CN113396212A - 细胞培养装置、细胞培养方法及产物的制造方法 - Google Patents

细胞培养装置、细胞培养方法及产物的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种细胞培养装置，其具备：培养容器，容纳细胞悬浮液；及隔膜泵，用于从培养容器内部抽出细胞悬浮液，由隔膜泵的隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，关于隔膜中的各个点，当连接从隔膜顶点引出到平面F的垂线的垂足和各个点的直线与垂线所成角度设为各个点的角度A时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，当将隔膜顶点上的隔膜厚度设为HT时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也满足1≤HT/H≤1.75的关系。本发明还提供一种使用了所述细胞培养装置的细胞培养方法及产物的制造方法。

Description

细胞培养装置、细胞培养方法及产物的制造方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养装置、细胞培养方法及产物的制造方法。
背景技术
当培养细胞时，有时以各种目的而使用泵从培养容器内部抽出培养液。例如，在日本专利公开2010-29109号公报(专利文献1)中，以捕集污染微生物为目的，从培养容器内部抽出培养液。
在美国专利第6544424号说明书(专利文献2)中记载有使用隔膜泵通过切向流方式对从培养容器内部抽出的培养液进行过滤。
发明内容
发明要解决的技术课题
本发明的实施方式要解决的课题是提供一种在由容量小的隔膜泵抽出细胞悬浮液的情况下，能够兼顾良好的细胞增殖性和抑制隔膜破损的细胞培养装置、细胞培养方法及使用了所述细胞培养方法的产物的制造方法。
用于解决技术课题的手段
用于解决上述课题的方法中包括以下方式。
＜1＞一种细胞培养装置，其具备：培养容器，容纳细胞悬浮液；及
隔膜泵，用于从上述培养容器内部抽出上述细胞悬浮液，
由上述隔膜泵的隔膜和包括上述隔膜的外缘部的远离上述隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，
关于上述隔膜中的各个点，当将连接从上述隔膜顶点引出到上述平面F的垂线的垂足与上述各个点的直线和上述垂线所成角度设为上述各个点的角度A时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，上述隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，
当将上述隔膜顶点上的上述隔膜厚度设为HT时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，上述隔膜厚度H也满足下述式1。
1≤HT/H≤1.75 (式1)。
＜2＞根据＜1＞所述的细胞培养装置，其中，在上述隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的上述隔膜厚度设为HY且将角度A为90°的点上的上述隔膜厚度设为HZ时，HZ＜HY，并且在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，上述隔膜厚度H也为H≤HZ。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的细胞培养装置，其中，在上述隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的上述隔膜厚度设为HY时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，上述隔膜厚度H也满足下述式2。
1＜HY/H≤3 (式2)。
＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的细胞培养装置，其中，上述隔膜的材质是硅酮橡胶。
＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的细胞培养装置，其中，上述隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力σ满足下述式3。
0.4MPa≤σ≤1.5MPa (式3)。
＜6＞一种细胞培养方法，其包括：在容纳于培养容器内部的细胞悬浮液中培养细胞；及
由隔膜泵从上述培养容器内部抽出上述细胞悬浮液，
由上述隔膜泵的隔膜和包括上述隔膜的外缘部的远离上述隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，
关于上述隔膜中的各个点，当将连接从上述隔膜顶点引出到上述平面F的垂线的垂足与上述各个点的直线和上述垂线所成角度设为上述各个点的角度A时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，上述隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，
当将上述隔膜顶点上的上述隔膜厚度设为HT时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，上述隔膜厚度H也满足下述式1。
1≤HT/H≤1.75 (式1)。
＜7＞根据＜6＞所述的细胞培养方法，其中，在上述隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的上述隔膜厚度设为HY且将角度A为90°的点上的上述隔膜厚度设为HZ时，HZ＜HY，并且在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，上述隔膜厚度H也为H≤HZ。
＜8＞根据＜6＞或＜7＞所述的细胞培养方法，其中，在上述隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的上述隔膜厚度设为HY时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，上述隔膜厚度H也满足下述式2。
1＜HY/H≤3 (式2)。
＜9＞根据上述＜6＞至＜8＞中任一项所述的细胞培养方法，其中，
上述隔膜的材质是硅酮橡胶。
＜10＞根据＜6＞至＜9＞中任一项所述的细胞培养方法，其中，上述隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力σ满足下述式3。
0.4MPa≤σ≤1.5MPa (式3)。
＜11＞根据＜6＞至＜10＞中任一项所述的细胞培养方法，其中，在上述隔膜泵运转时，驱动上述隔膜的上述隔膜泵的内部压力P满足下述式4。
大气压-0.1MPa≤P≤大气压+0.1Mpa(式4)。
＜12＞根据＜6＞至＜11＞中任一项所述的细胞培养方法，其中，上述细胞是CHO细胞。
＜13＞根据＜6＞至＜12＞中任一项所述的细胞培养方法，其中，还包括：使用分离膜并通过切向流过滤方式进行如下分离处理：将从上述培养容器内部抽出的上述细胞悬浮液分离成具有比上述细胞悬浮液中的细胞浓度高的细胞浓度的第一溶液，和具有比上述细胞悬浮液中的细胞浓度低的细胞浓度的第二溶液；
使上述第一溶液返回到上述培养容器内部；及
将培养基重新添加到上述培养容器内部。
＜14＞一种产物的制造方法，其包括：使用＜6＞至＜13＞中任一项所述的细胞培养方法培养生产产物的细胞；及
从上述细胞悬浮液回收产物。
＜15＞根据上述＜14＞所述的产物的制造方法，其中，上述产物是抗体。
发明效果
根据本发明的实施方式，提供一种在由容量小的隔膜泵抽出细胞悬浮液的情况下，能够兼顾良好的细胞增殖性和抑制隔膜破损的细胞培养装置、细胞培养方法及使用了所述细胞培养方法的产物的制造方法。
附图说明
图1是表示本发明所涉及的细胞培养装置的结构的一例的图。
图2是表示本发明所涉及的细胞培养装置中的隔膜泵的结构的一例的图。
图3A是用于对隔膜上的各个点的角度A进行说明的图。
图3B是用于对由隔膜限定的体积进行说明的图。
图4(A)～(D)是表示实施例及比较例中的隔膜状态的判定基准的附图。
图5是表示实施例及比较例中的增殖性及生存力的评价基准的曲线图。
图6是表示实施例1中的细胞浓度及生存力的变化的曲线图。
具体实施方式
以下，对本发明所涉及的细胞培养装置、细胞培养方法及产物的制造方法进行说明。然而，本发明所涉及的实施方式并不限定于以下实施方式，能够适当地加以变更而实施。
本发明中使用“～”示出的数值范围是指，将记载于“～”前后的数值分别作为最小值及最大值而包括的范围。
在本发明中阶段性地记载的数值范围中，在某一数值范围内记载的上限值或下限值可以替换为其他阶段性地记载的数值范围的上限值或下限值。并且，在本发明中记载的数值范围中，在某一数值范围内记载的上限值或下限值可以替换为实施例中所示的值。
在本发明中，两个以上的优选方式的组合为更优选的方式。
在本发明中，在存在多种相当于各成分的物质的情况下，除非另有说明，否则各成分的量是指多种物质的总量。
在本发明中，“工序”的术语不仅包括独立的工序，而且只要可实现工序的预期目的，则还包括无法与其他工序明确区分的工序。
本发明所涉及的细胞培养装置具备：
培养容器，容纳细胞悬浮液；及
隔膜泵，用于从培养容器内部抽出细胞悬浮液，
由隔膜泵的隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，
关于隔膜中的各个点，当将连接从隔膜顶点引出到平面F的垂线的垂足与各个点的直线和垂线所成角度设为各个点的角度A时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，垂线的
当将隔膜顶点上的隔膜厚度设为HT时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也满足下述式1。
1≤HT/H≤1.75(式1)。
在细胞培养中，有时以用于从培养容器内部抽出培养液等目的而使用泵。虽然也可以考虑以该目的而使用隔膜泵，但是以往的细胞培养用隔膜泵是容量较大的隔膜泵，至今还没有将由隔膜限定的空间的体积(后述)例如为20cm3以下的小型隔膜泵用于细胞培养中的例子。另一方面，例如在实验用培养中不是以得到大量的细胞或产物作为目的，因此从减少培养基等削减成本的观点考虑，本发明人等认为优选减小培养规模。本发明人等还考虑到，随着减小培养规模，隔膜泵也小型化。然而，本发明人等发现了：在简单地使隔膜泵小型化的情况下，隔膜厚度也变小，其结果，隔膜的强度降低，并且在培养中隔膜破损。
另一方面，本发明人等发现了：若为了确保小型隔膜的强度而增大隔膜的厚度，则隔膜翻转时的冲击对细胞施加压力，对细胞的增殖性带来不良影响。
然后，本发明人等发现了通过对隔膜中的厚度分布进行特定的设计，在确保细胞的增殖性的同时，也能够抑制隔膜的破损，并发明了本发明所涉及的细胞培养装置、细胞培养方法及产物的制造方法。
在本发明所涉及的细胞培养装置中，培养容器可以是通常的培养装置(也称为生物反应器)的培养容器、或者将除此以外的适当的容器设为培养容器。作为培养装置的例子，可以举出发酵槽式槽培养装置、气升式培养装置、培养皿式培养装置、旋转皿式培养装置、微载体式培养装置、流动层式培养装置、中空纤维式培养装置、滚瓶式培养装置、填充槽式培养装置等。
隔膜泵是通过被称为隔膜(Diaphragm)的隔膜的往复运动而抽吸和排出液体的泵。将在本发明所涉及的细胞培养装置中可以使用的隔膜泵的典型的一例示于图2中。另外，图2中示出的隔膜泵是不具有止回阀的产生往复流类型的隔膜泵，但是在本发明所涉及的细胞培养装置中可以使用的隔膜泵并不限定于此，也可以是具有止回阀并可以形成单向流的隔膜泵。
图2是表示隔膜泵37的剖面的剖面图。图2所示的隔膜泵37连结于液体所流通的流路(配管)58及气体所流通的流路(软管)59。隔膜泵37具有由部分304a及部分304b组成的壳体和隔膜302，隔膜302的两端部固定于壳体的部分304b中。因此，隔膜302的容纳在壳体部分304b中的两端部在隔膜泵运转时也不移动。该两端部实际上形成隔膜的径向外缘(外周)，呈圆环状外缘部。若为铁、不锈钢、塑料等具有隔膜泵所需强度的材料，则由部分304a及部分304b组成的壳体可以由任意材料组成。
隔膜302将隔膜泵37内部的空间划分为腔室301和腔室303两个。腔室301被来自流路58的液体充满，腔室303被来自流路59的气体充满。若流路59的内部由真空泵等减压，则腔室303内的压力也降低，因此通过腔室301与腔室303之间的压力差，隔膜302呈朝向腔室303侧画圆弧的形状。另一方面，若流路59的内部由加压气体源等加压，则腔室303内的压力也上升，因此通过腔室301与腔室303之间的压力差，隔膜302呈朝向腔室301侧画圆弧的形状。通过在该两种状态之间进行往复，能够在流路58内产生往复流。这种往复流能够使用于通过切向流过滤方式进行的过滤等。
另一方面，如上所述，也可以由隔膜泵形成单向流。在该情况下，在腔室301内，除了流路58以外，还安装另一个流路，并且在各个流路中安装止回阀，由此通过隔膜302的往复移动(翻转)能够形成单向流。
另外，如图2所示，隔膜的中心成为与包括隔膜外缘部的圆环的图2中的下表面的平面的距离最远的点，能够称为隔膜顶点。这是因为，如图2所示，在剖面上观察的情况下，隔膜的中心位于隔膜所形成的圆弧的顶点部。
隔膜如上所述重复进行往复移动，因此优选为弹性体。弹性体是指若受力则随之变形，若解除力则变形恢复原状的部件，尤其是指由具有橡胶弹性的材料组成的部件。橡胶弹性是指弹性模量比金属小且对力位移量大，在25℃下的弹性模量(杨氏模量)为几MPa～几百MPa左右，具体而言，是指1MPa到60MPa左右。杨氏模量例如能够使用商品名称“TGI100kN”(MinebeaMitsumi Inc.制造)并通过依据JIS K7161(2014年)的方法(试验片尺寸：纵长5cm×横长1.5cm×厚度0.1cm、试验速度：0.5mm/min)来测定。
在本发明所涉及的细胞培养装置中，由隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，
关于隔膜中的各个点，当将连接从隔膜顶点引出到平面F的垂线的垂足与各个点的直线和垂线所成角度设为各个点的角度A时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，垂线的
当将隔膜顶点上的隔膜厚度设为HT时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也满足下述式1。
1≤HT/H≤1.75 (式1)
在本发明中，对隔膜的各种区域、空间的体积或点的厚度进行说明，但是除非另有说明，否则关于本发明中的隔膜的区域、空间的体积或点的厚度的记载均表示在对隔膜(构成隔膜的弹性体)未施加来自外部的压力的状态下测定的隔膜的区域、空间的体积或点的厚度。在隔膜泵运转中，在施加于隔膜两面的压力上产生压力差，由此隔膜重复进行翻转等动作。然而，本发明中所记载的隔膜的区域、空间的体积或点的厚度不是在存在这种压力差的状态即从隔膜的任一面受到压力的状态下测定，而是例如通过从隔膜泵取出隔膜等而对隔膜不施加来自外部的压力的状态下测定的隔膜的区域、空间的体积或点的厚度。另外，在将隔膜载置于支撑台上测定厚度的情况下，根据载置的朝向在不同方向上受到自重，但是因由隔膜的自重引起的变形是可忽略的程度，因此在区域、空间体积、厚度的测定中不受特别的影响。
参考图3A及图3B的同时，对上述空间及角度A进行说明。如图3A及图3B所示，隔膜具有除了用于牢固地固定于壳体的突起部以外平坦的圆环状外缘部，和从外缘部以圆顶状隆起的形状的可动部。因此，隔膜的中心成为圆顶状隆起形状的顶点T。如图2中已说明，可动部因由隔膜分隔的腔室与腔室之间的压力差而可以翻转。在图3A及图3B中，隔膜的外缘部固定于隔膜泵的壳体，外缘部的图3A及图3B中的下表面(第1面)除了用于牢固地固定于壳体的突起部以外属于同一平面上。该下表面实际上具有圆环状形状。关于外缘部的图3A及图3B中的上表面(第2面)，也与下表面同样为圆环状，并且除了用于牢固地固定于壳体的突起部以外属于同一平面上。在本发明中，将包括隔膜的外缘部的图3A及图3B中的下表面(排除上述突起部)的平面称为平面F。平面F是将隔膜的外缘部的下表面所属平面延伸至可动部下方的空间而形成的虚拟平面。另外，外缘部的图3A及图3B中的下表面是指在外缘部的面中远离隔膜顶点(即，中心点)T的一侧的面。换言之，在图3A中，由于顶点T从外缘部朝上方隆起，因此在外缘部的上表面及下表面中远离顶点T的面是下表面。
若隔膜从顶点T翻转，则隔膜具有在图3A中由虚拟线示出的形状，但在该情况下，也仅使画圆弧方向相反而形状本身变得相同，因此对图3A中的用实线示出的形状的情况进行说明。
“由隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间”是指，被隔膜的圆弧形状部分的图3B中的下表面(靠近平面F的面)和平面F限定的(包围)封闭空间。该封闭空间其剖面作为图3B中的点描部而示出。该封闭空间的体积是因隔膜翻转而引起的液体侧腔室(图2中的腔室301)的容积变化的大致1/2的值，成为流入到隔膜泵中的或者从隔膜泵吐出的液体的量的指标。在本发明中的隔膜泵中，上述封闭空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，其小于以往用于培养的隔膜泵的体积。
通过将由隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积设为1cm3以上，可以从培养容器内部抽出足够量的细胞悬浮液。尤其，在去除灌流培养的培养基中的废产物等中使用隔膜泵的情况下，能够将细胞的废产物等通过过滤等充分地排出到系统外部，容易提高细胞的增殖性以维持细胞生存率。并且，通过将由隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积设为20cm3以下，能够容易避免培养液在细胞容器外部的滞留时间变得过长。与细胞容器内部相比，细胞容器外部是供氧、维持温度等条件容易降低的部位，通过避免培养液在细胞容器外部的滞留时间变得过长，能够提高细胞的增殖性以维持细胞生存率。由此，例如可以应对实验用小规模培养，并且能够降低培养成本。
根据上述观点，由隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积优选为2cm3以上且15cm3以下，更优选为2.5cm3以上且10cm3以下，进一步优选为3cm3以上且5cm3以下。
关于隔膜的圆弧形状部分中所包括的各个点，能够由角度来表示隔膜中的相对位置。如图3A所示，若将从隔膜顶点(中心)引出到平面F的垂线Pr设为基准线，则顶点位于与垂线Pr所成角度为0°的位置。关于隔膜的圆弧形状部分(除了外缘部以外的部分)中所包括的任意点(例如图3A中的点Pt)，能够限定从垂线Pr的垂足Ft向该任意点引出的直线与上述垂线Pr所成角度(也称为角度A)，所述垂线Pr从隔膜顶点(中心)引出到平面F。无论方向如何，该角度A不会取负值，因此角度A越远离隔膜的中心越变大，在属于平面F上的点上成为90°角度。另外，隔膜的圆弧形状部分中所包括的上述任意点设定在隔膜的图3A中的下表面(远离顶点的一侧的面)上。
另外，隔膜的可动部所具有的圆顶状隆起形状，优选为以垂线Pr为轴圆对称的形状。隆起形状的剖面(如图3A所示的包括垂线Pr的剖面)的形状(排除与外缘部的连接部位)可以是半球形或椭圆形，但是未必一定是如半球形或椭圆形那样的规则形状。例如，在图3A中，除了与外缘部的连接部位以外，可以是将隔膜的可动部的下表面的纵向(垂线Pr的方向)坐标(将图3A中的上方设为正)以横向(与垂线Pr正交的方向)坐标(将图3A中的右侧设为正)进行了2阶微分的值为0以下的任意形状。
在本发明的隔膜泵中的隔膜中，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内。换言之，隔膜厚度H是在各个点上确定的变量，但是隔膜中的角度A为0°到75°的区域(图3A中的区域X)中的该变量的最小值及最大值均在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内。在此，隔膜泵形成圆弧形状，但是各个点上的厚度H是指各个点上的与对隔膜的下表面的切线垂直的方向上的隔膜的尺寸。并且，除非另有说明，否则H是指角度A为0°到75°的区域中的各个点上的隔膜厚度。
由于角度A为0°到75°的区域中的各个点上的隔膜厚度为0.5mm以上，因此能够有效地抑制在培养中途隔膜破损，容易继续培养。并且，由于角度A为0°到75°的区域中的各个点上的隔膜厚度为1.5mm以下，因此能够避免隔膜难以翻转，通过隔膜的翻转而能够充分地发挥隔膜泵的功能。
根据上述观点，隔膜中的角度A为0°到75°的区域中的各个点上的厚度优选为0.6mm以上且1.4mm以下，更优选为0.7mm以上且1.3mm以下，进一步优选为0.8mm以上且1.2mm以下。
隔膜中的角度A为0°到75°的区域是隔膜顶点及其周边区域。角度A为0°到75°的区域中的厚度均匀、或者隔膜顶点上的厚度比周边区域稍微厚，由此提高隔膜的耐久性且不易破损。另一方面，若隔膜顶点上的厚度过大于周边区域的厚度，则应力容易集中在相对薄的部分，隔膜变得容易破损。
根据这些观点，在本发明中的隔膜中，当将隔膜顶点上的隔膜厚度设为HT时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也满足下述式1。
1≤HT/H≤1.75 (式1)。
由于满足式1，因此除了抑制隔膜破损的效果以外，还可以获得隔膜的翻转动作变得更柔和的效果。另外，顶点上的厚度及其周边的厚度越接近于均匀，隔膜的翻转动作越趋于柔和。若隔膜的翻转动作柔和，则能够避免由腔室301内的细胞悬浮液中的流速急剧上升引起的剪切增加，对细胞的损伤变小。
如上所述，H是表示各个点的厚度的变量，根据上述观点，关于隔膜中的角度A为0°到75°的区域中的任意点，HT/H值优选为1以上且1.5以下，更优选为1以上且1.3以下，进一步优选为1以上且1.2以下。
在隔膜中的角度A为75°到88°的区域(图3A中的区域Y)中的点中，当将厚度最厚的点上的隔膜厚度设为HY且将角度A为90°的点(图3A中的点Z)上的隔膜厚度设为HZ时，优选为HZ＜HY，并且，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也优选为H≤HZ。作为与隔膜破损有关的区域，主要有角度A为0°到75°的区域、角度A为75°到88°的区域及角度A为90°的点这三种。基本上，在隔膜中应力集中于厚度最薄的部分且该点容易破损，但是若仅增加所有区域的厚度，则隔膜翻转时的冲击变大，有时会导致细胞增殖性降低。因此，优选使隔膜翻转时应力最容易集中的区域即角度A为75°到88°的区域的最大厚度比其他区域的厚度厚，在这个意义上，优选为HZ＜HY。并且，若将角度A为75°到88°的区域中的隔膜厚度的最小值设为HS，则在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也优选为H≤HS。
HY/HZ优选为大于1且3以下，更优选为大于1且2以下，进一步优选为大于1且1.5以下，更加优选为大于1且1.3以下。角度A为90°的点上的厚度HZ越大，对角度A为75°到88°的区域施加的应力变得越大，因此优选使HY更大(大于HZ)。并且，若如上所述限制HY与HZ之比的上限值，则能够使隔膜的翻转动作更柔和，能够进一步减少由隔膜的翻转动作引起的对细胞的损伤，并能够进一步提高细胞的增殖性以趋于进一步抑制细胞生存率降低。另外，角度A为90°的点实际上位于圆形线上，但是在该线上若在隔膜厚度中存在偏差的情况下，作为在与HY的比较中使用的厚度，使用上述线上的最大厚度。
关于隔膜中的角度A为0°到75°的区域中的任一点的厚度H，也优选为H≤HZ，更优选同时满足HZ＜HY。角度A为0°到75°的区域中的隔膜厚度越厚，施加于角度A为90°的点上的应力越趋于变大，因此优选使角度A为90°的点上的隔膜厚度HZ更大(大于角度A为0°到75°的区域中的任意点的厚度)。另外，角度A为90°的点实际上位于圆形线上，但是在该线上若在隔膜厚度中存在偏差的情况下，作为在与角度A为0°到75°的区域中的任意点的厚度H的比较中使用的厚度，使用上述线上的最小厚度。
并且，在隔膜中的角度A为0°到75°的区域中的任一点的厚度H为H≤HZ且同时满足HZ＜HY的情况下，隔膜中的角度A为0°到75°的区域中的任一点的厚度H也成为H＜HY，因此在抑制角度A为75°到88°的区域中的隔膜破损的方面优选。
HZ值不受特别的限定，但是优选为0.5mm以上且2mm以下，更优选为0.7mm以上且1.9mm以下，进一步优选为0.9mm以上且1.8mm以下，最优选为1mm以上且1.7mm以下。
并且，关于隔膜中的角度A为0°到75°的区域中的任一点的厚度H，HZ/H值优选为1以上且3以下，更优选为1.1以上且2.5以下，进一步优选为1.2以上且2.0以下，最优选为1.3以上且1.8以下。若如上所述限制了隔膜中的角度A为0°到75°的区域中的各个点上的HZ与厚度H之比，则容易避免角度A为75°到88°的区域中的隔膜厚度变得过大，因此趋于能够使隔膜的翻转动作更柔和，进一步减少由隔膜的翻转动作引起的对细胞的损伤，并进一步提高细胞的增殖性以趋于能够进一步提高细胞生存率。
并且，如从图3A可知，隔膜中的角度A大于88°且小于90°的区域是当隔膜翻转时仅稍微移动的区域。关于角度A大于88°且小于90°的区域，由于能够认为与角度A为90°的点相同，因此可以同样适用关于HZ所记载的事项。
在隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，相对于厚度最厚的点上的隔膜厚度HY，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上隔膜厚度H优选满足下述式2。
1＜HY/H≤3 (式2)
角度A为0°到75°的区域中的隔膜厚度越厚，施加于区域Y的应力越趋于变大。关于隔膜中的角度A为0°到75°的区域中的任一点的厚度H，通过使HY/H大于1，角度A为75°到88°的区域具有仅承受隔膜翻转时的应力的厚度，在角度A为75°到88°的区域中更不易产生隔膜破损。通过使HY/H为3以下，将隔膜的翻转动作维持得更柔和，进一步降低由隔膜的翻转动作引起的对细胞的损伤，进一步提高细胞增殖性，趋于能够使细胞生存率进一步降低。
根据上述观点，关于隔膜中的角度A为0°到75°的区域中的任一点的厚度H，HY/H优选为大于1且3以下，更优选为1.2以上且2.8以下，进一步优选为1.4以上且2.6以下，更加优选为1.6以上且2.4以下。
并且，Hy值不受特别的限定，但是优选为1mm以上且3mm以下，更优选为1.2mm以上且2.8mm以下，进一步优选为1.4mm以上且2.6mm以下，最优选为1.6mm以上且2.4mm以下。
作为隔膜的材质，可以举出橡胶材料(例如氯丁橡胶、丁腈橡胶、乙烯丙烯二烯橡胶、硅酮橡胶)、弹性体(例如，热塑性聚酯弹性体、氯乙烯树脂类热塑性弹性体)、氟树脂(例如聚四氟乙烯)等。
隔膜的材质若可以发挥作为隔膜的作用，则不受特别的限定，可以是任意的弹性体。隔膜的材质优选为硅酮橡胶，更优选为硬度为45以上且54以下的硅酮橡胶，进一步优选为硬度为45以上且54以下，并且拉伸强度为5MPa以上且8MPa以下的硅酮橡胶。作为硅酮橡胶的例子，可以举出Momentive Perfo rmance Materials Japan LLC制造的TSE3457T等。橡胶的硬度能够依据JIS K6253：2012并由A型硬度计来测定。并且，橡胶的拉伸强度能够依据JIS K6249：2003并使用该JIS中规定的哑铃进行测定。
若硅酮橡胶的硬度为45以上且54以下，则隔膜的抗破损性和翻转动作的柔和性的平衡变得更好。若硅酮橡胶的拉伸强度为5MPa以上且8MPa以下，则隔膜的抗破损性和翻转动作的柔和性的平衡变得更好。若硅酮橡胶的硬度为45以上且54以下，而且硅酮橡胶的拉伸强度为5MPa以上且8MPa以下，则隔膜的抗破损性和翻转动作的柔和性的平衡变得更好。翻转动作柔和关系到对细胞的损伤减少、细胞增殖性的提高、细胞生存率的提高。
隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力σ优选满足下述式3。
0.4MPa≤σ≤1.5MPa(式3)。
隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力σ能够通过以下方法求出。
<隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力的测定方法>
从隔膜切出宽度为10mm、长度为40mm的大小的试验片，使用Toyo Seiki Seisaku-Sho，Ltd.制造的拉伸试验机STROGRAPH R2(商品名称)对试验片进行拉伸试验。在拉伸试验之前，使用Mitutoyo Corporation制造的高精度数显千分尺MDH-25M(商品名称)来测定试验片的厚度。关于拉伸试验，将夹头间距设为10mm且将拉伸速度设为10mm/分钟，并在试验片的长度方向上进行拉伸试验。将伸长率50％即夹头之间成为15mm时的荷载除以试验片的厚度，由此计算伸长率为50％时的拉伸应力。从一个隔膜切出3个试验片，使用3个试验片重复3次拉伸试验，并将所得到的3个拉伸应力的平均值用作隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力。
由于隔膜的伸长率为50％时的拉伸应力σ为0.4MPa以上，因此能够进一步避免隔膜在低压力下剧烈翻转，趋于能够进一步减少对细胞的损伤。由于隔膜的伸长率为50％时的拉伸应力σ为1.5MPa以下，因此能够将用于使隔膜翻转所需压力控制在适当的范围内，并且趋于能够进一步减少由隔膜的翻转动作的气势引起的对细胞的损伤。从而，由于隔膜的伸长率为50％时的拉伸应力σ为0.4MPa以上且1.5MPa以下，因此能够使隔膜的翻转动作更柔和，并且减少对细胞的损伤以趋于更容易维持高的细胞生存率。
根据上述观点，隔膜的伸长率为50％时的拉伸应力σ优选为0.4MPa以上且1.5MPa以下，更优选为0.5MPa以上且1.3MPa以下，进一步优选为0.6MPa以上且1.1MPa以下。
本发明所涉及的细胞培养方法包括：
在容纳于培养容器内部的细胞悬浮液中培养细胞；及
由隔膜泵从培养容器内部抽出细胞悬浮液，
由隔膜泵的隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，
关于隔膜中的各个点，当将连接从隔膜顶点引出到平面F的垂线的垂足与各个点的直线和垂线所成角度设为各个点的角度A时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，垂线的
当将隔膜顶点上的隔膜厚度设为HT时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，隔膜厚度H也满足下述式1。
1≤HT/H≤1.75 (式1)。
关于培养容器及隔膜泵，直接适用本发明所涉及的细胞培养装置的说明中所记载的事项。
在本发明所涉及的细胞培养方法中进行培养的细胞不受特别的限定，例如可以举出动物细胞、植物细胞、酵母等真核细胞及枯草杆菌、大肠杆菌等原核细胞。细胞可以是ES细胞、IPS细胞、各种干细胞等。
在本发明所涉及的细胞培养方法中进行培养的细胞可以是生产产物的细胞。若培养生产产物的细胞，则由细胞生产产物，若将其回收，则能够进行使用细胞的物质生产。作为生产产物的细胞而使用的细胞不受特别的限定，可以是动物细胞、植物细胞、酵母等真核细胞、以及枯草杆菌、大肠杆菌等原核细胞中的任一种。优选为CHO细胞、BHK-21细胞、C127细胞、杂交瘤细胞、NS0细胞及SP2/0-Ag14细胞等动物细胞，从进行多次分析并确立基因工程方法的方面考虑，更优选为CHO细胞。即使在细胞原本不生产所期望的产物或产量少的情况下，例如也能够通过将生产产物中所需蛋白质进行编码的质粒等表达载体导入到细胞中而有效地生产所期望的产物。由本发明中的细胞生产的产物只要是上述细胞在培养液中生产的物质，则不受特别的限定，例如可以举出醇、酶、抗生物质、核酸、重组蛋白、抗体等物质。其中，作为产物，优选为重组蛋白或抗体，更优选为抗体。
容纳在培养容器内部的细胞悬浮液中的细胞的浓度不受特别的限定。但是，由于容纳在培养容器内部的细胞悬浮液中的细胞的浓度高时细胞量变大，并且在细胞生产产物时产物的产量变大，因此优选细胞的浓度高。培养容器内部所容纳的细胞悬浮液中的细胞的浓度在播种细胞之后增大，例如可以增大至20×106个细胞/mL以上150×106个细胞/mL以下的范围内的细胞浓度。或者，培养容器内部所容纳的细胞悬浮液中的细胞的浓度可以增大至30×106个细胞/mL以上且120×106个细胞/mL以下的范围内的细胞浓度，也可以增大至40×106个细胞/mL以上且100×106个细胞/mL以下的范围内的细胞浓度，或者可以增大至50×106个细胞/mL以上且100×106个细胞/mL以下的范围内的细胞浓度。另外，在本发明中，关于细胞的“浓度”是指数量密度，即每单位容量的细胞数量。
作为用于培养细胞的培养基，能够使用在细胞培养中通常使用的液体培养基。例如，能够使用OptiCHO(Life Technologies公司、12681011)培养基、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、Eagle最低必需培养基(MEM)、RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、F-12K培养基、Ham F12培养基、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)、McCoy 5A培养基、Leibovitz L-15培养基及EX-CELL(商标)300系列(JRH Biosciences公司)、CHO-S-SFMII(Invitrogen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、CD-CHO(Invitrogen公司)、IS CHO-V(IrvineScientific公司)、PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich公司)等。
在培养基中可以添加胎牛血清(FCS)等血清。或者，培养基可以是无血清培养基，例如是完全合成培养基。
培养基中可以补充氨基酸、盐、糖类、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生物质、脂质、微量元素、植物蛋白质的水解物等追加成分。
培养基的pH根据培养的细胞而不同，通常为pH6.0～8.0，优选为pH6.8～7.6，更优选为pH7.0～7.4。
培养温度通常为30℃～40℃，优选为32℃～37℃，更优选为36℃～37℃，且可以在培养中改变培养温度。
可以在CO2浓度为0％～40％的环境下进行培养，也可以在CO2浓度为2％～10％的环境下进行培养。
在培养中，根据需要能够加以培养基的更换、通气、搅拌。
培养的细胞悬浮液的总量(包括培养容器内部的细胞悬浮液量和隔膜泵及流路等与培养容器液体连接的要件内的细胞培养液量)若为本发明中的隔膜泵可以使用的量，则不受特别的限定，但是优选为50mL以上且500mL以下，更优选为60mL以上且400mL以下，进一步优选为70mL以上且300mL以下，最优选为80mL以上且250mL以下。如上所述，在本发明中，使用隔膜泵进行培养，所述隔膜泵具有由隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下的隔膜。如此，由于本发明所涉及的隔膜泵的能力受到限定，因此优选为细胞悬浮液的量如上述范围那样小的小规模培养。通过将培养液体积设为上述下限值以上，不易受到由采样引起的液量减少、挥发等干扰的影响，更容易继续培养，通过将培养液体积设为上述上限值以下，培养液体积被抑制成小规模，趋于实验成本也被抑制。
本发明所涉及的细胞培养方法可以包括由搅拌叶片搅拌培养容器内部的细胞悬浮液，也可以包括由喷雾器对细胞悬浮液进行充气。
细胞培养优选为灌流培养。灌流培养是添加新鲜的培养基，同时去除已使用的培养基的培养法。根据灌流培养，也可以实现超过1×108个细胞/mL的高细胞浓度。典型的灌流培养在持续1天或2天的分批培养启动时开始，之后向培养物连续地、阶段性地和/或间断性地添加新鲜的供给培养基，同时去除已使用的培养基。在灌流培养中，能够利用沉淀、离心分离或过滤等方法，一边维持细胞浓度，一边去除已使用的培养基。灌流可以是连续地、阶段性地、间断性地或这些组合中的任一方式。
使用隔膜泵从培养容器内部抽出细胞悬浮液。可以间歇地或连续地进行从培养容器内部抽出细胞悬浮液，但是根据稳定地保持系统状态的观点，优选连续地进行。在使用不使用止回阀的往复流式隔膜泵的情况下，若运转隔膜泵，则交替进行从培养容器内部抽出细胞悬浮液、以及使所抽出的细胞悬浮液返回到培养容器两者。这种情况也包括在上述“从培养容器内部抽出细胞悬浮液”的表述所指范围内。细胞悬浮液的抽出位置若是比液面更靠下方的位置，则不受特别的限定，例如能够设为培养容器的底部附近。
在使用隔膜泵的情况下，可以在培养容器与隔膜泵之间设置交叉流动方式的过滤器，并进行基于交叉流动方式的过滤。通过这种过滤，可以回收由来自细胞悬浮液的细胞产生的产物、去除废产物等。
然而，在本发明所涉及的细胞培养方法中，从培养容器内部抽出细胞悬浮液的目的不受特别的限定，所抽出的细胞悬浮液可以仅被废弃以调节细胞浓度并去除废产物，或者也可以提供于通过离心分离等回收细胞的处理，或者可以由除了交叉流动方式以外的过滤器进行回收由细胞产生的产物、去除废产物等。在这种情况下，即使隔膜泵可以是产生往复流的类型，也可以是产生单向流的类型。
在本发明所涉及的细胞培养方法中，能够适用在本发明所涉及的细胞培养装置的说明中所记载的任意事项，本发明所涉及的细胞培养方法例如包括以下实施方式。
在本发明所涉及的细胞培养方法中，在隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的隔膜厚度为HY且将角度A为90°的点上的隔膜厚度设为HZ时，HZ＜HY，并且在角度A为0°到75°的区域中的任一点上隔膜厚度H优选为H≤HZ。
在本发明所涉及的细胞培养方法中，在隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的隔膜厚度设为HY时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上隔膜厚度H优选满足下述式2。
1＜HY/H≤3 (式2)。
在本发明所涉及的细胞培养方法中，隔膜的材质优选为硅酮橡胶。
在本发明所涉及的细胞培养方法中，隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力σ优选满足下述式3。
0.4MPa≤σ≤1.5MPa (式3)。
在本发明所涉及的细胞培养方法中，在隔膜泵运转时，驱动隔膜的隔膜泵的内部压力P优选满足下述式4。
大气压-0.1MPa≤P≤大气压+0.1MPa (式4)。
隔膜泵的内部压力P是指隔膜泵内的以隔膜为边界在与细胞悬浮液相反的一侧的空间中的压力，换言之，是指用于驱动隔膜泵的介质的压力。隔膜泵的内部压力P在图2中是指被气体充满的腔室303内的压力。换言之，上述式是指在隔膜泵运转中大气压与压力P之差的绝对值维持在0.1MPa以下，即大气压与压力P之差的绝对值的最大值为0.1MPa以下。隔膜泵的内部压力P可以在与上述空间连接的流路等中进行测定，例如可以在图2中的流路59中进行测定。
压力P与大气压之间的压力差成为用于使隔膜翻转的原动力。通过将上述压力差的绝对值设为0.1MPa以下，能够以适当的速度进行隔膜的翻转动作，并且进一步减少对细胞的损伤，趋于能够进一步抑制隔膜破损。
P优选为[大气压-0.1MPa]以上且[大气压+0.1MPa]以下，更优选为[大气压-0.08MPa]以上且[大气压+0.08MPa]以下，进一步优选为[大气压-0.06MPa]以上且[大气压+0.06MPa]以下，更加优选为[大气压-0.05MPa]以上且[大气压+0.05MPa]以下。然而，若将压力P与大气压之间的压力差维持在一定程度以上，则促进隔膜完全翻转，在避免细胞悬浮液滞留的方面上是有效的。因此，压力P与大气压之间的压力差的绝对值的最大值(隔膜翻转循环中的最大值)优选为1kPa以上，更优选为5kPa以上，进一步优选为8kPa以上，更加优选为10kPa(0.01MPa)以上。
在本发明所涉及的细胞培养方法中，细胞悬浮液中所包含的细胞可以是CHO细胞。
本发明所涉及的细胞培养方法包括：
使用分离膜并通过切向流过滤方式进行如下分离处理：将从培养容器内部抽出的细胞悬浮液，分离成具有比细胞悬浮液中的细胞浓度高的细胞浓度的第一溶液和具有比细胞悬浮液中的细胞浓度低的细胞浓度的第二溶液；
使第一溶液返回到培养容器内部；及
将培养基重新添加到培养容器内部。
切向流过滤方式是如下方式：通过使成为膜分离处理对象的液体沿着分离膜的膜面流动，使尺寸小的成分与液体成分一同向分离膜的透过侧移动，将尺寸大的成分及剩余的液体成分保持在分离膜的未透过侧。在本发明中，将分离膜的未透过侧即供给侧也称为初级侧，将分离膜的透过侧也称为次级侧。
在本发明的基于切向流过滤方式的膜分离处理中，从培养容器内部抽出的细胞悬浮液可以沿着分离膜的膜面形成平行的单向流，也可以使从培养容器内部抽出的细胞悬浮液的流动方向每隔规定时间反转以形成往复流。
能够使用隔膜泵从培养容器内部抽出细胞悬浮液。从培养容器内部抽出的细胞悬浮液被输送到用于进行切向流过滤的过滤器部。可以间歇地或连续地进行从培养容器内部向过滤器部抽出细胞悬浮液，但是根据稳定地保持系统状态的观点，优选连续地进行。
过滤器部具备例如容器和分离膜，所述分离膜将容器内部的空间分隔为供给侧和透过侧，并对从培养容器内部抽出的细胞悬浮液实施膜分离处理。在分离膜的供给侧，过滤器部具有分别与流路连接的流入口及流出口。在基于切向流过滤方式的膜分离处理中，在使从培养容器内部抽出的细胞悬浮液的流动方向每隔规定时间反转的情况下，流入口和流出口因流动方向的反转而切换。
分离膜可以是通过将纤维状的部件编织成网眼状而构成的筛网过滤器，也可以是中空纤维膜。作为中空纤维膜，能够使用微滤膜(MF膜)或超滤膜(UF膜)。
分离膜不使细胞悬浮液中的活细胞透过，但是例如使细胞悬浮液中的目标产物等小分子透过。例如，在使动物细胞生产抗体的情况下，抗体的尺寸为1nm～5nm左右，相对于此，动物细胞的大小为10μm量级左右，因此例如通过使用作为分离膜的微滤膜或超滤膜，在使活细胞滞留在初级侧的同时，能够使抗体通过分离膜转移到次级侧。并且，由于液体成分例如水分子的大小微小，因此液体成分的一部分量也与抗体一同转移到次级侧。其结果，在分离膜的非透过侧残留的液体中的细胞浓度上升。如此，通过基于切向流过滤方式的分离而被输送到过滤器部的细胞悬浮液不会透过分离膜而残留在初级侧，并分离成具有比细胞悬浮液高的细胞浓度的回流液，和透过分离膜并转移到次级侧的具有比细胞悬浮液低的细胞浓度的透过液。透过液中包括例如基于细胞的产物等小分子。另外，在此所谓的细胞悬浮液中的细胞浓度是指，培养容器内部的细胞悬浮液中的活细胞的浓度。并且，除非另有说明，否则在本发明中“细胞浓度”是指“活细胞浓度”。
残留在初级侧的回流液从过滤器部流出，并返回到培养容器内部。例如，将切向流过滤中的过滤器部供给侧空间中的流动方向固定为单方向的情况下，可以使细胞悬浮液因由具有止回阀的隔膜泵引起的送液压力而从流出口流出，并通过连接流出口与培养容器的流路返回到培养容器内部。在该情况下，回流液通过与当培养容器内部的细胞悬浮液移动到过滤器部的流入口时所通过的流路不同的流路返回到培养容器内部，由此形成循环流。另一方面，在由不具有止回阀的隔膜泵使切向流过滤中的过滤器部供给侧空间中的流动方向随着时间的经过而反转，即使流动往复的情况下，回流液通过与当培养容器内部的细胞悬浮液移动到过滤器部的流入口时所通过的流路相同的流路返回到培养容器内部，并且在流动方向反转的同时，流入口和流出口颠倒。
在透过分离膜的透过液中包含基于细胞的产物等小分子。回收透过液中的产物，能够用于制造医药品及制造食品等各种用途。产物的回收可以仅为透过液的回收，例如将透过液回收到罐中。在提高产物的纯度、或者变更溶剂、或者例如设为粉末状等要变更形态的情况下，能够将透过液提供于进一步处理。
从培养容器内部被输送到过滤器部的细胞悬浮液分离成透过液和回流液，因此回流液的量变得比被输送到过滤器部的细胞悬浮液的量少。为了至少补偿被输送到过滤器部的细胞悬浮液量与回流液量之差，将新鲜培养基供给到培养容器内部。通过将新鲜培养基供给到培养容器内部，能够抑制培养容器内部的细胞浓度过度上升，并且能够将培养容器内部的细胞状态保持为健康状态。即，可以获得基于灌流培养的益处。
另外，可以间歇地或连续地将新鲜培养基供给到培养容器内部。并且，培养容器内部的细胞悬浮液量不需要始终完全恒定，而可以大致恒定，例如可以产生±10％、或±5％、或±1％左右的变动。培养容器内部的细胞悬浮液量的测定也未必始终进行，而可以间歇地进行。即使在细胞悬浮液量中略有变动，也能够获得基于灌流培养的益处。
本发明所涉及的产物的制造方法包括：
使用本发明所涉及的细胞培养方法来培养生产产物的细胞；及
从上述细胞悬浮液回收产物。
在本发明所涉及的产物的制造方法中，由于使用本发明所涉及的细胞培养方法进行培养，因此生产产物的细胞的细胞增殖性良好，因此能够提高产物的生产率，并且也能够抑制隔膜破损。
作为生产产物的细胞，能够使用生产上述中所例示的产物的细胞，并且作为产物能够设为上述中所例示的产物。产物优选为抗体。
当培养结束时，可以从细胞悬浮液统一回收产物，但是优选在培养中以规定频率或连续地从细胞悬浮液回收产物。尤其，在产物的制造方法中使用的细胞培养方法还包括：
使用分离膜并通过切向流过滤方式进行如下分离处理：将从培养容器内部抽出的细胞悬浮液，分离成具有比细胞悬浮液中的细胞浓度高的细胞浓度的第一溶液和具有比细胞悬浮液中的细胞浓度低的细胞浓度的第二溶液；
使第一溶液返回到培养容器内部；及
将培养基重新添加到培养容器内部，
在产物的制造方法中，优选为从上述第二溶液回收产物的实施方式。
产物的尺寸通常比细胞小得多。当从培养容器抽出细胞悬浮液时，细胞悬浮液中所包含的产物也一同被抽出，但是在通过切向流过滤方式进行的分离处理中，由于产物具有比细胞小的尺寸，因此不会大幅减小浓度而仍包含在第二溶液中，另一方面，细胞主要滞留在第一溶液的一侧。因此，能够从第二液体中回收产物。
如上所述，“从细胞悬浮液回收产物”也包括从通过处理细胞悬浮液而得到的处理物(例如通过过滤而得到的第二溶液)回收产物的情况。
产物的回收可以是仅回收细胞悬浮液、仅回收上述第二溶液等，在该情况下，细胞悬浮液、第二溶液等例如能够回收到罐中。在回收了细胞悬浮液的情况下，优选对所回收的细胞悬浮液进行用于从细胞分离产物的处理，例如能够通过过滤器或离心分离等从溶液中去除细胞。并且，即使在回收了第二溶液的情况下，为了进一步去除细胞，也可以将其提供于通过过滤器或离心分离等进一步进行的处理。此外，以提高产物的纯度、或者变更溶剂、或者例如设为粉末状等变更形态为目的，也能够将溶液提供于进一步处理。
例如，溶液中所包含的产物能够通过纯化处理进行纯化。所得到的产物能够纯化至高纯度。在产物是抗体或其片段等的多肽的情况下，产物的分离及纯化使用在通常的多肽中被使用的分离及纯化方法即可。例如，只要适当地选择和组合亲和层析等层析柱、过滤器、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及等电点电泳等，则能够将多肽进行分离及纯化，但是并不限定于这些。所得到的多肽的浓度测定能够通过吸光度的测定或酶联免疫吸附测定法(Enzy me-linked immunosorbent assay；ELISA)等进行。
关于本发明所涉及的细胞培养装置、细胞培养方法及产物的制造方法的一例，在图1中统一进行说明。图1是表示在本发明所涉及的细胞培养方法及产物的制造方法中可适用的细胞培养装置的结构的一例的图。
细胞培养装置100具备：培养容器10，将细胞与培养基一同进行容纳并培养；隔膜泵37，用于通过流路57抽出容纳在培养容器10中的细胞悬浮液；泵P1，用于通过流路56将容纳在培养基供给容器20中的新鲜培养基L2供给到培养容器10内；CO2供给容器31，用于将CO2气体供给到培养容器10内；空气供给容器32，用于将空气供给到培养容器10内；及O2供给容器33，用于将O2气体供给到培养容器10内。在培养容器10内容纳有细胞悬浮液L1，并具备用于搅拌细胞悬浮液L1的搅拌叶片11。通过使搅拌叶片11旋转而搅拌容纳在培养容器10内部的细胞悬浮液L1，并保持细胞悬浮液L1的均匀性。并且，在培养容器上具备采样口35。
CO2供给容器31内的CO2气体通过流路51输送到流量计34，进而通过流路54供给到培养容器10内。在流路51中设置有调节器R1及压力计M1，进行流量控制及压力监视。在流路54中设置有过滤器F1，进行所供给气体的净化。空气供给容器32内的空气通过流路52输送到流量计34，进而通过流路54供给到培养容器10内。在流路52中设置有调节器R2及压力计M2，进行流量控制及压力监视。O2供给容器33内的O2气体通过流路53输送到流量计34，进而通过流路55供给到培养容器10内。在流路53中设置有调节器R3及压力计M3，进行流量控制及压力监视。在流路55中设置有过滤器F2，进行所供给气体的净化。
通过流路57被抽出的细胞悬浮液输送到切向流过滤方式的中空纤维膜过滤器36。透过中空纤维膜过滤器36的液体通过流路60并由泵P2从中空纤维膜过滤器36排出。在被培养的细胞是生产产物的细胞的情况下，能够通过将从中空纤维膜过滤器36排出到流路60的液体提供于纯化处理而回收产物。隔膜泵37生成在流路57、中空纤维膜过滤器36的非透过侧及流路58中进行往复的流动。隔膜泵37的与流路58侧腔室(液体侧腔室)相反的一侧的腔室(气体侧腔室)被气体充满，并连结于流路59。通过关闭电磁阀V2并打开电磁阀V1，空气供给容器38内的空气经由流路59流入到隔膜泵37的气体侧腔室。由此，气体侧腔室内的压力成为超过大气压的压力，隔膜泵37的隔膜呈将顶点置于液体侧腔室中的大致半球形状。相反地，在打开电磁阀V2并关闭电磁阀V1的情况下，隔膜泵37的气体侧腔室内的空气的一部分通过真空泵P3从气体侧腔室排出，气体侧腔室内部成为比低于大气压的压力，隔膜泵37的隔膜翻转为将顶点置于气体侧腔室上的大致半球形状。在电磁阀V1与隔膜泵37之间设置有调节器R4及过滤器F3，进行气体流量的控制及气体净化。同样地，在电磁阀V2与过滤器F3之间设置有调节器R5，进行气体流量的控制。在流路59中设置有压力计M4，由于几乎没有过滤器F3引起的压力损失，因此能够由压力计M4监视隔膜泵37的气体侧腔室内的压力。另外，图1中的箭头表示液体或气体的移动方向、或者隔膜泵37的隔膜的移动。另外，除了气体所通过的流路59以外的流路能够设为由金属、塑料等形成的配管，关于气体所通过的流路59，可以设为由金属、塑料等形成的配管，也可以是由橡胶等形成的软管。
实施例
使用图1中示出的细胞培养装置培养了CHO细胞。
首先，在总容量为250mL的ABLE INC.制造的培养容器中加入培养基(商品名称CDOptiCHO、Thermo Fisher Scientific K.K.制造)90mL并保持在37℃，从培养容器上表面，以3.8mL/分钟充入空气，以0.2mL/分钟充入CO2，并静置了1天。接着，播种了CHO细胞，以使培养容器内部的细胞浓度成为2.0×105个细胞/mL，培养容器内部的液量成为100mL。从播种过3天后，由作为试验对象的隔膜泵产生细胞悬浮液的往复流，以使隔膜气体侧腔室的最大压力(与大气压的差异的绝对值的最大值)成为表2中示出的规定压力，由该往复流进行了基于切向流过滤方式的过滤。过滤中使用了Repligen Corporation制造的中空纤维膜过滤器(T04-P20U-10-N)。由于通过过滤而补充从培养系统中损失的液量，因此也一并进行了新鲜培养基(由Thermo Fisher Scientific K.K.制造的商品名称CD OptiCHO表示的培养基与由GE Healthcare制造的商品名称Cell Boost 7a及7b表示的培养基的混合物)的供给(将新鲜培养基供给到培养容器内部)。以1.2L/天的比例进行了上述过滤及新鲜培养基的供给。在基于切向流过滤方式的过滤中，将细胞悬浮液分离成具有比细胞悬浮液高的细胞浓度的回流液和具有比细胞悬浮液低的细胞浓度的透过液，回流液返回到培养容器内部(使回流液返回到培养容器内部)。并且，从同一天(从播种过3天后)起，使用一端插入到培养容器内部的内径为2mm的单管，从培养容器下表面侧将氧气以1mL/分钟的流量供给到培养容器内部。
在上述培养中，从细胞浓度达到80× 106个细胞/mL之日起，一天一次进行从培养容器内部抽出规定量细胞悬浮液的操作(细胞渗出操作)，以使平均细胞浓度(通过以下记载的一天两次测定细胞浓度而得到的两个时间点的细胞浓度的平均值)成为约80×106个细胞/mL，从播种到第28天为止继续进行了培养。另外，在培养中途停止了由隔膜泵产生的细胞悬浮液的往复流的情况下，使隔膜气体侧腔室的压力的绝对值的最大值增加至0.1MPa，当往复流仍未重新开始时停止了培养。在培养停止之后，肉眼确认了有无隔膜破损。
从播种当天到开始了细胞渗出操作的当天之前为一天一次，从开始了细胞渗出操作的当天之后起在细胞渗出操作前后一天两次，对培养容器内部的细胞悬浮液进行采样，并使用BECKMAN COULTER公司的商品名称Vi-Cell XR测定出细胞浓度及生存力。生存力是指活细胞相对于死细胞与活细胞的总数的数量比例。
作为试验对象的隔膜泵，在比较例1中使用了Repligen制造的XCell ATF2。在除此以外的实施例及比较例中，使用了在SUS316制金属容器内部具有由以下材料形成的隔膜的隔膜泵。使用了如下装置，其将在实施例1～11、16、17中成型Momentive PerformanceMaterials Japan LLC制造的硅酮橡胶(TSE3 457T)、在实施例12中成型MomentivePerformance Materials Japan LLC制造的硅酮橡胶(TSE3478T)、在实施例13中成型Momentive Performance Ma terials Japan LLC制造的硅酮橡胶(TSE221-5U)、在实施例14中成型Mome ntive Performance Materials Japan LLC制造的硅酮橡胶(TSE3466)、在实施例15中成型Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.制造的硅酮橡胶(KE-951-U)而得到的具有表1及表2中记载的尺寸及特性的隔膜容纳于上述金属容器内部，并通过空气及真空泵和电磁阀将泵内的压力(气体侧腔室内的压力)每隔一定时间能够切换控制为正压或负压。
在将隔膜泵使用于上述培养之前，使用厚度计(Mitutoyo Corporation.制造、商品名称THICKNESS GAUGE547-31)测定出隔膜在各位置的厚度。当隔膜的伸长率为50％时的拉伸应力按以下顺序而测定。从隔膜切出宽度为10mm、长度为40mm的大小的试验片E1，使用Toyo Seiki Seisaku-Sho，Ltd.制造的拉伸试验机STROGRAPH R2(商品名称)对试验片E1进行了拉伸试验。在拉伸试验之前，使用Mitutoyo Corporation制造的高精度数显千分尺MDH-25M(商品名称)测定出试验片E1的厚度。关于拉伸试验，将夹头间距设为10mm且将拉伸速度设为10mm/分钟，在试验片E1的长度方向上进行了拉伸试验。通过将伸长率为50％即夹头之间成为15mm时的荷载除以试验片E1的厚度而导出伸长率为50％时的拉伸应力。从一个隔膜切出3个试验片E1，使用3个试验片重复3次拉伸试验，并将所得到的3个拉伸应力的平均值用作隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力。
按以下评价基准，对上述中所观察到的有无隔膜破损、细胞浓度及生存力进行了评价。
<隔膜状态>
A使用后没有破损、龟裂及变色。
B使用后隔膜的一部分变成白色。
C使用后在隔膜的一部分产生龟裂。
D在培养中途隔膜破损。
<细胞增殖性>
A播种后10天内细胞浓度增加到80×106个细胞/mL以上。
B播种后10天内细胞浓度未达到80×106个细胞/mL。
<平均生存力>
A 28天的培养期间中生存力的平均值为95％以上。
B 28天的培养期间中生存力的平均值为90％以上且小于95％。
C 28天的培养期间中生存力的平均值为85％以上且小于90％。
关于隔膜状态的评价，将具体状态的具体例示于图4中。图4(A)表示上述判定基准下的状态A中的隔膜状态，图4(B)表示上述判定基准下的状态B中的隔膜状态，图4(C)表示上述判定基准下的状态C中的隔膜状态，图4(D)表示上述判定基准下的状态D中的隔膜状态。在图4(A)～(D)中，在状态B、状态C及状态D中观察到明显的异常，但是在状态B及状态C中隔膜的运转本身可以进行。因此，可以说状态A～状态C在容许范围内。然而，如状态D那样，若在培养中途导致隔膜破损，则不能发挥作为隔膜泵的功能(产生往复流)，因此无法继续培养。并且，将关于细胞增殖性及平均生存力的评价的具体例示于图5中。图5中作为增殖性而示出的变化曲线表示播种后的培养天数与细胞浓度(活细胞浓度)的关系。如图5中的增殖性A的情况那样，在细胞增殖顺利进行的情况下，可以达到高的细胞浓度，并且能够维持该高的细胞浓度。另一方面，在细胞增殖性的评价为B的情况下，典型地，如图5所示，细胞浓度在较低的细胞浓度下达到最大值，此后导致减少。图5中的作为生存力而示出的变化曲线表示播种后的培养天数与生存力(细胞生存率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数))的关系。播种后的生存力趋于逐渐减少，然而减少趋势随着平均生存力评价的等级降低而变得显著。然而，即使平均生存力为C，也在容许范围内。关于细胞的评价中的容许范围的前提是细胞增殖性在容许范围内(增殖性A)，生存力高表示更优选的范围。
将各例的结构与评价结果一同示于以下表1及表2中。
[表1]
Figure BDA0003193595640000281
[表2]
Figure BDA0003193595640000291
在本申请的实施例1～实施例17中，在由隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，并且在角度A为0°到75°的区域中的任一点上隔膜厚度H满足式1，
1≤HT/H≤1.75 (式1)。
在所述实施例中，抑制了隔膜的破损，得到良好的细胞增殖性，并且得到良好的细胞生存率。例如，在实施例1中，除了在培养后的隔膜上未发现异常以外，还显示出图6所示的良好的细胞增殖性及生存力。在图6中白色菱形表示生存力的变化，黑色菱形表示细胞浓度(活细胞浓度)的变化。在图6中第10天之后在细胞浓度中发现振荡变动，这是因为，细胞浓度因细胞渗出操作而降低，并通过此后的增殖而细胞浓度再次上升。
相对于此，在比较例1中，上述空间的体积大于20cm3，角度A为0°到75°的区域中的隔膜厚度H的最大值大于1.5mm，HT/H的最大值大于1.75，在该比较例中，细胞浓度的上升在低的细胞浓度下中止，未能够获得充分的细胞增殖性。由于导致细胞浓度开始减少，因此停止了培养。因此，未能够测定出28天培养之后的隔膜状态及28天的平均生存力。该结果表明，即使使用以往的培养用隔膜泵，在小规模培养中也无法维持细胞增殖性。
并且，在比较例2中，角度A为0°到75°的区域中的隔膜厚度H的最小值小于0.5mm，在该比较例中，在播种后第10天之前且细胞浓度达到80×106个细胞/mL之前，导致隔膜在培养中途破损。因此，未能够测定出细胞增殖性及28天的平均生存力。
在比较例3中，角度A为0°到75°的区域中的隔膜厚度H的最大值大于1.5mm，在该比较例中，导致细胞浓度的上升在低的细胞浓度下停止，未能够获得充分的细胞增殖性。由于导致细胞浓度开始减少，因此停止了培养。因此，未能够测定出28天培养之后的隔膜状态及28天的平均生存力。
在比较例4中，角度A为0°到75°的区域中的隔膜厚度H的最大值大于1.5mm，HT/H的最大值大于1.75，在该比较例中，导致隔膜在培养中途破损。因此，未能够测定出28天的平均生存力。
在比较例5中，HT/H的最大值大于1.75，在该比较例中，导致隔膜在培养中途破损。因此，未能够测定出28天的平均生存力。另外，比较例5对应于将针对Repligen制造的XCellATF2的比较例1的隔膜以相似形状减小的例子。如此表明，即使直接减小以往的培养用隔膜泵，也无法兼顾抑制隔膜破损和高的细胞增殖性。
在比较例6中，HT/H的最小值小于1，在该比较例中，导致隔膜在培养中途破损。因此，未能够测定出28天的平均生存力。
根据以上结果可知，通过使用由隔膜和包括隔膜的外缘部的远离隔膜顶点的一侧的面的平面限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，角度A为0°到75°的区域中的任一点上隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，并且在角度A为0°到75°的区域中的任一点上隔膜厚度H也满足式1的隔膜泵，在小规模培养中才能够兼顾高的细胞增殖性和抑制隔膜破损。
此外，通过比较实施例4的结果与实施例7至实施例9的结果可知，通过满足HZ＜HY及HZ≥H，趋于进一步抑制隔膜破损。并且，根据实施例10的结果与实施例11的结果的比较可知，通过将HY/H值设为大于1且3以下的范围内的值，趋于得到更高的细胞生存率。通过比较实施例12及实施例14的结果与实施例13及实施例15的结果可知，通过将隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力σ设为0.4MPa以上且1.5MPa以下的范围内的值，趋于得到更高的细胞生存率。通过比较实施例1及实施例16的结果与实施例17的结果可知，通过将隔膜泵的内部压力P与大气压之间的压力差的绝对值控制在0.1MPa以下，趋于得到高的细胞生存率。
如以上说明，根据本发明，能够提供一种在由容量小的隔膜泵抽出细胞悬浮液的情况下，能够兼顾良好的细胞增殖性和抑制隔膜破损的细胞培养装置、细胞培养方法及产物的制造方法。
日本专利申请2019-018245号的公开其全部内容通过参考而援用于本说明书。
关于本说明书中所记载的所有文献、专利申请及技术标准，以与具体且分别记载了通过参考并入各文献、专利申请及技术标准的情况相同的程度，通过参考并入本说明书中。
符号说明
10 培养容器
11 搅拌叶片
20 培养基供给容器
31 CO2供给容器
32 空气供给容器
33 O2供给容器
34 流量计
35 采样口
36 中空纤维膜过滤器
37 隔膜泵
38 空气供给容器
51～60 流路
100 细胞培养装置
301 腔室
302 隔膜
303 腔室
304a 壳体部分
304b 壳体部分
A 角度
F 平面
Ft 垂线的垂足
F1～F3 过滤器
L1 细胞悬浮液
L2 新鲜培养基
M1～M4 压力计
P1 泵
P2 泵
P3 真空泵
Pr 垂线
Pt 任意点
R1～R5 调节器
T 顶点
V1、V2 电磁阀
X 区域
Y 区域
Z 角度A为90°的点

Claims (15)

1.一种细胞培养装置，其具备：
培养容器，容纳细胞悬浮液；及
隔膜泵，用于从所述培养容器内部抽出所述细胞悬浮液，
由所述隔膜泵的隔膜和包括所述隔膜的外缘部的远离所述隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，
关于所述隔膜中的各个点，当将连接从所述隔膜顶点引出到所述平面F的垂线的垂足与所述各个点的直线和所述垂线所成角度设为所述各个点的角度A时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，所述隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，
当将所述隔膜顶点上的所述隔膜厚度设为HT时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，所述隔膜厚度H也满足下述式1，
1≤HT/H≤1.75 (式1)。
2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中，
在所述隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的所述隔膜厚度设为HY且将角度A为90°的点上的所述隔膜厚度设为HZ时，HZ＜HY，并且在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，所述隔膜厚度H也为H≤HZ。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养装置，其中，
在所述隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的所述隔膜厚度设为HY时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，所述隔膜厚度H也满足下述式2，
1＜HY/H≤3 (式2)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞培养装置，其中，
所述隔膜的材质是硅酮橡胶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞培养装置，其中，
所述隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力σ满足下述式3，
0.4MPa≤σ≤1.5MPa (式3)。
6.一种细胞培养方法，其包括：
在容纳于培养容器内部的细胞悬浮液中培养细胞；及
由隔膜泵从所述培养容器内部抽出所述细胞悬浮液，
由所述隔膜泵的隔膜和包括所述隔膜的外缘部的远离所述隔膜顶点的一侧的面的平面F限定的空间的体积为1cm3以上且20cm3以下，
关于所述隔膜中的各个点，当将连接从所述隔膜顶点引出到所述平面F的垂线的垂足与所述各个点的直线和所述垂线所成角度设为所述各个点的角度A时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，所述隔膜厚度H也在0.5mm以上且1.5mm以下的范围内，
当将所述隔膜顶点上的所述隔膜厚度设为HT时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，所述隔膜厚度H也满足下述式1，
1≤HT/H≤1.75 (式1)。
7.根据权利要求6所述的细胞培养方法，其中，
在所述隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的所述隔膜厚度设为HY且将角度A为90°的点上的所述隔膜厚度设为HZ时，HZ＜HY，并且在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，所述隔膜厚度H也为H≤HZ。
8.根据权利要求6或7所述的细胞培养方法，其中，
在所述隔膜中的角度A为75°到88°的区域中的点中，当将厚度最厚的点上的所述隔膜厚度设为HY时，在角度A为0°到75°的区域中的任一点上，所述隔膜厚度H也满足下述式2，
1＜HY/H≤3 (式2)。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的细胞培养方法，其中，
所述隔膜的材质是硅酮橡胶。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的细胞培养方法，其中，
所述隔膜的伸长率为50％下的拉伸应力σ满足下述式3，
0.4MPa≤σ≤1.5MPa (式3)。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的细胞培养方法，其中，
在所述隔膜泵运转时，驱动所述隔膜的所述隔膜泵的内部压力P满足下述式4，
大气压－0.1MPa≤P≤大气压+0.1Mpa (式4)。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的细胞培养方法，其中，
所述细胞是CHO细胞。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的细胞培养方法，其还包括：
使用分离膜并通过切向流过滤方式进行如下分离处理：将从所述培养容器内部抽出的所述细胞悬浮液分离成具有比所述细胞悬浮液中的细胞浓度高的细胞浓度的第一溶液，和具有比所述细胞悬浮液中的细胞浓度低的细胞浓度的第二溶液；
使所述第一溶液返回到所述培养容器内部；及
将培养基重新添加到所述培养容器内部。
14.一种产物的制造方法，其包括：
使用权利要求6至13中任一项所述的细胞培养方法培养生产产物的细胞；及
从所述细胞悬浮液回收产物。
15.根据权利要求14所述的产物的制造方法，其中，
所述产物是抗体。
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