检测：以5×105个/孔的细胞数将细胞种于6cm2的平皿中，于24小时分别加入不同浓度的三个唑类化合物。药物作用24小时后胰酶消化，1200rpm离心5分钟收集细胞。用4℃预冷的PBS洗两次，每次1mL，弃900μL PBS，在低速涡旋状态下逐滴滴加经-20℃预冷的75％乙醇1mL，4℃固定24小时。1200rpm离心5分钟，用4℃预冷的PBS洗两次，加200μLPI染液(PI：50μg/mL，RNase A：200μg/mL，TritonX-100：0.1％)，室温避光染色30分钟。400目的尼龙网过滤后，流式细胞仪检测分析。
实验例1
(1)用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释三个唑类化合物分别为表1、表2和表3的浓度，不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞12、24和48小时后的细胞抑制率见图1及表1、表2和表3。
表1.氟苯达唑在不同给药剂量下作用U87不同时间的细胞抑制率
表2.甲苯达唑在不同给药剂量下作用U87不同时间的细胞抑制率
表3.芬苯达唑在不同给药剂量下作用U87不同时间的细胞抑制率
由此可见，三个唑类化合物均能以浓度和时间双依赖的形式抑制胶质瘤U87的增殖，且在氟苯达唑作用U87细胞24小时后的半数抑制率(IC50)约为0.1701μM，甲苯达唑作用U87细胞24小时后的半数抑制率(IC50)约为0.2066μM，芬苯达唑作用U87细胞24小时后的半数抑制率(IC50)约为0.1819μM(图1)。
用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基分别稀释三个唑类化合物为0，0.125，0.25，0.5μM，分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物作用于U87细胞，24小时后检测细胞形态的变化，结果如图2所示。U87细胞的形态随着给药浓度的增加逐渐发生改变(图2)。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U87细胞，24和48小时后检测三个唑类化合物对U87的细胞毒作用，结果如图3所示。三个唑类化合物均能够对U87产生细胞毒作用，并且作用呈剂量和时间依赖性(图3)。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U87细胞，24小时检测三个唑类化合物对U87细胞迁移的影响，24小时检测三个唑类化合物分别对U87细胞侵袭的影响，结果如图4和图5所示。随着给药浓度的增加，U87细胞的迁移(图4)和侵袭能力(图5)逐渐降低。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U87细胞，24小时后检测三个唑类化合物对U87细胞DNA复制活性的影响，结果如图6所示。随着药物浓度的增加，凋亡U87细胞增加，DNA复制活性减弱(图6)。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U87细胞，24小时后用Annexin V-EGFP(绿色荧光标记的膜结合蛋白V)和PI(碘化丙啶)对药物处理后的细胞进行双染后，流式检测可将细胞分为四个群，分别是左上(Q1)、右上(Q2)、右下(Q3)和左下(Q4)，其中Q2和Q4分别代表晚期和早期凋亡，合在一起为总的凋亡率。不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞48小时后的细胞凋亡变化见图7。三个唑类化合物均能够浓度依赖性地诱导U87细胞的凋亡(图7)。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U87细胞，24小时后用PI检测细胞周期。不同浓度的三个唑类化合物分别作用U87细胞24h后的细胞周期变化见图8。三个唑类化合物均能以浓度依赖的形式诱导U87细胞发生G2/M期阻滞(图8)。
实验例2
(1)用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释三个唑类化合物分别为表4、表5和表6的浓度，不同浓度的三个唑类化合物分别作用251细胞12、24和48小时后的细胞抑制率见图9及表4、表5和表6。
表4.氟苯达唑在不同给药剂量下作用U251不同时间的细胞抑制率
表5.甲苯达唑在不同给药剂量下作用U251不同时间的细胞抑制率
表6.芬苯达唑在不同给药剂量下作用U251不同时间的细胞抑制率
由此可见，三个唑类化合物均能以浓度和时间双依赖的形式抑制胶质瘤U251的增殖，且在氟苯达唑作用U251细胞24小时后的半数抑制率(IC50)约为0.2243μM，甲苯达唑作用U251细胞24小时后的半数抑制率(IC50)约为0.2532μM，芬苯达唑作用U251细胞24小时后的半数抑制率(IC50)约为0.2259μM(图9)。
用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基分别稀释三个唑类化合物为0，0.125，0.25，0.5μM，分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物作用于U251细胞，24小时后检测细胞形态的变化，结果如图10所示。U251细胞的形态随着给药浓度的增加逐渐发生改变(图10)。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U251细胞，24和48小时后检测三个唑类化合物对U251的细胞毒作用，结果如图11所示。三个唑类化合物均能够对U251产生细胞毒作用，并且作用呈剂量和时间依赖性(图11)。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U251细胞，24小时检测三个唑类化合物对U251细胞迁移的影响，24小时检测三个唑类化合物分别对U251细胞侵袭的影响，结果如图12和图13所示。随着给药浓度的增加，U251细胞的迁移(图12)和侵袭能力(图13)逐渐降低。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U251细胞，24小时后检测三个唑类化合物对U251细胞DNA复制活性的影响，结果如图14所示。随着药物浓度的增加，凋亡U251细胞增加，DNA复制活性减弱(图14)。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U251细胞，24小时后用Annexin V-EGFP(绿色荧光标记的膜结合蛋白V)和PI(碘化丙啶)对药物处理后的细胞进行双染后，流式检测可将细胞分为四个群，分别是左上(Q1)、右上(Q2)、右下(Q3)和左下(Q4)，其中Q2和Q4分别代表晚期和早期凋亡，合在一起为总的凋亡率。不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞48小时后的细胞凋亡变化见图15。三个唑类化合物均能够浓度依赖性地诱导U251细胞的凋亡(图15)。
分别用0，0.125，0.25，0.5μM的三个唑类化合物分别作用于U251细胞，24小时后用PI检测细胞周期。不同浓度的三个唑类化合物分别作用U251细胞24h后的细胞周期变化见图16。三个唑类化合物均能以浓度依赖的形式诱导U251细胞发生G2/M期阻滞(图16)。
Claims (7)
1.如式Ⅰ、式ⅠⅠ或式ⅠⅠⅠ所示的唑类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗神经胶质瘤药物中的应用；
2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的唑类化合物通过抑制神经胶质瘤细胞的增殖从而抑制胶质瘤。
3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的唑类化合物通过抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭从而抑制胶质瘤。
4.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的唑类化合物通过诱导细胞凋亡来实现抗神经胶质瘤作用。
5.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的唑类化合物通过非特异性阻滞神经胶质瘤细胞周期从而诱导其凋亡。
6.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为式Ⅰ、式ⅠⅠ或式ⅠⅠⅠ化合物与盐酸、氢溴酸、对甲苯磺酸、酒石酸、马来酸、富马酸、乳酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、苯磺酸、或三氟乙酸所成的盐。
7.含有式Ⅰ、式ⅠⅠ或式ⅠⅠⅠ所示的三个唑类化合物的药物组合物在制备预防和/或治疗神经胶质瘤药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物包括有效剂量的式Ⅰ、式ⅠⅠ或式ⅠⅠⅠ所示的唑类化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体，
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