CN113395976A - 良性肿瘤的预防或治疗药 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了良性肿瘤的预防或治疗药。提供了良性肿瘤的预防或治疗药,其包含WT1肽、其类似物或编码它们的核酸分子。在具体的实施方案中,本公开内容提供了良性肿瘤的预防或治疗药,其包含WT1肽、其类似物或编码它们的核酸分子。在优选的实施方案中,根据本公开内容的良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的预防或治疗药包含杀手型和/或辅助型WT1肽。在进一步优选的实施方案中,前述WT1肽是WT1126杀手肽和/或WT135辅助肽。在另一方面,提供了WT1肽‑特异性CTL、用于诱导WT1‑特异性辅助T细胞的方法和用于诱导呈递WT1肽的树突细胞的方法。
Description
技术领域
本公开内容包括用于预防或治疗良性肿瘤的药物和方法。在一个具体的实例中,本公开内容涉及用于预防或治疗家族性腺瘤息肉病的组合物。
背景技术
良性肿瘤是没有病理学恶性结果的肿瘤。通常认为,良性肿瘤不同于恶性肿瘤,并且不显示转移或浸润趋势。大多数良性肿瘤是无症状的,但当它们的直径很大时,它们可通过挤压其它组织而显示一些症状或变成恶性,并且需要得到治疗或预防。因此,对于良性肿瘤,存在很少的治疗和预防剂。
家族性腺瘤息肉病是具有肿瘤抑制基因APC的杂合缺失的遗传性疾病。从大约20岁开始,APC基因的纯合缺失在大肠中具有APC杂合缺失的腺体细胞中发生,并且腺瘤在大肠中到处发生,然后结肠癌从腺瘤发展。最初,腺瘤通过内窥镜作为治疗而被切除。然而,由于腺瘤随后变得太密而不能切除,并且癌症从腺瘤发展,因此通常进行全结肠切除术。渗透率是100%,并且其是非常严重的疾病,对于所有携带者在大约20岁发生。在日本有大约6,000个患者。
已知阿司匹林有效预防家族性腺瘤息肉病中的腺瘤和腺癌的发生和/或抑制其进展,但其效果很弱,并且存在胃肠出血作为阿司匹林副作用的风险。
肾母细胞瘤(Wilms tumor)基因WT1作为参与肾母细胞瘤的肿瘤发生的基因分离,所述肾母细胞瘤是儿科的肾肿瘤(参见非专利文件1)。该基因编码与细胞增殖和分化以及细胞凋亡和组织发育的调节机制有关的锌指转录因子。
现有技术文件
非专利文件
非专利文件1:Gessler, M等, Nature, Vol. 343, pp. 774-778, 1990。
发明内容
解决问题的手段
通过勤奋研究,本发明人已发现,WT1肽疫苗有效抑制和/或延迟良性肿瘤(例如家族性腺瘤息肉病)中的腺瘤发生,和抑制和/或延迟来自腺瘤的症状发生,并且WT1肽疫苗有效治疗和预防良性肿瘤,例如家族性腺瘤息肉病,其被认为是难治的,这是因为除了全部切除之外没有根本治疗。本发明人已发现,具有良性肿瘤例如家族性腺瘤息肉病的患者的腺瘤表达WT1癌症抗原,因此提出观点:WT1癌症疫苗可有效抑制和/或延迟良性肿瘤例如家族性腺瘤息肉病中的腺瘤发生,和抑制和/或延迟来自腺瘤的症状发生,然后最终完成了本发明。
本公开内容基于令人惊讶的发现,即,良性肿瘤的腺瘤中的细胞表达WT1蛋白。本领域已知WT1蛋白在恶性肿瘤的癌症细胞中高度表达,以及可容易预测WT1肽疫苗在恶性肿瘤中的有用性。本公开内容首次揭示了作为良性肿瘤的家族性腺瘤息肉病的腺瘤中的细胞表达WT1蛋白,并且提出总体上提供良性肿瘤的治疗或预防剂的观点。此外,由于WT1肽疫苗的有效性取决于WT1蛋白的表达方式(包括表达水平),即使发现WT1蛋白在腺瘤中表达,这也不能被合理地预测。在该方面,本公开内容首次证实了WT1肽疫苗对于良性肿瘤有效,并且发现了根据现有技术不可预测的效果。
因此,本公开内容提供了:
(条款X1)
用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,包含WT1肽或其类似物。
(条款X2)
根据条款X1的组合物,其中WT1肽或其类似物包括杀手型肽和/或辅助型肽。
(条款X3)
根据条款X1或条款X2的组合物,其中WT1肽或其类似物包括WT1126杀手肽和/或WT135辅助肽。
(条款X4)
根据条款X1-X3中任一项的组合物,其中组合物包含编码WT1肽或其类似物的核酸分子。
(条款X5)
根据条款X1-X4中任一项的组合物,其中核酸分子包括RNA和/或DNA。
(条款X6)
根据条款X1-X5中任一项的组合物,其中组合物进一步包含佐剂。
(条款X7)
根据条款X1-X6中任一项的组合物,其中佐剂是Montanide® ISA51佐剂。
(条款X8)
根据条款X1-X7中任一项的组合物,其中良性肿瘤表达WT1。
(条款X9)
根据条款X1-X8中任一项的组合物,其中良性肿瘤选自家族性腺瘤息肉病、非遗传性结肠直肠腺瘤、导管内乳头状粘液性肿瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、器官的上皮腺瘤、乳头瘤、非上皮性肌瘤、脂肪瘤、软骨瘤和血管瘤。
(条款X10)
根据条款X1-X9中任一项的组合物,其中良性肿瘤是家族性腺瘤息肉病。
(条款X11)
根据条款X1-X10中任一项的组合物,其中组合物将一周一次给予。
(条款X12)
诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞用于预防或治疗良性肿瘤的方法,包括在根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物的存在下培养来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞,或将根据前述条款中任一项的编码WT1肽或其类似物的核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞中,和从外周血单核细胞诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
(条款X13)
诱导呈递WT1的树突细胞用于预防或治疗良性肿瘤的方法,包括在根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物的存在下培养来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞,或将根据前述条款中任一项的编码WT1肽或其类似物的核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞中,和诱导呈递WT1的树突细胞。
(条款X13A)
条款X12或13的方法,进一步包含一个或多个根据条款X1-X11中任何一项或多项的特征。
(条款X14)
用于诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞的组合物,包含WT1肽或其类似物,或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,其中组合物用于预防或治疗良性肿瘤。
(条款X15)
用于诱导呈递WT1的树突细胞的组合物,包含WT1肽或其类似物,或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,其中组合物用于预防或治疗良性肿瘤。
(条款X15A)
根据条款X14或条款X15的组合物,进一步包含一个或多个根据条款X1-X13中任何一项或多项的特征。
(条款X16)
用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,包含WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
(条款X17)
用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,包含呈递WT1的树突细胞。
(条款X17A)
根据条款X16或条款X17的组合物,进一步包含一个或多个根据条款X1-X13中任何一项或多项的特征。
本公开内容还提供了:
(条款1)
用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,包含WT1肽或其类似物。
(条款2)
根据条款1的组合物,其中WT1肽或其类似物包括杀手型肽和/或辅助型肽。
(条款3)
根据条款1或2的组合物,其中WT1肽或其类似物包括WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和/或WT135辅助肽,或包含因为一至几个氨基酸被缺失、置换和/或添加而不同于WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和WT135辅助肽中任一种的氨基酸序列的氨基酸序列并且具有CTL-诱导活性的肽。
(条款4)
根据条款1-3中任一项的组合物,其中WT1肽或其类似物是由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
RYFPNAPYL (SEQ ID NO: 46),
YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 14),
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 45),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 47) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),和
C-CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 48) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款5)
根据条款1-4中任一项的组合物,其中WT1肽或其类似物是式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款6)
根据条款1-5中任一项的组合物,其中WT1肽或其类似物是式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款7)
根据条款1-6中任一项的组合物,其中WT1肽或其类似物是组合物,其进一步包含至少一种由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 50)和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 51),
或其药学上可接受的盐。
(条款8)
根据条款1-7中任一项的组合物,其中WT1肽或其类似物是组合物,其包含式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由氨基酸序列:WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)组成的肽或其药学上可接受的盐。
(条款9)
根据条款1-8中任一项的组合物,其中WT1肽或其类似物是组合物,其包含式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由氨基酸序列:WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)组成的肽或其药学上可接受的盐。
(条款10)
用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,包含编码WT1肽或其类似物的核酸分子。
(条款11)
根据条款A1-A10中任一项的组合物,其中核酸分子包括RNA和/或DNA。
(条款12)
根据条款1-11中任一项的组合物,其中组合物进一步包含佐剂。
(条款13)
根据条款1-12中任一项的组合物,其中佐剂是Montanide® ISA51佐剂。
(条款14)
根据条款1-13中任一项的组合物,其中良性肿瘤表达WT1。
(条款15)
根据条款1-14中任一项的组合物,其中良性肿瘤选自家族性腺瘤息肉病、非遗传性结肠直肠腺瘤、导管内乳头状粘液性肿瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、器官的上皮腺瘤、乳头瘤、非上皮性肌瘤、脂肪瘤、软骨瘤和血管瘤。
(条款16)
根据条款1-15中任一项的组合物,其中良性肿瘤是家族性腺瘤息肉病。
(条款17)
根据权利要求1-16中任一项所述的组合物,其中组合物将一周一次给予。
(条款18)
诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞用于预防或治疗良性肿瘤的方法,包括在根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物的存在下培养来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞,或将根据前述条款中任一项的编码WT1肽或其类似物的核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞中,和从外周血单核细胞诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
(条款19)
诱导呈递WT1的树突细胞用于预防或治疗良性肿瘤的方法,包括在根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物的存在下培养来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞,或将根据前述条款中任一项的编码WT1肽或其类似物的核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞,和诱导呈递WT1的树突细胞。
(条款19A)
条款18或19的方法,进一步包含一个或多个根据条款1-17中任何一项或多项的特征。
(条款20)
用于诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞的组合物,包含WT1肽或其类似物,或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,其中组合物用于预防或治疗良性肿瘤。
(条款21)
用于诱导呈递WT1的树突细胞的组合物,包含WT1肽或其类似物,或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,其中组合物用于预防或治疗良性肿瘤。
(条款21A)
条款20或21的组合物,进一步包含一个或多个根据条款1-19中任何一项或多项的特征。
(条款22)
用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,包含WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
(条款23)
用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,包含呈递WT1的树突细胞。
(条款23A)
根据条款22或23的组合物,进一步包含一个或多个根据条款1-19中任何一项或多项的特征。
(条款A1)
预防或治疗受试者的良性肿瘤的方法,包括给予受试者有效量的WT1肽或其类似物。
(条款A2)
根据条款A1的方法,其中WT1肽或其类似物包括杀手型肽和/或辅助型肽。
(条款A3)
根据条款A1或A1的方法,其中WT1肽或其类似物包括WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和/或WT135辅助肽,或包含因为一至几个氨基酸缺失、置换和/或添加而不同于WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和WT135辅助肽中任一种的氨基酸序列的氨基酸序列并且具有CTL-诱导活性的肽。
(条款A4)
根据条款A1-A3中任一项的组合物,其中WT1肽或其类似物是由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
RYFPNAPYL (SEQ ID NO: 46),
YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 14),
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 45),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 47) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),和
C-CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 48) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款A5)
根据条款A1-A4中任一项的方法,其中WT1肽或其类似物是式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款A6)
根据条款A1-A5中任一项的方法,其中WT1肽或其类似物是式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款A7)
根据条款A1-A6中任一项的方法,其中WT1肽或其类似物是组合物,其进一步包含至少一种由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 50)和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 51),
或其药学上可接受的盐。
(条款A8)
根据条款A1-A7中任一项的方法,其中WT1肽或其类似物是组合物,其包含式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由氨基酸序列:WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)组成的肽或其药学上可接受的盐。
(条款A9)
根据条款A1-A8中任一项的方法,其中WT1肽或其类似物是组合物,其包含式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由氨基酸序列:WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)组成的肽或其药学上可接受的盐。
(条款A10)
预防或治疗受试者的良性肿瘤的方法,包括给予受试者有效量的编码WT1肽或其类似物的核酸分子。
(条款A11)
根据条款A1-A10中任一项的方法,其中核酸分子包括RNA和/或DNA。
(条款A12)
根据条款A1-A11中任一项的方法,其中WT1肽或其类似物,或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,与佐剂组合使用。
(条款A13)
根据条款A1-A12中任一项的方法,其中佐剂是Montanide® ISA51佐剂。
(条款A14)
根据条款A1-A13中任一项的方法,其中良性肿瘤表达WT1。
(条款A15)
根据条款A1-A14中任一项的方法,其中良性肿瘤选自家族性腺瘤息肉病、非遗传性结肠直肠腺瘤、导管内乳头状粘液性肿瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、器官的上皮腺瘤、乳头瘤、非上皮性肌瘤、脂肪瘤、软骨瘤和血管瘤。
(条款A16)
根据条款A1-A15中任一项的方法,其中良性肿瘤是家族性腺瘤息肉病。
(条款A17)
根据条款A1-A16中任一项的方法,其中WT1肽或其类似物,或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,一周一次给予。
(条款A18)
预防或治疗受试者的良性肿瘤的方法,包括
在根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物的存在下培养来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞,或将根据前述条款中任一项的编码WT1肽或其类似物的核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞中,从而从外周血单核细胞诱导WT1-特异性细胞毒性T细胞(CTL)和/或WT1-特异性辅助T细胞,和
给予受试者由此制备的WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
(条款A19)
预防或治疗受试者的良性肿瘤的方法,包括
在根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物的存在下培养来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞,或将根据前述条款中任一项的编码WT1肽或其类似物的核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞中,从而诱导呈递WT1的树突细胞,和
给予受试者由此制备的呈递WT1的树突细胞。
(条款A19A)
根据条款A18或A19的方法,进一步包含一个或多个根据条款A1-A17中任何一项或多项的特征。
(条款A20)
预防或治疗受试者的良性肿瘤的方法,包括给予受试者有效量的通过WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子诱导的WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
(条款A21)
预防或治疗受试者的良性肿瘤的方法,包括给予受试者有效量的通过WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子诱导的呈递WT1的树突细胞。
(条款A21A)
根据条款A20或A21的组合物,进一步包含一个或多个根据条款A1-A19中任何一项或多项的特征。
(条款A22)
预防或治疗受试者的良性肿瘤的方法,包括给予受试者有效量的WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
(条款A23)
预防或治疗受试者的良性肿瘤的方法,包括给予受试者有效量的呈递WT1的树突细胞。
(条款A23A)
根据条款A22或A23的组合物,进一步包含一个或多个根据条款A1-A19中任何一项或多项的特征。
(条款B1)
WT1肽或其类似物,用于预防或治疗良性肿瘤。
(条款B2)
根据条款B1的WT1肽或其类似物,其中WT1肽或其类似物包括杀手型肽和/或辅助型肽。
(条款B3)
根据条款B1或B2的WT1肽或其类似物,其中WT1肽或其类似物包括WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和/或WT135辅助肽,或包含因为一至几个氨基酸缺失、置换和/或添加而不同于WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和WT135辅助肽中任一种的氨基酸序列的氨基酸序列并且具有CTL-诱导活性的肽。
(条款B4)
根据条款B1-B3中任一项的WT1肽或其类似物,其中WT1肽或其类似物是由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
RYFPNAPYL (SEQ ID NO: 46),
YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 14),
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 45),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 47) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),和
C-CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 48) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款B5)
根据条款B1-B4中任一项的WT1肽或其类似物,其中WT1肽或其类似物是式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款B6)
根据条款B1-B5中任一项的WT1肽或其类似物,其中WT1肽或其类似物是式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款B7)
根据条款B1-B6中任一项的WT1肽或其类似物,其中WT1肽或其类似物是组合物,其进一步包含至少一种由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 50)和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 51),
或其药学上可接受的盐。
(条款B8)
根据条款B1-B7中任一项的WT1肽或其类似物,其中WT1肽或其类似物是组合物,其包含式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由氨基酸序列:WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)组成的肽或其药学上可接受的盐。
(条款B9)
根据条款B1-B8中任一项的WT1肽或其类似物,其中WT1肽或其类似物是组合物,其包含式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由氨基酸序列:WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)组成的肽或其药学上可接受的盐。
(条款B10)
编码WT1肽或其类似物的核酸分子,用于预防或治疗受试者的良性肿瘤。
(条款B11)
根据条款B1-B10中任一项的核酸分子,其中核酸分子包括RNA和/或DNA。
(条款B12)
根据条款B1-B11中任一项的WT1肽或其类似物或核酸分子,其与佐剂组合使用。
(条款B13)
根据条款B1-B12中任一项的WT1肽或其类似物或核酸分子,其中佐剂是Montanide® ISA51佐剂。
(条款B14)
根据条款B1-B13中任一项的WT1肽或其类似物或核酸分子,其中良性肿瘤表达WT1。
(条款B15)
根据条款B1-B14中任一项的WT1肽或其类似物或核酸分子,其中良性肿瘤选自家族性腺瘤息肉病、非遗传性结肠直肠腺瘤、导管内乳头状粘液性肿瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、器官的上皮腺瘤、乳头瘤、非上皮性肌瘤、脂肪瘤、软骨瘤和血管瘤。
(条款B16)
根据条款B1-B15中任一项的WT1肽或其类似物或核酸分子,其中良性肿瘤是家族性腺瘤息肉病。
(条款B17)
根据条款B1-B16中任一项的WT1肽或其类似物或核酸分子,其将一周一次给予。
(条款B18)
根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物或根据前述条款中任一项的核酸分子,用于诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞用于预防或治疗良性肿瘤,其中WT1肽或其类似物与来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞一起培养,或将核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞中,从而诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
(条款B19)
根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物或根据前述条款中任一项的核酸分子,用于诱导呈递WT1的树突细胞用于预防或治疗良性肿瘤,其中WT1肽或其类似物与来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞一起培养,或将核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞中,从而诱导呈递WT1的树突细胞。
(条款B19A)
根据条款B18或B19的方法,进一步包含一个或多个根据条款B1-B17中任何一项或多项的特征。
(条款B20)
WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,用于诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞,其中WT1肽或其类似物或核酸分子用于预防或治疗良性肿瘤。
(条款B21)
WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,用于诱导呈递WT1的树突细胞,其中WT1肽或其类似物或核酸分子用于预防或治疗良性肿瘤。
(条款B21A)
根据条款B20或B21的组合物,进一步包含一个或多个根据条款B1-B19中任何一项或多项的特征。
(条款B22)
WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞,用于预防或治疗受试者的良性肿瘤。
(条款B23)
呈递WT1的树突细胞,用于预防或治疗受试者的良性肿瘤。
(条款B23A)
根据条款B22或B23的组合物,进一步包含一个或多个根据条款B1-B19中任何一项或多项的特征。
(条款C1)
WT1肽或其类似物在制备用于预防或治疗良性肿瘤的组合物中的用途。
(条款C2)
根据条款C1的用途,其中WT1肽或其类似物包括杀手型肽和/或辅助型肽。
(条款C3)
根据条款C1或C2的用途,其中WT1肽或其类似物包括WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和/或WT135辅助肽,或包含因为一至几个氨基酸缺失、置换和/或添加而不同于WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和WT135辅助肽中任一种的氨基酸序列的氨基酸序列并且具有CTL-诱导活性的肽。
(条款C4)
根据条款C1-C3中任一项的用途,其中WT1肽或其类似物是由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
RYFPNAPYL (SEQ ID NO: 46),
YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 14),
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 45),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 47) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),和
C-CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 48) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款C5)
根据条款C1-C4中任一项的用途,其中WT1肽或其类似物是式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款C6)
根据条款C1-C5中任一项的用途,其中WT1肽或其类似物是式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
(条款C7)
根据条款C1-C6中任一项的用途,其中WT1肽或其类似物是组合物,其进一步包含至少一种由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 50)和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 51),
或其药学上可接受的盐。
(条款C8)
根据条款C1-C7中任一项的用途,其中WT1肽或其类似物是组合物,其包含式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由氨基酸序列:WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)组成的肽或其药学上可接受的盐。
(条款C9)
根据条款C1-C8中任一项的用途,其中WT1肽或其类似物是组合物,其包含式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由氨基酸序列:WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)组成的肽或其药学上可接受的盐。
(条款C10)
编码WT1肽或其类似物的核酸分子在制备用于预防或治疗良性肿瘤的组合物中的用途。
(条款C11)
根据条款C1-C10中任一项的用途,其中核酸分子包括RNA和/或DNA。
(条款C12)
根据条款C1-C11中任一项的用途,其中WT1肽或其类似物或核酸分子与佐剂组合使用。
(条款C13)
根据条款C1-C12中任一项的用途,其中佐剂是Montanide® ISA51佐剂。
(条款C14)
根据条款C1-C13中任一项的用途,其中良性肿瘤表达WT1。
(条款C15)
根据条款C1-C14中任一项的用途,其中良性肿瘤选自家族性腺瘤息肉病、非遗传性结肠直肠腺瘤、导管内乳头状粘液性肿瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、器官的上皮腺瘤、乳头瘤、非上皮性肌瘤、脂肪瘤、软骨瘤和血管瘤。
(条款C16)
根据条款C1-C15中任一项的用途,其中良性肿瘤是家族性腺瘤息肉病。
(条款C17)
根据条款C1-C16中任一项的用途,其中WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子将一周一次给予。
(条款C18)
根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物或根据前述条款中任一项的核酸分子用于诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞用于预防或治疗良性肿瘤的用途,其中WT1肽或其类似物与来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞一起培养,或将核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞中,从而诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
(条款C19)
根据前述条款中任一项的WT1肽或其类似物或根据前述条款中任一项的核酸分子用于诱导呈递WT1的树突细胞用于预防或治疗良性肿瘤的用途,其中WT1肽或其类似物与来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞一起培养,或将核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞,从而诱导呈递WT1的树突细胞。
(条款C19A)
根据条款C18或C19的方法,进一步包含一个或多个根据条款C1-C17中任何一项或多项的特征。
(条款C20)
WT1肽或类似物或编码WT1肽或类似物的核酸分子在制备用于预防或治疗良性肿瘤的WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞中的用途。
(条款C21)
WT1肽或类似物或编码WT1肽或类似物的核酸分子在制备用于预防或治疗良性肿瘤的呈递WT1的树突细胞中的用途。
(条款C21A)
根据条款C20或C21的组合物,进一步包含一个或多个根据条款C1-C19中任何一项或多项的特征。
(条款C22)
WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞在制备用于预防或治疗良性肿瘤的组合物中的用途。
(条款C23)
呈递WT1的树突细胞在制备用于预防或治疗良性肿瘤的组合物中的用途。
(条款C23A)
根据条款C22或C23的组合物,进一步包含一个或多个根据条款C1-C19中任何一项或多项的特征。
本公开内容预期,上述一个或多个特征可与本文所述的任何特定组合进行组合。如需要,本领域技术人员在阅读和理解以下详细描述时将意识到本公开内容的其它实施方案和优点。
发明效果
根据本发明,实现了良性肿瘤的预防、延迟和治疗。在示例性的实施方案中,本发明实现家族性腺瘤息肉病的预防、延迟和治疗。在另一方面,本发明实现由良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的腺瘤产生的症状的预防、延迟和治疗。
此外,除了在给予部位处皮肤的发红和肿胀之外,本公开内容的WT1肽癌症疫苗没有严重的副作用,并且是非常安全的。因此,WT1肽癌症疫苗可安全和容易地给予大多数良性肿瘤患者和家族性腺瘤息肉病患者,并且从患者QOL的角度,避免了内窥镜切除和手术。从减少医药花费的经济影响的角度可以认为其优于常规技术。
附图简述
图1显示显微照片,其显示在人家族性腺瘤息肉病患者的腺瘤中WT1蛋白的表达。左侧的照片是腺瘤组织的照片,和右侧的照片是正常腺管的照片。在两个照片中,轻微染色指示WT1蛋白和深色圈染色区域指示细胞核。
图2是显微照片,其显示在APCMin/+小鼠中WT1蛋白的表达。从上方开始按顺序显示5x、10x和20x放大倍数的显微照片。各照片的左下方显示比例尺,和从上方开始按顺序显示500 μm、250 μm和100 μm的长度。各组织的右下方照片显示组织总体图片的放大区域。在所有照片中,深色染色指示WT1蛋白和圈染色区域指示细胞核。
图3是显微照片,其显示在APCMin/+小鼠中WT1蛋白的表达。放大倍数是40x,和显示100 μm的长度的比例尺显示在照片的左下方。深色染色指示WT1蛋白和圈染色区域指示细胞核。
图4显示给予WT1肽疫苗至APCMin/+小鼠的实验给予方案。上方的水平轴显示APCMin /+小鼠的周龄、接种的时间点和安乐死以供分析的时间点。在上方的水平轴上,下方的数字指示小鼠的周龄,上方的短箭头指示给予疫苗的时间点,和上方的长箭头指示将小鼠安乐死和进行分析的时间点。WT1疫苗和对照疫苗的组成显示在水平轴下方。
图5是显示通过给予WT1肽疫苗抑制腺瘤发生的图。图的纵轴指示每小肠的腺瘤数量,和左侧的散点图指示接受WT1肽疫苗的APCMin/+小鼠的结果和右侧的散点图指示接受对照疫苗的APCMin/+小鼠的结果。各散点图中的水平线显示平均值,和显著性检验的结果显示于图的上方。
图6是显示给予WT1肽疫苗增加WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的图。图的纵轴显示在CD3+CD8+T细胞中H-2Db WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率,和左侧的散点图显示接受WT1肽疫苗的APCMin/+小鼠的结果,和右侧的散点图显示接受对照疫苗的APCMin/+小鼠的结果。各散点图中的水平线显示平均值,和显著性检验的结果显示于图的上方。
图7是显示WT1肽疫苗-给予组和对照疫苗-给予组之间的回归分析的图。纵轴指示在CD3+CD8+T细胞中H-2Db WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率,和水平轴指示每小肠的腺瘤数量。各个点是在WT1肽疫苗-给予组和对照疫苗-给予组之间腺瘤数量和WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞频率的绘图。图的直线显示回归线,以及相关系数(R)、回归线的函数式和决定系数(R2)从上方按顺序显示在右侧。
图8显示给予WT1肽疫苗至APCMin/+小鼠的实验给予方案。上方的水平轴显示APCMin /+小鼠的周龄、接种的时间点和安乐死以供分析的时间点。在上方的水平轴上,下方的数字指示小鼠的周龄,上方的短箭头指示给予疫苗的时间点,和上方的长箭头指示将小鼠安乐死和进行分析的时间点。WT1疫苗和对照疫苗的组成显示在水平轴的下方。
图9显示显微照片,其显示在人非遗传性结肠直肠腺瘤患者的腺瘤中WT1蛋白的表达。从左侧开始第一个照片是正常腺管的照片,和右侧的三个照片是从三个非遗传性结肠直肠腺瘤患者获得的腺瘤组织的照片。在所有照片中,浅色染色指示WT1蛋白和深色圈或卵形染色区域指示细胞核。WT1蛋白的表达水平显示在各照片的下方,以及符号(-)指示表达水平低和符号(+)指示表达水平高。
图10显示给予本文由式(3)表示的化合物和WT135辅助肽的混合物至APCMin/+小鼠的实验给予方案。水平轴显示APCMin/+小鼠的周龄、接种的时间点和安乐死以供分析的时间点。在水平轴上,下方的数字指示小鼠的周龄,以及上方的箭头指示给予疫苗的时间点和将小鼠安乐死进行分析的时间点。
图11是显示通过给予本文由式(3)表示的化合物和WT135辅助肽的混合物抑制腺瘤发生的图。图的纵轴指示每小肠的腺瘤数量,和左侧的散点图指示接受WT1肽疫苗的APCMin/+小鼠的结果和右侧的散点图指示接受对照疫苗的APCMin/+小鼠的结果。各散点图中的水平线显示平均值,和显著性检验的结果显示于图的上方。
图12是显示通过给予本文由式(3)表示的化合物和WT135辅助肽的混合物增加WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的图。图的纵轴指示在CD3+CD8+T细胞中H-2Db WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率,和左侧的散点图显示接受本文由式(3)表示的化合物和WT135辅助肽的混合物的APCMin/+小鼠的结果和右侧的散点图显示接受对照疫苗的APCMin/+小鼠的结果。各散点图中的水平线显示平均值,和显著性检验的结果显示于图的上方。
图13是显示接受本文由式(3)表示的化合物和WT135辅助肽的混合物的组和接受对照疫苗的组之间的回归分析的图。图的纵轴指示在CD3+CD8+T细胞中H-2Db WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率,和水平轴指示每小肠的腺瘤数量。各个点是在接受本文由式(3)表示的化合物和WT135辅助肽的混合物的组和接受对照疫苗的组之间腺瘤数量和WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞频率的绘图。图中的直线显示回归线,以及相关系数(R)、回归线的函数式和决定系数(R2)从上方按顺序显示于右侧。
具体实施方式
本发明将在下文用其最佳模式进行描述。在整个说明书中,应理解单数形式的表述包括其复数形式,除非另外说明。因此,应理解单数冠词(例如,英语中的"a"、"an"或"the")也包括其复数形式,除非另外说明。还应理解,本文使用的术语以本领域常用的含义使用,除非另外说明。因此,除非另外定义,本文使用的所有专业术语和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下,以本说明书(包含定义)为准。
在本说明书中具体使用的术语定义和/或基本技术内容在下文适当地描述。
(术语定义)
在本说明书中,"WT1 (肾母细胞瘤基因1)"、"WT1蛋白"或"WT1肽"是指包含至少一部分(或全部)的肾母细胞瘤(WT1)基因产物或其类似物的多肽。特别地,"WT1蛋白"优选通常是由449个氨基酸组成的人WT1蛋白(SEQ ID NO: 1),或由因为一至几个(优选地约二至六个)氨基酸缺失、置换和/或添加而不同于SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的氨基酸序列组成的蛋白。将要插入或替换的氨基酸可以是不包括在20种由基因编码的氨基酸中的非天然氨基酸。"WT1肽"是指由一部分构成WT1蛋白的氨基酸序列组成的肽。在本说明书中,术语"WT1"或"WT1肽"将包括突变的WT1,除非另外指明。此外,当在本说明书中提及"WT1"或"WT1肽"时,"WT1"是指人WT1,除非另外指明。
本公开内容中使用的WT1肽的长度不特别限于,但优选地,约7至约30个氨基酸。优选的WT1肽具有作为结合HLA分子并由HLA分子呈递的抗原肽的特定序列模式(基序),和具有结合HLA分子的能力。结合HLA分子的能力可通过本领域已知的方法研究。这样的方法包括例如,基于计算机的方法,例如Rankpep、BIMAS和SYFPEITHI,以及用能够结合HLA分子的已知的WT1肽的竞争性结合测试。可用于本公开内容的WT肽在本文描述于章节"WT1肽"中,以及还描述于WO2016/093326中,其通过引用结合到本文中。
本公开内容中使用的优选WT1肽是激活杀手T细胞和/或辅助T细胞的肽。杀手T细胞和/或辅助T细胞的活化可通过单一类型的肽或多种类型的肽(其各自可被特化以激活杀手或辅助T细胞)进行。此外,本公开内容的药物组合物中使用的WT1肽可以是单一类型的肽或可以包括多种类型的肽。此外,本公开内容的药物或药物组合物中使用的WT1肽可以是杀手WT1肽或辅助WT1肽,或这些肽的混合物。本公开内容的WT1肽可以是单一肽或多种肽的缀合物、混合物或组合。更优选的WT1肽可包括杀手WT1肽和辅助WT1肽的组合。这样的组合的实例包括描述于WO2014/157692中的化合物或组合物。
如本文使用的,"良性肿瘤"是没有病理学恶性发现的肿瘤,并且被理解为不同于恶性肿瘤。认为良性肿瘤没有显示转移或浸润趋势。诊断为良性肿瘤不必然意味着良好的临床预后。例如,在脑干中发生的低级脑膜瘤是良性肿瘤,但其难以治疗,并且因为其挤压脑干并显示差的预后而在临床上是恶性的,因此通常需要治疗或预防。良性肿瘤包括但不限于,家族性腺瘤息肉病、非遗传性结肠直肠腺瘤、导管内乳头状粘液性肿瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、器官的上皮腺瘤、乳头瘤、非上皮性肌瘤、脂肪瘤、软骨瘤和血管瘤。
如本文使用的,术语"家族性腺瘤息肉病"、"家族性结肠息肉病"、"家族性腺瘤结肠息肉病"和"FAP"可互换使用,并且意指特征为肿瘤抑制基因APC (腺瘤结肠息肉病)的突变和在肠道中形成的大量腺瘤的遗传疾病,和其分类为良性肿瘤。如本文使用的,家族性腺瘤息肉病还包括在肠道之外的组织中与肿瘤一致的疾病,例如加德纳氏综合征。典型的家族性腺瘤息肉病模型动物包括但不限于,APCMin/+小鼠(Jackson Institute, Bar Harbor,Maine, USA)。
如本文使用的,术语例如"杀手型"或"杀手肽"意指所述肽具有激活细胞毒性T细胞(CTL,杀手T细胞)的能力。杀手T细胞的活化意指杀手T细胞的细胞毒性活性增加和/或杀手T细胞的数量增加。肽是否是"杀手(型)"肽通常通过下文描述的测试来确定。即是说,它可通过经由方法例如流式细胞术来检测T细胞表面上的CD8来确定。或者,它可通过经由方法例如51Cr释放测定法或乳酸脱氢酶(LDH)测定法来测量针对靶标的细胞毒性活性确定。在优选的实施方案中,本公开内容的WT1肽具有这种杀手型的活性。
MHC在人中被称为人白细胞抗原(HLA)。对应于MHC I类分子的HLA被分类为亚型,例如HLA-A、B、Cw、F和G。术语"MHC I类-受限的"优选地包括"HLA-A-受限的"、"HLA-B-受限的"和"HLA-Cw-受限的"。
对于各HLA亚型,多态性(等位基因)是已知的。HLA-A多态性的实例包括27种或更多种类型,例如HLA-A1、HLA-A0201和HLA-A24,HLA-B多态性的实例包括59种或更多种类型,例如HLA-B7、HLA-B40和HLA-B4403,以及HLA-Cw多态性的实例包括10种或更多种类型,例如HLA-Cw0301、HLA-Cw0401和HLA-Cw0602。在这些多态性中,HLA-A0201和HLA-A24是优选的。
本公开内容中的"WT1肽"是由SEQ ID NO: 1所示的人WT1的氨基酸序列中的7-30个连续氨基酸组成的部分肽。
如本文使用的,术语"MHC I类-受限的"是指肽结合MHC (主要组织相容性复合物)I类分子和诱导CTL的能力。"MHC I类-受限的WT1肽"是能够结合MHC I类分子以复合物的形式呈递并体外和/或体内从识别复合物的前体T细胞诱导CTL的肽,因此其与"WT1辅助肽"同义。"WT1 I类-受限的WT1肽"的氨基酸残基数量是7-30,优选地7-15,更优选地8-12,还更优选地8-11和最优选地8或9。
"MHC I类-受限的WT1肽"的实例包括在SEQ ID NO: 1所示的人WT1的氨基酸序列的位置2、3、4、6、7、10、17、18、20、23、24、26、29、30、32、33、37、38、39、40、47、63、64、65、70、73、80、81、82、83、84、85、86、88、92、93、96、98、99、100、101、104、107、110、118、119、120、123、125、126、128、130、136、137、138、139、141、143、144、146、152、161、163、165、168、169、174、177、179、180、185、187、191、192、194、202、204、206、207、208、209、210、211、213、217、218、219、221、222、223、225、227、228、230、232、233、235、239、240、242、243、244、250、251、252、260、261、263、269、270、272、273、276、278、279、280、285、286、287、289、292、293、294、295、298、299、301、302、303、306、309、312、313、315、316、317、318、319、324、325、326、327、329、332、334、337、340、343、345、347、349、351、354、356、358、362、363、364、366、368、371、372、373、375、379、383、384、386、387、389、390、391、394、396、401、406、408、409、410、412、415、416、417、418、419、420、423、424、425、426、427、428、429、432、433、434、436、437、439、440或441处开始的9个氨基酸残基的肽,或包含其变体的肽(参见WO2014/157692)。公布WO2014/157692通过引用以其整体结合到本文中。
"MHC I类-受限的WT1肽"可优选地是包含选自以下的氨基酸序列的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 52),
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 53),和
RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 54)
或者包含通过氨基酸改变而不同于选自SEQ ID NO: 2、3、52、53和54的氨基酸序列的改变的氨基酸序列并且具有CTL-诱导活性的肽。更优选地,所述肽可以是由选自SEQID NO: 2、3、52、53和54的氨基酸序列组成的肽。
当本公开内容中的"WT1肽或其类似物"是杀手肽时,包含通过氨基酸改变而不同于给定的氨基酸序列的改变的氨基酸序列的肽具有CTL-诱导活性。
本公开内容中包含通过氨基酸改变而不同于给定的氨基酸序列的改变的氨基酸序列并且具有CTL-诱导活性的肽也被称为"改变的杀手肽"。改变的杀手肽是由因为一至三个氨基酸缺失、置换和/或添加而不同于给定的氨基酸序列的氨基酸序列组成并且能够结合MHC I类以诱导CTL的肽。当所述肽由9个残基的氨基酸序列组成时,氨基酸置换可以在位置1 (N-末端)、2、3或9处。氨基酸添加(其包括插入)的数量通常是1至几个,优选地1-3个,更优选地1或2个,和甚至更优选地1个。氨基酸添加的优选位置包括C-末端。氨基酸缺失的数量优选地是1个。在这样的改变中,用于添加或置换的氨基酸可以是不同于20种由基因编码的氨基酸的非天然氨基酸。
改变的杀手肽的实例包括以下肽:
作为RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)的改变的杀手肽,
RYFPNAPYL (SEQ ID NO: 46) (WO2003/106682),
FMFPNAPYL (SEQ ID NO: 13),
RLFPNAPYL (SEQ ID NO: 18),
RMMPNAPYL (SEQ ID NO: 25),
RMFPNAPYV (SEQ ID NO: 28)或
YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 14) (WO2009/072610);
作为CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3)的改变的杀手肽,
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 45) (WO2002/79253),
Xaa-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO: 55)
(其中Xaa是Ser或Ala)或
Xaa-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu(SEQ ID NO: 56)
(其中Xaa是Ser、Ala、Abu、Arg、Lys、Orn、Cit、Leu、Phe或Asn) (WO2004/026897);
作为ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 52)的改变的杀手肽,
AYLPAVPSL (SEQ ID NO: 57) (WO2003/106682);
作为SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 53)的改变的杀手肽,
FLGEQQYSV (SEQ ID NO: 58),
SMGEQQYSV (SEQ ID NO: 59),或
SLMEQQYSV (SEQ ID NO: 60) (WO 2009/072610);和
作为RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 54)的改变的杀手肽,
RYPGVAPTL (SEQ ID NO: 61) (WO2003/106682)。
不是由SEQ ID NO: 1所示的人WT1的氨基酸序列中的连续8-35个氨基酸残基组成的部分肽的肽的氨基酸序列的实例包括以下氨基酸序列(参见WO2007/063903)。
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 47) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或
C-CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 48) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)。
本公开内容的改变的杀手肽的实例还包括多聚体肽,例如下文所示的二聚体(参见WO2014/157692):
式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),或
式(4)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)。
如本文使用的,术语例如"辅助型"或"辅助肽"意指所述肽具有激活辅助T细胞的能力。辅助T细胞的活化意指辅助T细胞帮助事件例如从B细胞产生抗体或活化杀手T细胞的功能增加,和/或辅助T细胞数量增加。肽是否是"辅助(型)"肽通常通过下文描述的测试来确定。即是说,它可通过经由方法例如流式细胞术来检测T细胞表面上的CD4确定。或者,它可通过用抗原刺激靶细胞和通过免疫染色检查是否产生抗原-特异性细胞因子例如IFN-α或IFN-γ确定。
如本文使用的,术语"MHC II类-受限的"是指肽结合MHC II类分子和诱导辅助T细胞的能力。
对应于MHC II类分子的HLA被分类为亚型,例如HLA-DR、DQ和DP。术语"MHC II类-受限的"优选地包括"HLA-DR-受限的"、"HLA-DQ-受限的"和"HLA-DP-受限的"。
因此,"MHC II类-受限的WT1肽"是能够结合MHC II类分子和体外和/或体内诱导辅助T细胞的肽。"MHC II类-受限的WT1肽"的氨基酸残基数量是7-30个,优选地14-30个。
当本公开内容中的"WT1肽或其类似物"是辅助肽时,包含通过氨基酸改变而不同于给定的氨基酸序列的改变的氨基酸序列的肽具有辅助T细胞-诱导活性。
本公开内容中包含通过氨基酸改变而不同于给定的氨基酸序列的改变的氨基酸序列并且具有辅助T细胞-诱导活性的肽也被称为"改变的辅助肽"。改变的辅助肽是由因为一至三个氨基酸缺失、置换和/或添加而不同于给定的氨基酸序列的氨基酸序列组成并且能够结合MHC II类以诱导辅助T细胞的肽。氨基酸添加(其包括插入)的数量优选地是1-3个。氨基酸缺失的数量优选地是1-5个。在这样的改变中,用于添加或置换的氨基酸可以是不同于20种由基因编码的氨基酸的非天然氨基酸。
改变的辅助肽的实例包括以下肽:
作为SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 69)的改变的辅助肽,
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 70) (WO2004/063217),
SGQARMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 71)或
SGQAYMFPNAPYLPSC (SEQ ID NO: 72);或
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 49),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 62),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 64),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 65)或
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 66);或
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 50)或
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 51)。
本公开内容的"WT1肽或其类似物"可在杀手肽和辅助肽的组合物中具有杀手型和辅助型两种活性。具有杀手型和辅助型两种活性的实例包括以下:
组合物,其包含选自以下的化合物
式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),和
式(4)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐,和
由选自以下的氨基酸序列组成的肽
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 63),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 64),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 65),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 50)和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 51)
或其药学上可接受的盐;
组合物,其包含式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)的氨基酸序列组成的肽或其药学上可接受的盐;以及
组合物,其包含式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或其药学上可接受的盐,和
由WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)的氨基酸序列组成的肽或其药学上可接受的盐。
如本文使用的,术语"佐剂"是指对主剂(例如,本公开内容的WT1肽)的辅助剂。在本公开内容中,佐剂是指增强或提高由治疗性或预防性组合物中的WT1肽诱导的免疫反应的物质。在本公开内容中,佐剂可以是例如,沉淀性佐剂,例如氢氧化钠、氢氧化铝、磷酸钙、磷酸铝、明矾、Pepesu或羧乙烯基聚合物,或油佐剂,例如液体石蜡、羊毛脂、Freund、Montanide ISA763AVG、Montanide ISA51、不完全弗氏佐剂或完全弗氏佐剂。
如本文使用的,术语"腺瘤"是指具有变成癌性的高风险的息肉。术语"息肉"是对于在肠组织例如小肠、大肠或直肠的内壁上形成的蘑菇样或疣样隆起病变的一般术语。腺瘤是赘生性息肉,和处于变成癌症例如结肠直肠癌的高风险。
在腺瘤中,在大肠中发生的腺瘤统称为"结肠直肠腺瘤"。结肠直肠腺瘤包括遗传性结肠直肠腺瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)和非遗传性结肠直肠腺瘤。"非遗传性结肠直肠腺瘤"是指其中由于因素例如生活方式、饮食、喝酒、抽烟和压力在肠道中形成大量腺瘤的疾病,并且其特征不是APC基因中的突变并被分类为良性肿瘤。
如本文使用的,"治疗"是指停止,优选地治愈,已经发生的本公开内容中感兴趣的疾病、障碍或症状的进展。治疗效果的评价可根据"New Guidelines to Evaluate theResponse to Treatment in Solid Tumors" (RECIST) <http://www.jcog.jp/doctor/tool/C_150_0010.pdf>或其最新版本进行。根据WHO或RECIST标准的最佳反应的定义如下。
表1
最佳反应 | WHO积和变化 | RECIST最长直径和变化 |
CR | 消失;在4周确认 | 消失;在4周确认 |
PR | 50%减少;在4周确认 | 30%减少;在4周确认 |
SD | PR和PD标准都不满足 | PR和PD标准都不满足 |
PD | 25%增加;在疾病增加之前没有记录CR、PR或SD | 20%增加;在疾病增加之前没有记录CR、PR或SD |
WHO=世界卫生组织,RECIST=实体瘤反应评价标准,CR=完全反应,PR=部分反应,SD=稳定疾病,PD=进行性疾病
如本文使用的,术语"用于治疗的组合物"或"治疗性组合物(制剂)"广泛意指能够治疗感兴趣的病况(例如疾病,例如家族性腺瘤息肉病)的任何组合物。在本公开内容的一个实施方案中,"治疗性组合物"可以是包含活性成分和一种或多种药理学可接受的载体的药物组合物。药物组合物可例如通过混合活性成分与上述载体和使用制药技术领域已知的任何方法产生。此外,治疗性组合物在使用形式方面不受限制,只要其用于治疗,并且可以是单独的活性成分或活性成分和任何其它成分的混合物。载体的形式不特别受限制,并且可以是例如,固体或液体(例如,缓冲溶液)。
如本文使用的,"预防"是指在发生之前通过任何手段不导致或至少延迟本公开内容中感兴趣的疾病、障碍或症状,或即使疾病、障碍或症状的原因出现,也不从该原因产生任何功能失常。
如本文使用的,术语"用于预防的组合物"或"预防性组合物(制剂)"广泛意指能够预防感兴趣的病况(例如疾病,例如家族性腺瘤息肉病)的任何组合物。
如本文使用的,"改进"意指完全或部分停止或减轻已经发生的本公开内容中感兴趣的疾病、障碍或症状的进展。
如本文使用的,术语"受试者"是指本公开内容的预防或治疗所预期的对象(例如,生物体,例如人,或从生物体获得的物质,例如细胞、血液或血清)。
如本文使用的,术语"外周血单核细胞"或"PBMC"是指含有从外周血分离的单核细胞(monocyte)或淋巴细胞的单核(mononuclear)细胞或单核(monocytic)细胞。外周血单核细胞包括各种血细胞,例如T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突细胞。通过刺激,外周血单核细胞可分化为细胞,例如细胞毒性T细胞或辅助T细胞。
在本说明书中,例如,WT1-特异性细胞毒性T细胞和辅助T细胞分别被称为"WT1-特异性细胞毒性T细胞"和"WT1-特异性辅助T细胞"。WT1-特异性细胞毒性T细胞和/或WT1-特异性辅助T细胞可通过使用本公开内容所述的WT1肽或其类似物或编码它的核酸分子诱导。
如本文使用的,术语"不成熟的树突细胞"是指当被肽或物质例如细胞敏化时能够从所述物质呈递肽或抗原的树突细胞。通过刺激,不成熟的树突细胞可分化为呈递特异性肽的细胞,例如树突细胞。
在本说明书中,例如,呈递WT1的树突细胞被称为"呈递WT1的树突细胞"。呈递WT1的树突细胞可通过使用本公开内容所述的WT1肽或其类似物或编码它的核酸分子诱导。
诱导或激活抗原呈递细胞或杀手T细胞或辅助T细胞的方法是本领域技术人员已知的。在体内,这些细胞可通过将WT1肽给予受试者来诱导或激活。在体外,在一个实例中,杀手T细胞可通过使含有源自受试者的淋巴细胞的样品与WT1肽和HLA分子的复合物反应来获得。在另一个实例中,源自受试者的外周血单核细胞可在WT1肽的存在下培养,和WT1-特异性CTL可从外周血单核细胞诱导。在进一步的实例中,通过HLA分子呈递WT1肽的抗原呈递细胞可通过在WT1肽的存在下培养源自受试者的不成熟的抗原呈递细胞来诱导。不成熟的抗原呈递细胞是指可成熟成为抗原呈递细胞的细胞,并以不成熟的树突细胞为例。在可选的实例中,WT1肽可添加至抗原呈递细胞以激活辅助T细胞。本公开内容的药物或组合物中使用的抗原呈递细胞或杀手T细胞或辅助T细胞可以是使用WT1肽或其衍生物或核酸分子中的任何一种诱导或激活的那些。由此诱导或激活的抗原呈递细胞或杀手T细胞或辅助T细胞可给予至受试者,优选地这些细胞所获自的受试者,以治疗或预防良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)。
如本文使用的"类似物"、"衍生物"、"类似物"或"突变体" (例如WT1肽的"类似物"、"衍生物"、"类似物"或"突变体")优选地是,但不限于含有与感兴趣的蛋白(例如WT1肽)基本上同源的区域的分子。在各种实施方案中,这样的分子与在所述氨基酸序列上比对的相同大小的氨基酸序列,或与通过本领域已知的计算机同源性程序比对的氨基酸序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一性,或编码这样的分子的核酸能够与编码所述蛋白的序列在(高)严格性、中等严格性或非严格性条件下杂交。它们通过经由氨基酸置换、缺失或添加来改变蛋白而获得,并且这样的衍生物仍显示原始蛋白的生物学功能,尽管在程度上不必然相同。例如,可能通过本文所述或本领域已知的合适和可用的体外测定法来检查这样的蛋白的生物学功能。在本说明书中,关于涉及本公开内容的多肽或片段或衍生物的实施方案,如本文使用的术语"功能上有活性的"或"具有功能活性"意指多肽或片段或衍生物具有蛋白的结构功能、调节功能或生物化学功能,例如生物活性。
在本公开内容中,WT1肽的片段是含有WT1肽的区域的多肽,并且只要其在本公开内容的目标中发挥功能(例如肽疫苗),其不必然具有天然WT1肽的所有生物功能。
如本文使用的,"蛋白"、"多肽"、"寡肽"和"肽"在本文可互换使用,是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性、分支或环状的。氨基酸可以是天然或非天然的,或可以是修饰的氨基酸。该术语还可包括装配成多个多肽链的复合物的那些。该术语还包括天然或人工修饰的氨基酸聚合物。这样的修饰包括例如,二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰基化、磷酸化或任何其它操纵或修饰(例如,与标记组分缀合)。该定义还包括例如,含有氨基酸的一种或多种类似物(例如,含有非天然氨基酸)、肽样化合物(例如,拟肽)和本领域已知的其它修饰的多肽。在本说明书中,"氨基酸"是对于具有氨基和羧基的有机化合物的一般术语。当根据本公开内容的实施方案的蛋白或酶含有"特定氨基酸序列"时,氨基酸序列中的任何氨基酸可经化学修饰。此外,氨基酸序列中的任何氨基酸可形成盐或溶剂化物。此外,氨基酸序列中的任何氨基酸可以是L型或D型。甚至在这样的情况下,根据本公开内容的实施方案的蛋白被认为含有上述"特定氨基酸序列"。蛋白中含有的氨基酸在体内经历的化学修饰包括例如,N-末端修饰(例如,乙酰基化和肉豆蔻酰基化)、C-末端修饰(例如,酰胺化和添加糖基磷脂酰肌醇)和侧链修饰(例如,磷酸化和糖基化)。氨基酸可以是天然或非天然的,只要它们满足本公开内容的目标。
如本文使用的,"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸"在本文可互换使用,意指任何长度的核苷酸的聚合物。该术语还包括"寡核苷酸衍生物"或"多核苷酸衍生物"。"寡核苷酸衍生物"或"多核苷酸衍生物"是指含有核苷酸的衍生物或在核苷酸之间具有不常见的键的寡核苷酸或多核苷酸,并且这些术语可互换使用。特别地,作为这样的寡核苷酸,例如2'-O-甲基-核糖核苷酸、其中寡核苷酸的磷酸二酯键转换为硫代磷酸酯键的寡核苷酸衍生物和其中寡核苷酸的磷酸二酯键转换为N3'-P5'氨基磷酸酯键的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的核糖和磷酸二酯键转换为肽核酸键的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶替换的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶替换的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶替换的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸的胞嘧啶被吩噁嗪-修饰的胞嘧啶替换的寡核苷酸衍生物、其中DNA的核糖被2'-O-丙基核糖替换的寡核苷酸衍生物和其中寡核苷酸的核糖被2'-甲氧基乙氧基核糖替换的寡核苷酸衍生物。除非另外指明,给定的核酸序列意图不仅包括明确指定的序列,而且包括通过保守修饰(例如,简并密码子置换)的变体和互补序列。特别地,通过简并密码子置换的变体可通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换的序列实现(Batzer等, Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka等,J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini等, Mol. Cell. Probes 8: 91-98(1994))。如本文使用的,术语"核酸"还与术语基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。如本文使用的,"核苷酸"可以是天然或非天然的。
如本文使用的,术语"基因"是指限定遗传特性的因子,并且可以指"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸"。
在本说明书中,基因的"同源性"意指两个或更多个基因序列彼此的同一性程度,并且通常,具有"同源性"意指具有高度的同一性或相似性。因此,两个基因的同源性越高,这些序列的同一性或相似性越高。两个基因是否同源可通过直接序列比较,或者在核酸的情况下,通过在严格性条件下杂交来检查。当直接比较两个基因序列时,当DNA序列彼此通常具有至少50%同一性,优选地至少70%同一性和更优选地至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性时,基因是同源的。因此,如本文使用的,"同源物"或"同源基因产物"是指另一物种、优选地哺乳动物、更优选地人的蛋白,其发挥与本文进一步描述的复合物的蛋白组分相同的生物功能。这样的同源物有时也被称为"直系同源基因产物"。应理解,这样的同源物、同源基因产物和直系同源基因产物也可使用,只要它们满足本公开内容的目标。
氨基酸在本文中可通过它们通常已知的由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号而被提及。核苷酸也可通过公知的单字母代码而被提及。在本说明书中,氨基酸序列或核苷酸序列的相似性、同一性或同源性的比较通过BLAST (一种用于序列分析的工具)使用默认参数计算。同一性检索可使用例如NCBI的BLAST 2.7.1(2017.10.19发布)进行。在本说明书中"同一性"的值通常是指当使用上述BLAST和在默认条件下比对序列时的值。然而,如果当改变参数时获得更高的值,则最高值被设定为同一性值。当在多个区域中评价同一性时,在它们中的最高值被设定为其同一性值。"相似性"是除了同一性之外还考虑相似氨基酸的数值。
在本公开内容的一个实施方案中,"几个"可以是例如,10、8、6、5、4、3或2个,或少于任何这些值。已知其中一个或几个氨基酸残基已被缺失、添加或插入,或被不同的氨基酸替换的多肽保持其生物活性(Mark等, Proc Natl Acad Sci USA. 1984 Sep; 81 (18):5662-5666., Zoller等, Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25; 10 (20): 6487-6500.,Wang等, Science 1984 Jun 29; 224 (4656): 1431-1433.)。这样的改变的蛋白可例如通过定点诱变、随机诱变或使用蛋白噬菌体文库的生物淘选制备。对于定点诱变,可使用例如KOD-Plus-诱变试剂盒(TOYOBO CO., LTD.)。从这样的具有改变例如缺失的突变体蛋白,具有与其野生型蛋白相同的活性的蛋白可通过各种表征法例如FACS分析和ELISA中的任何一种来选择。
在本公开内容的一个实施方案中,显示特征例如同一性的数值"70%或更多"可以是例如70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多或100%,并且可在任何两个所提及的数值作为起点的范围内。上述"同一性"是根据上述已知方法计算的在两个或多个氨基酸序列之间相同氨基酸数量的比例。特别地,在计算比例之前,将要比较的氨基酸序列比对,和如果需要最大化相同氨基酸的比例,将空位引入一部分氨基酸序列中。用于比对、计算比例和比较的方法以及相关的计算机程序是本领域众所周知的(例如,上述的BLAST)。如本文使用的,"同一性"和"相似性"可表示为通过NCBI BLAST测量的值,除非另外指明。当在BLAST中比较氨基酸序列时,Blastp可以对于算法的默认设置使用。测量结果作为正值或同一性被量化。
如本文使用的,术语"在严格性条件下杂交的多核苷酸"是指在本领域常用的严格性的众所周知的条件下杂交的多核苷酸。这样的多核苷酸可通过方法,例如使用选自本公开内容的多核苷酸的多核苷酸作为探针的集落杂交、噬菌斑杂交或DNA印迹杂交获得。特别地,这样的多核苷酸可以是通过用源自集落或噬菌斑的DNA固定于其上的滤膜在65℃下在0.7-1.0 M NaCl的存在下进行杂交,然后在65℃下用0.1-2倍SSC (盐水-柠檬酸钠)溶液(1倍SSC溶液的组成是150 mM氯化钠和15 mM柠檬酸钠)洗涤滤膜可鉴定的多核苷酸。"严格性条件"可以是例如以下条件中的任何一种:(1) 使用低离子强度和高温度用于洗涤(例如,在50℃下,用0.015 M氯化钠/0.0015 M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠),(2) 在杂交期间使用变性剂例如甲酰胺(例如,在42℃下用50%(v/v)甲酰胺和0.1%牛血清白蛋白/0.1%ficol/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50 mM磷酸钠缓冲液(pH6.5),和750 mM氯化钠和75 mM柠檬酸钠),或(3) 在37℃下在含有20%甲酰胺、5 × SSC、50 mM磷酸钠(pH7.6)、5 × Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20 mg/ml变性的剪切鲑鱼精DNA的溶液中孵育过夜,然后用1 × SSC在约37-50℃下洗涤滤膜。甲酰胺浓度可以是50%或更多。洗涤时间可以持续5、15、30、60或120分钟或更久。可考虑多种因素,例如温度和盐浓度以影响杂交反应的严格性。对于细节,参见Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley IntersciencePublishers, (1995)。"高度严格性条件"的实例是在65-68℃下0.0015M氯化钠和0.0015 M柠檬酸钠,或在42℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50%甲酰胺。杂交可根据描述于Molecular Cloning 2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition,Oxford University Press (1995)中的方案进行。仅含有A或T的序列优选地从在严格性条件下杂交的序列排除。中等严格性条件可例如根据DNA长度,由本领域普通技术人员容易确定,并且参见Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, No. 3, Vol. 1,7.42-7.45 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001,并且关于硝酸纤维素滤膜,包括杂交条件,例如5 × SSC、0.5% SDS和1.0 mM EDTA (pH8.0)的预洗涤溶液和在约40-50℃下用50%甲酰胺和2 x SSC-6 × SSC (或类似的杂交溶液,例如在约42℃下在约50%甲酰胺中的Stark溶液),和在约60℃下用0.5 × SSC和0.1% SDS的洗涤条件。因此,用于本公开内容的多肽还包括由核酸分子编码的多肽,所述核酸分子在高度或中等严格性条件下与编码本文特别描述的多肽的核酸分子杂交。
本公开内容的WT1肽可优选地是"纯化的"或"分离的"。如本文使用的,"纯化的"物质或生物因子(例如,核酸或蛋白)是这样的物质或生物因子,其中在自然中与所述物质或生物因子有关的至少一些因子已被除去。因此,纯化的生物因子通常具有比正常状态的生物因子更高的纯度(即,生物因子被富集)。如本文使用的术语"纯化的"意指生物因子以优选地至少75%重量、更优选地至少85%重量、甚至更优选地至少95%重量和最优选地至少98%重量存在。本公开内容使用的物质或生物因子优选地是"纯化的"物质。如本文使用的,"分离的"物质或生物因子(例如,核酸或蛋白)是这样的物质或生物因子,其中在自然中与所述物质或生物因子有关的因子已基本上被除去。如本文使用的术语"分离的"可根据其目的而具有不同含义,因此不必然以纯度表示,而是如果需要,意指生物因子以优选地至少75%重量、更优选地至少85%重量、甚至更优选地至少95%重量和最优选地至少98%重量存在。本公开内容使用的物质优选地是"分离的"物质或生物因子。
如本文使用的,术语"片段"是指相对于全长多肽或多核苷酸(长度n),具有1至n-1的序列长度的多肽或多核苷酸。片段长度可根据其目的而合适地改变。例如,在多肽的情况下,氨基酸长度的下限是3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或更多,和此处没有特别列出的整数表示的任何长度(例如,11)也可以是合适的下限。此外,在多核苷酸的情况下,核苷酸长度的下限是5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100或更多,和此处没有特别列出的整数表示的任何长度(例如,11)也可以是合适的下限。如本文使用的,应理解这样的片段落入本公开内容的范围内,例如,当全长用作癌症疫苗并且片段也是如此时。
如本文使用的,当提及基因或核酸分子或与其有关的多肽时,术语"生物功能"是指基因、核酸分子或多肽在体内或体外可具有的特定功能,并且这可包括但不限于杀手T细胞或辅助T细胞的活化。如本文使用的,可通过相应的"生物活性"发挥生物功能。如本文使用的,术语"生物活性"是指因子(例如,多核苷酸或蛋白)可具有的活性,和包括发挥各种功能中的任一种(例如,杀手T细胞或辅助T细胞的活化)的不同活性。"生物活性"可以是在体内发挥的活性或由于事件例如分泌而在体外发挥的活性。例如,如果因子是酶,其生物活性包括其酶促活性。这样的生物活性可通过本领域众所周知的技术测量。因此,"活性"可以是各种可测量的指标中的任何一种,所述指标指示或揭示(直接或间接的)结合;或影响任何反应(即,在响应一些暴露或刺激时具有可测量的效果),并包括直接结合本公开内容的多肽或多核苷酸的化合物的亲和力,以及上游或下游蛋白的量或在例如一些刺激或事件后的其它类似功能度量。
如本文使用的,术语分子例如基因、多核苷酸或多肽的"表达"意指所述分子经历某种体内作用以呈现另一种形式。优选地,术语"表达"意指分子例如基因或多核苷酸被转录和翻译成多肽形式,但其也可意指所述分子被转录以产生mRNA。因此,如本文使用的,"表达产物"包括这样的多肽或蛋白,或mRNA。更优选地,这样的多肽的形式可经过翻译后加工。例如,WT1的表达水平可通过任何方法测定。特别地,WT1的表达水平可通过评价WT1 mRNA的量、WT1蛋白的量和WT1蛋白的生物活性而知道。WT1 mRNA或蛋白的量可通过本文其他地方详述的方法或通过本领域已知的其它方法测定。
如本文使用的,术语"功能等同物"是指具有与初始实体相同的目的功能但不同的结构的任何实体。因此,应理解,本公开内容的"WT1肽"的功能等同物包括不具有与SEQ IDNO: 1相同的序列但作为其突变体或变体(例如,氨基酸序列变体)的那些,所述突变体或变体具有WT1肽的生物作用,以及在作用时可转化为具有WT1肽的生物作用的突变体或变体的那些(包括编码突变体或变体的核酸和含有这样的核酸的载体或细胞)。应理解,在本公开内容中WT1肽的功能等同物可以与WT1肽相同的方式使用,即使没有特别提及。功能等同物可通过检索数据库或其它来源发现。如本文使用的,术语"检索"是指通过利用一个核酸序列,经过电子、生物学或通过一些其它方法,发现具有特定功能和/或性质的不同核酸序列。电子检索包括BLAST (Altschul等, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))、FASTA(Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85: 2444-2448 (1988))、Smith和Waterman方法(Smith和Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195-197 (1981))和Needleman和Wunsch方法(Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)),但不限于此。生物学检索包括严格杂交、基因组DNA连接至尼龙膜或玻璃板的微阵列(微阵列测定法)、PCR和原位杂交,但不限于此。在本说明书中,意图本公开内容使用的基因应该还包括通过这样的电子或生物检索鉴定的相应基因。
本公开内容的功能等同物可以是因为一个或多个氨基酸被插入氨基酸序列中、在氨基酸序列中置换或缺失、或添加到氨基酸序列的一个或两个末端,不同于原始氨基酸序列的氨基酸序列。在本说明书中,表述"一个或几个氨基酸被插入氨基酸序列中、在氨基酸序列中置换或缺失、或添加到氨基酸序列的一个或两个末端"意指一个或多个可天然存在的氨基酸的改变、例如置换在氨基酸序列中通过众所周知的技术例如定点诱变或通过自然突变进行。改变的氨基酸序列可以是因为1-4、优选地1-3、特别优选地1-2或1个氨基酸被插入氨基酸序列中、在氨基酸序列中置换和/或缺失、或添加到氨基酸序列的一个或两个末端,不同于原始氨基酸序列的氨基酸序列。改变的氨基酸序列可优选地是因为其具有一个或多个氨基酸(优选地一个或几个或1、2、3或4个氨基酸)的保守置换,不同于SEQ ID NO:1-5的任何一个的氨基酸序列的氨基酸序列。如本文使用的,术语"保守置换"是指用不同但化学类似的氨基酸残基置换一个或多个氨基酸残基,以致于基本上不改变蛋白的功能。例如,一个疏水残基可被另一个疏水残基替换,和一个极性残基可被另一个具有相同电荷的极性残基替换。对于各氨基酸,能够进行这样的置换的功能相似的氨基酸是本领域已知的。特别地,非极性(疏水)氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。极性(中性)氨基酸的实例包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。带正电荷(碱性)氨基酸的实例包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸。此外,带负电荷(酸性)氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。
(WT1肽)
在本公开内容中,WT1肽可以是源自诱导细胞毒性T细胞或辅助T细胞的活化的WT1蛋白的肽。WT1蛋白的实例包括诱导细胞毒性T细胞的活化的WT1杀手肽和诱导辅助T细胞的活化的WT1辅助肽。WT1杀手肽的实例包括由源自WT1蛋白的8-12个氨基酸、优选地8-9个氨基酸组成的肽。特别优选地,WT1杀手肽是WT1126肽:Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro TyrLeu (SEQ ID NO: 2),WT1235肽:Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3)或式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),其是WT1126肽和WT1235肽的缀合物。WT1辅助肽的实例包括由源自WT1蛋白的14-20个氨基酸、优选地16-18个氨基酸组成的肽。特别优选地,WT1辅助肽是WT135肽(Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro ProGly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu; SEQ ID NO: 4)或WT1332肽(Lys Arg Tyr Phe LysLeu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His) (SEQ ID NO: 5)。因为一个或几个氨基酸缺失、置换或添加而不同于WT1肽的变体肽也可用作本公开内容的WT1肽。这样的变体肽的实例包括WT1126肽的变体肽、WT1235肽的变体肽、WT135肽的变体肽和WT1332肽的变体肽。
WT1126肽的优选的变体肽是其中从N-末端开始的位置4-8的氨基酸残基与从WT1126肽的N-末端开始的位置4-8 (PNAPY)相同的肽。WT1126肽的这样的变体肽优选地是由SEQ IDNO: 6-44的任何一个的氨基酸序列组成的肽:
WT1126P1G肽(GMFPNAPYL; SEQ ID NO: 6)
WT1126P1A肽(AMFPNAPYL; SEQ ID NO: 7)
WT1126P1V肽(VMFPNAPYL; SEQ ID NO: 8)
WT1126P1L肽(LMFPNAPYL; SEQ ID NO: 9)
WT1126P1I肽(IMFPNAPYL; SEQ ID NO: 10)
WT1126P1M肽(MMFPNAPYL; SEQ ID NO: 11)
WT1126P1W肽(WMFPNAPYL; SEQ ID NO: 12)
WT1126P1F肽(FMFPNAPYL; SEQ ID NO: 13)
WT1126P1Y肽(YMFPNAPYL; SEQ ID NO: 14)
WT1126P2V肽(RVFPNAPYL; SEQ ID NO: 15)
WT1126P2Q肽(RQFPNAPYL; SEQ ID NO: 16)
WT1126P2A肽(RAFPNAPYL; SEQ ID NO: 17)
WT1126P2L肽(RLFPNAPYL; SEQ ID NO: 18)
WT1126P2I肽(RIFPNAPYL; SEQ ID NO: 19)
WT1126P3I肽(RMIPNAPYL; SEQ ID NO: 20)
WT1126P3L肽(RMLPNAPYL; SEQ ID NO: 21)
WT1126P3G肽(RMGPNAPYL; SEQ ID NO: 22)
WT1126P3A肽(RMAPNAPYL; SEQ ID NO: 23)
WT1126P3V肽(RMVPNAPYL; SEQ ID NO: 24)
WT1126P3M肽(RMMPNAPYL; SEQ ID NO: 25)
WT1126P3P肽(RMPPNAPYL; SEQ ID NO: 26)
WT1126P3W肽(RMWPNAPYL; SEQ ID NO: 27)
WT1126P9V肽(RMFPNAPYV; SEQ ID NO: 28)
WT1126P9A肽(RMFPNAPYA; SEQ ID NO: 29)
WT1126P9I肽(RMFPNAPYI; SEQ ID NO: 30)
WT1126P9M肽(RMFPNAPYM; SEQ ID NO: 31)
WT1126P1D肽(DMFPNAPYL; SEQ ID NO: 32)
WT1126P1E肽(EMFPNAPYL; SEQ ID NO: 33)
WT1126P1H肽(HMFPNAPYL; SEQ ID NO: 34)
WT1126P1K肽(KMFPNAPYL; SEQ ID NO: 35)
WT1126P1N肽(NMFPNAPYL; SEQ ID NO: 36)
WT1126P1P肽(PMFPNAPYL; SEQ ID NO: 37)
WT1126P1Q肽(QMFPNAPYL; SEQ ID NO: 38)
WT1126P1S肽(SMFPNAPYL; SEQ ID NO: 39)
WT1126P1T肽(TMFPNAPYL; SEQ ID NO: 40)
WT1126P2I & P9I肽(RIFPNAPYI; SEQ ID NO: 41)
WT1126P2I & P9V肽(RIFPNAPYV; SEQ ID NO: 42)
WT1126P2L & P9I肽(RLFPNAPYI; SEQ ID NO: 43)和
WT1126P2L & P9V肽(RLFPNAPYV; SEQ ID NO: 44)。
WT1235肽的变体肽的实例包括包含WT1235: Cys Met Thr Trp Asn Gln Met AsnLeu (SEQ ID NO: 3)或WT1235m: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO:45)或由其组成的肽、包含SEQ ID NO: 3或45的氨基酸序列或由其组成的肽的二聚体、包含SEQ ID NO: 3或45的氨基酸序列或由其组成的肽的胱氨酸形式,和包含因为一个或几个氨基酸在上述氨基酸序列中被置换、缺失或添加而不同于上述氨基酸序列的氨基酸序列或由其组成的肽,但不限于此。在WT1235肽的变体肽中,WT1235m肽是特别优选的,这是因为它是-受限的WT1肽,而是在日本人中最丰富的HLA类型,并且它具有比野生型WT1235肽更高的治疗功效和优秀的水溶性。
这些变体肽的实例包括以下。
Cys-Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 47) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)或Cys-Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO: 48) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)在物理化学性质和稳定性方面特别优秀,这是因为N-末端半胱氨酸残基的硫醇基团被修饰(参见WO2007/063903)。
从覆盖宽范围的HLA亚型的角度,该实施方案中WT1肽的变体肽优选地含有对应于不同的HLA亚型的多种肽。例如,其优选地含有对应于HLA-A2亚型的肽或其药学上可接受的盐和对应于HLA-A24亚型的肽或其药学上可接受的盐二者。在这样的情况下,例如,药物组合物可包含式(1)的化合物:
[其中Xa和Ya独立地表示单键,肿瘤抗原肽A表示由选自以下的氨基酸序列组成的肽:RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2)、ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 52)、SLGEQQYSV (SEQ ID NO:53)、RVPGVAPTL (SEQ ID NO:7)、YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 14)和VLDFAPPGA (SEQ ID NO:68),和肿瘤抗原肽A的C-末端氨基酸的羰基结合式(2)中的羟基,
R1是氢或肿瘤抗原肽B,和
肿瘤抗原肽B表示具有与肿瘤抗原肽A不同的氨基酸序列并且由选自以下的氨基酸序列组成的肽:CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3)和CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 45),和肿瘤抗原肽B的半胱氨酸残基的硫醚基团结合式(1)中的硫醚基团]
或其药学上可接受的盐。
由上式(1)表示的化合物具有在溶液中针对氧化剂的优秀稳定性(这是由于半胱氨酸残基形成二硫键),和具有作为药物产品的原料的稳定质量。
此外,当在该实施方案中WT1肽的变体肽包含由式(1)表示的化合物(WT1杀手肽的缀合物)时,缀合物通过体内ERAP1导致的N-末端半胱氨酸残基之间的二硫键的还原性切割而降解,并产生两个表位,对应于不同的HLA亚型。体内产生对应于不同HLA亚型的多个表位的缀合物,例如由式(1)表示的缀合物,可广泛应对根据受试者变化的不同HLA亚型,并且可由单一缀合物覆盖大的群体,因此可在受试者中有效诱导CTL (参见WO 2014/157692,其通过引用以其整体结合到本文中)。
在该实施方案中"肿瘤抗原肽A"是由7-30个氨基酸残基组成的MHC I类-受限的WT1肽。在式(1)中的肿瘤抗原肽A中,N-末端氨基酸结合式(1)中的Ya,和C-末端氨基酸的羰基结合式(1)中的羟基。
由式(1)表示的化合物可以是
式(2)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起);
式(3)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起);或
式(4)的化合物:
(其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起)。
WT135肽的变体肽可以是任何肽,只要它具有因为一个或几个氨基酸被置换或缺失或添加而不同于SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的氨基酸序列。
WT1332肽的变体肽可以是任何肽,只要它具有因为一个或几个氨基酸被置换或缺失或添加而不同于SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的氨基酸序列。在优选的实施方案中,WT1332肽的变体肽优选地是由因为位置3、6、8和/或11的氨基酸残基被选自以下的氨基酸残基置换而不同于SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽
位置3:苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸,
位置6:缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸,
位置8:天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬氨酸
位置11:天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。
在它们中,WT1126肽的变体肽优选地是WT1126 P1F肽(SEQ ID NO: 13)、WT1126 P2L肽(SEQ ID NO: 18)、WT1126 P3M肽(SEQ ID NO: 25)或WT1126 P9V肽(SEQ ID NO: 28),更优选地WT1126 P2L肽、WT1126 P3M肽或WT1126 P9V肽,和甚至更优选地WT1126 P9V肽。
本公开内容的预防性或治疗性组合物中的WT1肽优选地是WT1126肽、WT1126 P1F肽、WT1126 P2L肽、WT1126 P3M肽或WT1126 P9V肽。更优选地,WT1肽是WT1126肽、WT1126 P2L肽、WT1126 P3M肽或WT1126 P9V肽,甚至更优选地WT1126肽或WT1126 P9V肽,和特别优选地WT1126肽。
WT1肽也可以是WT1肽的衍生物。WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽的衍生物的实例包括各种物质中的任一种连接到由9、16或18个连续氨基酸组成的氨基酸序列的N-和C-末端的一者或二者的那些。例如,氨基酸、肽或其类似物可连接。不受理论的约束,当这样的物质连接至WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽或其变体肽时,所述物质例如通过体内酶或通过方法例如细胞内加工而被加工,最终提供了由9、16或18个氨基酸组成的肽,其可被呈递到细胞表面上,以诱导WT1-特异性CTL反应。
该实施方案中的WT1肽或其类似物可进一步包含WT1辅助肽。当该实施方案中的WT1肽或其类似物进一步包含包含选自CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO: 63)、CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO: 64)、CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 65)、WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4)、CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 66)和WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 51)的氨基酸序列的肽时,它可进一步包含包含另一个选自上述组的氨基酸序列和/或任何其它WT1辅助肽的肽。
WT1肽可通过本领域常用的方法制备。例如,肽可通过文献中描述的方法合成,例如Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2,Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide synthesis, Maruzen Co., LTD.,1975; Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., LTD., 1985;或者Development of Pharmaceutical Product subsequent vol. 14, PeptideSynthesis, Hirokawa Shoten, 1991。
这样的WT1肽和变体肽的筛选可优选地通过一次用每种候选肽刺激一些具有良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的患者的PBMC (外周血单核细胞),和选择显示在IFN-γ测定(因为这是简单的方法)中良好反应的候选肽进行。
在本公开内容中,编码上述WT1蛋白或WT1肽的多核苷酸例如DNA或RNA也可用作预防性或治疗性组合物的活性成分。即是说,癌症免疫可通过插入编码WT1蛋白或WT1肽的多核苷酸到合适的载体,优选地表达载体,然后将载体给予动物(包括人)在体内产生。多核苷酸的实例包括DNA和RNA,并且多核苷酸优选地是DNA或RNA。多核苷酸的核苷酸序列可基于对具有良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的患者具有免疫原性的WT1蛋白或WT1肽的氨基酸序列确定。多核苷酸可通过用于DNA或RNA合成的已知方法或例如使用PCR的方法产生。包含编码WT1蛋白或WT1肽的DNA的预防性或治疗性组合物也是本公开内容的一方面。WT1蛋白或WT1肽优选地是WT1肽,更优选地WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽,或其变体肽,或其组合,甚至更优选地WT1126肽、WT1235肽或WT135肽,或其变体肽,或其组合,和最优选地,式(3)的化合物(WT1126肽和WT1235肽的缀合物)和WT135肽的组合。DNA可插入任何表达载体中。RNA本身在没有插入载体中的情况下,也可用作组合物的活性成分。
本公开内容的预防性或治疗性组合物可含有佐剂。佐剂可以是任何物质,只要当其与抗原一起或甚至分开给予时,它非特异性地增强对用作抗原的WT1蛋白或WT1肽的免疫反应。佐剂的实例包括沉淀性佐剂和油基佐剂。沉淀性佐剂包括例如,氢氧化钠、氢氧化铝、磷酸钙、磷酸铝、明矾、Pepesu和羧乙烯基聚合物。油基佐剂优选地是其中油可包裹水性抗原溶液以形成胶束的佐剂,和其特定实例包括液体石蜡、羊毛脂、Freund、MontanideISA763AVG、Montanide ISA51、不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。佐剂也可以是两种或更多种的混合物。优选地,佐剂是油基佐剂。在本公开内容的预防性或治疗性组合物中佐剂的量不特别受到限制,只要它是非特异性地增强对抗原的免疫反应的量,和可根据佐剂类型和其它因素而合适地选择。
本公开内容的预防性或治疗性组合物可通过口服给予或胃肠外给予,例如腹膜内给予、皮下给予、皮内给予、肌内给予、静脉内给予或鼻内给予来施用。胃肠外给予包括通过施加预防性或治疗性组合物至皮肤,或通过添加预防性或治疗性组合物至贴剂并将其附接到皮肤,经皮吸收活性成分WT1蛋白或WT1肽。本公开内容的预防性或治疗性组合物也可通过其它给予方法来施用,包括吸入。优选地,预防性或治疗性组合物通过胃肠外给予来施用。更优选地,预防性或治疗性组合物通过皮内给予或皮下给予来施用。用于皮内给予或皮下给予的身体部分的优选实例包括上臂。
本公开内容的预防性或治疗性组合物可呈各种制剂形式中的任一种,例如固体制剂或液体制剂,取决于其给予途径。例如,预防性或治疗性组合物可以是用于口服给予的内用固体或液体制剂或用于胃肠外给予的注射制剂。
用于口服给予的内用固体制剂的实例包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂和颗粒剂。
内用固体制剂可根据常规方法制备,和WT1蛋白或WT1肽按原样使用,或用添加剂混合或造粒(例如,通过搅拌造粒、流化床造粒、干法造粒或滚动搅拌流化床造粒)。例如,胶囊剂可通过填充胶囊制备,和片剂可通过压片来制备。一种或多种添加剂可合适地共混。添加剂的实例包括例如,赋形剂,例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、玉米淀粉;粘合剂,例如羟基丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、偏硅酸铝镁;分散剂,例如玉米淀粉;崩解剂,例如羧甲基纤维素钙;润滑剂,例如硬脂酸镁;增溶剂,例如谷氨酸和天冬氨酸;稳定剂;纤维素,例如羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素和甲基纤维素,和水溶性聚合物,包括合成聚合物,例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇;和甜味剂,例如白糖、糖粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖、还原型麦芽糖淀粉糖浆、粉状还原型麦芽糖淀粉糖浆、葡萄糖果糖糖浆、果糖葡萄糖糖浆、蜂蜜、山梨醇、麦芽糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、阿斯巴甜、糖精或糖精钠。
如果需要的话,颗粒剂或片剂可例如用包衣剂包衣,和包衣可以是两个或更多个层。包衣剂的实例包括白糖、明胶、羟基丙基纤维素和邻苯二甲酸羟基丙基甲基纤维素。胶囊剂可如下制备:合适选择任何上述赋形剂和均匀混合普仑司特水合物和选择的赋形剂,并填充从混合物制备的混合物或颗粒(含或不含合适的包衣)至胶囊,或将其包封在由于添加增塑剂例如甘油或山梨醇至合适的胶囊基质(例如明胶)而具有增加的可塑性的胶囊基质中。如果需要的话,可向胶囊基质中加入着色剂或防腐剂(二氧化硫;对羟基苯甲酸酯类,例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯)。胶囊剂包括硬胶囊剂或软胶囊剂。
用于口服给予的内用液体制剂的实例包括液体剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、使用前溶解的制剂例如干糖浆剂、和酏剂。对于这样的内用液体制剂,将WT1蛋白或WT1肽溶解、悬浮或乳化在内用液体制剂中常用的稀释剂中。稀释剂的实例包括纯化水、乙醇或其混合物。该液体制剂还可含有湿润剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、矫味剂、香料、防腐剂和缓冲剂中的任何一种。干糖浆可例如通过混合普仑司特水合物与白糖、糖粉、蔗糖、果糖、葡萄糖或乳糖制备。干糖浆可根据常规方法制成颗粒。
用于胃肠外给予的剂型包括注射剂、软膏剂、凝胶剂、霜剂、贴剂、气雾剂和喷雾剂,但优选地是注射剂。例如,优选使用WT1蛋白或WT1肽和常规载体制备注射剂。
用于胃肠外给予的注射剂可以是水性注射剂或油注射剂。水性注射剂可例如通过混合WT1蛋白或WT1肽与根据已知的方法通过合适添加药学可接受的添加剂到水性溶剂(例如注射用水或纯化水)获得的溶液,用无菌滤器过滤混合物,然后在无菌容器中填入无菌混合物制备。药学可接受的添加剂的实例包括例如,上述佐剂;等渗剂,例如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、葡萄糖和丙二醇;缓冲液,例如磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液、谷氨酸盐缓冲液和ε氨基己酸缓冲液;防腐剂,例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、苯扎氯铵、脱氢醋酸钠、依地酸钠、硼酸和硼砂;增稠剂,例如羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、聚乙烯醇和聚乙二醇;稳定剂,例如亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸和二丁基羟基甲苯;pH调节剂,例如盐酸、氢氧化钠、磷酸和乙酸。注射剂可含有任何一种合适的增溶剂,例如醇,例如乙醇;多元醇,例如丙二醇和聚乙二醇;和非离子表面活性剂,例如聚山梨醇酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油50、溶血卵磷脂和普卢兰尼克多元醇类。注射剂可进一步含有任何一种蛋白,例如牛血清白蛋白和钥孔䗩血蓝蛋白;和多糖,例如氨基葡聚糖。为了制备油基注射剂,可使用油基溶剂,例如芝麻油或大豆油,和可添加增溶剂,例如苯甲酸苯甲酯或苯甲醇。制备的注射溶液通常装入合适的容器中,例如安瓿或小瓶。液体制剂,例如用于注射的液体制剂,可在冷冻状态下或在通过冻干除去水后储存。冻干制剂在使用前通过添加注射用蒸馏水复溶。
此外,本公开内容的预防性或治疗性组合物可呈这样的形式,其中如果需要,WT1蛋白或WT1肽在脂质体中与多糖和/或将要掺入癌症疫苗组合物的任何其它组分混合。
本公开内容的预防性或治疗性组合物的剂量根据将使用的WT1蛋白或WT1肽或DNA和因素例如患者的年龄和体重或将要治疗的疾病而改变,并且在包含WT1肽例如WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽的疫苗组合物的情况下,例如WT1肽的量优选地是约0.1 μg至1mg/kg体重/天。WT1肽的剂量通常是0.0001 mg至1000 mg,优选地0.01 mg至1000 mg,更优选地0.1 mg至10 mg,并且该量优选地每几天至几个月给予一次。
此外,本公开内容的预防性或治疗性组合物可如下给予:从具有良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的患者的外周血收集PBMC,从外周血获得树突细胞,用预防性或治疗性组合物中作为其活性成分包含的肽例如WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽或多核苷酸例如DNA或RNA脉冲细胞,和通过皮下给予或任何其它给予方法将细胞返回到患者。用试剂例如WT1肽脉冲树突细胞的条件不特别受到限制,只要显示本公开内容的效果,和可采用任何常用的条件。
当编码WT1蛋白或WT1肽的核酸分子用于预防性或治疗性组合物中时,优选给予预防性或治疗性组合物,使得核酸分子被引入具有良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的患者的树突细胞中。核酸分子可通过例如,如上所述从具有良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的患者获得树突细胞和通过使用电脉冲将核酸分子引入树突细胞中,被引入具有良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的患者的树突细胞中。由于从引入树突细胞的核酸分子表达的WT1蛋白或WT1肽被呈递在树突细胞的表面上,将用核酸分子脉冲的树突细胞返回良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的患者体内可在活体内迅速诱导癌症免疫。通过引入编码WT1蛋白或WT1肽的核酸分子至受试者的树突细胞中来治疗或预防癌症的这种方法是本公开内容的优选实施方案之一。在上述实施方案中,核酸分子可以是DNA或RNA,和优选地RNA。
本公开内容的另一方面涉及诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞的方法,包括在WT1蛋白或WT1肽的存在下培养源自受试者的外周血单核细胞,或将编码WT1蛋白或WT1肽的核酸分子引入这样的外周血单核细胞中,从而从外周单核细胞诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。外周血单核细胞所来源的受试者不特别受到限制。WT1蛋白或WT1肽可以是WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽,或其变体肽,并且优选WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽。例如,当源自受试者的外周血单核细胞在WT1126肽或WT1235肽的存在下培养时,WT1-特异性CTL从外周血单核细胞中CTL的前体细胞诱导。当源自受试者的外周血单核细胞在WT135肽或WT1332肽的存在下培养时,WT1-特异性辅助T细胞从外周血单核细胞中辅助T细胞的前体细胞诱导。对于源自受试者的外周血单核细胞的培养条件不特别受到限制,并且细胞可在任何常用条件下培养。由此获得的CTL和辅助T细胞分别识别WT1126肽、WT1235肽、WT135肽和WT1332肽。因此,通过本公开内容诱导的WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞可特别用于破坏高表达WT1的肿瘤细胞和治疗和/或预防目标良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)。用于给予WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞至受试者的方法不特别受到限制,并且细胞可例如以与上述预防性或治疗性组合物相同的方式给予。
本公开内容的另一方面涉及用于诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞的试剂盒,包含WT1蛋白或WT1肽作为基本组分。优选地,试剂盒用于如上所述从受试者诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞的方法中。除了WT1蛋白或WT1肽之外,这样的试剂盒还可包含任何其它组分,例如用于获得外周血单核细胞的工具、佐剂或反应容器。使用该试剂盒,有可能有效诱导识别癌症抗原例如WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽的WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
在又一个实施方案中,本公开内容涉及诱导呈递WT1蛋白或WT1肽的树突细胞的方法,包括在WT1蛋白或WT1肽的存在下培养源自受试者的不成熟的树突细胞,或将编码WT1蛋白或WT1肽的核酸分子引入这样的不成熟的树突细胞中,从而从不成熟的树突细胞诱导呈递WT1蛋白或WT1肽的树突细胞。WT1蛋白或WT1肽可以是WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽或其变体肽,并且优选是WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽。编码WT1蛋白或WT1肽的核酸分子可以是编码WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽或其变体肽的核酸分子,并且优选是编码WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽的核酸分子。核酸分子可以是DNA或RNA,并且优选是RNA。不成熟的树突细胞所来源的受试者不特别受到限制。由于不成熟的树突细胞包含在细胞例如外周血单核细胞中,这样的细胞可在WT1126肽、WT1235肽、WT135肽或WT1332肽的存在下培养。当由此获得的树突细胞给予受试者时,上述WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞被有效诱导,从而受试者的良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)可得到治疗和/或预防。给予树突细胞至受试者的方法不特别受到限制,并且细胞可以例如与上述预防性或治疗性组合物相同的方式给予。
(优选的实施方案)
本公开内容的优选的实施方案在下文描述。应理解,下文提供的实施方案为更好理解本公开内容而提供,并且本公开内容的范围不应限于以下描述。因此,明显的是,本领域技术人员根据本说明书中的描述可在本公开内容的范围内进行合适的修改。还应理解,本公开内容的以下实施方案可单独或组合使用。
此外,所有下述实施方案是综合或具体实例。在以下实施方案中数值、形状、材料、组分、步骤、步骤顺序或其它描述是实例,而不意图限制权利要求的范围。此外,在以下实施方案的组分中,在指示最宽构思的独立权利要求中没有描述的组分作为任选组分而描述。
(预防性或治疗性组合物)
在一个方面,本公开内容提供了用于预防或治疗良性肿瘤的组合物(预防性或治疗性组合物),其包含WT1肽或其类似物。WT1已显示在恶性肿瘤的癌症细胞中高度表达,但其在良性肿瘤中的表达是未知的。本公开内容基于令人惊讶的发现,即WT1蛋白在良性肿瘤的细胞中表达和提供了良性肿瘤的新治疗方式。
在一个实施方案中,本公开内容的良性肿瘤表达WT1。不受理论的约束,本公开内容的WT1肽用作癌症抗原并增强CTL的细胞毒性活性和/或辅助T细胞的活性,从而对良性肿瘤的细胞引起细胞毒性,并且由于其活性,本公开内容的WT1肽疫苗具有针对表达WT1的良性肿瘤的治疗效果。WT1蛋白的表达不限于特定良性肿瘤,而是在各种遗传性和非遗传性良性肿瘤中观察到。因此,WT1蛋白可不仅在遗传性良性肿瘤中而且在获得性良性肿瘤中表达,并且应理解,这种类型的良性肿瘤可使用本公开内容的技术治疗或预防。在一个实施方案中,良性肿瘤选自家族性腺瘤息肉病、非遗传性结肠直肠腺瘤、导管内乳头状粘液性肿瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、器官的上皮腺瘤、乳头瘤、非上皮性肌瘤、脂肪瘤、软骨瘤和血管瘤。
在一个实施方案中,本公开内容提供了用于预防或治疗家族性腺瘤息肉病的组合物,其包含WT1肽或其类似物。尽管WT1肽或其类似物已表明有效治疗血管发生,但出人意料的是,WT1肽或其类似物有效治疗或预防家族性腺瘤息肉病,其是难治疗的,并且之前实际上没有治愈法,而是切除。本公开内容提供了切除实际上是唯一治疗的家族性腺瘤息肉病的新治疗方式,并且本公开内容的治疗或预防不要求切除,因此可用于促进生活质量(QOL)的改善。
在一个实施方案中,本公开内容的WT1肽可以是单一类型的肽或包含多种类型的肽。此外,用于本公开内容的药物或组合物的WT1肽可以是杀手WT1肽或辅助WT1肽,或可以是这些肽的混合物。更优选地,WT1肽包含杀手型WT1肽和辅助型WT1肽二者。WT1肽的二聚体可用于本公开内容。WT1肽的二聚体可通过在两个WT1肽之间形成二硫键获得,每个WT1肽具有半胱氨酸残基。用于本公开内容的药物组合物的WT1肽可以是单一类型的肽或包含多种类型的肽。
WT1肽是否在受试者中发挥治疗性或预防性效果取决于WT1肽是否对应于受试者的HLA类型。由于对于许多WT1肽,目前已知所述肽合适的HLA类型,用于本公开内容的WT1肽可根据受试者的HLA类型选择。此外,多种类型的WT1肽可用于本公开内容的药物组合物以覆盖宽范围的受试者。
在一个优选的实施方案中,用于本公开内容的WT1肽是WT1126杀手肽、WT1235杀手肽、WT135辅助肽和/或WT1332辅助肽。优选地,WT1肽包含选自WT1126肽和WT1235肽的杀手肽和选自WT135肽和WT1332肽的辅助肽。不希望受到理论的约束,在本公开内容中已发现WT1肽当包含杀手和辅助肽二者时比当其单独使用时更有效。
在另一方面,本公开内容的WT1肽包含式(3)的化合物和WT135辅助肽二者。据申请人所知,尚未知道式(3)的化合物和WT135辅助肽的组合显示针对良性肿瘤的预防性和/或治疗性功效。
在另一方面,本公开内容提供了用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,其包含编码WT1肽或其类似物的核酸分子。
在某些实施方案中,本公开内容提供了用于预防或治疗家族性腺瘤息肉病的组合物,其包含编码WT1肽或其类似物的核酸分子。在该情况下,本公开内容的药物组合物中的活性成分可被认为是编码WT1肽的多核苷酸,但不限于此。多核苷酸的核苷酸序列可基于WT1肽的氨基酸序列确定。多核苷酸可例如通过用于DNA或RNA合成例如化学合成或PCR的已知方法产生。
在一个实施方案中,本公开内容的预防性或治疗性组合物包含编码WT1肽或其类似物的DNA。
在另一个实施方案中,本公开内容的预防性或治疗性组合物包含编码WT1肽或其类似物的RNA。
在另一个实施方案中,本公开内容的预防性或治疗性组合物包含编码WT1肽或其类似物的RNA和DNA。
在一个实施方案中,本公开内容的预防性或治疗性组合物除了上述组分之外还包含佐剂。
在一个优选的实施方案中,用于本公开内容的佐剂包括Montanide® ISA51佐剂。
在一个实施方案中,本公开内容的预防性或治疗性组合物一周给予一次。
本公开内容的药物或组合物可与用于治疗和/或预防良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的药剂组合使用。
本公开内容的药物或组合物的给予途径不特别受到限制,并且优选的给予途径的实例包括皮内给予、皮下给予、经皮给予和经粘膜给予(例如,滴眼剂、滴鼻剂、舌下给予)。
本公开内容的药物或组合物的剂型不特别受到限制,并且可以是例如,剂型,例如注射液、滴眼液、滴鼻液、洗剂、霜剂、贴剂、舌下片剂或锭剂。这些剂型可通过本领域技术人员众所周知的方法制备和给予。
当使用本公开内容的药物或组合物时WT1肽的剂量根据因素例如WT1肽类型、给予途径、剂型、疾病类型、疾病严重性和受试者健康状况而适当改变。一般而言,WT1肽的剂量是0.1 μg/kg至1 mg/kg/成人/天。类似地,WT1肽的类型、给予途径和剂型可适当改变。除了药学可接受的载体或赋形剂之外,本公开内容的药物或组合物还可包含合适的佐剂,例如氢氧化铝。或者,本公开内容的药物或组合物可包含包封在脂质体中的WT1肽。
在该实施方案中,例如,当WT1肽是式(2)或式(3)的化合物时,WT1肽可在引入阶段对于成人每2周以3.5 mg/天经皮内给予,共1-5次,和在维持阶段对于成人每1或2个月以3.5 mg/天经皮内给予,共3-6次。
剂量范围可以是对于成人每天1.0 mg或更多、2.5 mg或更多、5.0 mg或更多、10mg或更多、15 mg或更多、20 mg或更多或25 mg或更多、或100 mg或更少、50 mg或更少、40mg或更少、30 mg或更少、25 mg或更少、20 mg或更少、15 mg或更少、10 mg或更少、5.0 mg或更少或2.5 mg或更少。特别地,剂量可以是例如对于成人每天0.5 mg、1.0 mg、1.5 mg、2.0mg、2.5 mg、3.0 mg、3.5 mg、4.0 mg、4.5 mg、5.0 mg、5.5 mg、6.0 mg、6.5 mg、7.0 mg、7.5mg、8.0 mg、8.5 mg、9.0 mg、9.5 mg或10 mg。
给予间隔可合适选自1周至1年,和可以是例如,1天或更久、1周或更久、2周或更久、3周或更久、1个月或更久、2个月或更久、3个月或更久、4个月或更久、5个月或更久或6个月或更久,或1年或更少、9个月或更少、6个月或更少、5个月或更少、4个月或更少、3个月或更少、2个月或更少、1个月或更少、3周或更少、2周或更少或1周或更少。特别地,给予间隔可以是例如1天、3天、5天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月或1年。
给予次数可合适选自共1-100次,和可以是例如1次或更多、2次或更多、3次或更多、4次或更多、5次或更多、6次或更多、7次或更多、8次或更多、9次或更多或10次或更多,或100次或更少、50次或更少、40次或更少、30次或更少、20次或更少、15次或更少、10次或更少、9次或更少、8次或更少、7次或更少、6次或更少、5次或更少、4次或更少、3次或更少或2次或更少。特别地,给予次数可以是例如1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次或12次。
在另一方面,本公开内容提供了WT1肽或其类似物,或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,用于治疗和/或预防良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)。
在又一个方面,本公开内容涉及WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子用于治疗和/或预防良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)或用于制备治疗和/或预防良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的药物组合物的用途。本公开内容进一步提供了治疗和/或预防良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的方法,包括给予有需要的受试者有效量的WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子的步骤。在进一步的实施方案中,本公开内容涉及WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子用于制备治疗和/或预防良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的药物的用途。在又一个方面,本公开内容涉及治疗和/或预防良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的方法,其特征为给予有需要的受试者WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子。包括上述内容的本文描述的所有说明也适用于这些方面。
(诱导免疫细胞的方法)
在另一方面,本公开内容提供了诱导WT1-特异性细胞毒性T细胞(CTL)和/或WT1-特异性辅助T细胞的方法,用于预防或治疗良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病),其特征为包括以下步骤:在本文所述的任何WT1肽或其类似物的存在下培养源自需要治疗良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的受试者的外周血单核细胞,或将编码本文所述的任何WT1肽或其类似物的核酸分子引入这样的外周血单核细胞中,从而从外周单核细胞诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。本领域技术人员将理解,在章节"预防性或治疗性组合物"中给出的任何说明也适用于该诱导方法。
在另一方面,本公开内容提供了诱导呈递WT1的树突细胞的方法,用于预防或治疗良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病),其特征为包括以下步骤:在本文所述的任何WT1肽或其类似物的存在下培养源自需要治疗良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的受试者的不成熟的树突细胞,或将编码本文所述的任何WT1肽或其类似物的核酸分子引入这样的不成熟的树突细胞中,从而诱导呈递WT1的树突细胞。本领域技术人员将理解,在章节"预防性或治疗性组合物"中给出的任何说明也适用于该诱导方法。
在另一方面,本公开内容涉及包含WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子的组合物,用于诱导WT1-特异性细胞毒性T细胞和/或WT1-特异性辅助T细胞,其中组合物用于预防或治疗良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)。本领域技术人员将理解,在章节"预防性或治疗性组合物"中给出的任何说明也适用于该组合物。
在又一个方面,本公开内容涉及包含WT1肽或其类似物或编码WT1肽或其类似物的核酸分子的组合物,用于诱导呈递WT1的树突细胞,其中组合物用于预防或治疗良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)。本领域技术人员将理解,在章节"预防性或治疗性组合物"中给出的任何说明也适用于该组合物。
在又一个方面,本公开内容提供了用于预防或治疗良性肿瘤的组合物(例如,家族性腺瘤息肉病),其包含WT1-特异性细胞毒性T细胞和/或WT1-特异性辅助T细胞。本领域技术人员将理解,在章节"预防性或治疗性组合物"中给出的任何说明也适用于该组合物。
在又一个方面,本公开内容提供了用于预防或治疗良性肿瘤的组合物(例如,家族性腺瘤息肉病),其包含呈递WT1的树突细胞。本领域技术人员将理解,在章节"预防性或治疗性组合物"中给出的任何说明也适用于该组合物。
(制备方法)
本公开内容的肽或衍生物或核酸分子可通过本领域常用的制备方法制备。这些制备方法可根据熟悉免疫学方法、分子生物学方法、生物化学方法和微生物学方法的人的知识适当改进。特别地,本公开内容的肽或衍生物或核酸分子可根据天然WT1蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO: 1)或天然WT1蛋白的核酸序列进行设计,和可通过使用微生物的系统例如表达系统制备。制备方法中的起始材料和中间体可作为商业产品购买,或可通过公众已知的文件中描述的方法获得或根据公众已知的方法从公众已知的化合物获得。可使用这些起始材料和中间体的类似物,只要它们不干扰制备过程。
(一般技术)
本文使用的免疫学、分子生物学、生物化学和微生物学技术是本领域众所周知和常用的,并且描述于参考文献中,例如Sambrook J.等(1989). Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor和其第三版(2001);Ausubel, F.M. (1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience;Ausubel, F.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, GreenePub. Associates and Wiley-Interscience;Innis, M.A. (1990). PCR Protocols: AGuide to Methods and Applications, Academic Press;Ausubel, F.M. (1992). ShortProtocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates;Ausubel, F.M. (1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates;Innis, M.A.等(1995).PCR Strategies, Academic Press;Ausubel, F.M. (1999). Short Protocols inMolecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology, Wiley, and annual updates;Sninsky, J.J.等(1999). PCRApplications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press;和实验医学单独卷"Experimental methods for gene transfer & expression analysis", Yodosha,1997,并且每个参考文献的相关部分(或全部)通过引用并入本文。
(注释)
在本说明书中,当可使用文中所列物质中的"至少一个"时,使用术语"或"。在本说明书中,当指定为"在两个值的范围内"时,该范围还包括这两个具体值。
本文引用的参考文献例如科学文献、专利和专利申请通过引用以其整体结合到本文中,其程度与各参考文献的内容具体在本文中描述相同。
为容易理解,上文已经参考优选的实施方案描述了本公开内容。本公开内容将在下文根据实施例进行描述,但上文的描述和以下实施例仅为说明的目的而不是为了限制本公开内容的目的而提供。因此,本公开内容的范围不限于在本说明书中特别描述的实施方案或实施例,而是仅由权利要求的范围来限定。
实施例
下文描述了实施例。如果需要的话,以下实施例中使用的生物处理符合大阪大学或管理机构规定的标准。实施例中使用的试剂在下文描述,但也可使用来自其它生产商(例如Sigma-Aldrich、FUJIFILM Wako Pure Chemical、Nacalai Tesque、R & D Systems、USCNLife Science INC、Thermo Fisher Scientific、Kanto Chemical、Funakoshi、TokyoChemical Industry、Merck)的等同物。
(小鼠)
以下实施例使用ApcMin/+ (C57BL/6J)小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor,Maine, USA)。小鼠在大阪大学医学院的实验动物科学学院的无特定微生物(SPF)容纳设施中遵从大阪大学动物实验规章进行饲喂。
(试剂)
以下实施例使用MHC I类(H-2Db)-结合肽WT1126-134 (RMPNAPYL,9a.a)和MHC II类(H-2I-Ab)-结合肽WT135-52 (WAPVLDFAPPGASAYGSL,18a.a.),其购自SIGMA Genosys(Ishikari,Japan)。式(3)的化合物和WT135-52辅助肽的混合物中使用的原材料由SumitomoDainippon Pharma Co., Ltd. (Osaka, Japan)提供。将肽储存在−20℃下直到使用。将肽溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS; 137 mM NaCl,2.7 mM KCl,8.1 mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4)和储存在−20℃下。弗氏不完全佐剂(IFA)和Montanide ISA 51购自Seppic S.A. (Orsay,France)。
(实施例1:家族性腺瘤息肉病的腺瘤中WT1蛋白的表达)
该实施例显示WT1蛋白在具有家族性腺瘤息肉病的人患者的腺瘤中表达。
(实验方法)
具有家族性腺瘤息肉病的人患者的小肠和大肠用福尔马林固定,和用石蜡包埋,并且将石蜡块切成厚度3 μm。为了减少内源过氧化物酶反应,石蜡切片用3% H2O2溶液处理,然后在二甲苯中脱石蜡,并且在用乙醇逐步再水合后,为了抗原修复,在10 mM Tris EDTA缓冲液(10 mM Tris,1 mM EDTA,pH 9.0)中在70℃油浴中加热25分钟和在110℃油浴中加热25分钟并且在室温下冷却3小时。经处理的切片在4℃下与用PBST (PBS + 0.05% Tween20®)稀释100倍的抗-WT1 6FH2小鼠单克隆抗体(Dako Cytomation,Inc.,Carpinteria,CA)反应过夜。然后,切片用Dako REAL Envision HRP RABBIT/MOUSE (Dako Cytomation)在37℃下处理30分钟。使用Dako REAL Envision Detection System Peroxidase/DAB+,Rabbit/Mouse (Dako Cytomation),WT1蛋白根据说明书手册可视化。然后,切片用苏木精染色。
(结果)
实施例1的结果显示在表1和图1中。表1显示在源自各患者的样本的腺瘤、正常腺管和成纤维细胞中WT1蛋白的表达水平。表1证实了腺瘤中WT1蛋白的表达水平显著高于正常腺管。在图1中,轻微染色指示WT1蛋白和深色圈染色区域指示细胞核。WT1蛋白的表达在腺瘤中观察到,但在正常腺管中未观察到。
表2
(实施例2:在APCMin/+小鼠中WT1蛋白的表达)
该实施例显示WT1蛋白在APCMin/+小鼠的小肠腺瘤中表达,所述小鼠是家族性腺瘤息肉病的模型小鼠。
(实验方法)
20周龄APCMin/+ (C57BL/6J)小鼠的小肠和大肠用福尔马林固定,和用石蜡包埋,并且将石蜡块切成厚度3 μm。石蜡切片用二甲苯脱石蜡,并且在用乙醇逐步再水合后,为了抗原修复,在10 mM柠檬酸盐缓冲液(10 mM柠檬酸钠,0.05% Tween 20,pH 6.0)中用微波照射15分钟。经处理的切片在4℃下与用含有山羊血清的PBS稀释100倍的抗-WT1 6FH2小鼠单克隆抗体(Dako Cytomation, Inc., Carpinteria, CA)反应过夜。然后,切片与用含有山羊血清的PBS稀释100倍的生物素化的抗-小鼠IgG抗体(Vector Labs., Burlingame, CA)在37℃下反应30分钟。为了减少内源过氧化物酶反应,切片用3% H2O2溶液处理,并且根据说明书手册WT1蛋白使用Vectastain ABC试剂盒(Vector Labs)可视化。然后,切片用苏木精染色。
(结果)
实施例2的结果显示于图2和3。图2从上方开始按顺序显示5x、10x和20x放大倍数的显微照片,和图3显示40x放大倍数的显微照片。在图2和3中,深色染色指示WT1蛋白和圈染色区域指示细胞核。WT1蛋白的表达在APCMin/+小鼠的小肠腺瘤中观察到,所述小鼠是家族性腺瘤息肉病的模型小鼠。
(实施例3:给予WT1肽疫苗至家族性腺瘤息肉病模型小鼠)
该实施例显示给予WT1肽疫苗至APCMin/+小鼠的实验的给予方案。
(实验方法)
WT1肽疫苗的给予方案显示于图4。100 μg的WT1126-134杀手肽和45 μg的WT135-52辅助肽或PBS的混合物用IFA Montanide ISA51佐剂乳化,以获得WT1肽疫苗或对照疫苗。WT1肽疫苗或对照疫苗经皮内给予4至5周龄APCMin/+小鼠的侧腹。从出生后第5周开始免疫,并以一周一次的频率进行8次。经免疫的小鼠在最后一次免疫后10天安乐死,用于进一步分析。WT1肽疫苗的给予不引起器官损伤,如下表3中所示。
表3
(实施例4:通过给予WT1肽疫苗预防和治疗腺瘤)
该实施例显示给予WT1肽疫苗至APCMin/+小鼠预防腺瘤发生并治疗腺瘤。
(实验方法)
使用根据实施例3描述的给予方案获得的小鼠。在最后一次免疫后10天从安乐死的小鼠收集整个肠。将小肠分成8-10个部分,和将大肠分成盲肠和升结肠。每个部分纵向切开,用PBS洗涤,夹在滤纸之间和在4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液中在4℃下固定24小时或更久。固定的肠组织用1%亚甲基蓝溶液染色,然后在立体显微镜下观察以计数腺瘤(息肉)数量。在WT1肽疫苗-给予组和对照疫苗-给予组之间腺瘤(息肉)数量的差异通过Student t检验进行统计学分析。
(结果)
实施例4的结果显示于图5。图的水平轴显示左侧的接受WT1疫苗的组和右侧的接受对照疫苗的组,和纵轴显示每小肠的腺瘤数量。在WT1肽疫苗-给予组中每小肠的腺瘤平均数是约29,而在对照疫苗-给予组中是约34,表明WT1肽疫苗的给予显著抑制腺瘤的发生,并且还治疗腺瘤。
(实施例5:通过给予WT1肽疫苗增加WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞)
该实施例显示给予WT1肽疫苗至APCMin/+小鼠增加WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞。
(实验方法)
使用根据实施例3描述的给予方案获得的小鼠。在最后一次免疫后10天从安乐死的小鼠收集脾细胞。红细胞溶解后,细胞用H-2Db WT1四聚体(MBL,Aichi,Japan)染色,和进一步用抗-小鼠CD3抗体(17A2,BioLegend,San Diego,CA)和抗-小鼠CD8抗体(KT15,MBL,Aichi,Japan)染色。经染色的细胞通过FACSCanto分析,和测量在CD3+CD8+T细胞中H-2DbWT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率。WT1肽疫苗-给予组和对照疫苗-给予组之间H-2Db WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率差异通过Student t检验进行统计学分析。
(结果)
实施例5的结果显示于图6。图的水平轴显示左侧的接受WT1肽疫苗的组和右侧的接受对照疫苗的组,和纵轴显示CD3+CD8+细胞中H-2Db WT1四聚体的频率。在WT1疫苗-给予组中H-2Db WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率平均数是约0.6%,而在对照疫苗-给予组中是约0.2%,表明给予WT1疫苗增加WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞。
(实施例6:统计学分析)
该实施例显示在实施例4的腺瘤数量和实施例5的WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞之间观察到相关性。
(实验方法)
从实施例4获得的每小肠的腺瘤数量和从实施例5获得的CD3+CD8+T细胞中H-2DbWT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率通过Microsoft Excel®在散点图上作图。此外,对于这些结果,在Excel中通过Pearson相关系数经统计学分析相关性。
(结果)
从实施例6的结果发现,在WT1肽疫苗-给予组和对照疫苗-给予组之间腺瘤(息肉)数量和WT1四聚体频率的差异表明相关性,尽管其很弱。
(实施例7:单一药剂实例)
该实施例显示在接受杀手型WT1肽疫苗和辅助型WT1肽疫苗二者的组和接受单独的杀手型WT1肽疫苗或辅助型WT1肽疫苗的组之间在APCMin/+小鼠中预防腺瘤发生和治疗腺瘤的效果比较。
(实验方法)
WT1肽疫苗的给予方案显示于图8。100 μg的WT1126-134杀手肽和45 μg的WT135-52辅助肽的混合物、单独100 μg的WT1126-134杀手肽、单独45 μg的WT135-52辅助肽和PBS分别用IFAMontanide ISA51佐剂乳化。杀手肽和辅助肽的混合物、单独的杀手肽、单独的辅助肽或仅PBS对照疫苗经皮内给予至5周龄APCMin/+小鼠的侧腹。从出生后第5周起始免疫,并以一周一次的频率进行8次。在最后一次免疫后10天经免疫的小鼠被安乐死,用于进一步分析。
(实施例8:在其它良性肿瘤中WT1的表达)
该实施例显示WT1还在非遗传性结肠直肠腺瘤中表达。
(实验方法)
从发生非遗传性结肠直肠腺瘤的人患者(3个患者)切下腺瘤组织,并且通过与实施例1相同的方法染色WT1蛋白和细胞核。
(结果)
实施例8的结果显示于图9。在图9中,从左侧开始第一个图显示正常腺管的显微镜图像,和右侧的三个图显示非遗传性结肠直肠腺瘤的腺瘤组织的显微镜图像。在图9中,浅色染色指示WT1蛋白和深色圈或卵形染色区域指示细胞核。WT1蛋白的表达在腺瘤中观察到,但在正常腺管中未观察到。
(实施例9:给予式(3)的化合物和WT135-52辅助肽的混合物至家族性腺瘤息肉病模型小鼠)
该实施例显示给予式(3)的化合物和WT135-52辅助肽的混合物至APCMin/+小鼠的实验的给予方案。
(实验方法)
WT1肽疫苗的给予方案显示于图10。将WT1肽疫苗用PBS溶解,和含有WT1肽疫苗或单独的PBS的溶液用IFA Montanide ISA51佐剂乳化,以得到WT1肽疫苗或对照疫苗。WT1肽疫苗或对照疫苗经皮内给予至4至5周龄APCMin/+小鼠的侧腹。从出生后第4至第5周开始免疫,并以一周一次的频率进行6次。经免疫的小鼠在最后一次免疫后7天安乐死,用于进一步分析。
(实施例10:通过给予式(3)的化合物和WT135-52辅助肽的混合物预防和治疗腺瘤)
该实施例显示给予式(3)的化合物和WT135-52辅助肽的混合物至APCMin/+小鼠预防腺瘤发生和治疗腺瘤。给予式(3)的化合物和WT135-52辅助肽的混合物不引起器官损伤,如下表4所示。
表4
(实验方法)
使用根据实施例9所述的给予方案获得的小鼠。最后一次免疫后7天从安乐死的小鼠取出器官并称重。将小肠分成8-10个部分。每个部分纵向切开,用PBS洗涤,夹在滤纸之间,和在4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液中在4℃下固定24小时或更久。经固定的肠组织用1%亚甲基蓝溶液染色,然后在立体显微镜下观察以计数腺瘤(息肉)数量。在WT1肽疫苗-给予组和对照疫苗-给予组之间腺瘤(息肉)数量的差异通过Student t检验经统计学分析。
(结果)
实施例10的结果显示于图11。图的水平轴显示左侧的接受WT1肽疫苗的组和右侧的接受对照疫苗的组,和纵轴显示每小肠的腺瘤数量。WT1肽疫苗-给予组中每小肠的腺瘤平均数是约37.2,而对照疫苗-给予组中是约43.7。因此,给予WT1肽疫苗显示出抑制腺瘤发生并且还治疗腺瘤。
(实施例11:通过给予式(3)的化合物和WT135-52辅助肽的混合物增加WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞)
该实施例显示给予式(3)的化合物和WT135-52辅助肽的混合物至APCMin/+小鼠增加WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞。
(实验方法)
使用根据实施例9所述的给予方案获得的小鼠。最后一次免疫后7天从安乐死的小鼠收集脾细胞。红细胞溶解后,细胞用H-2Db WT1四聚体(MBL,Aichi,Japan)染色,并进一步用抗-小鼠CD3抗体(17A2,BioLegend,San Diego,CA)、抗-小鼠CD8抗体(KT15,MBL,Aichi,Japan)和7-AAD Viability Staining Solution (Bioscience,San Diego,CA)染色。经染色的细胞通过FACSCanto分析,除去7-AAD+死细胞碎片和测量CD3+CD8+T细胞中H-2Db WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率。在WT1肽疫苗-给予组和对照疫苗-给予组之间H-2Db WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率差异通过Student t检验经统计学分析。
(结果)
实施例11的结果显示于图12。图的水平轴显示左侧的接受WT1肽疫苗的组和右侧的接受对照疫苗的组,和纵轴显示CD3+CD8+细胞中H-2Db WT1四聚体的频率。在WT1疫苗-给予组中CD3+CD8+细胞中H-2Db WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率平均数是约0.13%,而在对照疫苗-给予组中是约0.04%,表明给予WT1肽疫苗增加WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞。
(实施例12:统计学分析)
该实施例显示在实施例10的腺瘤数量和实施例11的WT1四聚体+CD3+CD8+T细胞之间观察到相关性。
(实验方法)
从实施例10获得的每小肠的腺瘤数量和从实施例11获得的CD3+CD8+T细胞中H-2DbWT1四聚体+CD3+CD8+T细胞的频率通过Microsoft Excel®在散点图上作图。此外,对于这些结果,在Excel中通过Pearson 相关系数经统计学分析相关性。
(结果)
从实施例12的结果发现,在WT1肽疫苗-给予组和对照疫苗-给予组之间腺瘤(息肉)数量和WT1四聚体频率的差异表明高相关性,证实了WT1-特异性免疫对肿瘤抑制具有强效果。
(注释)
尽管本公开内容在上文中说明了本公开内容的优选实施方案,但应理解本公开内容的范围应仅通过权利要求进行解释。应理解,本文引用的专利、专利申请和其它文件应该通过引用以其整体结合到本文中,其程度与参考文献的内容具体在本文描述相同。本申请伴随有对在2018年10月5日提交至日本专利局的日本专利申请号2018-190461的优先权要求,并且应理解,所有在先申请应该通过引用结合到本文中。
工业适用性
本公开内容可用于预防、延迟和治疗良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)和用于预防、延迟和治疗由良性肿瘤(例如,家族性腺瘤息肉病)的腺瘤产生的症状。本公开内容的WT1肽疫苗是有用的,这是因为它能够使我们避免手术,例如内窥镜切除,并且它是非常安全的,没有严重副作用。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1 人WT1蛋白的全长氨基酸序列
SEQ ID NO: 2 人WT1126肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 3 人WT1235肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 4 人WT135肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 5 人WT1332肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 6 人WT1126 P1G肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 7 人WT1126 P1A肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 8 人WT1126 P1V肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 9 人WT1126 P1L肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 10 人WT1126 P1I肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 11 人WT1126 P1M肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 12 人WT1126 P1W肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 13 人WT1126 P1F肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 14 人WT1126 P1Y肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 15 人WT1126 P2V肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 16 人WT1126 P2Q肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 17 人WT1126 P2A肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 18 人WT1126 P2L肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 19 人WT1126 P2I肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 20 人WT1126 P3I肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 21 人WT1126 P3L肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 22 人WT1126 P3G肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 23 人WT1126 P3A肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 24 人WT1126 P3V肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 25 人WT1126 P3M肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 26 人WT1126 P3P肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 27 人WT1126 P3W肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 28 人WT1126 P9V肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 29 人WT1126 P9A肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 30 人WT1126 P9I肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 31 人WT1126 P9M肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 32 人WT1126 P1D肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 33 人WT1126 P1E肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 34 人WT1126 P1H肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 35 人WT1126 P1K肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 36 人WT1126 P1N肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 37 人WT1126 P1P肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 38 人WT1126 P1Q肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 39 人WT1126 P1S肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 40 人WT1126 P1T肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 41 人WT1126 P2I & P9I肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 42 人WT1126 P2I & P9V肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 43 人WT1126 P2L & P9I肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 44 人WT1126 P2L & P9V肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 45 人WT1235m肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 46 人WT1126肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 47 人WT1235肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 48 人WT1235肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 49 人WT1122肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 50 人WT135肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 51 人WT135肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 52 人WT110肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 53 人WT1187肽的氨基酸序列
SEQ ID NO: 54 人WT1126肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 55 人WT1235肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 56 人WT1235肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 57 人WT1235肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 58 人WT110肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 59 人WT1187肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 60 人WT1187肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 61 人WT1126肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 62 人WT1122肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 63 人WT135肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 64 人WT135肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 65 人WT135肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 66 人WT135肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 67 人WT135肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 68 人WT137肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 69 人WT1122肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 70 人WT1122肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 71 人WT1122肽的变体的氨基酸序列
SEQ ID NO: 72 人WT1122肽的变体的氨基酸序列。
Claims (26)
1.用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,其包含WT1肽或其类似物。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述WT1肽或其类似物包括杀手型肽和/或辅助型肽。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中所述WT1肽或其类似物包括WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和/或WT135辅助肽,或包含因为一至几个氨基酸被缺失、置换和/或添加而不同于WT1126杀手肽、WT1235杀手肽和WT135辅助肽的任一种的氨基酸序列的氨基酸序列并且具有CTL-诱导活性的肽。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中所述WT1肽或其类似物是由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 2),
RYFPNAPYL (SEQ ID NO: 46),
YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 14),
CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 45),
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 3),
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO: 47) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),和
C-CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 48) (其中式中显示的C-C意指C残基通过二硫键连接在一起),
或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物,其中所述WT1肽或其类似物是组合物,其进一步包含至少一种由选自以下的氨基酸序列组成的肽:
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 4),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO: 50)和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO: 51),
或其药学上可接受的盐。
10.用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,其包含编码WT1肽或其类似物的核酸分子。
11.根据权利要求10所述的组合物,其中所述核酸分子包括RNA和/或DNA。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物,其中所述组合物进一步包含佐剂。
13. 根据权利要求12所述的组合物,其中所述佐剂是Montanide® ISA51佐剂。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物,其中所述良性肿瘤表达WT1。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物,其中所述良性肿瘤选自家族性腺瘤息肉病、非遗传性结肠直肠腺瘤、导管内乳头状粘液性肿瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、器官的上皮腺瘤、乳头瘤、非上皮性肌瘤、脂肪瘤、软骨瘤和血管瘤。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物,其中所述良性肿瘤是家族性腺瘤息肉病。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物,其中所述组合物将一周一次给予。
18.诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞用于预防或治疗良性肿瘤的方法,包括在根据权利要求1-9中任一项所述的WT1肽或其类似物的存在下培养来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞,或将根据权利要求10或11所述的编码WT1肽或其类似物的核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的外周血单核细胞中,和从所述外周血单核细胞诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
19.诱导呈递WT1的树突细胞用于预防或治疗良性肿瘤的方法,包括在根据权利要求1-9中任一项所述的WT1肽或其类似物的存在下培养来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞,或将根据权利要求10或11所述的编码WT1肽或其类似物的核酸分子引入来自需要治疗良性肿瘤的受试者的不成熟的树突细胞中,和诱导呈递WT1的树突细胞。
20.用于诱导WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞的组合物,其包含WT1肽或其类似物,或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,其中所述组合物用于预防或治疗良性肿瘤。
21.用于诱导呈递WT1的树突细胞的组合物,其包含WT1肽或其类似物,或编码WT1肽或其类似物的核酸分子,其中所述组合物用于预防或治疗良性肿瘤。
22.用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,其包含WT1-特异性CTL和/或WT1-特异性辅助T细胞。
23.用于预防或治疗良性肿瘤的组合物,其包含呈递WT1的树突细胞。
24.预防或治疗受试者的良性肿瘤的方法,包括给予所述受试者有效量的WT1肽或其类似物。
25. WT1肽或其类似物,用于预防或治疗良性肿瘤。
26. WT1肽或其类似物在制备用于预防或治疗良性肿瘤的组合物中的用途。
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