CN113388585A - 一种噬菌体高滴度培养方法与应用 - Google Patents

一种噬菌体高滴度培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种T7噬菌体高滴度培养方法及其应用。本发明利用基因工程操作方法构建表达gene17.5串联gene19.5编码蛋白的重组大肠杆菌作为补偿宿主，再通过反向遗传方法在补偿宿主中拯救出gene17.5、gene19.5双基因缺失株噬菌体，双基因缺失T7噬菌体感染补偿宿主后在宿主内复制、富集，并在诱导gene17.5、19.5编码蛋白表达后裂解宿主。通过推迟宿主的裂解时间，增加噬菌体在宿主内的复制循环次数达到高滴度培养目的。

Description

一种噬菌体高滴度培养方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种噬菌体高滴度培养方法及应用，更具体地，涉及补偿宿主的构建、gene17.5、gene19.5双基因缺失T7噬菌体反向遗传拯救，并在此基础上建立噬菌体高滴度培养方法。
背景技术
噬菌体是侵染细菌的病毒，其识别宿主具有高度的特异性，其结构简单、基因数量少、容易被多元化群体操纵，因此成为分子生物学研究的重要模型系统。一个噬菌体颗粒可以杀灭数十亿个细菌，这种强大的杀菌能力使其有望成为抗生素替代品而备受关注。1985年G.P Smith创立了噬菌体表面展示技术，该技术可将外源蛋白的基因型和表型、蛋白质分子活性和噬菌体的可繁殖性有机结合。目前，噬菌体展示技术被广泛应用于疾病的诊断和治疗、蛋白分子互作、抗原表面筛选、细胞信号传导、抗体工程和新型疫苗研制等领域。解析噬菌体生命活动周期，尤其是噬菌体复制循环次数与启动宿主细菌裂解之间的调控关系，探索是否可以通过延长宿主裂解时间、增加复制循环数的方式在细菌内累积更多子代噬菌体颗粒、提高噬菌体繁殖滴度，对于廉价生产噬菌体类产品具有重要意义。
除温和型噬菌体外，烈性噬菌体均以裂解宿主的方式完成一个营养生长周期，进而释放子代粒子开始新一轮侵染。前期研究表明，多数双链DNA噬菌体均采用“穿孔素(Holin)-溶菌酶(Endolysin)”的二元系统裂解宿主细菌。Ry Yong等人最新研究表明，双链DNA噬菌体裂解过程包含三个步骤：穿孔素合成后在细胞膜上聚集，在特定时间点突然形成跨膜孔；溶菌酶通过跨膜孔切割内、外膜之间的肽聚糖(PG，peptidoglycan)；Spanin通过构象改变使细菌内、外膜融合，形成裂解碎片最终裂解细菌。随着对噬菌体分子结构和基因功能的解析、对溶菌机制认识的深入和明确，发现不同噬菌体的裂解方式存在一定差异。参与裂解宿主的重要蛋白分子：Holin、Endolysin、Spanin均有两种形式，理论上可以组合成8种裂解宿主的方式，目前仅其中的6种裂解方式找到对应的噬菌体。大多数噬菌体的裂解方式只是建立在基因比对分析后的理论推测，并未有明确的实验证实。
公开于该背景知识的信息旨在增加对该发明的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种噬菌体高滴度培养方法。本发明首先构建表达gene17.5、gene19.5的重组大肠杆菌作为补偿宿主，检验表达产物对宿主损伤作用；再经反向遗传方法在补偿宿主内拯救出缺失gene17.5、gene19.5的重组噬菌体(命名为T7-delgene17.5/19.5)；进一步地，本发明还优化该双基因缺失噬菌体在补偿宿主内高滴度培养的工艺参数，最终确定T7噬菌体高滴度培养方法，实现子代噬菌体数量显著提高。利用建立的方法培养表面展示口蹄疫病毒VP1抗原的重组噬菌体，证明该方法具有应用前景。
为了实现上述目的，本发明提供一种T7噬菌体高滴度培养方法，该方法包括：
步骤I.构建诱导表达gene17.5、gene19.5编码蛋白的补偿宿主；gene17.5的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，gene19.5的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示；
5’-CCATGGtgGTGCTATCATTAGACTTTAACAACGAATTGATTAAGGCTGCTCCAATTGTTGGGACGGGTGTAGCAGATGTTAGTGCTCGACTGTTCTTTGGGTTAAGCCTTAACGAATGGTTCTACGTTGCTGCTATCGCCTACACAGTGGTTCAGATTGGTGCCAAGGTAGTCGATAAGATGATTGACTGGAAGAAAGCCAATAAGGAGTGACATCATCATCATCATCAC-3’(SEQ ID NO：1)
5’-ATGTTCCGCTTATTGTTGAACCTACTGCGGCATAGAGTCACCTACCGATTTCTTGTGGTACTTTGTGCTGCCCTTGGGTACGCATCTCTTACTGGAGACCTCAGTTCACTGGAGTCTGTCGTTTGCTCTATACTCACTTGTAGCGATTAGCATCATCATCATCATCACTAAGGATCC-3’(SEQ ID NO：2)
步骤II.通过反向遗传方法在补偿宿主内拯救gene17.5、gene19.5双缺失的T7噬菌体；
步骤III.通过诱导gene17.5和gene19.5编码蛋白的表达实现对补偿宿主裂解过程的控制；通过推迟补偿宿主起始裂解的时间点，增加双基因缺失株T7噬菌体在胞内的复制循环次数，从而实现T7噬菌体的高滴度培养。
具体地，步骤I包括：
(1)以T7噬菌体基因组为模板，以引物F4/R4、F5/R5分别扩增gene17.5和gene19.5；通过引物在gene17.5上游引入NcoⅠ酶切位点，在gene19.5下游引入BamHⅠ酶切位点；
F4：5’-agaCCATGGtgGTGCTATCATTAGACT-3’(SEQ ID NO：3)
R4：5’-GCGGAACATGTGATGATGATGATGATGTCACTCCTTATTGGCTTTCTT-3’(SEQ ID NO：4)
F5：5’-AGGAGTGACATCATCATCATCATCACATGTTCCGCTTATTGTTGAAC-3’(SEQ ID NO：5)
R5：5’-agaGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGCTAATCGCTACA-3’(SEQ ID NO：6)
(2)以gene17.5和gene19.5为模板，通过引物F4/R5，经SOE-PCR方法将二者串联，得到串联基因；
(3)通过NcoⅠ和BamHⅠ位点将串联基因插入pET-28a重组质粒载体，得到重组质粒；
(4)将重组质粒转化大肠杆菌BL21，构建补偿宿主，采用IPTG诱导gene17.5和gene19.5编码蛋白的表达。
具体地，步骤II包括：
(1)提取T7噬菌体基因组，SfiⅠ单酶切，电泳鉴定，切胶回收酶切位点左侧34kb基因片段；
(2)以T7噬菌体基因组为模板，以引物F1和R1，PCR扩增SfiⅠ酶切位点至gene17.5之间的片段S1，以引物F2和R2扩增gene17.5下游至gene19.5上游之间的片段S2；以引物F3和R3扩增gene19.5下游至T7噬菌体基因组右侧末端之间的片段S3，通过SOE-PCR将S1、S2和S3片段串联，得到串联片段并经SfiⅠ单酶切；
F1：5’-ataGGCCGTTGTGGCCACTGATGGTA-3’(SEQ ID NO：7)
R1：5’-CTTATCCTTTTCCATACATACTTGTACCTCCTTGAGAGT-3’(SEQ ID NO：8)
F2：5’-ACTCTCAAGGAGGTACAAGTATGTATGGAAAAGGATAAG-3’(SEQ ID NO：9)
R2：5’-ATCAGTCGGTCAGGAAGACCGAGTCTCCTCCCTTTATGTT-3’(SEQ ID NO：10)
F3：5’-AACATAAAGGGAGGAGACTCGGTCTTCCTGACCGACTGAT-3’(SEQ ID NO：11)
R3：5’-AGGGACACAGAGAGACACTCAAGGTAA-3’(SEQ ID NO：12)
(3)将酶切回收的T7噬菌体基因组SfiⅠ位点左侧片段和同酶处理的串联片段进行连接，连接产物导入补偿宿主，拯救得到gene17.5、gene19.5双缺失的T7噬菌体。
具体地，步骤III包括：
(1)甘油冻存的补偿宿主在LB平皿上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种LB培养液，37℃震荡培养过夜，取过夜培养物接种LB培养液，培养至OD600＝1.5；
(2)以MOI＝0.001的比例将gene17.5、gene19.5双缺失的T7噬菌体接种到已培养的补偿宿主中，37℃震荡培养；
(3)加入IPTG至培养体系中，37℃震荡，直至补偿宿主完全裂解；
(4)添加RNase A、Dnase I，37℃震荡，继续培养；
(5)培养体系中加入氯仿继续震荡，终止培养，回收子代噬菌体。
更具体地，步骤III包括：
(1)甘油冻存的补偿宿主在LB平皿上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD600＝1.5；
(2)以MOI＝0.001的比例将双基因缺失的T7噬菌体接种到已培养的补偿宿主中，37℃、200转/分震荡培养3h；
(3)加入10mM/L工作浓度的IPTG至培养体系中，37℃、200转/分震荡，直至补偿宿主完全裂解；
(4)添加终浓度为1μg/mL的RNase A、Dnase I，37℃、200转/分震荡，继续培养30min；
(5)培养体系中加入1％终浓度氯仿继续震荡30min，终止培养，回收子代噬菌体。
本发明的方法可用于噬菌体培养，特别是噬菌体的商品化生产。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)通过诱导gene17.5、19.5编码蛋白的表达，实现裂解宿主起始时间点的人工调控。
(2)推迟起始裂解时间，延长缺失株T7噬菌体在宿主内复制循环数，从而显著提高子代噬菌体的产量。
(3)gene17.5、gene19.5双基因缺失T7噬菌体较gene17.5单基因缺失遗传稳定性更好，在补偿宿主中培养滴度更高。
(4)噬菌体高滴度培养方法的建立极大降低噬菌体抗菌制剂或噬菌体类疫苗的生产成本。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了双基因缺失T7噬菌体拯救流程图。
图2示出了验证表达gene17.5、gene19.5编码蛋白的补偿宿主构建的电泳图。
图3示出了补偿宿主诱导表达产物鉴定结果。
图4示出了双基因缺失T7噬菌体的拯救电泳图。
图5示出了双基因缺失T7噬菌体鉴定结果。
图6示出了基因缺失株T7噬菌体爆发量比较结果。
图7示出了T7噬菌体高滴度培养工艺优化结果。
图8示出了T7-VP1噬菌体的高滴度培养结果。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1表达gene17.5、gene19.5编码蛋白的补偿宿主构建
1、重组质粒的构建
根据T7噬菌体基因组序列，对照gene17.5上下游序列设计引物F4、R4，委托金斯瑞公司合成，在上游引物5’端添加NcoⅠ酶切位点，下游引物5’端添加His Tag标签、终止密码子。对照gene19.5上下游序列设计引物F5、R5，在上游引物5’端添加起始密码子，下游引物5’端添加终止密码子、His Tag标签和BamHⅠ酶切位点。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见约200bp大小的gene17.5、150bp大小的gene19.5，见图2的(A)。以扩增的基因片段为模板，利用引物F4、R5，通过SOE-PCR扩增gene17.5、gene19.5融合片段，见图2的(B)。然后用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切含有融合基因，插入经同酶处理的pET-28a载体，构建同时表达gene17.5、gene19.5编码蛋白的重组质粒载体，双酶切鉴定(图2的(C))、测序分析融合基因的碱基序列。
2、gene17.5、gene19.5编码蛋白的诱导表达
将构建的重组表达质粒载体化学转化法导入大肠杆菌BL21(DE3)，利用氨苄青霉素(Amp)筛选阳性菌，即为补偿宿主。Gene17.5/19.5编码蛋白的诱导表达过程如下：挑取补偿宿主接种3mL氨苄抗体LB培养液，37℃摇床过夜培养。次日，以1:100比例将过夜培养的种子转接到10mL新鲜培养液，37℃摇床过夜培养至菌浓OD600＝0.5，然后加入IPTG使之终浓度达到5mM/L并持续摇床培养，直至大肠杆菌裂解，培养液澄清(图3的A)。SDS-PAGE、Western-blot检测显示holin蛋白得到表达，见图3的B和C。
实施例2 Gene17.5、gene19.5双缺失T7噬菌体拯救
1、T7噬菌体基因组的提取
5000rpm、15min离心收集T7噬菌体培养上清液，添加终浓度为1μg/mL的RNase A、Dnase I，37℃反应1h，添加1/4体积的PEG-NaCl溶液(20％(w/v)PEG-8000，2.5M NaCl)，摇匀后4℃放置2-3h，12000g、30min离心收集沉淀。用5mL SM液(NaCl 5.8g，MgSO4.7H2O 2g，1MTris-HCl(PH7.5)50mL，2％明胶5mL，定容到1L)重悬沉淀，添加50μL 10％SDS、50μL 0.5MEDTA，65℃消化30min，加等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，抽提2次。转移上清，用等体积氯仿/异戊醇(24:1)，再抽提2次。取上清，加等体积异丙醇沉淀，12000g离心，收集沉淀用1mL预冷的70％乙醇洗涤沉淀1-2次，将沉淀室温下晾干，然后溶于200μL TE溶液，即为提取的T7噬菌体DNA。分别取5μL DNA用于核酸定量、琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物-20℃保存备用。
2、T7噬菌体基因片段的制备
选择位于gene17.5上游约400bp处的单一酶切位点SfiⅠ切割T7噬菌体基因组，琼脂凝胶电泳鉴定酶切产物，切胶回收酶切位点左侧约34kb条带(图4的(D))。以T7噬菌体基因组为模板，以表-1中的引物F1和R2，PCR扩增SfiⅠ酶切位点至gene17.5之间的片段S1(图4的(A))，引物F2和R2扩增gene17.5至gene19.5之间的片段S2(图4的(B)),引物F3和R3扩增gene19.5至T7噬菌体基因组右侧末端之间的片段S3(图4的(A))。通过引物在S1片段上游引入酶切位点SfiⅠ，下游融合20bp长度的S2上游片段；S2片段上下分别融合20bp长度的S1和S3基因序列；S3片段上游融合20bp长度的S2下游基因序列。以S1、S2、S3片段为模板，利用引物F1和R3扩增完整基因片段，如图4的(C)。
3、双基因缺失T7噬菌体的拯救
将酶切回收的T7噬菌体左侧片段和SfiⅠ酶切处理的片段与S1+S2+S3融合片段以摩尔比1:1进行连接，酒精沉淀连接产物，10μl无菌超纯水重悬连接产物。用常规方法制备100μl补偿宿主电转化感受态细胞，并与10μl连接产物混合，转入预冷的2mm电极杯中冰置30分钟。在电转化上以1500V、200Ω条件电击，电转化产物迅速转入1mL LB培养液中，37℃孵育15分钟，将复苏后的补偿宿主涂布在含有10mM/L IPTG的LB琼脂板中，37℃温箱继续培养3-5小时，直至出现明显的噬菌斑。选择gene17.5上下游约300bp处设计检测引物F6和R6(序列如表1所示)，PCR方法初步鉴定拯救出的基因缺失噬菌体。提取疑似阳性的双基因缺失噬菌体基因组，SfiⅠ单酶切基因组，并设T7-wt酶切对照，电泳检测酶切产物，可见双基因缺失后酶切条带偏小(图5)。筛选到双基因缺失的阳性噬菌体命名为T7-del17.5/19.5噬菌体。双基因缺失噬菌体拯救流程见图1。
4、单基因与双基因缺失噬菌体生物特性比较
将发明人前期构建的gene17.5单基因缺失T7噬菌体与本发明中构建的gene17.5、gene19.5双基因缺失T7噬菌体做遗传稳定性和爆发量两个指标的对比。甘油冻存的补偿宿主菌株在LB固体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养。从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD600＝0.5左右，分别接种单基因、双基因缺失噬菌体，37℃、150转/分震荡培养2小时，加入终浓度10mmol/L IPTG开始诱导gene17.5、gene19.5编码蛋白的表达，直至菌液由浑浊变为澄清。连续重复上述操作20次，将基因缺失噬菌体连续传20代。二代测序两个基因缺失株噬菌体全基因组序列，结果显示gene17.5单基因缺失噬菌体在基因组36836位(36836C→AA24D)、36878位(36878A→G E38G)有两个错义突变。测定第20代基因缺失T7噬菌体爆发量，发现单基因缺失株传代后爆发量显著下降，而双基因缺株缺失株爆发量无明显变化，见图6。
实施例3 T7-△holin高滴度培养工艺
1、双基因缺失噬菌体种子液的制备
甘油冻存的补偿宿主菌株在LB固体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养。从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD600＝0.5左右，接种鉴定阳性的T7-del17.5/19.5噬菌体，37℃、150转/分震荡培养2小时，加入终浓度10mmol/L IPTG开始诱导gene17.5、gene19.5编码蛋白的表达，直至菌液由浑浊变为澄清，双层琼脂法在100mmol/L IPTG平板上测定噬菌体滴度，并将培养的噬菌体调整浓度为1×1011pfu/mL，并按照4‰的比例加入甲醛溶液，4℃保存备用。
2、MOI条件优化
以1:100比例转接补偿宿主至300mL新鲜培养液，37℃、200转/分震荡培养，培养至OD600＝1.0左右，测定该时间点菌落浓度。将培养的补偿宿主分装成50mL/瓶，并按照MOI＝0.01、0.001、0.0001和0.00001比例接种T7-△holin噬菌体种子，37℃摇床继续培养2小时，加入10mM/L工作浓度IPTG，持续震荡培养直至完全裂解。双层琼脂法测定培养产物中噬菌体滴度，比较不同MOI接种条件下对子代噬菌体产量的影响。结果见图7A，在MOI为0.001时子代噬菌体产量最高。
3、起始接种噬菌体的补偿宿主浓度优化
以1:100比例转接补偿宿主至300mL新鲜培养液，37℃、200转/分震荡培养，分别在补偿宿主浓度OD600＝0.5、1.0、1.5、2.0时取出50mL至新的三角摇瓶，以最适MOI＝0.001接种T7-del17.5/19.5噬菌体种子，37℃摇床继续培养2小时，加入10mM/L工作浓度IPTG，持续震荡培养直至完全裂解。双层琼脂法测定培养产物中噬菌体滴度，比较不同起始菌浓对子代噬菌体产量的影响。结果见图7B，补偿宿主培养至OD600值为1.5时开始接种噬菌体收获的子代噬菌体产量最高。
4、起始诱导时间的优化
以1:100比例转接补偿宿主至300mL新鲜培养液，37℃、200转/分震荡培养，选择补偿宿主菌浓达到OD600值为1.5时接种噬菌体，将培养的菌液分装成50mL/瓶，并以最适的MOI＝0.001接种T7-del17.5/19.5噬菌体种子。37℃摇床继续培养，并分别在接种后的1、1.5、2、2.5小时加入10mM/L工作浓度阿拉伯糖，持续震荡培养直至完全裂解。双层琼脂法测定培养产物中噬菌体滴度，比较不同起始诱导时间对子代噬菌体产量的影响。结果如图7C所示，接种噬菌体后1.5小时开始诱导gene17.5、gene19.5编码蛋白的表达，最终收获的子代噬菌体产量最大。
实施例4 T7噬菌体高滴度培养方法的应用
发明人前期构建表面展示口蹄疫病毒VP1抗原的重组T7噬菌体(T7-VP1)，旨在利用该重组噬菌体作为抗原制备口蹄疫疫苗。利用本发明建立的T7噬菌体高滴度培养方法，制备T7-VP1噬菌体抗原，提高疫苗抗原含量降低生产成本。操作流程如下：利用反向遗传方法在补偿宿主中拯救出gene17.5、gene19.5双基因缺失的T7-del17.5/19.5-VP1噬菌体。以1:100比例转接补偿宿主至1000mL新鲜培养液，37℃、200转/分震荡培养，选择补偿宿主菌浓达到OD600值为1.5时以MOI＝0.001接种T7-del17.5/19.5-VP1噬菌体，接种后每隔0.5小时取样检测。37℃摇床继续培养1.5小时，然后加入10mM/L工作浓度IPTG诱导gene17.5、gene19.5编码蛋白的表达，持续震荡培养直至完全裂解。同时设置T7-del17.5-VP1单基因缺失噬菌体对照。添加终浓度为1μg/mL的RNase A、Dnase I，37℃反应继续震荡30分钟后停止培养。5000rpm、15分钟离心，去除宿主细胞碎片，双层琼脂法测定T7-del17.5/19.5-VP1重组噬菌体滴度，SDS-PAGE和Western-blot检测噬菌体表面展示VP1蛋白表达情况。由于VP1抗原蛋白与T7噬菌体衣壳蛋白相融合而展示在噬菌体头部，因此通过检测VP1融合蛋白的量来代表子代噬菌体含量。从图8的A和B可以看出T7-del17.5/19.5-VP1在补偿宿主中培养，较单价缺失T7-del17.5-VP1相同条件下产生的VP1融合蛋白的产量高。由此可见，本发明提供的T7噬菌体高滴度培养方法能够高效的制备T7-VP1重组噬菌体。
表1引物序列表
Figure BDA0003111093160000121
注：下划线为限制性酶切位点。
综上所述，本发明通过构建诱导gene17.5、gene19.5编码蛋白表达的重组大肠杆菌作为补偿宿主，在此基础上利用反向遗传方法拯救gene17.5、gene19.5双缺失的T7噬菌体，优化该噬菌体在补偿宿主中的培养条件，最终建立T7噬菌体高滴度培养方法，本发明为噬菌体类产品的开发和生产奠定基础。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更。
序列表
<110> 江苏农牧科技职业学院
<120> 一种噬菌体高滴度培养方法与应用
<141> 2021-06-03
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 230
<212> DNA
<213> Bacteriophage T7
<400> 1
ccatggtggt gctatcatta gactttaaca acgaattgat taaggctgct ccaattgttg 60
ggacgggtgt agcagatgtt agtgctcgac tgttctttgg gttaagcctt aacgaatggt 120
tctacgttgc tgctatcgcc tacacagtgg ttcagattgg tgccaaggta gtcgataaga 180
tgattgactg gaagaaagcc aataaggagt gacatcatca tcatcatcac 230
<210> 2
<211> 177
<212> DNA
<213> Bacteriophage T7
<400> 2
atgttccgct tattgttgaa cctactgcgg catagagtca cctaccgatt tcttgtggta 60
ctttgtgctg cccttgggta cgcatctctt actggagacc tcagttcact ggagtctgtc 120
gtttgctcta tactcacttg tagcgattag catcatcatc atcatcacta aggatcc 177
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agaccatggt ggtgctatca ttagact 27
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcggaacatg tgatgatgat gatgatgtca ctccttattg gctttctt 48
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aggagtgaca tcatcatcat catcacatgt tccgcttatt gttgaac 47
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agaggatcct tagtgatgat gatgatgatg ctaatcgcta ca 42
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ataggccgtt gtggccactg atggta 26
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cttatccttt tccatacata cttgtacctc cttgagagt 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
actctcaagg aggtacaagt atgtatggaa aaggataag 39
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atcagtcggt caggaagacc gagtctcctc cctttatgtt 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
aacataaagg gaggagactc ggtcttcctg accgactgat 40
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
agggacacag agagacactc aaggtaa 27
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
tagtgctggc ggtggggta 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ccttgagtat atcactgtaa 20

Claims (5)

1.一种T7噬菌体高滴度培养方法，其特征在于，该方法包括：
步骤I.构建诱导表达gene17.5、gene19.5编码蛋白的补偿宿主；gene17.5的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，gene19.5的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示；
步骤II.通过反向遗传方法在补偿宿主内拯救gene17.5、gene19.5双缺失的T7噬菌体；
步骤III.通过诱导gene17.5和gene19.5编码蛋白的表达实现对补偿宿主裂解过程的控制；通过推迟补偿宿主起始裂解的时间点，增加双基因缺失株T7噬菌体在胞内的复制循环次数，从而实现T7噬菌体的高滴度培养。
2.根据权利要求1所述的T7噬菌体高滴度培养方法，其特征在于，步骤I包括：
(1)以T7噬菌体基因组为模板，以引物F4/R4、F5/R5分别扩增gene17.5和gene19.5；通过引物在gene17.5上游引入NcoⅠ酶切位点，在gene19.5下游引入BamHⅠ酶切位点；
F4：5’-agaCCATGGtgGTGCTATCATTAGACT-3’(SEQ ID NO：3)
R4：5’-GCGGAACATGTGATGATGATGATGATGTCACTCCTTATTGGCTTTCTT-3’(SEQ ID NO：4)
F5：5’-AGGAGTGACATCATCATCATCATCACATGTTCCGCTTATTGTTGAAC-3’(SEQ ID NO：5)
R5：5’-agaGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGCTAATCGCTACA-3’(SEQ ID NO：6)
(2)以gene17.5和gene19.5为模板，通过引物F4/R5，经SOE-PCR方法将二者串联，得到串联基因；
(3)通过NcoⅠ和BamHⅠ位点将串联基因插入pET-28a重组质粒载体，得到重组质粒；
(4)将重组质粒转化大肠杆菌BL21，构建补偿宿主，采用IPTG诱导gene17.5和gene19.5编码蛋白的表达。
3.根据权利要求1所述的噬菌体高滴度培养方法，其特征在于，步骤II包括：
(1)提取T7噬菌体基因组，SfiⅠ单酶切，电泳鉴定，切胶回收酶切位点左侧34kb基因片段；
(2)以T7噬菌体基因组为模板，以引物F1和R1，PCR扩增SfiⅠ酶切位点至gene17.5之间的片段S1，以引物F2和R2扩增gene17.5下游至gene19.5上游之间的片段S2；以引物F3和R3扩增gene19.5下游至T7噬菌体基因组右侧末端之间的片段S3，通过SOE-PCR将S1、S2和S3片段串联，得到串联片段并经SfiⅠ单酶切；
F1：5’-ataGGCCGTTGTGGCCACTGATGGTA-3’(SEQ ID NO：7)
R1：5’-CTTATCCTTTTCCATACATACTTGTACCTCCTTGAGAGT-3’(SEQ ID NO：8)
F2：5’-ACTCTCAAGGAGGTACAAGTATGTATGGAAAAGGATAAG-3’(SEQ ID NO：9)
R2：5’-ATCAGTCGGTCAGGAAGACCGAGTCTCCTCCCTTTATGTT-3’(SEQ ID NO：10)
F3：5’-AACATAAAGGGAGGAGACTCGGTCTTCCTGACCGACTGAT-3’(SEQ ID NO：11)
R3：5’-AGGGACACAGAGAGACACTCAAGGTAA-3’(SEQ ID NO：12)
(3)将酶切回收的T7噬菌体基因组SfiⅠ位点左侧片段和同酶处理的串联片段进行连接，连接产物导入补偿宿主，拯救得到gene17.5、gene19.5双缺失的T7噬菌体。
4.根据权利要求1所述的噬菌体高滴度培养方法，其特征在于，步骤III包括：
(1)甘油冻存的补偿宿主在LB平皿上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种LB培养液，37℃震荡培养过夜，取过夜培养物接种LB培养液，培养至OD600＝1.5；
(2)以MOI＝0.001的比例将gene17.5、gene19.5双缺失的T7噬菌体接种到已培养的补偿宿主中，37℃震荡培养；
(3)加入IPTG至培养体系中，37℃震荡，直至补偿宿主完全裂解；
(4)添加RNase A、Dnase I，37℃震荡，继续培养；
(5)培养体系中加入氯仿继续震荡，终止培养，回收子代噬菌体。
5.权利要求1-4中任意一项所述的方法在噬菌体培养中的应用。
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