CN113373255A - 黄秋葵果色相关的est-ssr标记开发及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组黄秋葵果色相关的EST‑SSR标记开发及试剂盒。本发明提供21对EST‑SSR标记的引物序列。本发明选择PPI的DEGs的SSR引物进行筛选验证和应用，最终得到了21个分型成功率高，多态性好的新EST‑SSR标记，应用于黄秋葵种质资源遗传多样性评价。同时，本发明定位到了果实颜色显著关联的分子标记，为今后黄秋葵果实颜色遗传改良提供了重要的工具。
Description
技术领域
本发明涉及EST-SSR标记，具体而言，是黄秋葵果色相关的EST-SSR标记开发及试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
黄秋葵是一年或多年生草本植物，具有很高的营养价值。黄秋葵的多糖具有抗抑郁和消炎的作用，其粘液中富含功能活性和抗氧化物质，具有很高的保健功效。
虽然黄秋葵非常重要，但是目前没有非常完善的生物技术手段加速黄秋葵的遗传改良，相关的分子标记也很缺乏。主流的分子标记技术，如简单重复序列多态性（SSR）、inter-simple sequence repeat（ISSR）等分子标记技术都已经开始应用于黄秋葵的遗传学研究、分子标记辅助育种。随着转录组测序成本越来越低，利用转录组测序开发SSR分子标记成为一种极为方便快捷的、可迅速丰富黄秋葵分子标记信息库的一种手段。
虽然已经有一些黄秋葵分子标记的报道，但是黄秋葵可用分子标记依然远远不足以满足需求，与其他作物相比仍然相对较少。其次，基于转录组开发的分子标记，由于基因表达的时空特异性，利用unigene开发的EST-SSR分子标记带有特定的倾向。因而，这种便捷的分子标记开发策略在黄秋葵的分子标记开发中依然有重要应用，不断开发新的分子标记对黄秋葵的遗传改良仍然是非常必要的工作。
果实颜色差异通常是由于果实中花青素含量不同，该物质是通过氧化还原反应，起到清除活性氧的作用，对植物自身抗逆、在人体内具有抗衰老保健功效。果实颜色受基因、环境共同调节，开发黄秋葵果实颜色相关的分子标记，可在苗期利用分子标记辅助筛选果实颜色，加速黄秋葵遗传改良进程，筛选出既美观，又具有更高营养保健功效的优良品种。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供黄秋葵果色相关的EST-SSR标记开发及试剂盒。本发明利用黄秋葵果色相关的转录组测序数据，开发EST-SSR分子标记，并选择了蛋白互作网络（PPI）成员差异表达基因（DEGs）中的SSR标记合成引物，筛选多态性SSR标记应用于黄秋葵种质资源评价和果色性状关联分析。24.98%的Unigene包含简单重复序列元件，以单碱基重复为主要形式，Tri-和Di-次之。我们选择47对EST-SSR引物在153个黄秋葵品种/品系中进行基因分型，最终得到了21对分型结果理想的EST-SSR标记。这些标记在黄秋葵种质资源中遗传多态性差异非常大。本发明公布了大量的黄秋葵EST-SSR标记引物序列，大大丰富了黄秋葵的SSR分子标记，公布的SSR引物信息和定位到的显著关联标记为黄秋葵果色分子标记辅助选择育种提供了重要的分子标记。
一组黄秋葵果色相关的EST-SSR引物，所述引物共有21对，分别为：
第1对引物，其序列如 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
第2对引物，其序列如 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
第3对引物，其序列如 SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；
第4对引物，其序列如 SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；
第5对引物，其序列如 SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；
第6对引物，其序列如 SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；
第7对引物，其序列如 SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；
第8对引物，其序列如 SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示；
第9对引物，其序列如 SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示；
第10对引物，其序列如 SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO：20所示;
第11对引物，其序列如 SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示；
第12对引物，其序列如 SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示；
第13对引物，其序列如 SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示；
第14对引物，其序列如 SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示；
第15对引物，其序列如 SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示；
第16对引物，其序列如 SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示；
第17对引物，其序列如 SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示；
第18对引物，其序列如 SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示；
第19对引物，其序列如 SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示；
第20对引物，其序列如 SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示；
第21对引物，其序列如 SEQ ID NO:41和SEQ ID NO：42所示。
一种鉴定筛选黄秋葵种质资源果色的试剂盒，包括所述的引物。
本发明的有益效果是：
本发明利用黄秋葵果色相关的转录组测序数据，分析了表达序列中简单重复序列多态性的规律及这些表达基因参与的生物学过程和代谢途径等，并针对SSR位点设计引物，开发SSR分子标记，并选择了蛋白互作网络PPI成员DEGs中的SSR标记合成引物，筛选多态性SSR标记应用于黄秋葵种质资源评价和果色性状关联分析。24.98%的Unigene包含简单重复序列元件，以单碱基重复为主要形式，Tri-和Di-次之。我们选择47对EST-SSR引物在153个黄秋葵品种/品系中进行基因分型，最终得到了21对分型结果理想的EST-SSR标记。这些标记在黄秋葵种质资源中遗传多态性差异非常大，多态性信息含量PIC值分布在0.01-0.42之间。一般线性模型GLM关联分析定位到2个EST-SSR标记与黄秋葵果色显著关联。本发明公布了大量的黄秋葵EST-SSR标记引物序列，大大丰富了黄秋葵的SSR分子标记，公布的SSR引物信息和定位到的显著关联标记为黄秋葵果色分子标记辅助选择育种提供了重要的分子标记。这些黄秋葵果色相关的差异表达基因的EST序列尚未提交到NCBI数据库，是新的EST序列，开发得到的21个新EST-SSR标记也不同于已报道的黄秋葵的SSR标记。
附图说明
图1是黄秋葵果色相关的EST-SSR标记开发流程图。
图2是基因组SSR特征分析。
图3是PPI中DEGs基因富集分析。
图4是遗传结构分析。
图5是果色性状关联分析。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。
黄秋葵果色相关的EST-SSR标记，是对黄秋葵转录组测序数据和黄秋葵材料搜集、SSR标记开发、GO和KEGG富集分析、差异基因蛋白互作网络分析、基因组DNA提取、SSR分型、遗传多样性分析、遗传结构分析、果色性状关联分析等过程得到的（图1）。
本发明中，用黄秋葵转录组测序数据得到黄秋葵果色相关的EST-SSR引物的具体方法是：
一、黄秋葵转录组测序数据和材料搜集
选取不同果色的黄秋葵鲜样，对果皮部分进行RNA提取与检测、文库构建与质检、上机测序得到数据。本发明所用黄秋葵种质资源如表1所示，总计153份黄秋葵种质（表1）应用于21对高质量EST-SSR分子标记(表2)的应用评价。
表1 黄秋葵种质资源
| 编号 | 品种(品系)代号 |
| AE1 | GZ-012 |
| AE2 | GZ-014 |
| AE3 | GZ-028 |
| AE4 | GZ-032 |
| AE5 | GZ-033 |
| AE6 | GZ-040 |
| AE7 | GZ-041 |
| AE8 | GZ-043 |
| AE9 | GZ-052 |
| AE10 | GZ-060 |
| AE11 | GZ-065 |
| AE12 | GZ-067 |
| AE13 | GZ-084 |
| AE14 | GZ-089 |
| AE15 | GZ-094 |
| AE16 | GZ-119 |
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| AE22 | GZ-163 |
| AE23 | GZ-164 |
| AE24 | GZ-165 |
| AE25 | GZ-169 |
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| AE28 | GZ-172 |
| AE29 | GZ-173 |
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| AE32 | GZ-183 |
| AE33 | GZ44 |
| AE34 | GZ50 |
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| AE36 | GZ78 |
| AE37 | GZ100 |
| AE38 | GZ108 |
| AE39 | GZ146 |
| AE40 | GZ158 |
| AE41 | 42 |
| AE42 | 86 |
| AE45 | 77 |
| AE46 | 78 |
| AE48 | 79 |
| AE49 | 80 |
| AE50 | GZ-1 |
| AE51 | GZ-3 |
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| AE57 | GZ-50 |
| AE58 | GZ-55 |
| AE59 | GZ-82 |
| AE60 | GZ-98 |
| AE61 | GZ-115 |
| AE62 | GZ-116 |
| AE63 | GZ-117 |
| AE64 | GZ-158 |
| AE65 | GZ-214 |
| AE66 | GZ-217 |
| AE67 | GZ-225 |
| AE68 | GZ-234 |
| AE69 | GZ-239 |
| AE70 | 81 |
| AE71 | 82 |
| AE72 | GZ-023 |
| AE73 | 83 |
| AE74 | 84 |
| AE75 | 85 |
| AE76 | 86 |
| AE77 | 87 |
| AE78 | 88 |
| AE79 | 89 |
| AE80 | 90 |
| AE81 | 91 |
| AE82 | 92 |
| AE83 | 93 |
| AE84 | 94 |
| AE85 | 95 |
| AE86 | 96 |
| AE87 | 97 |
| AE88 | GZ-167 |
| AE89 | GZ-112 |
| AE90 | GZ-092 |
| AE91 | GZ-035 |
| AE92 | GZ-085 |
| AE93 | GZ-155 |
| AE94 | 98 |
| AE95 | D02 |
| AE96 | GZ-129 |
| AE97 | GZ-066 |
| AE98 | GZ-017 |
| AE99 | 99 |
| AE100 | GZ-079 |
| AE101 | 100 |
| AE102 | GZ-140 |
| AE103 | GZ-071 |
| AE104 | GZ-133 |
| AE105 | GZ-062 |
| AE106 | GZ-058 |
| AE107 | 101 |
| AE108 | D01 |
| AE109 | GZ-018 |
| AE110 | GZ-099 |
| AE111 | 102 |
| AE112 | 103 |
| AE113 | 104 |
| AE114 | GZ-139 |
| AE115 | 105 |
| AE116 | 106 |
| AE117 | 107 |
| AE118 | GZ-093 |
| AE119 | 108 |
| AE120 | GZ-103 |
| AE121 | GZ-010 |
| AE122 | GZ-037 |
| AE123 | GZ-096 |
| AE124 | GZ-111 |
| AE125 | GZ-127 |
| AE126 | GZ-011 |
| AE127 | GZ-124 |
| AE128 | 109 |
| AE129 | GZ-086 |
| AE130 | GZ-131 |
| AE131 | GZ-007 |
| AE132 | GZ-072 |
| AE133 | GZ-024 |
| AE134 | GZ-016 |
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| AE136 | GZ-101 |
| AE137 | GZ-025 |
| AE138 | GZ-141 |
| AE139 | GZ-069 |
| AE140 | GZ-114 |
| AE141 | GZ-152 |
| AE142 | GZ-130 |
| AE143 | GZ-156 |
| AE144 | GZ-159 |
| AE145 | GZ-077 |
| AE146 | GZ-081 |
| AE147 | GZ-113 |
| AE148 | 110 |
| AE149 | 111 |
| AE150 | GZ-073 |
| AE151 | GZ-076 |
| AE152 | GZ-004 |
| AE153 | GZ-022 |
| AE154 | GZ-030 |
| AE155 | GZ-045 |
| AE156 | GZ-083 |
表2 黄秋葵EST-SSR标记特征
| 引物序号 | 重复基元 | 上游引物 | 下游引物 | ||
| 1 | (TCT）5 | SEQ.ID NO.1: | GCGGTGAGTGAGGCCTTATC | SEQ.ID NO.2: | GCAATGGGCTTCCACCTACT |
| 2 | (GGT）7 | SEQ.ID NO.3: | GATACGGTAGCAACAGTCTGC | SEQ.ID NO.4: | GCTTCCTAAACTCCCCCACC |
| 3 | (TGA）6 | SEQ.ID NO.5: | TTGCGATGAAAGGCCGAGAT | SEQ.ID NO.6: | CTCAAGGCACCCCTGTACAA |
| 4 | (TGA）5 | SEQ.ID NO.7: | TTGCTCCGATGGCTATGTCC | SEQ.ID NO.8: | GCCTTAGTCACCGACCGAAA |
| 5 | (GAA）5 | SEQ.ID NO.9: | TTCTCCTCCACACACTCCCA | SEQ.ID NO.10: | AGGTGAGGCTTTTTCGGCTT |
| 6 | (CCA）5 | SEQ.ID NO.11: | AAGCCGAAAAAGCCTCACCT | SEQ.ID NO.12: | AGCTGGTGTTTCTTGGCTGT |
| 7 | (GCT）7 | SEQ.ID NO.13: | TGAAGCTTAAACCCTCAGAACAC | SEQ.ID NO.14: | AGCTCCGAAAGTGAAAGCCA |
| 8 | (TCT）5 | SEQ.ID NO.15: | CTTGCTATCGTGACCCCTCC | SEQ.ID NO.16: | ACCAAACCCGTGAACGAGAA |
| 9 | (TAA）10 | SEQ.ID NO.17: | ACAAAATCTGGTCTCTATTCAAAACCA | SEQ.ID NO.18: | GCCGATTGGAGAAAGAAGGC |
| 10 | (TTC）6 | SEQ.ID NO.19: | TGAACCGCTAATCCAAAGCCT | SEQ.ID NO.20: | GAGAAATTGGGAGGTGGGGG |
| 11 | (GTG）6 | SEQ.ID NO.21: | ACTTAGCCACCCACGAGTTG | SEQ.ID NO.22: | TTAGCACGACGCCAGTTCTT |
| 12 | (CTG）5 | SEQ.ID NO.23: | TCAGGAGGTGTTGCTTGGTC | SEQ.ID NO.24: | ATGGCAGCAAAGCTCCTTCT |
| 13 | (GAA）10 | SEQ.ID NO.25: | CCACCACTTACACTCGCCTT | SEQ.ID NO.26: | TCCAAACTTCCATCACCGCT |
| 14 | (TAA）6 | SEQ.ID NO.27: | CGAAATCGGCACCTATCGGT | SEQ.ID NO.28: | TTTGGCCACTGTTTTTGCAA |
| 15 | (CCA）6 | SEQ.ID NO.29: | CCGGGAAATGTAGATGCCCA | SEQ.ID NO.30: | GGCGACTGAGGGATGGAAAA |
| 16 | (CAC）6 | SEQ.ID NO.31: | GGCAAAGGAGGGAGAAGCTT | SEQ.ID NO.32: | TTAATCTGCTGGCAGGGTGG |
| 17 | (TCT）5 | SEQ.ID NO.33: | ACCTGATTGCCTCACTGCTC | SEQ.ID NO.34: | CATCTTCAACGGCTGCCATG |
| 18 | (CTC）8 | SEQ.ID NO.35: | AGGTGTATCAACTGTGGCGG | SEQ.ID NO.36: | GGGCAAGAGTTCTCACTGCA |
| 19 | (CTT）8 | SEQ.ID NO.37: | GCAGTGAGAACTCTTGCCCA | SEQ.ID NO.38: | TCCCTGAAGACAAGCCAACC |
| 20 | (GCA）6 | SEQ.ID NO.39: | GAACACGTCGCCCCCATAAT | SEQ.ID NO.40: | CTCCCCATAAGCTCTGCCTG |
| 21 | (TTG）5 | SEQ.ID NO.41: | TGCCGCTGCTTTCTCCAATA | SEQ.ID NO.42: | GCTTCATGCTTGTTTTGTGGA |
二、SSR标记开发
转录组测序得到的Unigene序列，导入MISA软件进行SSR分析，统计SSR motif的类型，频数分布等（图2）。选择 SSR 位点的重复基元，以单核苷酸为重复单位时，其重复次数≥10，二核苷酸重复次数≥6次，三、四、五、六核苷酸重复次数≥5 次进行 SSR 检测。找出序列中简单重复序列元件后，以Unigene的序列为参考，利用Primer3批量设计SSR引物，PCR产物长度在100-400bp之间。
三、GO和KEGG富集分析
使用TBTools软件对包含SSR的Unigene和包含SSR的PPI网络中DEGs进行GO和KEGG富集分析，解析Unigene和PPI中包含SSR的基因的共性，其参与的主要生物学过程，分子生物学功能，细胞组分，以及参与的代谢途径特征。
四、DEGs互作网络分析
使用String（https://string-db.org/）分析差异表达基因的蛋白功能互作网络，并利用Cytoscape软件绘制和编辑互作网络图。PPI中，共计128个基因序列里有至少1个SSR元件并成功设计了SSR引物。PPI中DEGs基因，富集分析(Level 3)发现（图3之A），主要参与oxidation-reduction process, small molecule metabolic process, NADP metabolicprocess等生物学过程，主要富集在cofactor binding, oxidoreductase activity,isomerase activity等分子功能，GO_CC富集主要是thylakoid, extrinsic component ofmembrane, membrane protein complex等。KEGG富集分析发现，这些PPI基因主要富集在B09108 Metabolism of cofactors and vitamins, 00630 Glyoxylate anddicarboxylate metabolism, B09102 Energy metabolism等代谢途径（图3之B）。
五、基因组DNA抽提
取200mg嫩叶，采用Tiangen DNAsecure 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒（货号DP320-02）提取红麻基因组DNA，具体操作步骤参考试剂盒说明书。提取完成后，取2μl使用Thermo微量紫外分光光度计NanoDrop（型号ND1000）测定DNA浓度及A260/280，4μl体积在1%浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，检测DNA完整性，主带清晰且不拖尾的DNA用于后续SSR分型。
六、SSR分型
根据引物序列，合成荧光SSR引物，在引物5’端添加FAM荧光基团。DNA聚合酶使用Takara DNA聚合酶（TransGen Phi29 DNA Polymerase，货号LP101-01）。PCR体系总体积为20μl，DNA模板2μl，Buffer 2μl，TransTaq 0.3μl，dNTP1.6μl，ddH2O 12.1μl，正反向引物各1μl（浓度2μmol/μl）。PCR扩增程序设置为预变性94℃ 4min，变性94℃ 30s→退火56℃ 90s→延伸72℃ 1min，这3个阶段循环35次，延伸72℃ 5min，4℃保存。PCR扩增结束后，取1μlPCR产物，在ABI3730xl毛细管电泳仪上进行电泳，电泳结束后，GeneMapper4.0软件读数，导出SSR基因分型信息。
七、遗传多样性分析
SSR分型数据根据各软件格式要求进行转换。将基因型格式文件导入POPGENE1.32软件，选择二倍体共显性数据格式，分析单个SSR位点在样本整体的等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Shannon’s多样性指数（I）。Powermarker3.25软件计算各位点的多态性信息含量（PIC）。利用NTSYSPC2.10e软件计算样本两两间的Jaccard遗传相似系数，导出样本两两间遗传相似系数矩阵。我们评估了新开发的EST-SSR分子标记在黄秋葵种质资源遗传多样性，总体153个黄秋葵基因型材料中，21个EST-SSR标记等位基因数平均为3.62，分布在2到6之间；有效等位基因数目平均为1.22个，分布在1.01至2.04之间。
八、遗传结构分析
使用Powermarker3.25软件计算基于等位基因频率的Nei’s（1983）遗传距离，使用邻位相连聚类法（Neighbor-Joining clustering）绘制聚类树，并使用MEGA7.0软件对聚类树进行编辑美化。将SSR分型数据导入Structure2.0软件进行分析，K设为从1到20， MCMC(Markov Chain Monie Carfo)和不作数迭代值(length of burn-in period)分别设为10000和100000，每个K值重复运行3次。将Structure运行的results文件上传至StructureHarvester在线工具进行分析，绘制ΔK值随K值的变化曲线，根据峰值判断最佳K值，将最佳K值对应的3次重复运行结果indfile下载并导入Clumpp2.0软件将3次结果合并为1个Q值矩阵，利用Structure2.0软件绘制Q plot。对比NJ聚类和Structure的分析模型，解析群体遗传结构。基于这21个SSR位点的分型数据，我们对这153份黄秋葵材料的群体遗传结构进行了分析。Strucuture软件的先验模型推测每个材料划分入特定亚群的概率，结果导入structure harvester分析ΔK值随着K值的变化曲线如图4之A所示，K=7时，ΔK为最大值的拐点，这153份材料最佳亚群数目为7个。我们将最佳K值对应的3次重复的Q矩阵使用Clumpp合并，绘制Q plot（图4之B）。为了进一步分析群体遗传结构，我们使用powermarker软件计算基于等位基因频率的Nei’s遗传距离，并使用邻位相连距离法（N-J）绘制聚类树（图4之C）和二维主坐标分析PCoA（图4之D）。
九、果色性状关联分析
利用153份黄秋葵种质的SSR分型和果色性状表型数据，本发明进行了初步关联分析定位。将基因型和表型数据导入TASSEL2.1软件，剔除MAF<0.05的位点，采用一般线性模型（General Linear Model, GLM）进行关联分析。当P_Marker<0.05时，则认为该分子标记与黄秋葵果色显著关联。而该值接近0.05时，也可以认为该分子标记与黄秋葵果色关联，但需要更多的验证。本发明还考查了153份黄秋葵种质的果实颜色，根据颜色分类，可将黄秋葵种质划分为5类：浅绿、绿、深绿、粉色、紫红色。将颜色用数字代替作为果实颜色表型值，与EST-SSR基因型一起，导入TASSEL2.1软件，进行一般线性模型（GLM）关联分析，共定位到2个EST-SSR标记与黄秋葵果实颜色关联。OREST22标记，与黄秋葵果色颜色显著相关，P值=0.0235，对表型变异解释率为4.94%；该标记所在unigene为Cluster-12086.22033，注释为sulfite reductase [ferredoxin], chloroplastic [Herrania umbratica]，在转录组数据中显著下调表达（图5之A）。标记OREST1与黄秋葵果色显著关联，P值=0.0615，未达到显著性水平，但是非常接近0.05。我们认为这也是一个潜在（suggestive）的果实相关位点。该标记所在unigene为Cluster-12086.35646，注释为hypothetical protein，在转录组数据中显著下调表达 (图5之B)。这表明这两个关联标记所在基因可能是果实颜色相关的功能基因，这两个EST-SSR可作为今后黄秋葵遗传改良提供了候选分子标记。
最后，还需要注意的是，以上所述仅是本发明的若干个具体实施例而已，本发明不限于以上实施例，还可以有各种改动和变形。
序列表
<110> 浙江省园林植物与花卉研究所（浙江省萧山棉麻研究所）
<120> 黄秋葵果色相关的EST-SSR标记开发及试剂盒
<141> 2021-06-16
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggtgagtg aggccttatc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaatgggct tccacctact 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatacggtag caacagtctg c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttcctaaa ctcccccacc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgcgatgaa aggccgagat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcaaggcac ccctgtacaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgctccgat ggctatgtcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccttagtca ccgaccgaaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttctcctcca cacactccca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggtgaggct ttttcggctt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagccgaaaa agcctcacct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agctggtgtt tcttggctgt 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgaagcttaa accctcagaa cac 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agctccgaaa gtgaaagcca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttgctatcg tgacccctcc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
accaaacccg tgaacgagaa 20
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acaaaatctg gtctctattc aaaacca 27
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gccgattgga gaaagaaggc 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgaaccgcta atccaaagcc t 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gagaaattgg gaggtggggg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acttagccac ccacgagttg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttagcacgac gccagttctt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcaggaggtg ttgcttggtc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atggcagcaa agctccttct 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccaccactta cactcgcctt 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tccaaacttc catcaccgct 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgaaatcggc acctatcggt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tttggccact gtttttgcaa 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccgggaaatg tagatgccca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggcgactgag ggatggaaaa 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggcaaaggag ggagaagctt 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttaatctgct ggcagggtgg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acctgattgc ctcactgctc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
catcttcaac ggctgccatg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aggtgtatca actgtggcgg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gggcaagagt tctcactgca 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gcagtgagaa ctcttgccca 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tccctgaaga caagccaacc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gaacacgtcg cccccataat 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ctccccataa gctctgcctg 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgccgctgct ttctccaata 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gcttcatgct tgttttgtgg a 21
Claims (2)
1.一组黄秋葵果色相关的EST-SSR引物，其特征在于，所述引物共有21对，分别为 ：
第1对引物，其序列如 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
第2对引物，其序列如 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
第3对引物，其序列如 SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；
第4对引物，其序列如 SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；
第5对引物，其序列如 SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；
第6对引物，其序列如 SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；
第7对引物，其序列如 SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；
第8对引物，其序列如 SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示；
第9对引物，其序列如 SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示；
第10对引物，其序列如 SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO：20所示；
第11对引物，其序列如 SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示；
第12对引物，其序列如 SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示；
第13对引物，其序列如 SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示；
第14对引物，其序列如 SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示；
第15对引物，其序列如 SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示；
第16对引物，其序列如 SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示；
第17对引物，其序列如 SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示；
第18对引物，其序列如 SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示；
第19对引物，其序列如 SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示；
第20对引物，其序列如 SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示；
第21对引物，其序列如 SEQ ID NO:41和SEQ ID NO：42所示。
2.一种鉴定筛选黄秋葵种质资源果色的试剂盒，其特征在于，它包括如权利要求1中所述的21对引物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| CN202110668574.6A CN113373255B (zh) | 2021-06-16 | 2021-06-16 | 黄秋葵果色相关的est-ssr标记开发及试剂盒 |
Publications (2)
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2021
- 2021-06-16 CN CN202110668574.6A patent/CN113373255B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ROLAND SCHAFLEITNER等: "The okra (Abelmoschus esculentus) transcriptome as a source for gene sequence information and molecular markers for diversity analysis", GENE, vol. 517, pages 27 - 36, XP028973589, DOI: 10.1016/j.gene.2012.12.098 * |
Also Published As
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