CN113368063A - 一种注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂及其制备方法 - Google Patents
一种注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于蛋白质和多肽药物技术领域，具体涉及一种重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的冻干制剂及其制备方法，该冻干粉针包括重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白、赋形剂、冻干保护剂和缓冲体系。本发明通过对不同赋形剂、冻干保护剂、缓冲体系及冻干曲线的研究，提供一种外观良好、复溶性好、活性较高、杂质少、副作用低、安全性高、质量稳定的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂，解决了蛋白质不稳定、容易聚集变性和活性降低等问题，该制剂使用方便，吸收快，便于储存和运输。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质和多肽药物技术领域，具体涉及一种重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的冻干制剂及其制备方法。
背景技术
脑血管疾病是目前人类疾病三大死亡原因之一，具有高致残率和病死率的特点，严重危害人类的健康，其中缺血性脑血管病(ischemia cerebral vasculardiseases，ICVD)临床较多见，约占全部脑血管病人的60％～70％，可分为全脑缺血和局灶性脑缺血两大类，其发病机制尚不完全清楚。研究表明脑水肿和过度的炎症反应是脑缺血及缺血后再灌注损伤的重要原因。脑缺血后，局部大量凝血酶激活后与细胞膜上的相应受体结合是引起脑水肿的主要原因之一；大量的中性粒细胞在局部微血管内聚集后浸润到脑实质，又可通过产生活性氧自由基、细胞因子、脂质代谢产物、蛋白水解酶等，引发炎症级联反应，炎症反应在急性脑缺血后，尤其是再灌注所引发的继发性脑损伤中起关键作用。因此，积极预防和治疗脑水肿与过度炎症反应，可有效的降低急性缺血性脑血管病的病死率，改善预后。重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(human recombinant neutrophilinhibitoryfactor and hirulog hybrid，TNHH)是中性粒细胞抑制因子[neutrophilinhibitory factor，NIF，特征表述为NIF-Gly(5～10))]与水蛭肽(hirulog)经基因工程重组表达和纯化等技术形成的重组三功能嵌合蛋白。TNHH不仅能抑制白细胞的黏附、活化，而且还能抑制凝血酶的激活，拟用于治疗急性缺血性脑血管，它的作用机制一方面可能通过抑制白细胞黏附、迁移、激活和释放的功能，治疗急性缺血性脑血管病的炎性损伤；另一方面可能通过与凝血酶非活性区结合，抑制凝血酶引起的脑水肿。目前，重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白制剂鲜少报道，故制备注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白意义重大。
生物大分子分子量大且结构复杂，因此其制剂存在诸多不稳定性因素，例如外消旋化、水解、氧化、脱酰胺等化学不稳定性因素，变性、沉淀、聚集或吸附等物理不稳定性因素，和长途运输过程的剧烈震荡及环境条件变化等外界因素。若蛋白质药物以水溶液、液体制剂或混悬液形式存在，都可因上述化学、物理或外界不稳定性因素导致药物失活，故在一定程度上相比液体制剂来说，冻干制剂能显著提高蛋白药物的稳定性；但在冻干过程中，蛋白质也可发生聚集、变性及结构的破坏，因此选择优良的蛋白保护剂尤其重要，优良的蛋白保护剂不仅能够在冻干过程中对蛋白质药物起到很好的保护作用，而且能够对成品贮藏期内的蛋白质变性起到抑制作用。本发明通过加入蛋白保护剂提高重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的稳定性并通过冻干工艺的优化得到一种稳定性高、可供临床使用、更适宜储存和运输的冻干制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外观良好、复溶性好、活性较高、杂质少、质量稳定的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂，另一目的在于提供一种重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的冻干制剂的制备方法。本发明的冻干制剂外观疏松、饱满、完整，相对液体制剂稳定性显著提高，易于生产、贮存和运输，此外，冻干制剂复溶性好，经复溶后蛋白理化性质、活性和杂质无显著变化。
本发明所述的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂，包括重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白、赋形剂、冻干保护剂和缓冲体系。
优选地，所述重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的冻干制剂是通过冻干液体制剂制备的，其中冻干前的液体制剂中所含抗体蛋白含量为1～10mg/mL。
更为优选地，所述重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的冻干制剂，冻干前的液体制剂中所含抗体蛋白含量为3～8mg/mL。
优选地，所述赋型剂选自山梨醇、甘露醇、乳糖和聚维酮中的一种或几种。
进一步优选地，所述赋型剂为甘露醇和聚维酮。
更为优选地，所述赋型剂中的聚维酮型号为K12，K17，K25或K30。
优选地，所述冻干制剂中赋型剂的含量为14～220mg/mL。
进一步优选地，所述赋型剂为40～120mg/mL甘露醇和14～100mg/mL聚维酮。
更为优选地，所述赋型剂为60～100mg/mL甘露醇和14～50mg/mL聚维酮。
优选地，所述冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘氨酸或明胶中的一种。
进一步优选地，所述冻干保护剂为蔗糖或海藻糖。
优选地，所述冻干制剂中冻干保护剂的含量为5～60mg/mL。
进一步优选地，所述冻干保护剂的含量为30～50mg/mL。
更为优选地，所述冻干保护剂为30～50mg/mL蔗糖或海藻糖。
优选地，所述缓冲体系为柠檬酸盐缓冲液、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、Tris缓冲液或醋酸盐缓冲液。
进一步优选地，所述缓冲体系为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、Tris-磷酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。
更为优选地，所述缓冲体系为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。
优选地，所述冻干制剂中缓冲体系的含量为5～30mM。
更为优选地，所述冻干制剂中缓冲体系的含量为5～15mM。
优选地，所述冻干制剂冻干前的液体制剂的pH为4.5～6.0。
更为优选地，冻干制剂冻干前的液体制剂的pH为4.5～5.5。
优选地，所述冻干制剂，其冻干前的液体制剂包含：
(1)白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白1～10mg/mL；
(2)赋型剂14～220mg/mL；
(3)冻干保护剂5～60mg/mL；
(4)缓冲体系5～30mM；
(5)pH 4.5～6.0。
进一步优选地，所述冻干制剂，其冻干前的液体制剂包含：
(1)白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白3～8mg/mL；
(2)甘露醇40～120mg/mL；
(3)聚维酮14～100mg/mL；
(4)冻干保护剂30～50mg/mL；
(5)缓冲体系5～15mM；
(6)pH 4.5～5.5。
本发明所述的冻干制剂的制备方法为：将处方量的赋型剂、冻干保护剂和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入缓冲体系中，搅拌溶解，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液将pH调制4.5～6.0，即为冻干前的液体制剂，然后过0.22μm滤膜后灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冷冻干燥，其冷冻干燥过程包括预冻、升华干燥和解析干燥步骤。
优选地，预冻温度为-40～-50℃，升华干燥温度为-15℃～-20℃，维持2～5h，升温至-5℃～-10℃，维持14～16h；解析干燥温度为25℃～30℃，维持2～6h。
进一步优选地，预冻过程还包括退火步骤，其退火温度为-10℃～-20℃，退火时间维持1～3h。
更为优选地，本发明所述的冻干制剂的制备方法为：将处方量的赋型剂、冻干保护剂和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入缓冲体系中，搅拌溶解，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液将pH调制4.5～6.0，即为冻干前的液体制剂，然后过0.22μm滤膜后灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冷冻干燥，包括如下步骤：
a.预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-40℃～-50℃，维持1～3h；再以10℃/h升温至-10℃～-20℃，维持1～3h；再以10℃/h降温至-40℃～-50℃，维持维持1～3h；
b.升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-15℃～-20℃，维持2～5h；稍后以5℃/h升温至-5℃～-10℃，维持14～16h。
c.解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25～30℃，持续干燥2～6h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
本发明与现有技术相比具有如下突出优点：
1、相比液体制剂，冻干制剂极大的减少了重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白在储存和运输过程中的降解和聚集，显著提高其稳定性，更适合长期储存或运输；
2、本发明的重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液属于生物大分子药物，稳定性较差，蛋白质容易发生聚集、变性及结构的破坏，从而导致蛋白质失活，使用本发明的处方所得产品稳定性高；
3、本发明冻干工艺中，在预冻中引入退火，并对退火温度和退火时间进行研究，使用本发明的冻干工艺所得产品，冻干周期缩短，外观性状较好，复溶时间较短，复溶前后蛋白外观形状及活性没有显著变化，适于注射给药；
4、采用本发明制备的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂纯度较高、杂质少且水分含量低；稳定性高，放置2年，冻干制剂的外观性状、活性、杂质均变化较小；活性高，符合临床用药的要求。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，但这些实施例并不构成对本发明的限制，所以，在本发明的方法前提下对本发明的简单改进均属本发明要保护的范围。
白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液的获得：参照Novagen公司《pET系统操作手册》(第10版)，按照常规分子克隆技术构建白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白质粒，转入pET3c BL-21(DE3)大肠杆菌表达菌株，获得白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白工程菌，发酵获得重组表达的白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白前体，在100L发酵体积下，OD600达到100，目的蛋白表达率可达到45％；所得发酵液经分离提纯后得白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液。
实施例1
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的甘露醇、聚维酮K12、蔗糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至5.0，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-40℃，并维持2h；再以10℃/h升温至-15℃，维持2h；再以10℃/h降温至-40℃，维持2h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-15℃，维持4h；稍后以5℃/h升温至-5℃，维持15h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥4h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例2
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的甘露醇、聚维酮K17、蔗糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，搅拌溶解，使得混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至4.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-45℃，并维持1h；再以10℃/h升温至-10℃，维持1h；再以10℃/h降温至-45℃，维持1h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-20℃，维持2h；稍后以5℃/h升温至-10℃，维持14h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至30℃，持续干燥2h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例3
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的甘露醇、聚维酮K25、海藻糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至5.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持3h；再以10℃/h升温至-20℃，维持3h；再以10℃/h降温至-50℃，维持3h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-20℃，维持5h；稍后以5℃/h升温至-5℃，维持16h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至30℃，持续干燥6h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例4
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的甘露醇、聚维酮K25、蔗糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至4.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-45℃，并维持3h；再以10℃/h升温至-10℃，维持2h；再以10℃/h降温至-45℃，维持1h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-20℃，维持3h；稍后以5℃/h升温至-10℃，维持16h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥3h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例5
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的甘露醇、聚维酮K30、海藻糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH6.0的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至6.0，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持1h；再以10℃/h升温至-20℃，维持1h；再以10℃/h降温至-50℃，维持1h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-20℃，维持5h；稍后以5℃/h升温至-10℃，维持14h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥6h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例6
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的山梨醇、聚维酮K30、甘氨酸和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至6.0，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持3h；再以10℃/h升温至-18℃，维持1h；再以10℃/h降温至-50℃，维持2h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-18℃，维持4h；稍后以5℃/h升温至-10℃，维持16h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至28℃，持续干燥5h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例7
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的甘露醇、乳糖、明胶和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH5.0的Tris-磷酸盐缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至5.0，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持3h；再以10℃/h升温至-12℃，维持2h；再以10℃/h降温至-50℃，维持3h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-15℃，维持3h；稍后以5℃/h升温至-5℃，维持16h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥4h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例8
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的甘露醇、蔗糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至4.6，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-40℃，并维持2h；再以10℃/h升温至-15℃，维持2h；再以10℃/h降温至-40℃，维持2h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-15℃，维持4h；稍后以5℃/h升温至-5℃，维持15h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥4h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例9
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的聚维酮K17、蔗糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至6.0，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-40℃，并维持2h；再以10℃/h升温至-15℃，维持2h；再以10℃/h降温至-40℃，维持2h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-15℃，维持4h；稍后以5℃/h升温至-5℃，维持16h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥4h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例10
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的甘露醇、聚维酮K17、蔗糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白加入pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至4.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-45℃，并维持6h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-20℃，维持3h；稍后以5℃/h升温至-10℃，维持15h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥4h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例11
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的右旋糖酐、聚维酮C15、蔗糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH3.8的醋酸-醋酸钠缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至3.8，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-35℃，并维持3h；再以10℃/h升温至-10℃，维持2h；再以10℃/h降温至-35℃，维持1h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-20℃，维持2h；稍后以5℃/h升温至-10℃，维持15h。
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至40℃，持续干燥4h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
实施例12
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
a.冻干前液体制剂的制备：
将处方量的甘露醇、聚维酮C15、山梨糖和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH6.8的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至6.8，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
b.注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干粉针的冻干程序为：
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-45℃，并维持6h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品以10℃/h升温至-20℃，维持3h；稍后以5℃/h升温至-10℃，维持15h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥4h，再极限真空2h，在真空状态下压塞，出箱。
对比实施例1
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
将处方量水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，稀释，使TNHH蛋白浓度达3mg/mL后，加入处方量的甘露醇，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至7.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持15h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品升温至-30℃，维持6h；稍后升温至-20℃，维持50h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥20h，在真空状态下压塞，出箱。
对比实施例2
(一)处方
白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白 3mg/mL
磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液 10mM
pH 7.5
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
将处方量水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，稀释，使TNHH蛋白浓度达3mg/mL后，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至7.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持15h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品升温至-30℃，维持6h；稍后升温至-20℃，维持50h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥20h，在真空状态下压塞，出箱。
对比实施例3
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
将处方量水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH7.5的乙酸钠-乙酸缓冲液中，稀释，使TNHH蛋白浓度达3mg/mL后，加入处方量的甘油，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至7.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持15h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品升温至-30℃，维持6h；稍后升温至-20℃，维持50h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥20h，在真空状态下压塞，出箱。
对比实施例4
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
将处方量水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，稀释，使TNHH蛋白浓度达3mg/mL后，加入处方量的甘氨酸，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至7.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持15h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品升温至-30℃，维持6h；稍后升温至-20℃，维持50h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥20h，在真空状态下压塞，出箱。
对比实施例5
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
将处方量水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH5.5的乙酸钠-乙酸缓冲液中，稀释，使TNHH蛋白浓度达3mg/mL后，加入处方量的蔗糖，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至5.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持15h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品升温至-30℃，维持6h；稍后升温至-20℃，维持50h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥20h，在真空状态下压塞，出箱。
对比实施例6
(一)处方
(二)注射用白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂的制备：
将处方量水蛭肽嵌合蛋白原液加入pH8.5的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液中，稀释，使TNHH蛋白浓度达9mg/mL后，加入处方量的海藻糖，搅拌溶解，使混合后各组分的浓度如上表所示，并用0.1mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠将其pH调至8.5，将所得药液过0.22μm滤膜灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冻干；
(1)预冻：先将待冻干样品溶液全速降温至-50℃，并维持15h；
(2)升华干燥：冻干机内抽真空并维持0.20±0.02mbar，将样品升温至-30℃，维持6h；稍后升温至-20℃，维持50h；
(3)解析干燥：冻干机内抽真空并维持0.10±0.02mbar，将样品的温度升至25℃，持续干燥20h，在真空状态下压塞，出箱。
箱。
验证实施例：
将上述实施例和对比实施例放置于2～8℃进行长期稳定性考察，分别于0个月、3个月、6个月、12个月、24个月末取样检测，结果如表1所示；25℃±2℃条件下进行加速试验，于第0个月、3个月、6个月、12个月末取样检测，结果如表2所示。
表1 2～8℃长期稳定性实验结果
表2 25℃加速稳定性实验结果
由上表1和表2稳定性数据结果可知，实施例1～7的冻干制剂为白色疏松块状物，复溶后澄清透明，水分含量较小、活性较高，长期和加速稳定性考察条件下，SEC-HPLC和RP-HPLC检测的结果与0天的检测数据相比基本保持不变；实施例10、12和对比实施例1～6冻干周期较长，水分含量较大，活性下降，长期和加速稳定性考察条件下，SEC-HPLC和RP-HPLC检测的结果与0天的检测数据相比含量下降；实施例8～12冻干品性状较差，实施例8粉饼有裂纹，实施例9和11粉饼上有气孔，水分含量都增大，长期和加速稳定性考察条件下，活性明显下降，SEC-HPLC与RP-HPLC检测的结果下降较快；实施例10～12、对比实施例1～6，长期和加速稳定性考察条件下，活性明显下降，SEC-HPLC与RP-HPLC检测的结果增大较快。
实施例1～7所得样品在长期稳定性考察放置24个月和加速稳定性考察放置12个月后，与0天取样结果相比无明显变化，说明用本发明制备的样品质量稳定，适合临床用药的要求。
Claims (10)
1.一种注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白冻干制剂，包括重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白、赋形剂、冻干保护剂和缓冲体系。
2.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述的赋型剂选自山梨醇、甘露醇、乳糖和聚维酮中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述的赋型剂为甘露醇和聚维酮。
4.的如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述的赋型剂的含量为14～220mg/mL，优选赋型剂为40～120mg/mL甘露醇和14～100mg/mL聚维酮。
5.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述的冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘氨酸或明胶中的一种，优选蔗糖或海藻糖。
6.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述的缓冲体系为柠檬酸盐缓冲液、组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、Tris缓冲液或醋酸盐缓冲液。
7.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂冻干前的液体制剂的pH为4.5～6.0。
8.所述冻干制剂的制备方法，其特征在于，将处方量的赋型剂、冻干保护剂和重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白原液加入缓冲体系中，搅拌溶解，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液将pH调制4.5～6.0，即为冻干前的液体制剂，然后过0.22μm滤膜后灌装于西林瓶中，半压塞，放入冻干机中冷冻干燥。
9.如权利要求8所述的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述的冷冻干燥过程包括预冻、升华干燥和解析干燥，其中预冻过程还包括退火步骤。
10.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述的冻干制剂是通过冻干液体制剂制备的，其中所述冻干前液体制剂包含：
(1)白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白1～10mg/mL；
(2)赋型剂14～220mg/mL；
(3)冻干保护剂5～60mg/mL；
(4)缓冲体系5～30mM；
(5)pH 4.5～6.0。
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