CN113376128B - 一种利用咖啡渣荧光碳量子点检测甜蜜素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体为制备咖啡渣荧光碳量子点并将其用于食品添加剂甜蜜素的检测。本发明解决的技术问题是提供一种咖啡渣荧光碳量子点的制备方法及其在食品添加剂检测领域的应用。本发明制备的荧光碳量子点具有荧光强、分散性好、稳定性好；将其作为传感器，用于检测甜蜜素，呈现荧光增强“turn on”型，具有灵敏度高、稳定性强、选择性好、检测成本低等优点，针对甜蜜素的线性检测最佳浓度范围为2.8～56μmol/L，检出限为3.16μmol/L，远低于国标GB 5009.97‑2016所提供检出限49.7μmol/L，与其它检测方法相比具有显著竞争力，可作为快速、便捷、准确地检测甜蜜素的有效方法，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及咖啡渣荧光碳量子点的制备及其在甜蜜素检测中的应用，属于食品添加剂检测领域。
背景技术
甜蜜素(环己基氨基磺酸钠)是一种人工合成的甜味剂，常用作食品添加剂来提升食品口感，相较于其他糖类物质不会受到胰岛素的调控，避免了血压升高和肥胖症等症状，适合作为糖类替代物缓解糖尿病人摄食中的苦味。但最新欧盟食品科学委员会规定了人体每日甜蜜素摄入量(ADI)为0～7mg/(kg·bw)。我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》GB 2760-2014中明确规定甜蜜素的使用范围和用量(0.65～8.0g/kg)，凡是超过使用规范均属于滥用食品添加剂，所以探究快速、便捷、准确地检测甜蜜素方法已迫在眉睫。
当前《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》GB 5009.97-2016采用了三种测定甜蜜素的方法：气相色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法。此外，文献报道涉及到离子色谱、毛细管区带电泳-间接紫外、近红外光谱、分光光度等方法来测定食品中甜蜜素的含量(详见文献张子臣,朱爱国,徐薇,等.食品中甜蜜素的应用及检测方法的比较[J].食品安全质量检测学报,2019,010(005):1261-1267.；莫益倩,廖雯意,肖之敏,等.食品中甜蜜素检测方法的研究进展[J].食品安全质量检测学报,2020(16)；王秀玲,叶升锋,桑华春.食品中甜蜜素的快速测定[J].食品研究与开发,2015(07):98-99.)。以上方法各有特点，但也存在操作繁琐、设备昂贵、误差大等问题，亟待探索一种灵敏度高、方便、快捷、特异性好的检测方法。
碳量子点是一种以碳元素为主体的新型荧光碳纳米材料，这种优质材料得到了各界的广泛关注。相较于传统的半导体量子点和有机染料，碳量子点因基于生物质的碳量子点而具有高水溶性、耐光性、低毒性以及良好的生物适应性等优势而广泛应用于生物成像、生物传感、生物分子传送。当前常以农林废弃物、厨余垃圾、粮食、食用菌等原料制备碳量子点，但利用咖啡渣制备碳量子点尚未见报道。
咖啡是世界三大饮品之一，而每生产1kg咖啡将产生0.9kg咖啡渣，咖啡渣中含有脂肪酸、木质素、纤维素和半纤维素等有机物，被视为新生代极具潜力的可持续发展的生物质资源，因此对咖啡渣资源化利用成为新的热点。本发明首次采用咖啡渣制备碳量子点，利用碳量子点与待测物质之间的相互作用来减弱或增强荧光，从而实现快速、准确地检测微量待检物。
发明内容
本发明解决的第一个技术问题是咖啡渣荧光碳量子点的制备。
本发明咖啡渣荧光碳量子点的制备方法，制备步骤如下：
a、将适量咖啡渣放入烧杯、加入蒸馏水，磁力搅拌，将搅拌混匀的咖啡渣溶液转移到反应釜；
b、将反应釜放入烘箱，在设定的温度下反应；
c、待反应结束，取出反应釜，自然冷却至室温，然后倒出反应液，将反应液用滤纸过滤，收集滤液旋转蒸发、干燥、研磨，得到咖啡渣荧光碳量子点。
优选的，在a步骤前，用乙醇与蒸馏水的混合液(体积比7：3)超声清洗反应釜和烧杯 15min。
优选的，a步骤的具体操作为：称取0.125g咖啡渣放入烧杯，加入40mL的蒸馏水，磁力搅拌20～30s，随后将搅拌混匀的咖啡渣溶液倒进反应釜，进行b步骤。
优选的，b步骤中，反应温度为120℃，反应时间为10h。
优选的，c步骤中，倒出反应液，用滤纸过滤获得澄清的碳量子点溶液，利用旋转蒸发仪旋蒸至近干，转移到烘箱内烘干、研磨得到固体粉末状的碳量子点。
本发明解决的第二个技术问题是咖啡渣荧光碳量子点在甜蜜素检测中的应用。
本发明咖啡渣荧光碳量子点，采用上述方法制备后，通过透射电镜可以看出碳量子点平均粒径在5.9±1.9nm且分布较为均匀，荧光光谱图可以看出该材料具有良好荧光性质。
本发明咖啡渣荧光碳量子点，采用上述方法制备后，咖啡渣荧光碳量子点在λex＝370nm 激发下获得其最大发射在λem＝460nm，通过将一定量的咖啡渣荧光碳量子点与甜蜜素相互作用后，甜蜜素在2.8～56μmol/L浓度范围内与咖啡渣荧光碳量子点的荧光强度变化成良好线性关系，R2＝0.992。
本发明咖啡渣荧光碳量子点，采用上述方法制备后，在碱性环境下(pH＝7～11)，咖啡渣荧光碳量子点对甜蜜素保持良好的检出效果。
本发明咖啡渣荧光碳量子点，采用上述方法制备后，咖啡渣荧光碳量子点对甜蜜素检测灵敏度高，检出限为3.16μmol/L，低于国标GB 5009.97-2016所提供检出限49.7μmol/L，可作为快速检测甜蜜素的手段。
附图说明
图1为本发明中是以咖啡渣为原料制备的碳量子点XRD图。
图2为本发明中制备的咖啡渣荧光碳量子点FT-IR图。
图3为本发明中咖啡渣荧光碳量子点TEM图。
图4A为本发明中的咖啡渣荧光碳量子点在不同激发波长下的荧光发射光谱图；图4B 为本发明中的咖啡渣荧光碳量子点在λem＝460nm的激发光谱图和λex＝370nm的发射光谱图。
图5为本发明中制备咖啡渣荧光碳量子点检测甜蜜素的标准曲线。图5内嵌图为本发明中不同浓度的甜蜜素对咖啡渣荧光碳量子点荧光传感影响图。
图6为本发明中甜蜜素检测过程中待测溶液的pH值对咖啡渣荧光碳量子点的荧光强度影响图。
图7为本发明中甜蜜素和其他干扰物质对咖啡渣荧光碳量子点荧光传感影响对比图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明以下实例中所采用的试剂、原材料和设备如下：
表1 本发明中所用到的试剂和原材料
| 药品名称 | 化学式 | 规格 | 生产厂家 |
| 甜蜜素 | C<sub>6</sub>H<sub>12</sub>NSO<sub>3</sub>Na | 分析纯 | 麦克林生化科技有限公司 |
| 无水乙醇 | CH<sub>3</sub>CH<sub>2</sub>OH | 分析纯 | 成都科龙化工试剂厂 |
| 乙酸 | CH<sub>3</sub>COOH | 分析纯 | 成都科龙化工试剂厂 |
| 硼酸 | H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> | 分析纯 | 成都科龙化工试剂厂 |
| 磷酸 | H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub> | 分析纯 | 成都科龙化工试剂厂 |
| 氢氧化钠 | NaOH | 分析纯 | 天津市致远化学试剂有限公司 |
| 蔗糖 | C<sub>12</sub>H<sub>12</sub>O<sub>11</sub> | 分析纯 | 成都科龙化工试剂厂 |
| 无水氯化钙 | CaCl<sub>2</sub> | 分析纯 | 成都科隆化学品有限公司 |
| 七水硫酸镁 | MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 分析纯 | 成都科隆化学品有限公司 |
| 氯化钾 | KCl | 分析纯 | 成都科隆化学品有限公司 |
| 山梨酸 | C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>2</sub> | 化学纯 | 麦克林生化科技有限公司 |
| 硫酸铜 | CuSO<sub>4</sub> | 分析纯 | 成都科龙化工试剂厂 |
| 氯化铁 | FeCl<sub>3</sub> | 分析纯 | 上海市阿拉丁工业公司 |
| 咖啡渣 | 上海威铭食品有限公司 |
表2 本发明中所用到的设备
| 设备名称 | 型号 | 生产厂家 |
| 电热鼓风干燥箱 | DHG-9070A | 上海一恒科学仪器有限公司 |
| 电子天平 | BSA224S | 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司 |
| 高压水热反应釜 | DX-2700 | 丹东方圆仪器有限公司 |
| 旋转蒸发仪 | HB 10S096 | IKA集团 |
| 循环水式多用真空泵 | SHB-III | 郑州长城科工贸易有限公司 |
| 紫外可见光分光光度计 | K5600C | 北京凯奥科技发展有限公司 |
| 荧光分光光度仪 | F-7000 | 日本日立公司 |
| 傅里叶红外光谱仪 | NICOLET iS10 | 赛默飞世科技公司 |
| 超声仪 | SB-5200DTN | 宁波新芝生物科技股份有限公司 |
| X射线衍射仪 | Ultima IV | 日本理学仪器株式会社 |
实施例1：咖啡渣荧光碳量子点的制备
本实施例1提供一种咖啡渣荧光碳量子点的制备方法，具体包括如下步骤：
优选的，a、配制1.56g/L～ 6.25g/L咖啡渣混合液，磁力搅拌20～30s，将搅拌混匀的咖啡渣溶液转移到反应釜；更优选3.125g/L咖啡渣混合液。
优选的，b、将反应釜放入烘箱，在120℃～ 200℃反应6～ 14h；更优选120℃，10h。
优选的，c、待反应结束，取出反应釜，自然冷却至室温，然后倒出反应液，将反应液用滤纸过滤，收集滤液旋转蒸发、干燥、研磨，得到咖啡渣荧光碳量子点粉末，避光保存备用。
优选的，在a步骤前，用乙醇与蒸馏水的混合液(体积比7：3)超声清洗反应釜和容器 10√20min；更优选15min。
实施例2：咖啡渣荧光碳量子点在甜蜜素检测中的应用
将上述实施例1制备咖啡渣荧光碳量子点粉末配制成3.125g/L溶液加入到含有不同甜蜜素浓度的水溶液中(例如：精准称取0.05612g甜蜜素标准品，用蒸馏水溶解并定容至100mL 并混匀作为标准储备液280μmol/L，随后设置甜蜜素浓度梯度：0、2.8、9.4、11.8、28、56μmol/L)，进行荧光检测，根据检测的荧光强度变化与甜蜜素浓度之间的线性关系，建立标准曲线(整个检测结果显示甜蜜素在2.8～56μmol/L范围内线性良好，相关系数R2＝0.992)；
将咖啡渣荧光碳量子点溶液加入到含有甜蜜素的待测水体中进行荧光检测，获得荧光强度变化；
通过标准曲线从而计算出待测水体中甜蜜素的浓度。
本实施例中研究了不同咖啡渣荧光碳量子点浓度、反应体系的pH值和反应时间，以获得咖啡渣荧光碳量子点的特征和最佳检测条件。咖啡渣荧光碳量子点的激发波长为370nm，激发狭缝和发射狭缝宽度均选择为5nm。选择了不同酸、盐、金属离子(Mg2+、K+、Fe3+、Cu2+)及蔗糖作为干扰物质，考查其对咖啡渣荧光碳量子点的荧光影响，并对检测甜蜜素的选择性进行研究。实验结果和分析如下：
(1)咖啡渣荧光碳量子点的表征
图1为本发明咖啡渣荧光碳量子点粉末的XRD图。由图1可以看出，咖啡渣荧光碳量子点为非晶态结构，在23.5°附近有宽的石墨碳的(002)晶面衍射峰。
图2为本发明咖啡渣荧光碳量子点粉末的的红外光谱图。由图2可以看出，在3310cm-1有一处有羟基-OH和氨基-NH的振动峰；在2941cm-1左右出现了C-H的伸缩振动；在2360cm-1处的峰值表明咖啡渣荧光碳量子点含有O＝C＝O基团；在1670cm-1附近再出出现C＝O的特征峰；在1395cm-1处表明C-O基团的存在，同时在1090cm-1和818cm-1出现C-H面外弯曲振动峰。这些数据表明，合成的荧光碳量子点含有-OH、-NH和C-O基团，为其具有良好的水溶性提供了依据。
图3为本发明咖啡渣荧光碳量子点粉末的TEM图。在透射电镜下可以清晰的观察到近似圆形的碳量子点，平均粒径在5.9±1.9nm且分布较为均匀，这也是保证碳量子点拥有良好荧光性质的原因之一。
图4A显示了当激发波长在λex＝300～400nm范围内增强时，合成荧光碳量子点的激发依赖发射光谱的变化。荧光强度随着激发波长λex＝300～370nm逐渐增大，然后随激发波长从λex＝370～400nm增大而减小，因此选择激发波长为λex＝370nm作为最佳激发波长。这可能是由于荧光碳量子点的尺寸不同，或是不同的表面状态和官能团的分布，亦可能是荧光碳量子点上存在不同的表面能陷阱所引起的。图4B再一次证实了最大激发波长和最大发射波长的位置。
(2)甜蜜素检测过程中咖啡渣荧光碳量子点浓度对荧光传感的影响
图5为本发明中制备咖啡渣荧光碳量子点检测甜蜜素的标准曲线。具体是配制3.125g/L 咖啡渣荧光碳量子点溶液40mL，量取1mL溶液到比色皿中，依次加入50μL预先配置好不同浓度的甜蜜素溶液到比色皿中，搅匀，使用荧光分光光度计做出对应的发射光谱，结果如图5内嵌图所示，在加入不同浓度甜蜜素溶液后整个溶液体系的荧光发射强度开始增强，属于“turn on”型(荧光增强)，并且随着甜蜜素溶液浓度的增大相应的荧光峰值也逐渐升高直至浓度达到56μmol/L。根据上述所获得的荧光强度值作出咖啡渣荧光碳量子点检测甜蜜素的标准曲线，其中F0代表原液荧光强度，F代表加入甜蜜素发生荧光增强后的荧光强度，C表示加入甜蜜素的浓度值；整个检测结果显示甜蜜素在2.8～56μmol/L范围内线性良好，相关系数 R2＝0.992，证明该方法所获得的检测数据具有实际应用价值。
(3)甜蜜素检测过程中待测溶液pH值对咖啡渣荧光碳量子点荧光传感效果的影响
图6为本发明中甜蜜素检测过程中待测溶液的pH值对咖啡渣荧光碳量子点的荧光强度影响图。溶液pH值在2～11之间变化时，测试添加和不添加咖啡渣荧光碳量子点溶液的荧光发射光谱，实验结果显示未添加甜蜜素时咖啡渣荧光碳量子点自身荧光发射强度随着pH 值的减弱而降低。推测造成这种现象的原因是酸碱环境的改变引起了碳量子点表面基团的改变从而使碳量子点的荧光性能发生了变化，最终体现在发射光谱上的便是荧光峰值的降低。随后加入甜蜜素计算pH值在2～11之间的荧光强度变化率ΔF/F，F0代表咖啡渣荧光碳量子点溶液荧光强度，F代表加入甜蜜素后溶液荧光强度，ΔF＝F-F0表示为加入甜蜜素前后荧光强度的差值。结果如图6所示，在中性和碱性环境中咖啡渣荧光碳量子点的荧光增强率比较明显且能够大致稳定在25％左右，最佳反应pH＝7.01，反观酸性环境下荧光强度变化不大、稳定性也相对较差但整体依然是呈增强趋势，该荧光碳量子点在pH＝7～11范围内对甜蜜素表现出荧光增强，证明咖啡渣荧光碳量子点对于甜蜜素的检测在碱性环境更佳。
(4)甜蜜素检测过程中反应时间对咖啡渣荧光碳量子点荧光传感效果的影响
较长的反应时间会使荧光传感器失去原有的优点，较短的时间会导致不完全反应，导致荧光增强不明显，线性范围窄，灵敏度低。在0～35min内对反应时间进行优化，加入甜蜜素后，大约30s荧光发射已经明显增强，且10min后荧光值基本稳定，无明显变化。这说明咖啡渣荧光碳量子点和甜蜜素反应速度快，该传感器具有时效性。
(5)实施例1的咖啡渣荧光碳量子点检测甜蜜素的灵敏度实验
表3 10次咖啡渣荧光碳量子点溶液及添加甜蜜素后溶液荧光强度
首先分别测得10次碳量子点原液和第一次加入甜蜜素后溶液的荧光强度，记录结果如表3所示。然后计算出原液平均荧光强度F0并将数据带入公式(1)得到标准偏差Sb值，然后由
得出荧光强度差值，同时导入公式(2)得到灵敏度S，其中ΔC加入甜蜜素后整个溶液体系中增强剂的浓度变化值；最终通过公式(3)得到检出限DL＝3.16μmol/L。最新《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》GB 5009.97-2016所提供的检出限为0.010g/kg，由于该溶液为稀溶液浓度近似看作水溶液浓度1kg/L，换算后国标检出限为49.7μmol/L。本发明制备的咖啡渣荧光碳量子点检测甜蜜素的检出限远低于国标法，且本发明制备的荧光传感器简单，操作方便，成本低。与其它传感器相比具有一定的竞争力，对甜蜜素的检测有良好的应用前景。
(6)实施例1的咖啡渣荧光碳量子点检测甜蜜素的选择性实验
如图7所示，除了甜蜜素，对比研究了山梨酸、蔗糖，Mg2+、K+、Fe3+和Cu2+等对咖啡渣荧光碳量子点检测的影响。
可以看出咖啡渣荧光碳量子点与甜蜜素之间的荧光传感属于“turn on”型，和Cu2+之间属于“turn off”型，对于其他离子和干扰物质基本没有荧光传感响应，说明咖啡渣荧光碳量子点对甜蜜素的检测具有选择性。
Claims (6)
1.咖啡渣荧光碳量子点在食品添加剂甜蜜素检测领域的应用，其特征在于食品添加剂甜蜜素的检测包括如下步骤：
将荧光碳量子点加入到含有不同浓度的甜蜜素溶液中，进行荧光检测，根据检测的荧光强度与甜蜜素浓度之间的线性关系，建立标准曲线；
将咖啡渣荧光碳量子点加入到含有不同浓度甜蜜素溶液中进行荧光检测，获得荧光强度增强“turn on”型传感器；
通过标准曲线从而计算出溶液中甜蜜素的浓度；
其中，所述荧光碳量子点采用如下步骤制备而成：
a、将适量咖啡渣放入烧杯、加入蒸馏水，磁力搅拌20~30s，将搅拌混匀的咖啡渣溶液转移到反应釜；所述咖啡渣溶液浓度为1.56g/L～6.25g/L；
b、将反应釜放入烘箱，于120℃～200℃加热反应6～14h，；
c、待反应结束，取出反应釜，自然冷却至室温，然后倒出反应液，将反应液用滤纸过滤，收集滤液旋转蒸发、干燥、研磨，得到咖啡渣荧光碳量子点粉末。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：进行荧光增强反应时，反应体系的pH值为7～11；反应时间为0.5～10min。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：进行荧光增强反应时，所述甜蜜素浓度的线性检测范围为2.8~56µmol/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：步骤a中所述咖啡渣溶液浓度为3.125g/L。
5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：步骤b中于120℃加热反应10h 。
6.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：c步骤中，采用旋蒸仪除去大部分的水分，再将剩余溶液放入烘箱鼓风烘干、研磨得到固体粉末状的碳量子点，所述荧光碳量子点平均粒径为5.9±1.9nm。
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