CN101693016A - 通用的注射用重组人血清白蛋白融合蛋白制剂配方 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具通用性、简单、特别有效的制剂配方用于制造注射用重组人血清白蛋白/治疗性蛋白质融合蛋白的临床用药。该制剂配方和冷冻干燥工艺包括将不同的重组人血清白蛋白融合蛋白利用单一有效配方进行配制和经冷冻干燥而成的临床治疗用注射针剂。冻干针剂可减少形成断裂的游离人血清白蛋白、游离的治疗性蛋白质片断和融合蛋白聚合体机会。产品可以长期贮存不易分解变质；剂量准确，外观优良；稳定性好，安全性高，并大大提高了用药的安全性。制剂配方和生产工艺步骤简单、具独特性、高质量和易于产业化，以及制剂的最大特点是对人体不会产生任何过敏和增加毒副作用等特点。

Description

通用的注射用重组人血清白蛋白融合蛋白制剂配方

本发明为美国发明专利US7,244,833B2、US7,442,371B2和US7,572,437B2，中国发明专利ZL02142881.6、中国发明专利ZL200410042814.8、中国发明专利ZL200410057313.7、中国发明专利申请CN101260145A、中国发明专利申请CN1011121753A和中国发明专利申请CN101172091A，以及国际PCT发明专利申请WO2009/043277A1的继续申请。

技术领域

本发明属于生物制品用于治疗和预防的制造技术领域，特别是重组人血清白蛋白与治疗性蛋白质形成的融合蛋白用于临床治疗用药的生产制造。本发明使用了特定的制剂配方和生产工艺步骤，尤其是将融合蛋白以特异、简单有效的制剂配方和形成冻干产品应用于临床用药的制造(特别是制剂由简单而行之有效的醇、糖、表面活性剂和适宜盐缓冲液组合，剂型采用冻干粉针)。该制剂可以保证适用于所有由人血清白蛋白形成的融合蛋白的注射用针剂，适用于皮下、肌注或静脉等途径给药。特别适用于经酵母菌或传代脊椎动物细胞分泌表达的重组人血清白蛋白融合蛋白的规模化生产和医学应用。本发明的制剂配方步骤简单、通用并具有独特和意想不到的效果。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是人血液中最丰富的蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半，其作用为维持渗透压，结合并运输营养物和代谢物，HSA作为一种基本载体，携带传递蛋白质、脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要组成部分。在血液中的半衰期长达14-20天。血清白蛋白是一个球状非糖基化，分子量为66kd的血清蛋白质。人血清白蛋白基因位于4号染色体上有16961碱基对，分为15个间隔区。经RNA加工拼接后形成的mRNA可以编码的一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)在通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，分泌到细胞外。人血清白蛋白有很大的应用及临床应用价值。例如：作为药物可用于治疗因血清白蛋白丢失、合成障碍和创伤失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血症；可以作为细胞培养基的添加成分、可以作为护肤品添加剂、可以作为药物的辅剂、赋型剂等等。

根据人血清白蛋白的半衰期长的特点，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与人治疗性蛋白质的融合基因在酵母菌或脊椎动物细胞中表达加工为融合蛋白，并分泌到细胞外的培养液中。融合蛋白增加了人治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性。于在林、富岩将人血清白蛋白与人粒细胞刺激因(hGCSF)、人红细胞生成素(hEPO)、人白细胞介素(Interleukins)、人干扰素(Interferons)、人皮肤细胞生长因子分别形成融合蛋白，该项技术已在本发明人的中国授权发明专利ZL021428816、ZL2004100428148、ZL2004100573137、美国授权发明专利US7,244,833B2、US7,442,371B2、US7,572,437B2和在已提交的中国发明专利申请(200710059770.3和200710057571.9)中分别公开了人血清白蛋白和不同的治疗性蛋白质基因相融合所获得的人血清白蛋白与各种血细胞增生刺激因子(CPSF)、各种人干扰素及各种皮肤细胞生长因子，利用基因工程方法重组形成几十种人血清白蛋白融合蛋白的技术，且获得的融合蛋白可在体内具有缓慢释放，与治疗性蛋白质单体相比，在体内给药后在血液中至少有3-10倍长的半衰期。体外体内试验验证其具有治疗性蛋白质的生物活性和药物功能，并进行了长效新药的研发。

人血清白蛋白的发酵生产工艺已在本发明人获得的中国发明授权专利中公开(ZL200410057313.7)。人血清白蛋白和人血清白蛋白与治疗性蛋白质形成的融合蛋白的大规模分离纯化工艺已在本发明人的中国发明专利申请中公开(公开号：CN101260145A)。

现在本发明人正在将20余种人血清白蛋白与治疗性蛋白质形成的融合蛋白推进入长效性新药的研发阶段。为了寻找一种有效、简单、成本低廉、长期稳定可靠又符合临床用药的要求而发明了本通用型制剂配方(制剂配方在本发明中等同于制剂处方)。研发中的5种融合蛋白新药，“注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白”、“注射用重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白”、“注射用人血清白蛋白/干扰素α2b”、“外用型人血清白蛋白/人表皮细胞生长因子融合蛋白”和“注射用人血清白蛋白/EP0融合蛋白”利用这个制剂配方已启动或已完成了临床前研究工作，进入临床试验研究许可申报阶段。在本发明提交前，未见任何关于重组人血清白蛋白融合蛋白冻干粉针剂的研究和报道，更未见能具有通用性和具有效性的简单制剂配方可供任何人血清白蛋白融合蛋白制备注射用针剂来生产临床试验用药的报道。

如果获得一种具有简便高效的、具公用性、广谱性和具特异性的能将各种人血清白蛋白融合蛋白都可以用于临床用药制造的通用制剂配方和制剂剂型，就可将几十种具有临床治疗意义的蛋白药物的制造技术简易化、通用化和高性能，这具有真正的实用性和明显的必要性。

生物大分子-蛋白质的稳定性可受到多种因素的影响，而易于发生分子聚合、形成二聚体、三聚体、四聚体或多聚体形态；也可以在化学、蛋白酶适宜环境条件下起作用，蛋白质发生降解，二者的结果，均会在蛋白质的生物学活性上产生变化。对于蛋白制剂，影响其稳定性的物理和化学因素很多，包括温度、pH、离子强度、表面活性剂、缓冲对、保护剂等。融合蛋白的生物活性在长期贮存时同样是会受到多种环境因素的影响。例如对温度，氧和紫外线高度敏感。由于这些因子的作用，可能发生多种物理或化学变化，例如结合，聚合和氧化断裂从而蛋白质的大大丧失其生物活性。因此如果贮存期间重组人血清白蛋白融合蛋白的稳定性不能保证的话，会导致给药剂量的变化从而影响疗效。

人血清白蛋白与治疗性蛋白质形成的融合蛋白是把人血清白蛋白与治疗性蛋白质通过基因工程方法将融合在一起，但二个蛋白维持各自独特的功能。由于人血清白蛋白的性质相当稳定，因此理论上说融合后的治疗性融合蛋白稳定性会有大大提高。但不同的人血清白蛋白融合蛋白由于其治疗性蛋白质的特性完全不同，因此，采用水制剂时必须考量每个融合蛋白自身的不同，进行长时间的制剂筛选和稳定性考察，需要耗时至少两年才能获得一个完整可靠的数据链。采用冻干粉针剂则可以保证任何融合蛋白的稳定性，冻干粉状态使融合蛋白在按规定条件储藏时不会有较大变化(形成聚合体或发生降解或均有生成)。一个稳定和通用的制剂配方和生产工艺将可以大大节省各种融合蛋白的新药研发中的人力物力，也可明显加快研发的进度和降低研发成本和风险。因此本发明的重要性不言而喻。

重组融合蛋白在临床上的应用方式和给药途经是基本确定的，注射针剂通过皮下、肌注或静脉给药。注射用针剂通常由原料药和具有一定意义和作用的辅料组成制剂配方(处方)。注射用针剂要符合一定的渗透压和适当的pH缓冲系统。甘露醇、甘氨酸、山梨醇、丙三醇、羟乙基淀粉、右旋糖酐、水解明胶、聚维酮、丙氨酸以及其它氨基酸可作为填充剂和赋型剂用于针剂配方是十分常见的，含量也一般在0.1-10％；乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、棉子糖和精氨酸可作为稳定剂，含量一般在0.1％-4％左右；制剂的缓冲剂系统可由钙盐；醋酸钠盐、磷酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、邻苯二甲酸盐、氯化钠盐从5mM至300mM不等，并使制剂的pH保持在4至8之间。另外，适量的甘草酸单铵、L-半胱氨酸盐酸盐、无水亚硫酸钠、氢氧化钠溶液，抗氧化剂维生素E、维生素C、硫代硫酸钠、硫脲，共同加无菌注射用水制备成制剂也是常规注射用针剂的配方组分。

本发明人在新药研发中比较了各种已知制剂的配方和制剂的剂型(水针剂、粉针剂)，分析、研究和进行了大量的试验，证明了本发明描述的制剂配方和制剂剂型、对保护和稳定人血清白蛋白融合蛋白注射用药具有意想不到的优势，并已形成注射用临床治疗药物。

发明内容

本发明提供了一种能稳定保存人血清白蛋白与治疗性蛋白质形成的融合蛋白，并适合于实际临床使用的含有这种融合蛋白的注射用冻干粉针剂。

本发明的目的是提供一种适合重组人血清白蛋白融合蛋白注射用临床治疗用药的制剂配方和制剂剂型，这可通过以下步骤达到：

(1)纯化的适用于制备临床用药的融合蛋白原液(原料药)与适量的作为赋型剂的甘露醇、作为稳定剂和促溶剂的蔗糖、阻抑融合蛋白形成聚合体的表面活性剂聚山梨酯80、适量的低盐缓冲液组成符合临床注射用药要求的渗透压和pH值条件下组合形成制剂；

(2)从步骤(1)中获得的含融合蛋白蛋白的制剂，经过滤除菌，分装一定量的制剂进入管状西林瓶

(3)由步骤(2)获得的目标蛋白直接经冷冻干燥程序，进行冻干形成具有一定形态的白色疏松体成为冻干粉针剂；

(4)由步骤(3)获得的冻干粉针剂按所制定的质量标准规定进行检定，并可用于人类疾病的治疗和预防。

本发明所指的制剂配方可以是各种类型的含有重组人血清白蛋白融合蛋白而形成的临床用药形式的冻干粉针剂配方。制剂配方中的组分可以是，包括，但不局限于，各种有利于保护融合蛋白的结构稳定性、有增强融合蛋白的生物学功能、可以是有助于融合蛋白制剂适于人体的必要缓冲体系和减少注射带来的对人体的刺激作用的组分。

重组人血清白蛋白融合蛋白可以是人血清白蛋白与治疗性蛋白质以各种不同形式通过基因工程方法和技术进行连接而成的融合蛋白。人血清白蛋白可以在治疗性蛋白质肽链的N末端或C末端；在人血清白蛋白和治疗性蛋白质之间的连接方式可以有连接肽或者是没有连接肽的连接。连接肽的长度可以是1-100个氨基酸。没有连接肽的连接可以是直接连接，即是两个蛋白质分子肽链各自均没有任何氨基酸丢失的条件下形成的连接。人血清白蛋白与治疗性蛋白质之间的连接还可以是有氨基酸缺失的条件下形成融合蛋白的缺失连接。这种缺失，可以是发生在两个蛋白质中的一个或两个蛋白质都有不同氨基酸肽链长度的缺失。缺失可以是1-100个氨基酸的缺失。人血清白蛋白和治疗性蛋白质形成融合蛋白时，也均可以有在不影响各自生物学功能的条件下两个蛋白质中的一个或两个蛋白质的肽链中发生氨基酸的替换和改变。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种含有人血清白蛋白融合蛋白的注射用粉针剂，所述注射用粉针剂由重组人血清白蛋白和治疗性蛋白质形成的融合蛋白，并与医学上可接受的赋型剂和稳定剂辅料、溶于pH4～8的药学上可接受的盐缓冲液中，通过冷冻干燥而形成白色疏松体冻干粉针剂，按标示量进入注射用水，可迅速复溶为澄清液体，用于临床治疗作用，所述重组人血清白蛋白融合蛋白的浓度为0.1～5mg/ml。

重组人血清白蛋白融合蛋白的表达和生产制备方法可参考于在林、富岩的授权发明专利(美国发明专利US7,244,833B2、US7,442,371B2、US7,572,437B2，中国发明专利ZL02142881.6、中国发明专利ZL200410042814.8、中国发明专利ZL200410057313.7和中国发明专利申请公开CN101260145A)等。

所述赋型剂和稳定性辅料可根据需要酌情添加，如醇类、氨基酸类和糖类等。本发明中优选的辅料赋型剂为甘露醇、甘氨酸、甲硫氨酸、羟乙基淀粉、右旋糖酐、水解明胶、聚维酮、丙氨酸以及其它氨基酸，稳定性辅料为乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、棉子糖和精氨酸。为阻止蛋白质形成聚合体所试验的表面活性剂为医学可以接受的表面活性剂如聚山梨酯(吐温)80，聚山梨酯(吐温)20、环糊精、右旋糖酐、泊洛沙姆等。制剂的缓冲剂系统可由钙盐；醋酸钠盐、磷酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、邻苯二甲酸盐、氯化钠盐、甘草酸单铵、L-半胱氨酸盐酸盐、无水亚硫酸钠、或氢氧化钠适当含量组成。

作为赋型剂的辅料优选为甘露醇或甘氨酸或二者均含有，优选为甘露醇，含量浓度为2～6％，优选为3-5％，更优选为4.0％。具有稳定性作用的辅料优选为蔗糖和海藻糖，含量浓度为0.5-2％，优选为蔗糖0.5-1.5％，更优选为1.0％。表面活性剂优选为聚山梨酯80，含量浓度为0.001-0.02％，优选为0.002-0.006％，更优选为0.004％。作为制剂的缓冲液体系优选为柠檬酸、磷酸盐和醋酸钠盐，优选为磷酸盐或柠檬酸，含量浓度为5-100mM，优选为含量浓度为10-50mM，更优选为10mM。制剂的pH值优选为4.0-8.0，更优选为pH5.0-7.0。制剂配方的摩尔渗透压优选为人体最适范围200-500mOsm，优选为200-400mOsm，更优选为220-340mOsm。

制剂的最大特点是对人体不会产生任何过敏、增加新的毒副作用。制剂中如果除蔗糖不含有外，提高甘露醇的含量也是可行的。蔗糖的添加较单纯的甘露醇对融合蛋白的保护作用更为明显。

在制剂优选配方中重组人血清白蛋白融合蛋白的含量可在0.1mg-5mg/ml范围形成制剂，优选为0.2-5mg/ml，更优选为0.6-4mg/ml。灌注量在0.2ml-3ml，优选为0.5ml-2ml，更优选为0.5ml-1m1，从而获得0.3mg-5mg/2.0ml/支；优选为0.3mg-2mg/1.0ml/支，更优选为0.3mg-1.0mg/0.5ml/支。

在原料药(原液)到成品的生产过程中，所用水为无热源注射用水，所用试剂均经无热源处理步骤，所用玻璃器材都经过干热烘烤除热源的处理，所用配方组分均为“药用级”或“化学分析纯”符合生物制品对制剂配方辅料的要求。

冷冻干燥可以使得人血清白蛋白融合蛋白制剂获得极为稳定的保藏状态。在水剂配方中，融合蛋白在储藏时，随着时间，会形成单体游离的人血清白蛋白和治疗性蛋白质片断。这是水剂不可避免的。发明人经过比较水剂和冻干粉针剂，显示出本发明的优势十分明显。重组人血清白蛋白融合蛋白的冷冻干燥生产工艺如下：原液加入经优选的辅料(甘露醇、蔗糖、聚山梨酯80和盐溶液)配制成半成品，经过0.22μm正压过滤后，分装西林瓶，每支装量为0.5ml-2ml，入冻干箱开始冻干程序。冻干曲线为：-50℃预冷4hr，-20℃在真空状态下升华8hr，然后进行梯度升温开始解析，-10℃1hr，0℃1hr，10℃1hr，29℃(产品温度升至26℃时启动极限真空)，解析共约9h，经压力等指标检测后压盖，出冻干机，成品加封铝塑组合盖。冻干全程约需26h。冻干得到成型的白色疏松体，含水率在3.0％以内。在加入标示量的注射用水后，可迅速复溶为无色澄清液体。冻干曲线可由技术人员进行控制和进行曲线优化。

本发明的制剂和剂型是符合医学临床用药要求的制剂和剂型，生产制备工艺简单可控，简化了可用于生产各种不同的人血清白蛋白融合蛋白的临床用药方法，适用于，包括，但不局限于，重组人血清白蛋白和各种治疗性蛋白质形成的融合蛋白直接制备成为注射用药。本发明可适用的融合蛋白有人血清白蛋白与造血细胞增生刺激因子形成的融合蛋白(于在林，中国专利ZL02142881.6；US7,244,833B2)，包括，但不局限于：人血清白蛋白与血红细胞增生素(EPO)、与白细胞介素(ILs)、与干细胞因子(SCF)、与血小板增生素(TPO)、与粒细胞集落刺激因子(GCSF)和与巨噬粒细胞集落刺激因子(GM-GSF)等形成的融合蛋白；有人血清白蛋白与人干扰素形成的融合蛋白(富岩、于在林ZL200410042814.8)，包括，但不局限于：与干扰素-α(-2a、-2b或-1b)、与干扰素-β、与干扰素-γ、与干扰素-ω等形成的融合蛋白；还有人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子形成的融合蛋白(于在林、富岩中国专利申请CN200710059770.3)，包括，但不局限于，与人表皮细胞生长因子(EGF)、与人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、与人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、与人胰岛素样细胞生长因子(IGF)、与人角质细胞生长因子(KGF)、与人血小板衍生生长因子(PDGF)等。

在重组人血清白蛋白融合蛋白制剂配方药剂的稳定性考察中，选取的检定指标有冻干粉复溶速率、澄清度检测、蛋白质纯度检测有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和高效液相色谱法、蛋白质含量、在细胞水平的生物活性测定、pH值、各种辅料含量的测定(蔗糖、甘露醇和聚山梨酯80)、水分、无菌检查、异常毒性检查、细菌内毒素检查等常规和自行制定的检定方法来决定配方和冻干工艺是否符合药剂的要求。

附图说明

附图1、用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法考察重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rHSA/GCSF，代号9314)在水剂制剂配方中的稳定性。编号1、3、5、7为水剂制剂；编号2、4、6、8为非制剂。1和2为在室温条件下保存3天；5和6为室温条件下保存6天。编号3和4为在4℃条件下保存3天，编号5和6为在4℃条件下保存6天。

附图2、所发明的制剂处方已稳定重复用于人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白、重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白和人血清白蛋白/表皮细胞生长因子融合蛋白的冷冻干燥成品制造。附图2(A)为“注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白”的冻干粉针剂成品生产实际记录典型冻干曲线图流程图；附图2(B)为“注射用重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白”的冻干粉针剂成品生产实际冻干曲线记录流程图。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅是用于说明本发明而不是限制本发明的范围。

实施例1：重组人血清白蛋白融合蛋白在水针剂制剂配方中的表现

不同的重组蛋白质药物制成水制剂时的配方各有较明显的不同，并形成自己的专利配方，例如，重组干扰素α2a和干扰素α2b的水针剂配方不同，重组粒细胞刺激因子注射液水制剂配方也与重组干扰素的配方不同。以美国Amgen公司的重组人粒细胞刺激因子注射液NEUPOGEN成品水针剂剂配方作为制剂配方筛选参考，并进行比较。美国Amgen公司的NEUPOGEN注射液规格0.5ml：每支含有rhGCSF：0.3mg；醋酸：0.295mg；甘露醇：25.0mg；聚山梨酯80：0.02mg；钠盐：0.0175mg。所以在此基础上，以人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rHSA/GCSF)为例，进行重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的注射用针剂的制剂处方研究。

试验采用非制剂的原液(原料药，含有10mM NaAc)和完全模拟Amgen的水针剂制剂配方(只将蛋白更换为rHSA/GCSF融合蛋白，其余组分不变)进行比较，考察结果见附图1：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法考察重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rHSA/GCSF，代号9314)在水针剂制剂配方中的稳定性。编号1、3、5、7为水剂制剂；编号2、4、6、8为非制剂。1和2为在室温条件下保存3天；5和6为室温条件下保存6天。编号3和4为在4℃条件下保存3天，编号7和8为在4℃条件下保存6天。由图中试验结果可以清楚看出：

(1)、不含水针剂配方的原液在4℃及室温下不稳定，4℃6天时、室温3天时明显有降解带产生；室温6天时绝大部分被降解；

(2)、水针剂配方在4℃及室温下也相对不稳定(但比原液要好很多)，4℃6天时、室温3天时仅有少量降解带产生；室温6天时降解带也明显有增多；而重组人粒细胞刺激因子在该水制剂配方中，可以在4℃保持至少两年的稳定。结果也表明同样含有人粒细胞刺激因子蛋白，但与人血清白蛋白形成融合蛋白后，在同样条件下变得不稳定了。结果表明水剂配方很难获得一个通用的制品配方。因此，必须重新进行适合于重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的水针剂配方筛选。在没有文献参考的条件下，只能逐一进行比较和筛选，这将是一个十分耗时的工作。成功更多是靠“运气”和经验来帮助。

(3)、液体制剂配方与单纯原液醋酸钠缓冲体系对比，保护作用则非常明显；但为增加成品稳定性、满足长期储存需要，因此应该采用冻干剂型。这样在冻干粉针剂复溶后，融合蛋白在室温条件下将有近48小时的稳定，无蛋白质降解带形成(见附图1中的编号1、3、5、7条带的表现)。

(4)制剂配方和制剂形式筛选也考虑了如何保持rHSA/GCSF单体数量，不形成或减少形成蛋白聚合体的机会。冻干形式比液体形式形成聚合体的机会更小。

因此，试验表明如果采用冻干制剂的方法，可简单达到增加融合蛋白的稳定性的目标。

本发明还曾分别对重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白、人重组血清白蛋白/干扰素α2b融合蛋白(带有连接肽)和人重组血清白蛋白/表皮细胞生长因子融合蛋白(rHSA/EGF)进行相同的试验获得了完全类似的结果，显示了水剂的不稳定。

用甘氨酸来替换制剂配方中的甘露醇，对融合蛋白的稳定作用表现明显要好于甘露醇。但在加速试验中也没有发现其可形成保有融合蛋白在水针剂状态持续维持数月以上稳定的迹象。因此可以确定，冻干粉针剂能更好地保证和达到不因融合蛋白的不同，而在单一制剂配方中，经冷冻干燥制备成可用于临床治疗用药的要求。

实施例2：冻干剂型-配方中添加糖种类的研究(蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖)：

本发明针对人血清白蛋白融合蛋白的分子结构的特定性，在初步处方筛选的选定甘露醇的基础上，进行了添加不同种类的糖，以考察是否可增加成品冻干制剂的稳定性。

选取检验合格的人血清白蛋白/干扰素α2a原液，配成10mM PB、0.3mg融合蛋白、4％甘露醇、1％蔗糖(或分别是海藻糖、葡萄糖、乳糖)、0.004％吐温80，pH6.5的制剂，装量为0.5ml；同时配成10mM PB，0.3mg融合蛋白、5％甘露醇、0.004％吐温80，装量0.5ml，做对照。冻干后，进行纯度分析。结果表明，冻干后融合蛋白成品的蛋白纯度，在相同的糖含量下(1％)，蔗糖与海藻糖对融合蛋白的保护作用最好，葡萄糖次之，乳糖最差。同时后两者的复溶性要逊于蔗糖和海藻糖作为添加剂的配方。当蔗糖含量为5％，甘露醇含量为0％时，融合蛋白不能复溶。因此，从制剂的摩尔渗透压、对蛋白的保护效果和生产成本考虑优选药用级蔗糖，其在制剂中的含量为1.0％。

表-1

配比	甘露醇含量	蔗糖含量
			1	5.0％	0
2	4.9％	0.1％
			3	4.75％	0.25％
4	4.5％	0.5％
			5	4.25	0.75％
6	4.0％	1.0％
			7	3.5％	1.5％
8	0	5.0％

实施例3：冻干剂型-配方中聚山梨酯80含量的研究

针对重组人血清白蛋白融合蛋白易于形成聚合体。以重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rHSA/GCSF)为例进行了详尽的处方筛选研究。在GCSF分子上有一个自由巯基，当两个GCSF分子相遇可以形成二聚体，并且不能用常规方法分开，只能通过完全变性分开。形成聚合体使得制备的蛋白质生物活性大大下降。在rhGCSF的生产制备时，这种聚合体，是通过完全变性，然后在重新复性来解决(当然得率要下降)。在形成人血清白蛋白融合蛋白后，就不能再通过变性-复性来解决了。重组人血清白蛋白融合蛋白自己有17个二硫键存在，rHSA/GCSF融合蛋白有20个二硫键，rHSA/干扰素α2a和rHSA/干扰素α2b各有19个二硫键，rHSA/EGF则有21个二硫键可能存在。这样变性后的正确复性成功率要远低于1％。这一分子结构的特定性，使得在Amgen的水针剂配方及本发明的试验结果表明配方应该含有一定量的聚山梨酯80，可以明显减少聚合体的形成，为此在进行配方筛选时，对保护剂聚山梨酯80的添加不同含量(0.002％、0.004％、0.008％、0.01％)的保护效果进行了对比。结果表明，不论那个重组人血清白蛋白融合蛋白在含有一定量的聚山梨酯80时均可降低聚合体的形成(聚合体形式，可以是形成共价键的二聚体，也可以是由于表明分子聚合而形成的聚合体)。有效的聚山梨酯80含量为0.002％-0.01％范围。虽然0.01％对人体仍然是安全的，但考虑到实际效果和参考已上市销售的成熟配方，采用有明显保护作用的0.004％聚山梨酯80为配方的最佳含量。

实施例4：在辅料及辅料含量确定后的最适pH值、融合蛋白含量及灌注量的考察

在辅料及辅料含量确定后，又进行了pH值、融合蛋白含量和冻干时的灌注量进行考察。在设定的条件下，例如：融合蛋白含量1mg/ml、4％甘露醇、1％蔗糖、0.004％聚山梨酯80时，pH值经过pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5的比较，结果表明对rHSA/GCSF融合蛋白在pH4-6之间没有观察到明显不同。rHSA/干扰素α2a则在pH5-7之间没有观察到明显的不同。根据临床用药特点，通用制剂配方的pH可设定为6.0。对成品的pH值许可波动范围确定在±1.0。在选定pH值后，再比较融合蛋白的含量，当融合蛋白含量小于0.2mg/ml时，融合蛋白的稳定性明显下降。考虑到临床用药的可能使用的方便剂量，可以确定0.4mg/ml的蛋白含量可作为制剂的处方中容许下线。西林瓶灌注量的测试由0.5ml到2ml不等，对融合蛋白的纯度和活性没有明显的影响。在冻干时的灌注体积改变和冻干曲线的影响，可以经由专业人员进行调整解决，属于本领域技术操作人员可以根据其经验和仪器设备来处理的。

实施例5：制剂配方确定后的冻干曲线研究

本发明人通过试验确定了一个可用于多种重组人血清白蛋白融合蛋白的通用冷冻干燥制剂配方：0.02-0.2％重组人血清白蛋白融合蛋白、4.0％甘露醇、1.0％蔗糖、0.004％聚山梨酯80和10mM的磷酸盐缓冲液，pH5.5。

冻干曲线的设计主要考虑了融合蛋白成品的相对耐热性，前面的-50℃4hr，冷冻的速度越快，产生的冰晶越小，复溶时易溶解，同时可以保证样品冻实，抽真空时不起泡；冻干过程中升华干燥在-20℃除去大部分水分，然后通过逐步升温使制品缓慢的升高温度，随着制品温度的升高使水分进一步降低；最后一步应用29℃，并在制品温度达到26时极限真空，可以使水分降到更低，同时使制品温度不会升到太高，保证活性不受影响。半成品分装后，加半塞，放入冻干机冷冻隔板，按照既定冻干程序(表：成品冻干程序)进行冻干，冻干程序结束，压塞，出冻干箱，轧铝盖。进行水分、纯度等分析。

本发明中描述的制剂配方和所使用的冻干曲线在“注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白”[附图2(A)]、“注射用重组人血清白蛋白/干扰素α2a”[附图2(B)]的临床试验研究用药制备中得到实际使用。同时也在“重组人血清白蛋白/表皮细胞生长因子融合蛋白冻干粉”的实际制备生产中得到应用。

表：重组人血清白蛋白融合蛋白的成品通用冻干曲线流程

当然，在实际应用于不同的融合蛋白时，还有可能要据此进行必要的优化，以获得最佳的冻干效果。

实施例6：通用重组人血清白蛋白融合蛋白的冷冻干燥制剂配方的长期稳定性测定

对本发明筛选和优化的适用于所有人血清白蛋白融合蛋白注射用制剂配方和冷冻干燥生产工艺获得的成品(已实际对三种不同的重组人血清白蛋白融合蛋白进行了20多个批次的冷冻干燥粉针剂的生产制备，每批次从700支至20000支规模不等)。冻干粉针剂在2-8℃的条件下，从2008年5月保藏至2009年11月稳定性没有明显变化。在25℃的加速试验中(25℃的3个月，相当于2-8℃的18个月)稳定性考察中，也没有明显变化。按照常规经验，一般冻干粉针剂在指定的保藏条件下，30个月的有效期是可以保证。稳定性试验选取的检定指标有冻干粉复溶速率、澄清度检测、蛋白质纯度检测有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和高效液相色谱法、蛋白质含量、在细胞水平的生物活性测定、pH值、各种辅料含量的测定(蔗糖、甘露醇和聚山梨酯80)、水分、无菌检查、异常毒性检查、细菌内毒素检查等中国药典(2005版三部)方法和自己制定的检定方法来决定这个配方和冻干工艺是否符合药剂的要求。

考察结果表明本发明的制剂配方对重组人血清白蛋白融合蛋白有很好的保护作用，制品配方适应度好，可适于各种所测定的人重组血清白蛋白融合蛋白。已有4个融合蛋白实际使用制剂配方和冷冻干燥生产工艺制备临床前研究用药和临床试验研究用药。可以肯定其稳定性和有效性。同时制剂配方简单、成本低廉、制剂各组分对人体安全有效。

Claims (4)

1.一种制剂配方用于制备含有人血清白蛋白融合蛋白的注射用冻干粉针剂，其特征在于：

(1)所述的制剂配方由含有重组人血清白蛋白融合蛋白与药学上可接受的赋型剂、稳定剂辅料和可接受的盐缓冲液组成；

(2)(1)中所含的重组人血清白蛋白融合蛋白含量为0.01-0.5％，优选地是0.02-0.4％；

(3)(1)中所含的赋型剂为甘露醇或甘氨酸，稳定剂为蔗糖、或海藻糖以及聚山梨酯80，盐缓冲液为磷酸盐或醋酸盐或柠檬酸盐，优选的赋型剂为甘露醇、稳定剂为蔗糖和聚山梨酯80，盐缓冲液为磷酸盐或醋酸盐；

(4)进一步(3)中的甘露醇含量为2-6％，优选地是4.0％，蔗糖含量为0.5-1.5％，优选地是1.0％，聚山梨酯80的含量为0.002-0.006％，优选地是0.004％，盐缓冲液的浓度为5-100mM，优选地是10mM，pH值为4.0-7.0，优选地是pH值5.5-6.5。

2.权利要求1所述制剂配方中的人血清白蛋白融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白是由通过各种连接方式将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合，然后通过酵母菌或脊椎动物细胞表达制备的重组人血清白蛋白融合蛋白。

3.如权利要求1所述的冻干粉针剂，其特征在于，是利用冷冻干燥技术将含有药用级人血清白蛋白融合蛋白和药用级辅料混合配制而成的液体制剂经分装管状玻璃容器，由冻干机冷冻干燥而成具有一定形状的疏松体，在加入标示量的注射用水后可迅速复溶为澄明液体。

4.权利要求1所述的冻干粉针剂是作为各种疾病的临床治疗和预防用药物。

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