CN113388667B - 重金属铅检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于重金属铅检测技术领域。针对现有的重金属铅的检测技术存在的环境适应性差、效率低的问题，提供一种重金属铅检测试剂盒及方法。本发明通过两步脱氧核酶酶切反应实现多级信号放大。首先，Pb2+特异性脱氧核酶以环状双发卡脱氧核酶为底物进行酶切，生成引发第二步酶切反应的线性双发卡脱氧核酶；然后，线性双发卡脱氧核酶对分子信标进行酶切，使得分子信标两端修饰的荧光基团跟淬灭基团分离，分子信标释放荧光信号，最终将极微量的Pb2+转化为强荧光信号。本发明真正实现各种环境和温度下的Pb2+快速、灵敏的现场检测。

Description

重金属铅检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于重金属铅检测技术领域，具体涉及一种重金属铅检测试剂盒及方法。
背景技术
重金属污染对环境危害严重，且能通过生物链蓄积进入人体，对人类健康及生命安全造成威胁。其中铅离子因其用途广、毒性大而受到普遍关注。因此，食品安全和环境检测等过程中对微量铅的检测十分必要。
传统的铅检测方法主要有原子吸收光谱法和荧光光谱法等，需要借助昂贵的大型仪器，检测成本高且操作复杂，适合精准的定量分析，不适用于现场快速检测或对大量样品的现场初筛。近年来，研究者们开发了多种基于脱氧核酶的核酸传感器用于铅、镉等重金属的检测中。比如，有研究者将两端分别标记荧光和淬灭基团的底物链设计成分子内的茎环结构，保证荧光基团和淬灭基团紧密接触，当底物链被切断后，茎环结构转变为两条游离短链，释放荧光信号。然而，这类核酸传感器是基于单个脱氧核酶的传感器，仅有单次信号放大，效率较低，检测灵敏度也难以提高。此外，一些多次信号放大的核酸传感器大多需要核酸外切酶或聚合酶等蛋白质类酶的参与，这些蛋白质试剂需要低温保藏，且对反应温度要求严格，不适用于各种温度和环境下的现场检测。鉴于目前重金属快速检测技术的诸多不足之处，研发一种操作简便、环境适应性强、快速、灵敏地现场检测重金属铅的技术具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有的重金属铅的检测技术存在的环境适应性差、效率低的上述问题，本发明提供一种重金属铅检测试剂盒及方法。本发明的检测原理是：通过两步脱氧核酶酶切反应实现多级信号放大。首先，Pb2+特异性脱氧核酶以环状双发卡脱氧核酶为底物进行酶切，生成引发第二步酶切反应的线性双发卡脱氧核酶；然后，线性双发卡脱氧核酶对分子信标进行酶切，使得分子信标两端修饰的荧光基团跟淬灭基团分离，分子信标释放荧光信号，最终将极微量的Pb2+转化为强荧光信号。本发明真正实现各种环境和温度下的Pb2+快速、灵敏的现场检测，最终应用于实际样品的现场检测或大量样本的前期初筛中。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种重金属铅检测试剂盒，所述试剂盒包括pb2+特异性脱氧核酶、环状双发卡脱氧核酶、分子信标及缓冲液，不包括蛋白质类酶或抗体；
所述pb2+特异性脱氧核酶是一类具有催化功能的DNA分子，其空间结构中存在活性中心，当其专一地与pb2+结合时，活性中心被激活；
所述环状双发卡脱氧核酶为在脱氧核酶的活性中心的第7-8个碱基或第8-9个碱基位置添加两个发卡结构，且脱氧核酶的线性形式通过首尾连接得到的单链环状序列；所述环状双发卡脱氧核酶中含有核糖核苷酸位点，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述的核糖核苷酸位点为pb2+特异性脱氧核酶的酶切位点；当所述酶切位点被酶切后，环状双发卡脱氧核酶断裂形成线性双发卡脱氧核酶；
所述分子信标含有与所述线性双发卡脱氧核酶结合臂的互补核酸片段，所述互补核酸片段的中间段为核糖核苷酸位点，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述核糖核苷酸位点为线性双发卡脱氧核酶的酶切位点；所述分子信标带有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团和淬灭基团位于所述双发卡脱氧核酶的酶切位点的两侧。
本发明研究证明，双发卡在活性中心的位置对酶切活性影响较大。当两个发卡结构添加在环状双发卡脱氧核酶的活性中心的第7-8个碱基或第8-9个碱基位置时，酶切活性较高。
进一步的，所述pb2+特异性脱氧核酶的酶切位点由1-2个核糖核苷酸组成；所述双发卡脱氧核酶酶切位点由1-2个连续的核糖核苷酸组成。
进一步的，所述荧光基团和淬灭基团修饰在分子信标的两端或内部。
进一步的，所述荧光基团选自FITC、FAM、VIC、ROX、TET、Texas Red、HEX、TAMRA、Cy3、Cy5、Rhodamine B以及Perylene中的一种或多种；所述淬灭基团选自Dabcyl、NFQ、QYS-7、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Anthraquinone以及TAMRA中的一种或多种；优选荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。
进一步的，所述分子信标是具有茎环结构的单链寡核苷酸，其环部含有与线性双发卡脱氧核酶结合臂的互补核酸片段。
进一步的，所述环状双发卡脱氧核酶采用如下方法制备：
采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状脱氧核酶的二级结构；在DNA连接酶的作用下连接成环时，另设计一条短链DNA splint作为辅助连接，连接处两端的双链互补部分为5-9bp；先对设计的单链脱氧核酶的5’端进行磷酸化处理，然后在DNA连接酶的作用下首尾相连成环，成环条件为：加入20μM的磷酸化链1μL，20μM的splint 2μM，1×的T4Buffer 2μL，5U的T4DNA连接酶0.5μL，总体系为20μL，在25℃条件下反应4h-6h。
优选的，DNA连接酶为T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、E.Coli DNA连接酶、9oNTM DNA连接酶、CircLigaseTM ssDNA Ligase、CircLigaseTMssDNA Ligase II中的任一种。
或者所述环状双发卡脱氧核酶采用如下方法制备：
在成环体系中加入5’端磷酸化修饰的双发卡脱氧核酶单链，CircLigaseTM ssDNALigase II，1×CircLigase II Reaction Buffer，MnCl2和甜菜碱，于PCR仪中经60℃恒温反应16h后，80℃温浴10min将酶灭活。
进一步的，环化反应结束后，先用核酸外切酶去除未环化的线性核酸链以及加入的辅助DNA splint；将酶切处理后的产物用12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后进行切胶回收；在回收后的样品中进入有机溶剂，去除样品中的蛋白杂质；最后再用冰乙醇沉淀，浓缩回收环状双发卡脱氧核酶；然后用75％的乙醇洗涤产物，置于空气中挥发水分，得到纯净的环状脱氧核酶。
进一步的，所述缓冲液含Mg离子，pH值为8-11；优选8-9。
进一步的，所述试剂盒的检测浓度为10fM-1μM；优选检测浓度范围为10fM-10nM，更优选100fM-10nM。
本发明还提供一种重金属铅检测方法，包括：将待测样品与权利要求1-8所述的pb2+特异性脱氧核酶、环状双发卡脱氧核酶、分子信标以及缓冲液混合后，在25℃～50℃条件下反应10min～60min；首先，Pb2+特异性脱氧核酶以环状双发卡脱氧核酶为底物进行酶切，生成线性双发卡脱氧核酶；然后线性双发卡脱氧核酶对分子信标进行酶切，使得分子信标两端修饰的荧光基团跟淬灭基团分离，分子信标释放荧光信号，最终将极微量的Pb2+转化为强荧光信号；利用酶标仪检测反应体系中的荧光值，并将该荧光值与未添加待检样品的对照组中的背景荧光值进行比较以判断待检样品中是否含有重金属铅。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明为双循环级联信号放大技术，相比于单循环线性信号放大，信号放大效率显著提高。
(2)本方法中使用的环状双发卡脱氧核酶可以极大的降低无待检样品时的背景荧光值，可显著提高检测的灵敏度。
(3)由于两个循环的反应条件相同且互不干扰，因此可以将两个循环在同一体系中同时进行，这就使得反应可通过一步操作进行检测，大大简化了操作步骤且降低了污染的可能性。
(4)本发明为无蛋白质类酶参与的重金属铅检测技术，仅含化学性质稳定的核酸类元件，不需要蛋白质类试剂和精密的变温仪器，具有较高的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明所提供的试剂盒及检测方法的原理示意图；
图2为环状双发卡脱氧核酶的制备原理示意图；
图3为本发明实施例2的环状双发卡脱氧核酶介导的荧光检测结果；
图4为本发明实施例3的不同浓度铅的检测结果；
图5为本发明实施例4的铅离子检测的特异性评价结果；
图6为本发明实施例5的不同缓冲溶液和不同pH值下的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1重金属铅检测试剂盒
一种重金属铅检测试剂盒，由pb2+特异性脱氧核酶、环状双发卡脱氧核酶、分子信标以及含有Mg2+的缓冲液组成，缓冲液pH值范围为8-9。
所述pb2+特异性脱氧核酶是一类具有催化功能的DNA分子，同蛋白质类酶和RNA催化酶一样，在其精细的空间结构中存在一个特殊的“活性中心”，当其专一地与pb2+结合时，就会激活其酶切核酸底物的活性。
所述环状双发卡脱氧核酶为在脱氧核酶的活性中心的第7-8个碱基或第8-9个碱基位置添加两个发卡结构，且脱氧核酶的线性形式通过首尾连接得到的单链环状形式；所述环状双发卡脱氧核酶中含有核糖核苷酸位点E，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述的核糖核苷酸位点E为pb2+特异性脱氧核酶的酶切位点；
所述pb2+特异性脱氧核酶通过结合臂区域与环状双发卡脱氧核酶结合，pb2+特异性脱氧核酶在pb2+存在时其活性中心被激活，发挥酶切作用，将环状双发卡脱氧核酶酶切，使其断裂形成线性双发卡脱氧核酶；
所述分子信标含有与双发卡脱氧核酶结合臂的互补核酸片段，所述互补核酸片段的中间段为核糖核苷酸位点B，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述核糖核苷酸位点B为双发卡脱氧核酶的酶切位点；所述分子信标标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团和淬灭基团分别位于所述脱氧核酶酶切位点的两侧。
所述分子信标的序列在所述互补区的两端延伸出额外的序列具有互补的区域；更优选的，所述两端延伸出额外的序列均为脱氧核糖核酸，序列个数可以选择每测1～14个，或2～12个，或4～8个碱基。
优选所述分子信标是两端延伸出5bp，环部大小为20nt且茎部长度为5bp的单链寡核苷酸。
所述环状双发卡脱氧核酶采用如下方法制备得到：
采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状双发卡脱氧核酶的二级结构，所述结构含有两个稳定的发卡结构，且发卡结构茎部互补长度为6bp；环部大小为3nt。在T4DNA连接酶的作用下连接成环时，另需设计一条短链DNA(splint)作为辅助连接，连接处两端的双链部分分别是7～9bp。先对双发卡脱氧核酶链的5’端进行磷酸化处理，然后在T4DNA连接酶的作用下首尾相连成环，成环条件为：加入2μM的磷酸化的双发卡脱氧核酶链，4μM的splint，1×的T4 Buffer(40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP，pH7.8@25℃)，5U的T4 DNA连接酶，总体系为20μL，在25℃条件下反应4h-6h。
环状双发卡脱氧核酶制备完成后需要后期纯化，具体操作如下：环化反应结束后，先用核酸外切酶EXO I去除未环化的线性核酸链以及加入的辅助寡核苷酸链splint；将酶切处理后的产物用12％的PAGE凝胶电泳，电压为300V，电流为15mA，进行分离，然后进行切胶回收；在回收后的样品中加入苯酚-氯仿(体积比1:1)有机溶剂，去除样品中的蛋白杂质，最后再用冰乙醇沉淀，浓缩回收环状双发卡脱氧核酶，然后用75％的乙醇洗涤产物2-3次，置于空气中挥发水分，得到纯净的环状脱氧核酶。
使用上述试剂盒一步法检测重金属pb2+的具体步骤如下：
将含有pb2+的待测样品与试剂盒中的环状双发卡脱氧核酶、分子信标、pb2+特异性脱氧核酶以及缓冲液混合后，在30℃～37℃条件下反应10min～60min后，利用酶标仪(激发波长为490nm，扫描波长范围为510～610nm)检测反应体系中的荧光值，并将该荧光值与未添加待检样品的对照组中的背景荧光值进行比较以判断待检样品中是否含有重金属pb2+。
实施例2重金属铅的检测
1、环状双发卡脱氧核酶的制备及纯化
1)双发卡脱氧核酶单链hpDz-1(5’-磷酸化，长度为68nt)通过成环反应制备环状双发卡脱氧核酶，制备时需借助成环辅助链Splint-1a(长度为14nt)。形成的双发卡脱氧核酶结合臂长度为13nt，最适酶切温度为50℃。
2)脱氧核酶单链Dz-1(5’-磷酸化，长度为38nt)通过成环反应制备环状脱氧核酶，制备时需借助成环辅助链Splint-1b(长度为14nt)。与环状双发卡脱氧核酶相比，其在活性中心部位不带有两个发卡结构，其余序列相同。其结合臂长度为13nt，最适酶切温度为50℃。
3)环状脱氧核酶的制备：成环方式如图2所示。在成环体系中加入5μM的5’端磷酸化修饰的双发卡脱氧核酶单链hpDz-1(或脱氧核酶单链Dz-1)，10μM成环辅助链Splint-1a(或Splint-1b)和25U T4 DNA Ligase(购自Thermo Scientific公司)，并加入1×T4 DNALigase Buffer(含40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP，pH 7.8@25℃)，总体系为20μL。于PCR仪中经25℃恒温反应12h后，75℃温浴10min将酶灭活。
4)纯化：环化反应结束后，先用核酸外切酶Exonulease I(购自ThermoScientific公司)去除未环化的线性核酸链以及加入的成环辅助链；将酶切处理后的产物用12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为350V，电流为15mA，进行分离，然后进行切胶回收；在回收后的样品中加入苯酚-氯仿(1:1)去除样品中的蛋白杂质；最后，用冰乙醇沉淀，浓缩回收环状双发卡脱氧核酶，然后用75％的乙醇洗涤产物2-3次。置于空气中挥发水分，得到纯净的环状双发卡脱氧核酶。灭菌水溶解后，使用微量紫外分光光度计测定核酸的浓度。
2、Pb2+检测反应
向检测体系中加入1μM PbNO3、200nM分子信标MB-1(茎环结构，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ l)、100nM环状双发卡脱氧核酶hpDz-1，100nM pb2+特异性脱氧核酶GR5-1，50mM MgCl2，20mM Tris-HCl缓冲液(pH＝9)。于PCR仪中经50℃反应1h。同时设置未添加PbNO3的对照组，使用环状双发卡脱氧核酶hpDz-1和不带有双发卡的环状脱氧核酶Dz-1进行对比。将150μL样品加入到96孔板中，使用酶标仪测定样品的荧光值，激发波长设为490nm，扫描波长范围为510nm-610nm。
图3中的结果显示，当使用环状双发卡脱氧核酶时，Pb2+存在时，荧光值大幅增高。而未添加Pb2+的对照组荧光值极低，说明本方法的信号放大效率极高且背景值极低，可实现对Pb2+的检测。此外，当使用不带有双发卡的环状脱氧核酶时，未添加Pb2+时仍有较高的荧光值，说明环状双发卡脱氧核酶具有背景值低的优势，可用于Pb2+的高灵敏度检测。
表1实施例2中使用的寡核苷酸单链序列
Figure BDA0003114579220000051
注：斜体加粗部分为核糖核苷酸，其余为脱氧核糖核苷酸；下划线部分为双发卡结构。
实施例3重金属铅的检测
1、环状双发卡脱氧核酶的制备及纯化
1)双发卡脱氧核酶单链hpDz-2(5’-磷酸化，长度为64nt)通过成环反应制备环状双发卡脱氧核酶，制备时需借助成环辅助链Splint-2(长度为18nt)。形成的双发卡脱氧核酶结合臂长度为8nt，最适酶切温度为35℃。
2)环状双发卡脱氧核酶的制备：成环方式如图2所示。在成环体系中加入0.5μM的5’端磷酸化修饰的双发卡脱氧核酶单链hpDz-2，1μM成环辅助链Splint-2和5U T4 DNALigase(购自Thermo Scientific公司)，并加入1×T4 DNA Ligase Buffer(含40mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP，pH 7.8@25℃)，总体系为20μL。于PCR仪中经25℃恒温反应4h后，75℃温浴10min将酶灭活。
3)纯化：环化反应结束后，用核酸外切酶Exonulease I(购自Thermo Scientific公司)去除未环化的线性核酸链以及加入的成环辅助链；用冰乙醇沉淀，浓缩回收环状双发卡脱氧核酶，然后用75％的乙醇洗涤产物(2-3次)。置于空气中挥发水分，得到纯净的环状双发卡脱氧核酶。灭菌水溶解后，使用微量紫外分光光度计测定核酸的浓度。
2、Pb2+检测反应
向检测体系中加入1fM-1μM的PbNO3、200nM分子信标MB-2(茎环结构，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ l)、100nM环状双发卡脱氧核酶hpDz-2，100nM pb2+特异性脱氧核酶GR5-2，50mM MgCl2，20mM HEPES缓冲液(pH＝8)，总体系为150μL。于PCR仪中经35℃反应40min。同时设置未添加PbNO3的对照组。
将150μL样品加入到96孔板中，使用酶标仪测定样品的荧光值，激发波长设为490nm，扫描波长范围为510nm-610nm。在本实验中，采用(F-FB)/(F0-FB)来表示检测体系的信号放大效率。其中F为Pb2+存在时的荧光值，F0为未加入待检样品的背景荧光值，FB为不加入分子信标时反应缓冲液的荧光值。(F-FB)/(F0-FB)>1时，说明检测体系的信号被放大，可检测到Pb2+的存在，且(F-FB)/(F0-FB)的值越大表明信号放大效率越高。
图4中的结果显示，本方法可实现对不同浓度pb2+的检测，检测限可达100fM。并且，当pb2+浓度为100fM-1nM时，pb2+浓度的对数值与(F-FB)/(F0-FB)值呈线性关系，可用于对pb2+浓度的测定。
表2实施例3中使用的寡核苷酸单链序列
Figure BDA0003114579220000061
注：斜体加粗部分为核糖核苷酸，其余为脱氧核糖核苷酸；下划线部分为双发卡结构。
实施例4重金属铅的检测
1、环状双发卡脱氧核酶的制备及纯化
1)双发卡脱氧核酶单链hpDz-3(5’-磷酸化，长度为59nt)通过成环反应制备环状双发卡脱氧核酶。形成的双发卡脱氧核酶结合臂长度为8nt，最适酶切温度为35℃
2)环状双发卡脱氧核酶的制备：在成环体系中加入0.5μM的5’端磷酸化修饰的双发卡脱氧核酶单链hpDz-3，100U CircLigaseTM ssDNA Ligase II(购自Epicenter公司)，1×CircLigase II Reaction Buffer(含33mM Tris-Ac，66mM KAc，0.5mM DTT，pH 7.5)，2.5mM MnCl2和1M甜菜碱，总体系为100μL。于PCR仪中经60℃恒温反应16h后，80℃温浴10min将酶灭活。
3)纯化：环化反应结束后，用核酸外切酶Exonulease I(购自Thermo Scientific公司)去除未环化的线性核酸链；用冰乙醇沉淀，浓缩回收环状双发卡脱氧核酶，然后用75％的乙醇洗涤产物(2-3次)。置于空气中挥发水分，得到纯净的环状双发卡脱氧核酶。灭菌水溶解后，使用微量紫外分光光度计测定核酸的浓度。
2、Pb2+检测反应
向检测体系中加入1μM PbNO3、200nM分子信标MB-3(茎环结构，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ l)、100nM环状双发卡脱氧核酶hpDz-3，100nM pb2+特异性脱氧核酶GR5-3，50mM MgCl2，20mM HEPES缓冲液(pH＝8)，总体系为150μL。于PCR仪中经35℃反应50min。同时设置添加1μM ZnCl2、MnCl2、CaCl2、BaCl2、KCl、NaCl的对照组以验证本方法的特异性，同时设置PbNO3与其他盐离子同时存在的对照组以验证本方法的抗干扰性。
将150μL样品加入到96孔板中，使用酶标仪测定样品的荧光值，激发波长设为490nm，扫描波长范围为510nm-610nm。在本实验中，采用(F-FB)/(F0-FB)来表示检测体系的信号放大效率。其中F为Pb2+存在时的荧光值，F0为未加入待检样品的背景荧光值，FB为不加入分子信标时反应缓冲液的荧光值。(F-FB)/(F0-FB)>1时，说明检测体系的信号被放大，可检测到Pb2+的存在，且(F-FB)/(F0-FB)的值越大表明信号放大效率越高。
图5的结果显示，本方法的特异性良好，仅在pb2+存在时，有信号放大，且多种离子混合并不影响检测反应，说明本方法具有良好的抗干扰性能。
表3实施例4中使用的寡核苷酸单链序列
Figure BDA0003114579220000071
注：斜体加粗部分为核糖核苷酸，其余为脱氧核糖核苷酸；下划线部分为双发卡结构。
实施例5缓冲液种类和pH对检测的影响
1、环状双发卡脱氧核酶的制备及纯化
1)双发卡脱氧核酶单链hpDz-2同实施例3
2)环状双发卡脱氧核酶的制备：同实施例3
3)纯化：同实施例3
2、Pb2+检测反应
向检测体系中加入1μM的PbNO3、200nM分子信标MB-2(茎环结构，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ l)、100nM环状双发卡脱氧核酶hpDz-2，100nM pb2+特异性脱氧核酶GR5-2，50mM MgCl2，20mM的不同缓冲液(pH＝8)或不同pH值的Tris-HCl缓冲液，总体系为150μL。于PCR仪中经35℃反应40min。同时设置未添加PbNO3的对照组。
将150μL样品加入到96孔板中，使用酶标仪测定样品的荧光值，激发波长设为490nm，扫描波长范围为510nm-610nm。在本实验中，采用(F-FB)/(F0-FB)来表示检测体系的信号放大效率。其中F为Pb2+存在时的荧光值，F0为未加入待检样品的背景荧光值，FB为不加入分子信标时反应缓冲液的荧光值。(F-FB)/(F0-FB)>1时，说明检测体系的信号被放大，可检测到Pb2+的存在，且(F-FB)/(F0-FB)的值越大表明信号放大效率越高。
图6中的结果显示，在所用的四种缓冲液中，Tris-Ac、HEPES和Tris-HCl可引发检测体系的荧光信号放大，其中HEPES和Tris-HCl效果更好。不同pH反应的实验中，当Tris-HCl的pH值为6-11时，均可引发荧光信号放大。其中pH＝8-11时效果更好。
上述的实施例的结果表明本发明的方法具有较好的检测灵敏度，且信号放大效率较高。可以通过一步操作实现重金属pb2+的快速简便特异性检测，因此具有很好的推广应用价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 重金属铅检测试剂盒及方法与应用
<141> 2021-06-02
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tttccccatc tgaagtagcg ccgccgtata gtgactcgt 39
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (17)..(17)
<223> 核糖核苷酸
<220>
<221> stem_loop
<222> (39)..(68)
<223> 双发卡结构
<400> 2
tacaacgagt cactatagga agatggggaa aggctagcag tctgggacag actactcacg 60
gagtgagt 68
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgttgtaact cact 14
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> RBS
<222> (17)..(17)
<223> 核糖核苷酸
<400> 4
tacaacgagt cactatagga agatggggaa aggctagc 38
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cgttgtagct agcc 14
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (20)..(20)
<223> 核糖核苷酸G
<220>
<221> misc_RNA
<222> (21)..(21)
<223> 核糖核苷酸U
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 6
cctgcctttt tatagtgacn nttccccatc ttcctttttg gcagg 45
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tctatttctg aagtagcgcc gccgtatagt ga 32
<210> 8
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (16)..(16)
<223> 核糖核苷酸
<220>
<221> stem_loop
<222> (35)..(64)
<223> 双发卡结构
<400> 8
tacaacgatc actataggaa gaatagaggc tagcagtctg ggacagacta ctcacggagt 60
gagt 64
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atcgttgtaa ctcactcc 18
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (18)..(18)
<223> 核糖核苷酸G
<220>
<221> misc_RNA
<222> (19)..(19)
<223> 核糖核苷酸U
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 10
cgaggttttt atagtgannc tattcttatt ttcctcg 37
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tcagtctgaa gtagcgccgc cgtatagtga 30
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (16)..(16)
<223> 核糖核苷酸
<220>
<221> stem_loop
<222> (34)..(59)
<223> 双发卡结构
<400> 12
tacaacgatc actataggaa gactgaggct agcggctggg acagcccgca cggagtgcg 59
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_RNA
<222> (19)..(19)
<223> 核糖核苷酸G
<220>
<221> misc_RNA
<222> (20)..(20)
<223> 核糖核苷酸u
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 13
cgagcttttt tatagtgann cagtcttatt ttgctcg 37

Claims (7)

1.一种重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括pb2+特异性脱氧核酶、环状双发卡脱氧核酶、分子信标及缓冲液，所述缓冲液含Mg2+，pH值范围为8-11，不包括蛋白质类酶或抗体；
所述pb2+特异性脱氧核酶是一类具有催化功能的DNA分子，其空间结构中存在活性中心，当其专一地与pb2+结合时，活性中心被激活；
所述环状双发卡脱氧核酶为在脱氧核酶的活性中心的第7-8个碱基位置添加两个发卡结构或第8-9个碱基位置添加两个发卡结构，且脱氧核酶的线性形式通过首尾连接得到的单链环状序列；所述环状双发卡脱氧核酶中含有核糖核苷酸位点，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述的核糖核苷酸位点为pb2+特异性脱氧核酶的酶切位点；当所述酶切位点被酶切后，环状双发卡脱氧核酶断裂形成线性双发卡脱氧核酶；
所述分子信标是具有茎环结构的单链寡核苷酸，其环部含有与环状双发卡脱氧核酶结合臂的互补核酸片段，所述互补核酸片段的中间段为核糖核苷酸位点，其余均为脱氧核糖核苷酸；所述核糖核苷酸位点为线性双发卡脱氧核酶的酶切位点；所述分子信标带有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团和淬灭基团修饰在分子信标茎部结构的两端或内部，所述荧光基团和淬灭基团位于所述双发卡脱氧核酶的酶切位点的两侧。
2.根据权利要求1所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述pb2+特异性脱氧核酶的酶切位点由1-2个核糖核苷酸组成；所述双发卡脱氧核酶酶切位点由1-2个连续的核糖核苷酸组成。
3.根据权利要求1所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自FITC、FAM、VIC、ROX、TET、Texas Red、HEX、TAMRA、Cy3、Cy5、Rhodamine B以及Perylene中的一种或多种；所述淬灭基团选自Dabcyl、NFQ、QYS-7、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Anthraquinone以及TAMRA中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述环状双发卡脱氧核酶采用如下方法制备：
采用预测核酸二级结构的软件模拟要合成的环状脱氧核酶的二级结构；在DNA连接酶的作用下连接成环时，另设计一条短链DNA splint作为辅助连接，连接处两端的双链互补部分为5-9 bp；先对设计的单链脱氧核酶的5’端进行磷酸化处理，然后在DNA连接酶的作用下首尾相连成环，成环条件为：加入20 μM的磷酸化链1 μL，20 μM的splint 2 μM，1×的T4Buffer 2 μL，5U的T4DNA连接酶0.5 μL，总体系为20 μL，在25℃条件下反应4 h-6 h；
或者采用如下方法制备：
在成环体系中加入5’端磷酸化修饰的双发卡脱氧核酶单链，CircLigase™ ssDNALigase II，1×CircLigase II Reaction Buffer，MnCl2和甜菜碱，于PCR仪中经60℃恒温反应16 h后，80℃温浴10 min将酶灭活。
5.根据权利要求4所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，环化反应结束后，先用核酸外切酶去除未环化的线性核酸链以及加入的辅助DNA splint；将酶切处理后的产物用12%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后进行切胶回收；在回收后的样品中加入有机溶剂，去除样品中的蛋白杂质；最后再用冰乙醇沉淀，浓缩回收环状双发卡脱氧核酶；然后用75%的乙醇洗涤产物，置于空气中挥发水分，得到纯净的环状脱氧核酶。
6.根据权利要求1所述的重金属铅检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测浓度为100 fM-1 μM。
7.一种重金属铅检测方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于，包括：
将待测样品与权利要求1-6所述的重金属铅检测试剂盒中的pb2+特异性脱氧核酶、环状双发卡脱氧核酶、分子信标以及缓冲液混合后，在20℃~37℃条件下反应10 min~60 min；首先，Pb2+特异性脱氧核酶以环状双发卡脱氧核酶为底物进行酶切，生成线性双发卡脱氧核酶；然后线性双发卡脱氧核酶对分子信标进行酶切，使得分子信标两端修饰的荧光基团跟淬灭基团分离，分子信标释放荧光信号，最终将极微量的Pb2+转化为强荧光信号；利用酶标仪检测反应体系中的荧光值，并将该荧光值与未添加待检样品的对照组中的背景荧光值进行比较以判断待检样品中是否含有重金属铅。
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