CN113365662A - 治疗方法 - Google Patents

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詹姆斯·海斯
理查德·J·霍兰德
亚当·贾奇
林荞梦
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Gainawan Science Co ltd
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Abstract

本发明提供了用于将核酸递送至细胞或靶细胞的胞质溶胶的方法和组合物。所述方法包括使所述细胞接触1)膜去稳定化聚合物；以及2)核酸缀合物。所述核酸缀合物包括与任选的接头结合的靶向配体和核酸。

Description

治疗方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2018年11月2日提交的美国申请序列号62/755,196的优先权益，所述申请以引用的方式并入本文。
背景技术
靶向核酸缀合物是生物活性核酸的有效药物递送系统(参见WO2017/177326)。为了有效，必须将基于核酸(包括大核酸分子，例如体外转录的信使RNA(mRNA)以及与信使RNA或基因相互作用的较小的多核苷酸)的药物递送至正确的细胞区室。
例如，双链核酸诸如双链RNA分子(dsRNA)(包括例如，siRNA)因其物理化学特性而无法渗透细胞。在递送到正确的区室中时，siRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调节机制阻断基因表达。通常，siRNA的尺寸大，分子量在12-17kDa的范围内，并且由于其具有最多至50个负电荷的磷酸骨架而高度阴离子化。另外，两条互补的RNA链产生刚性螺旋。这些特征结构导致siRNA的―类药(drug-like)”特性差。在静脉内施用时，siRNA从体内快速排出，其中典型半衰期仅在10分钟的范围内。另外，siRNA被存在于血液和其他流体或组织中的核酸酶快速降解，并已显示出在体外和体内刺激强免疫应答。参见，例如，Robbins等,Oligonucleotides 19:89-102,2009。mRNA分子存在类似的不可渗透性、脆弱性和免疫原性问题。
通过引入适当的化学修饰，可以增加针对核酸酶的稳定性并且同时可以抑制免疫刺激。某些配体与siRNA的缀合可以改善双链RNA分子的药代动力学特征。已经证实某些小分子siRNA缀合物有效地特异性下调在啮齿动物的肝细胞中表达的基因。然而，为了引起期望的生物学效应，需要大剂量。参见Soutschek等,Nature 432:173-178,2004。
尽管存在先前的努力，仍需要用于将核酸递送到细胞中的改进方法。例如，需要提高效力、减少所需剂量和/或降低给药频率的方法。还需要可以用于皮下递送核酸的方法和制剂。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于将核酸递送至细胞的方法，其包括使细胞接触1)膜去稳定化聚合物；以及2)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于将核酸递送至受试者体内的靶细胞的胞质溶胶的方法，所述方法包括：向受试者施用(a)膜去稳定化聚合物，以及(b)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸，其中核酸被递送至靶细胞的胞质溶胶。
在一个实施方案中，本发明提供一种方法，其包括向动物施用1)膜去稳定化聚合物；以及2)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸。
在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含：a)药学上可接受的载剂，b)膜去稳定化聚合物；以及c)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸。在一个实施方案中，组合物被配制用于通过注射进行施用。在一个实施方案中，组合物被配制用于通过皮下注射进行施用。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗通过多肽的过表达进行表征的疾病的方法，其包括向患有疾病的动物施用治疗有效量的(a)膜去稳定化聚合物；以及b)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为靶向过表达多肽的表达的siRNA。
在一个实施方案中，本发明提供一种将siRNA递送至动物的肝脏的方法，其包括向动物施用(a)膜去稳定化聚合物，其包含被选择用于促进聚合物的肝细胞特异性递送的靶向部分(T5)；以及b)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为siRNA。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗动物的乙型肝炎病毒感染的方法，其包括向动物施用：(a)膜去稳定化聚合物，其包含被选择用于促进聚合物的肝细胞特异性递送的靶向部分(T5)，以及(b)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为被选择用于促进缀合物的肝细胞特异性递送的靶向配体，B为任选的接头，并且C为对于治疗乙型肝炎病毒感染有效的siRNA。
在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括：1)膜去稳定化聚合物；2)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸；以及3)用于将核酸递送至细胞的说明书，其包括使细胞与核酸缀合物和膜去稳定化聚合物接触。
在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括：1)膜去稳定化聚合物；2)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸；以及3)用于将核酸递送至受试者体内的靶细胞的胞质溶胶的说明书，这通过向受试者施用核酸缀合物和膜去稳定化聚合物来实现。
在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括：1)膜去稳定化聚合物；2)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸；以及3)用于将核酸缀合物和膜去稳定化聚合物施用给动物的说明书。
在一个实施方案中，本发明提供一种膜去稳定化聚合物和一种式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸；其用于医学疗法。
在一个实施方案中，本发明提供一种式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸；其用于使用与膜去稳定化聚合物组合的核酸能够治疗的疾病的预防或治疗性治疗。
在一个实施方案中，本发明提供了式(X)的核酸缀合物的用途，所述式(X)的核酸缀合物为：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸；其用于制备用于治疗使用与膜去稳定化聚合物组合的核酸能够治疗的疾病的药物。
在一个实施方案中，本发明提供一种式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸，其中核酸缀合物与膜去稳定化聚合物非共价缔合。
在一个实施方案中，本发明提供一种式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸，其中核酸缀合物被包含多种膜去稳定化聚合物的胶束部分或完全包封。
在一个实施方案中，本发明提供一种式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸，其中核酸缀合物被包含多种膜去稳定化聚合物的胶束部分包封。
在一个实施方案中，本发明提供一种式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸，其中核酸缀合物被包含多种膜去稳定化聚合物的胶束完全包封。
在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸，其中核酸缀合物被包含多种膜去稳定化聚合物的胶束部分或完全包封。
在一个实施方案中，本发明提供了可以用于靶向递送治疗性核酸(例如至肝脏)的化合物、组合物和方法。具体地，它包括将聚合物胶束用作皮下施用的缀合物平台的有效增强剂，以将核酸治疗剂靶向递送至肝脏。聚合物胶束在递送至肝细胞期间通常保持完整并发挥其功能，例如，在皮下施用时。通过测量靶基因相对于媒介物对照的表达抑制或减少来检查基因沉默。在小鼠中获得了有利的结果，其中膜去稳定化聚合物和核酸缀合物的共同施用使效力提高约5倍；还观察到起效更快并且作用持续时间更长。
通过以下具体实施方式和附图，本领域技术人员将清楚本发明的其他目的、特征和优点。
具体实施方式
膜去稳定化聚合物
膜去稳定化聚合物在美国专利申请公布号：US2010/0160216、US2010/0210504、US2011/0143434、US2011/0123636、US2016/0250338、US2017/0239360和US2016/0206750，以及国际专利申请公布号：WO2009/140427、WO2009/140429、WO2015/017519和WO2016/118697中有报道。另外，某些特定的膜去稳定化聚合物的合成的描述可以见于Prieve等,Mol.Ther.,2018,26,3的补充部分。
在一个实施方案中，膜去稳定化聚合物包括三个不同的区域：
首先，肝细胞靶向可以通过靶向部分诸如单个N-乙酰基半乳糖胺单糖单元实现，所述单糖单元与在肝细胞表面高度表达的ASGPr受体的三个三价结构域中的一个相互作用。此单糖单元形成聚合物链的―头部”。N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc或NAG)可以通过与三硫代碳酸乙酯(ECT)偶联的PEG12氨基酸间隔物连接至聚合物的第二功能结构域。这代表起始的―链转移剂”或CTA。后续聚合反应可以在完全去保护的单糖上发生。
第二―增溶”或亲水性区域由聚乙二醇甲基丙烯酸酯4-5(PEGMA4-5)(数字4和5是指单体中乙二醇重复的数目)和甲基丙烯酸羟乙酯(HMA)构成。比率通常为大约75/25PEGMA/HMA。聚合可以通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)发生，其允许控制由偶氮二异丁腈(AIBN)引发的自由基聚合过程中产生的分子量和多分散性。该反应可以在固定的时间在一定的浓度和温度下进行，以产生大约4kDa的亲水性聚合物，所述聚合物以末端三硫代碳酸酯官能团封端，从而允许进一步聚合。
聚合物的第三区域提供内体释放功能。也可以使用RAFT聚合进行合成，但是在这种情况下，反应中的单体单元是丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEA)、甲基丙烯酸丁酯(BMA)和丙基丙烯酸(PAA)(比率通常为约33％/55％/12％)。此第二聚合步骤将聚合物另外延伸大约5kDa。聚合后，可以通过自由基诱导的还原除去聚合物端基(三硫代碳酸酯)，并通过1HNMR、HPLC和GPC对最终聚合物进行表征(以确定MW和多分散性)。
两个聚合区域的组合有助于使功效最大化。在生理或中性pH下，聚合物通常是中性的。此外，在中性pH下，第二内体释放区域表现出疏水特征。在与亲水性结构域缀合时，如果聚合物高于在水性介质中的临界胶束浓度(CMC)，则将自发形成小的胶束结构。这些已在红细胞溶血测定中显示出具有pH响应性膜去稳定化活性：低于CMC，溶血作用急剧下降。在内吞和后续pH降低过程中，聚合物可以变得带正电并因此促进内体释放。
在一个实施方案中，膜去稳定化聚合物是式(XX)的聚合物：
T5-L-[PEGMAm-M2 n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w(XX)
其中：
PEGMA为具有2-20个乙二醇单元的聚乙二醇甲基丙烯酸酯残基；M2为选自由以下组成的组的甲基丙烯酸酯残基：
(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；
(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
甲基丙烯酸胆固醇酯残基；
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；以及
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
BMA为甲基丙烯酸丁酯残基；
PAA为丙基丙烯酸残基；
DMAEMA为甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯残基；
m和n各自为大于0的摩尔分数，其中m大于n并且m+n＝1；
q为0.2至0.75的摩尔分数；
r为0.05至0.6的摩尔分数；
s为0.2至0.75的摩尔分数；
q+r+s＝1；
v为1至25kDa；
w为1至25kDa；
T5为靶向部分(例如，肽、聚合物或糖)；并且
L不存在或为连接部分。
在一个实施方案中，M2选自由以下组成的组：
甲基丙烯酸2,2,3,3,4,4,4-七氟丁酯残基、
甲基丙烯酸3,3,4,4,5,6,6,6-八氟-5(三氟甲基)己酯残基、
2-甲基丙烯酸2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十五氟辛酯残基、
甲基丙烯酸3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己酯残基、
甲基丙烯酸3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛酯残基、
甲基丙烯酸1,1,1-三氟-2-(三氟甲基)-2-羟基-4-甲基-5-戊酯残基、甲基丙烯酸2-[(1',1',1'-三氟-2'-(三氟甲基)-2'-羟基)丙基]-3-降冰片基酯残基、
甲基丙烯酸2-乙基己酯残基、
甲基丙烯酸丁酯残基、
甲基丙烯酸己酯残基、
甲基丙烯酸辛酯残基、
甲基丙烯酸正癸酯残基、
甲基丙烯酸月桂基酯残基、
甲基丙烯酸肉豆蔻基酯残基、
甲基丙烯酸硬脂基酯残基、
甲基丙烯酸胆固醇酯残基、
乙二醇苯基醚甲基丙烯酸酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-苯基乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-(1H-咪唑-1-基)乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,环己基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-[双(1-甲基乙基)氨基]乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,3-甲基丁基酯残基、
甲基丙烯酸新戊酯残基、
甲基丙烯酸叔丁酯残基、
甲基丙烯酸3,3,5-三甲基环己酯残基、
甲基丙烯酸2-羟丙基酯残基、
甲基丙烯酸5-壬基酯残基、
甲基丙烯酸2-丁基-1-辛酯残基、
甲基丙烯酸2-己基-1-癸酯残基，以及
甲基丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯残基。
靶向部分T5为可以是例如肽、聚合物或糖的部分。在某些实施方案中，靶向部分T5靶向递送至体内的位置，例如，靶向递送至特定器官或细胞类型。在某些实施方案中，T5为肽。在某些实施方案中，T5为聚合物。在某些实施方案中，T5为糖。
在一个实施方案中，膜去稳定化聚合物为式(XXI)的聚合物：
Figure BDA0003143117940000121
在一些实施方案中，px为约2至约50的整数，例如，约2至约20，例如，4至12(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)。在一些实施方案中，px为约8至约16的整数(例如，8、9、10、11、12、13、14、15或16)。在一些实施方案中，px为约12。在一些实施方案中，py为约2至约20的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。在一些实施方案中，py为约2至约10的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些实施方案中，py为约4至约5的整数(例如，4或5)。
在式(X)的聚合物中，应当理解，聚合物嵌段的表示：
Figure BDA0003143117940000131
指定具有两个单体基团a和b的聚合物嵌段：
Figure BDA0003143117940000132
其分布在整个嵌段中，其中约75.5重量％的嵌段为单体基团a，并且约24.5重量％的嵌段为单体基团b。聚合物嵌段的表示：
Figure BDA0003143117940000133
不指定包含一个单体基团a的均聚物嵌段和一个单体基团b的均聚物嵌段的聚合物嵌段。对于聚合物嵌段的表示同样正确的是：
Figure BDA0003143117940000134
其具有分布在整个嵌段中的三种单体单元，大致处于所示的总重量比。
靶向核酸缀合物
术语―烷氧基”和―烷硫基”以其常规含义使用，并且是指通过氧原子(―氧基”)或硫基与分子的其余部分连接的那些烷基，并且还包括其单卤化和多卤化变体。
除非另外指明，否则术语―烷基”自身或作为另一取代基的一部分意指具有指定碳原子数的直链或支链烃自由基(即，C1-8意指1至8个碳)。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。术语―烯基”是指具有一个或多个双键的不饱和烷基自由基。类似地，术语―炔基”是指具有一个或多个三键的不饱和烷基自由基。此类不饱和烷基的实例包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。
术语―动物”包括哺乳动物物种，诸如人、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。
如本文所用，术语―芳基”是指单个全碳芳环或多缩合全碳环系，其中至少一个环为芳族。例如，在某些实施方案中，芳基具有6至20个碳原子、6至14个碳原子、6至12个碳原子，或6至10个碳原子。芳基包括苯基自由基。芳基还包括具有约9至20个碳原子的多缩合碳环系(例如，包括2、3或4个环的环系)，在所述多缩合碳环系中至少一个环为芳族并且其中其他环可以是芳族或不是芳族(例如，环烷基)。当化合价需要允许时，多缩合环系的环可以通过稠合、螺环和桥接键彼此连接。应当理解，如上文所定义的多缩合环系的连接点可以是环系的任何位置，包括环的芳族或碳环部分。芳基的非限制性实例包括但不限于苯基、茚基、茚满基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基、蒽基等。
术语―环烷基”是指具有3至8个碳原子的饱和或部分不饱和(非芳族)的全碳环(即，(C3-C8)碳环)。该术语还包括多缩合的饱和全碳环系(例如，包括2、3或4个碳环的环系)。相应地，碳环包括多环碳环(multicyclic carbocyle)，诸如二环碳环(例如，具有约3至15个碳原子、约6至15个碳原子或6至12个碳原子的二环碳环，诸如二环[3.1.0]己烷和二环[2.1.1]己烷)，以及多环碳环(polycyclic carbocycle)(例如，具有最多至约20个碳原子的三环和四环碳环)。当化合价需要允许时，多缩合环系的环可以通过稠合、螺环和桥接键彼此连接。例如，多环碳环可以通过单个碳原子彼此连接以形成螺环连接(例如，螺戊烷、螺[4,5]癸烷等)、通过两个相邻的碳原子彼此连接以形成稠合连接(例如，诸如十氢萘、3,3-二甲基-1-氯丁烷(norsabinane)、降蒈烷的碳环)，或通过两个不相邻的碳原子彼此连接以形成桥接连接(例如，降冰片烷、二环[2.2.2]辛烷等)。环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、二环[2.2.1]庚烷、蒎烷和金刚烷。
术语―基因”是指包含产生多肽或前体多肽所需要的部分长度或全长编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。
如本文所用，―基因产物”是指基因的产物，诸如RNA转录物或多肽。
除非另有说明，否则术语―卤代”或―卤素”意指氟、氯、溴或碘原子。
如本文所用，术语―杂芳基”是指在环中具有至少一个除碳之外的原子的单个芳环，其中所述原子选自由氧、氮和硫组成的组；―杂芳基”还包括具有至少一个这样的芳环的多缩合环系，所述多缩合环系在下文进一步描述。因此，―杂芳基”包括约1至6个碳原子和约1-4个选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子的单个芳环。硫和氮原子也可以氧化形式存在，前提条件是环是芳族的。示例性杂芳基环系包括但不限于吡啶基、嘧啶基、噁唑基和呋喃基。―杂芳基”还包括多缩合环系(例如，包括2、3或4个环的环系)，其中如上定义的杂芳基与一个或多个选自环烷基、芳基、杂环和杂芳基的环缩合。应当理解，杂芳基或杂芳基多缩合环系的连接点可以处于杂芳基或杂芳基多缩合环系的任何合适的原子处，包括碳原子和杂原子(例如，氮)。示例性杂芳基包括但不限于吡啶基、吡咯基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡唑基、噻吩基、吲哚基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃基、噁二唑基、噻二唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻唑基、苯丙噁唑基、吲唑基、喹喔啉基和喹唑啉基。
术语―杂环”是指在环中具有至少一个除碳之外的原子的单个饱和或部分不饱和的环，其中所述原子选自由氧、氮和硫组成的组；该术语还包括具有至少一个这样的饱和或部分不饱和的环的多缩合环系，所述多缩合环系在下文进一步描述。因此，该术语包括在环中具有约1至6个碳原子和约1至3个选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子的单个饱和或部分不饱和的环(例如，3、4、5、6或7元环)。硫和氮原子也可以其氧化形式存在。示例性杂环包括但不限于氮杂环丁烷基、四氢呋喃基以及哌啶基。术语―杂环”还包括多缩合环系(例如，包括2、3或4个环的环系)，其中单个杂环(如上文所定义)可以与一个或多个选自环烷基、芳基和杂环的基团缩合，以形成多缩合环系。当化合价需要允许时，多缩合环系的环可以通过稠合、螺环和桥接键彼此连接。应当理解，多缩合环系的各个环可相对于彼此以任何顺序连接。还应当理解，多缩合环系(如上文针对杂环所定义)的连接点可以处于多缩合环系的任何位置，包括环的杂环、芳基和碳环部分。在一个实施方案中，术语杂环包括3-15元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-10元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-8元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-7元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-6元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括4-6元杂环。在一个实施方案中，术语杂环包括3-10元单环或二环杂环，其包括1至4个杂原子。在一个实施方案中，术语杂环包括3-8元单环或二环杂环，其包括1至3个杂原子。在一个实施方案中，术语杂环包括3-6元单环杂环，其包括1至2个杂原子。在一个实施方案中，术语杂环包括4-6元单环杂环，其包括1至2个杂原子。示例性杂环包括但不限于吖丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、高哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、四氢呋喃基、二氢噁唑基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、1,2,3,4-四氢喹啉基、苯并噁嗪基、二氢噁唑基、苯并二氢吡喃基、1,2-二氢吡啶基、2,3-二氢苯并呋喃基、1,3-苯并间二氧杂环戊烯基、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、螺[环丙烷-1,1'-异吲哚啉基]-3'-酮、异吲哚啉基-1-酮、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷基、咪唑烷-2-酮咪唑烷、吡唑烷、丁内酰胺、戊内酰胺、咪唑烷酮、乙内酰脲、二氧戊环、邻苯二甲酰亚胺以及1,4-二噁烷。
术语―糖”包括单糖、二糖和三糖，所有这些糖均可以是任选取代的。该术语包括葡萄糖、蔗糖果糖、半乳糖和核糖，以及脱氧糖诸如脱氧核糖和氨基糖诸如半乳糖胺。糖衍生物可以如国际专利申请公布号WO 96/34005和97/03995中所述便利地制备。糖可以便利地通过醚键、硫醚键(例如S-糖苷)、胺氮(例如N-糖苷)或碳-碳键(例如C-糖苷)与式I的化合物的其余部分连接。在一个实施方案中，糖可以便利地通过醚键与式I的化合物的其余部分连接。
如本文所用，术语―小干扰RNA”或―siRNA”是指当siRNA与靶基因或序列处于同一细胞中时能够减少或抑制靶基因或序列的表达的双链RNA(即，双链体RNA)(例如，通过介导与siRNA序列互补的mRNA的降解或抑制其翻译)。siRNA可与靶基因或序列基本相同或完全相同，或可包含错配区域(即，错配基序)。在某些实施方案中，siRNA的长度可为约19-25个(双链体)核苷酸，并且长度优选为约20-24、21-22或21-23个(双链体)核苷酸。siRNA双链体可包含约1至约4个核苷酸或约2至约3个核苷酸的3'突出端和5'磷酸酯末端。siRNA的实例包括但不限于由两条单独链的分子组装的双链多核苷酸分子，其中一条链是有义链并且另一条链是互补的反义链。
在某些实施方案中，siRNA的一条链或两条链上的5'和/或3'突出端包括1-4个(例如，1、2、3或4个)修饰和/或未修饰的脱氧胸苷(t或dT)核苷酸、1-4个(例如，1、2、3或4个)修饰(例如，2'OMe)和/或未修饰的尿苷(U)核糖核苷酸，和/或1-4个(例如，1、2、3或4个)修饰(例如，2'OMe)和/或未修饰的与靶序列(例如，反义链中的3'突出端)或其互补链(例如，有义链中的3'突出端)具有互补性的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
优选地，siRNA是化学合成的。还可以通过用大肠杆菌(E.coli)RNA酶III或Dicer切割较长的dsRNA(例如，长度大于约25个核苷酸的dsRNA)来产生siRNA。这些酶将dsRNA加工成生物活性siRNA(参见，例如，Yang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:9942-9947(2002)；Calegari等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14236(2002)；Byrom等,Ambion TechNotes,10(1):4-6(2003)；Kawasaki等,Nucleic Acids Res.,31:981-987(2003)；Knight等,Science,293:2269-2271(2001)；以及Robertson等,J.Biol.Chem.,243:82(1968))。优选地，dsRNA的长度为至少50个核苷酸至约100、200、300、400或500个核苷酸。dsRNA的长度可以像1000、1500、2000、5000个核苷酸一样长或更长。dsRNA可以编码整个基因转录物或部分基因转录物。在某些情况中，siRNA可由质粒编码(例如，转录为自动折叠成具有发夹环的双链体的序列)。
短语―抑制靶基因的表达”是指本发明的siRNA沉默、减少或抑制靶基因表达的能力。为了检查基因沉默的程度，使测试样品(例如，来自表达靶基因的感兴趣的生物体的生物样品或表达靶基因的培养细胞的样品)与沉默、减少或抑制靶基因表达的siRNA接触。将测试样品中靶基因的表达与未接触siRNA的对照样品(例如，来自表达靶基因的感兴趣的生物体的生物样品或表达靶基因的培养细胞的样品)中靶基因的表达进行比较。可以给对照样品(例如，表达靶基因的样品)指定100％的值。在特定实施方案中，当相对于对照样品(例如，仅缓冲液、靶向不同基因的siRNA序列、杂混的siRNA序列等)而言测试样品的值为约100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，实现了靶基因表达的沉默、抑制或减少。合适的测定包括但不限于使用本领域技术人员已知的技术检查蛋白质或mRNA水平，所述技术例如像斑点印迹、RNA印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶作用以及本领域技术人员已知的表型测定。
治疗性核酸诸如siRNA的―有效量”或―治疗有效量”是足以产生期望效果的量，所述期望效果例如，与不存在siRNA的情况下检测到的普通表达水平相比抑制靶序列的表达。在特定实施方案中，当相对于对照(例如，仅缓冲液、靶向不同基因的siRNA序列、杂混的siRNA序列等)而言利用siRNA获得的值为约100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，实现了靶基因或靶序列表达的抑制。用于测量靶基因或靶序列的表达的合适的测定包括但不限于使用本领域技术人员已知的技术检查蛋白质或mRNA水平，所述技术例如像斑点印迹、RNA印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶作用以及本领域技术人员已知的表型测定。
如本文所用的术语―核酸”是指含有至少两种核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的呈单链或双链形式的聚合物并且包括DNA和RNA。―核苷酸”含有糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基团。核苷酸通过磷酸酯基团连接在一起。―碱基”包括嘌呤和嘧啶，所述嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物；以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于放置新反应性基团诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸酯和烷基卤化物的修饰。核酸包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，所述核酸为合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸类似的结合特性。此类类似物和/或修饰残基的实例包括但不限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸以及肽-核酸(PNA)。另外，核酸可以包括一个或多个UNA部分。
术语―保护基”是指通常用于阻断或保护化合物上的特定官能团的取代基。举例来说，―氨基保护基”为连接于氨基的阻断或保护化合物中的氨基官能度的取代基。合适的氨基-保护基包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基(CBZ)和9-芴基亚甲基氧羰基(Fmoc)。类似地，―羟基-保护基”是指阻断或保护羟基官能度的羟基的取代基。合适的保护基包括乙酰基、甲硅烷基和2,2-二甲氧基丙烯。―羧基-保护基”是指阻断或保护羧基官能度的羧基的取代基。常见的羧基-保护基包括苯基磺酰基乙基、氰乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、2-(对甲苯磺酰基)乙基、2-(对硝基苯基亚磺酰基)乙基、2-(二苯基膦基)-乙基、硝基乙基等。对于保护基及其使用的一般描述，参见P.G.M.Wuts和T.W.Greene,Greene's Protective Groups in Organic Synthesis第4版,Wiley-Interscience,New York,2006。
术语―合成活化基团”是指可以与原子连接以活化所述原子以允许其与另一反应性基团形成共价键的基团。应当理解，合成活化基团的性质可取决于其所活化的原子。例如，当合成活化基团与氧原子连接时，合成活化基团是将活化所述氧原子以使其与另一反应性基团形成键(例如，酯、氨基甲酸酯或醚键)的基团。此类合成活化基团是已知的。可以与氧原子连接的合成活化基团的实例包括但不限于乙酸酯基、琥珀酸酯基、三氟甲磺酸酯基和甲磺酸酯基。当合成活化基团与羧酸的氧原子连接时，合成活化基团可以是可衍生自已知偶联试剂(例如已知的酰胺偶联试剂)的基团。此类偶联试剂是已知的。此类偶联试剂的实例包括但不限于N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、羟基苯并三唑(HOBt)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳酸酯(EDC)、(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(HATU)、丙基膦酸酐溶液(T3P)或O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)。
核酸
术语―核酸”包括具有通常称为寡核苷酸的含有高达至60个核苷酸的片段和称为多核苷酸的较长片段的任何寡核苷酸或多核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由称为脱氧核糖的5-碳糖组成，其在此糖的5’和3’碳上共价连接至磷酸酯以形成交替的非支化聚合物。DNA可呈以下形式：例如反义分子、质粒DNA、预先缩合的DNA、PCR产物、载体、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合。核糖寡核苷酸由类似重复结构组成，其中5-碳糖为核糖。RNA可呈以下形式：例如，小干扰RNA(siRNA)、Dicer-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)、自扩增RNA(sa-RNA)以及其组合。因此，在本发明的上下文中，术语―多核苷酸”和―寡核苷酸”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)键组成的核苷酸单体或核苷单体的聚合物或低聚物。术语―多核苷酸”和―寡核苷酸”还包括包含非天然存在的单体或其功能类似的部分的聚合物或低聚物。此类修饰的或取代的寡核苷酸常常优于天然形式，因为例如像细胞摄取增强、免疫原性减小以及在核酸酶存在下稳定性增加的性质。
除非另外指明，否则具体核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。确切地说，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合型碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。
如本文所述，本发明的某些实施方案提供了用于将核酸递送至细胞的方法和组合物。在某些实施方案中，核酸是本文所述的核酸。例如，本文使用的核酸可为单链DNA或RNA、或双链DNA或RNA、或DNA-RNA杂交体。本文描述了双链RNA的实例并且包括例如siRNA和其他RNAi剂，诸如aiRNA和前体miRNA。单链核酸包括例如反义寡核苷酸、核酶、成熟miRNA以及三链体形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotide)。
在某些实施方案中，核酸是寡核苷酸。在特定实施方案中，寡核苷酸的长度在约10至约100个核苷酸的范围内。在各种相关实施方案中，单链、双链和三链的寡核苷酸的长度都可以在约10至约60个核苷酸、约15至约60个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸或约20至约30个核苷酸的范围内。
在某些实施方案中，核酸选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、Dicer-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)、自扩增RNA(sa-RNA)以及其组合。
在某些实施方案中，核酸是反义分子。在某些实施方案中，核酸是miRNA分子。在某些实施方案中，核酸是siRNA。合适的siRNA以及可用于其制备的方法和中间体在国际专利申请公布号WO2016/054421中进行了报道。
靶基因
在某些实施方案中，核酸(例如，siRNA)可用于下调或沉默感兴趣的基因的翻译(即，表达)。感兴趣的基因包括但不限于与病毒感染和存活相关的基因、与代谢疾病和病症(例如，肝脏疾病和病症)相关的基因、与肿瘤发生和细胞转化(例如，癌症)相关的基因、血管生成基因、免疫调节基因诸如与炎性和自身免疫应答相关的那些、配体受体基因以及与神经变性病症相关的基因。在某些实施方案中，感兴趣的基因在肝细胞中表达。
与病毒感染和存活相关的基因包括由病毒表达，以便结合、进入细胞并在其中复制的那些。特别感兴趣的是与慢性病毒疾病相关的病毒序列。特别感兴趣的病毒序列包括以下病毒的序列：丝状病毒，诸如埃博拉病毒和马尔堡病毒(参见，例如，Geisbert等,J.Infect.Dis.,193:1650-1657(2006))；沙粒病毒诸如拉沙病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳瑞托病毒以及萨比亚病毒(Buchmeier等,Arenaviridae:the viruses and theirreplication,在:FIELDS VIROLOGY,Knipe等(编),第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia,(2001)中)；流感病毒诸如甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒(参见，例如，Steinhauer等,Annu Rev Genet.,36:305-332(2002)；以及Neumann等,J GenVirol.,83:2635-2662(2002))；肝炎病毒(参见，例如，Hamasaki等,FEBS Lett.,543:51(2003)；Yokota等,EMBO Rep.,4:602(2003)；Schlomai等,Hepatology,37:764(2003)；Wilson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:2783(2003)；Kapadia等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:2014(2003)；以及FIELDS VIROLOGY,Knipe等(编),第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(2001))；人免疫缺陷病毒(HIV)(Banerjea等,Mol.Ther.,8:62(2003)；Song等,J.Virol.,77:7174(2003)；Stephenson,JAMA,289:1494(2003)；Qin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:183(2003))；疱疹病毒(Jia等,J.Virol.,77:3301(2003))；以及人乳头瘤病毒(HPV)(Hall等,J.Virol.,77:6066(2003)；Jiang等,Oncogene,21:6041(2002))。
可以被沉默的示例性丝状病毒核酸序列包括但不限于编码结构蛋白(例如，VP30、VP35、核蛋白(NP)、聚合酶蛋白(L-pol))和膜相关蛋白(例如，VP40、糖蛋白(GP)、VP24)的核酸序列。用于埃博拉病毒的完整基因组序列在例如Genbank登录号NC_002549；AY769362；NC_006432；NC_004161；AY729654；AY354458；AY142960；AB050936；AF522874；AF499101；AF272001；以及AF086833中列出。埃博拉病毒VP24序列在例如Genbank登录号U77385和AY058897中列出。埃博拉病毒L-pol序列在例如Genbank登录号X67110中列出。埃博拉病毒VP40序列在例如Genbank登录号AY058896中列出。埃博拉病毒NP序列在例如Genbank登录号AY058895中列出。埃博拉病毒GP序列在例如Genbank登录号AY058898；Sanchez等,VirusRes.,29:215-240(1993)；Will等,J.Virol.,67:1203-1210(1993)；Volchkov等,FEBSLett.,305:181-184(1992)；以及美国专利号6,713,069中列出。另外的埃博拉病毒序列在例如Genbank登录号L11365和X61274中列出。用于马尔堡病毒的完整基因组序列在例如Genbank登录号NC_001608；AY430365；AY430366；以及AY358025中列出。马尔堡病毒GP序列在例如Genbank登录号AF005734；AF005733和AF005732中列出。马尔堡病毒VP35序列在例如Genbank登录号AF005731和AF005730中列出。另外的马尔堡病毒序列在例如Genbank登录号X64406；Z29337；AF005735和Z12132中列出。靶向埃博拉病毒和马尔堡病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利公布号20070135370中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
可以被沉默的示例性流感病毒核酸序列包括但不限于编码核蛋白(NP)、基质蛋白(M1和M2)、非结构蛋白(NS1和NS2)、RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)、神经氨酸酶(NA)以及血细胞凝集素(HA)的核酸序列。甲型流感病毒NP序列在例如Genbank登录号NC_004522；AY818138；AB166863；AB188817；AB189046；AB189054；AB189062；AY646169；AY646177；AY651486；AY651493；AY651494；AY651495；AY651496；AY651497；AY651498；AY651499；AY651500；AY651501；AY651502；AY651503；AY651504；AY651505；AY651506；AY651507；AY651509；AY651528；AY770996；AY790308；AY818138；以及AY818140中列出。甲型流感病毒PA序列在例如Genbank登录号AY818132；AY790280；AY646171；AY818132；AY818133；AY646179；AY818134；AY551934；AY651613；AY651610；AY651620；AY651617；AY651600；AY651611；AY651606；AY651618；AY651608；AY651607；AY651605；AY651609；AY651615；AY651616；AY651640；AY651614；AY651612；AY651621；AY651619；AY770995；以及AY724786中列出。靶向流感病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利公布号20070218122中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
可以被沉默的示例性肝炎病毒核酸序列包括但不限于在转录和翻译中涉及的核酸序列(例如，En1、En2、X、P)以及编码结构蛋白(例如，包括C蛋白和C相关蛋白的核心蛋白；包括S蛋白、M蛋白和/或L蛋白的衣壳蛋白和包膜蛋白或其片段)的核酸序列(参见，例如FIELDS VIROLOGY,同上)。可以被沉默的示例性丙型肝炎病毒(HCV)核酸序列包括但不限于5’-非翻译区(5’-UTR)、3’-非翻译区(3’-UTR)、多蛋白翻译起始密码子区、内部核糖体进入位点(IRES)序列、和/或编码以下蛋白质的核酸序列：核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白酶/解旋酶、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和/或NS5B RNA-依赖性RNA聚合酶。HCV基因组序列在例如Genbank登录号NC_004102(HCV基因型1a)、AJ238799(HCV基因型1b)、NC_009823(HCV基因型2)、NC_009824(HCV基因型3)、NC_009825(HCV基因型4)、NC_009826(HCV基因型5)以及NC_009827(HCV基因型6)中列出。甲型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_001489中列出；乙型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_003977中列出；丁型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_001653中列出；戊型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_001434中列出；并且庚型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登录号NC_001710中列出。使编码与病毒感染和存活相关的基因的序列沉默可以方便地与用来治疗病毒病状的常规药剂的施用组合使用。靶向肝炎病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括美国专利公布号20060281175、20050058982和20070149470；美国专利号7,348,314；以及在2009年3月20日提交的美国临时申请号61/162,127中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
与代谢性疾病和病症(例如，以肝脏为靶标的病症以及肝脏疾病和病症)相关的基因包括，例如，在血脂异常中表达的基因(例如，肝X受体，诸如LXRα和LXRβ(Genback登录号NM_007121)、法尼醇(farnesoid)X受体(FXR)(Genbank登录号NM_005123)、固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、位点1蛋白酶(SIP)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG辅酶A还原酶)、载脂蛋白B(ApoB)(Genbank登录号NM_000384)、载脂蛋白CIII(ApoC3)(Genbank登录号NM_000040和NG_008949REGION:5001.8164)和载脂蛋白E(ApoE)(Genbank登录号NM_000041和NG_007084REGION:5001.8612))；以及在糖尿病中表达的基因(例如，葡萄糖6磷酸酶)(参见，例如，Forman等,Cell,81:687(1995)；Seol等,Mol.Endocrinol.,9:72(1995)，Zavacki等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:7909(1997)；Sakai等,Cell,85:1037-1046(1996)；Duncan等,J.Biol.Chem.,272:12778-12785(1997)；Willy等,Genes Dev.,9:1033-1045(1995)；Lehmann等,J.Biol.Chem.,272:3137-3140(1997)；Janowski等,Nature,383:728-731(1996)；以及Peet等,Cell,93:693-704(1998))。本领域技术人员将了解，与代谢疾病和病症(例如，以肝脏为靶标的疾病和病症以及肝脏疾病和病症)相关的基因包括在肝脏本身中表达的基因以及在其他器官和组织中表达的基因。使编码与代谢疾病和病症相关的基因的序列沉默可以方便地与用来治疗疾病或病症的常规药剂的施用组合使用。靶向ApoB基因的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利公布号20060134189中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。靶向ApoC3基因的siRNA分子的非限制性实例包括在2009年1月26日提交的美国临时申请号61/147,235中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
与肿瘤发生和细胞转化(例如，癌症或其他瘤形成)相关的基因序列的实例包括有丝分裂驱动蛋白诸如Eg5(KSP、KIF11；Genbank登录号NM_004523)；丝氨酸/苏氨酸激酶诸如polo样激酶1(PLK-1)(Genbank登录号NM_005030；Barr等,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.,5:429-440(2004))；酪氨酸激酶诸如WEE1(Genbank登录号NM_003390和NM_001143976)；细胞凋亡抑制剂，诸如XIAP(Genbank登录号NM_001167)；COP9信号体亚基诸如CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN5(JAB1；Genbank登录号NM_006837)；CSN6、CSN7A、CSN7B和CSN8；泛素连接酶诸如COP1(RFWD2；Genbank登录号NM_022457和NM_001001740)；以及组蛋白脱乙酰酶诸如HDAC1、HDAC2(Genbank登录号NM_001527)、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9等。靶向Eg5和XIAP基因的siRNA分子的非限制性实例包括在2007年5月29日提交的美国专利申请序列号11/807,872中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用方式整体并入本文。靶向PLK-1基因的siRNA分子的非限制性实例包括美国专利公布号20050107316和20070265438；以及2008年12月23日提交的美国专利申请序列号12/343,342中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用方式整体并入本文。靶向CSN5基因的siRNA分子的非限制性实例包括在2008年4月15日提交的美国临时申请号61/045,251中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用方式整体并入本文。
与肿瘤发生或细胞转化相关的基因序列的另外的实例包括易位序列诸如MLL融合基因、BCR-ABL(Wilda等,Oncogene,21:5716(2002)；Scherr等,Blood,101:1566(2003))、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、BCL-2、AML1-ETO以及AML1-MTG8(Heidenreich等,Blood,101:3157(2003))；过表达序列诸如多药耐药基因(Nieth等,FEBS Lett.,545:144(2003)；Wu等,Cancer Res.63:1515(2003))、细胞周期蛋白(Li等,Cancer Res.,63:3593(2003)；Zou等,Genes Dev.,16:2923(2002))、β-连环蛋白(Verma等,Clin CancerRes.,9:1291(2003))、端粒酶基因(Kosciolek等,Mol Cancer Ther.,2:209(2003))、c-MYC、N-MYC、BCL-2、生长因子受体(例如，EGFR/ErbB1(Genbank登录号NM_005228、NM_201282、NM_201283和NM_201284；还参见Nagy等Exp.Cell Res.,285:39-49(2003)、ErbB2/HER-2(Genbank登录号NM_004448和NM_001005862)、ErbB3(Genbank登录号NM_001982和NM_001005915)和ErbB4(Genbank登录号NM_005235和NM_001042599)；以及突变序列，诸如RAS(综述于Tuschl和Borkhardt,Mol.Interventions,2:158(2002)中)。靶向EGFR基因的siRNA分子的非限制性实例包括在2007年5月29日提交的美国专利申请序列号11/807,872中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用方式整体并入本文。
使编码DNA修复酶的序列沉默与化学治疗剂的施用组合使用(Collis等,CancerRes.,63:1550(2003))。编码与肿瘤迁移相关的蛋白质的基因还靶向感兴趣的序列，例如整联蛋白、选择蛋白和金属蛋白酶。上述实例不是排他的。本领域技术人员将理解，可以包括有利于或促进肿瘤发生或细胞转化、肿瘤生长或肿瘤迁移的任何全部或部分基因序列作为模板序列。
血管生成基因能够促进新血管的形成。特别感兴趣的是血管内皮生长因子(VEGF)(Reich等,Mol.Vis.,9:210(2003))或VEGFR。靶向VEGFR的siRNA序列在例如GB 2396864；美国专利公布号20040142895；以及CA 2456444中列出，所述专利的公开内容出于所有目的以引用方式整体并入本文。
抗血管生成基因能够抑制新血管形成。这些基因对于治疗其中血管生成在疾病的病理发展中起作用的那些癌症特别有用。抗血管生成基因的实例包括但不限于内皮抑素(参见，例如，美国专利号6,174,861)、血管抑素(参见，例如，美国专利号5,639,725)和VEGFR2(参见，例如，Decaussin等,J.Pathol.,188:369-377(1999))，其公开内容出于所有目的以引用方式整体并入本文。
免疫调节基因为调节一种或多种免疫应答的基因。免疫调节基因的实例包括但不限于细胞因子，诸如生长因子(例如，TGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、SCF等)、白细胞介素(例如，IL-2、IL-4、IL-12(Hill等,J.Immunol.,171:691(2003))、IL-15、IL-18、IL-20等)、干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)以及TNF。Fas基因和Fas配体基因也是感兴趣的免疫调节靶序列(Song等,Nat.Med.,9:347(2003))。在造血细胞和淋巴样细胞中编码二级信号传导分子的基因也包括在本发明中，例如Tec家族激酶如布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)(Heinonen等,FEBS Lett.,527:274(2002))。
细胞受体配体包括能够与细胞表面受体(例如，胰岛素受体、EPO受体、G蛋白偶联受体、具有酪氨酸激酶活性的受体、细胞因子受体、生长因子受体等)结合以调节(例如，抑制、激活等)受体参与的生理途径(例如，葡萄糖水平调节、血细胞发育、有丝分裂等)的配体。细胞受体配体的实例包括但不限于细胞因子、生长因子、白介素、干扰素、促红细胞生成素(EPO)、胰岛素、胰高血糖素、G蛋白偶联受体配体等。编码用于三核苷酸重复(例如，CAG重复)扩增的模板可用于在由三核苷酸重复的扩增引起的神经变性病症中使致病序列沉默，所述神经变性病症诸如脊髓延髓肌肉萎缩(spinobulbular muscular atrophy)和亨廷顿舞蹈病(Caplen等,Hum.Mol.Genet.,11:175(2002))。
可被核酸(例如，siRNA)靶向以使基因表达下调或沉默的某些其他靶基因包括但不限于主动脉平滑肌肌动蛋白α2(ACTA2)、醇脱氢酶1A(ADH1A)、醇脱氢酶4(ADH4)、醇脱氢酶6(ADH6)、Afamin(AFM)、血管紧张素原(Angiotensinogen，AGT)、丝氨酸-丙酮酸氨基转移酶(AGXT)、α-2-HS-糖蛋白(AHSG)、醛酮还原酶家族1成员C4(AKR1C4)、血清白蛋白(ALB)、α-1-微球蛋白/bikunin前体(AMBP)、血管生成素相关蛋白3(ANGPTL3)、血清淀粉样蛋白P成分(APCS)、载脂蛋白A-II(APOA2)、载脂蛋白B-100(APOB)、载脂蛋白C3(ApoC3)、载脂蛋白C-IV(APOC4)、载脂蛋白F(APOF)、β-2-糖蛋白1(APOH)、水通道蛋白-9(AQP9)、胆汁酸辅酶A:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)、C4b-结合蛋白β链(C4BPB)、由LINC01554编码的假定未表征蛋白(Putative uncharacterized protein)(C5orf27)、补体因子3(C3)、补体因子5(C5)、补体成分C6(C6)、补体成分C8α链(C8A)、补体成分C8β链(C8B)、补体成分C8γ链(C8G)、补体成分C9(C9)、钙调蛋白结合转录激活因子1(CAMTA1)、CD38(CD38)、补体因子B(CFB)、补体因子H相关蛋白1(CFHR1)、补体因子H相关蛋白2(CFHR2)、补体因子H相关蛋白3(CFHR3)、大麻素受体1(CNR1)、血浆铜蓝蛋白(CP)、羧肽酶B2(CPB2)、结缔组织生长因子(CTGF)、C-X-C基序趋化因子2(CXCL2)、细胞色素P450 1A2(CYP1A2)、细胞色素P450 2A6(CYP2A6)、细胞色素P4502C8(CYP2C8)、细胞色素P450 2C9(CYP2C9)、细胞色素P450家族2亚家族D成员6(CYP2D6)、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)、叶绿醌Ω-羟化酶CYP4F2(CYP4F2)、7-α-羟基胆甾-4-烯-3-酮12-α-羟化酶(CYP8B1)、二肽基肽酶4(DPP4)、凝血因子12(F12)、凝血因子II(凝血酶)(F2)、凝血因子IX(F9)、纤维蛋白原α链(FGA)、纤维蛋白原β链(FGB)、纤维蛋白原γ链(FGG)、纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)、含黄素的单加氧酶3(FMO3)、含黄素的单加氧酶5(FMO5)、组特异性成分(group-specific component)(维生素D结合蛋白)(GC)、生长激素受体(GHR)、甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)、透明质酸结合蛋白2(HABP2)、铁调素抗微生物肽(HAMP)、羟基酸氧化酶(乙醇酸氧化酶)1(HAO1)、HGF活化剂(HGFAC)、结合珠蛋白相关蛋白；结合珠蛋白(HPR)、血红素结合蛋白(HPX)、富组氨酸糖蛋白(HRG)、羟基类固醇(11-β)脱氢酶1(HSD11B1)、羟基类固醇(17-β)脱氢酶13(HSD17B13)、间α胰蛋白酶抑制剂重链H1(ITIH1)、间α胰蛋白酶抑制剂重链H2(ITIH2)、间α胰蛋白酶抑制剂重链H3(ITIH3)、间α胰蛋白酶抑制剂重链H4(ITIH4)、前激肽释放酶(KLKB1)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、肝脏表达的抗微生物肽2(LEAP2)、白细胞衍生趋化因子2(leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2)、脂蛋白(a)(LPA)、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸肽酶2(mannan-binding lectin serine peptidase 2，MASP2)、S-腺苷甲硫氨酸合酶同种型-1(MAT1A)、NADPH氧化酶4(NOX4)、聚[ADP-核糖]聚合酶1(PARP1)、对氧磷酶1(PON1)、对氧磷酶3(PON3)、维生素K依赖性蛋白C(PROC)、视黄醇脱氢酶16(RDH16)、组成型血清淀粉样蛋白A4(serum amyloid A4,constitutive，SAA4)、丝氨酸脱水酶(SDS)、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族A成员1(Serpin Family A Member 1，SERPINA1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂A11(SERPINA11)、人组织激肽释放酶结合蛋白(Kallistatin，SERPINA4)、皮质类固醇结合球蛋白(SERPINA6)、抗凝血酶III(SERPINC1)、肝素辅因子2(SERPIND1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族H成员1(SERPINH1)、溶质运载蛋白家族5成员2(SLC5A2)、钠/胆汁酸协同转运蛋白(SLC10A1)、溶质运载蛋白家族13成员5(SLC13A5)、溶质运载蛋白家族22成员1(SLC22A1)、溶质运载蛋白家族25成员47(SLC25A47)、溶质运载蛋白家族2、易化葡萄糖转运蛋白(facilitated glucosetransporter)成员2(SLC2A2)、钠偶联中性氨基酸转运蛋白4(SLC38A4)、溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B1(Solute carrier organic anion transporter family member1B1，SLCO1B1)、神经鞘磷脂磷酸二酯酶1(Sphingomyelin Phosphodiesterase 1，SMPD1)、胆盐磺基转移酶(Bile salt sulfotransferase，SULT2A1)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)、色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶2家族多肽B10(UGT2B10)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶2家族多肽B15(UGT2B15)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶2家族多肽B4(UGT2B4)以及玻连蛋白(VTN)。
除了其出于治疗目的用于使任何上述基因的表达沉默之外，本文所述的某些核酸(例如，siRNA)还可用于研究和开发应用以及诊断、预防、预后、临床以及其他医疗保健应用。作为一个非限制性实例，某些核酸(例如，siRNA)可以用于针对测试感兴趣的基因是否可能成为治疗性靶标的靶标验证研究中。某些核酸(例如，siRNA)还可以用于旨在发现作为可能的治疗性靶标的基因的靶标鉴定研究中。
产生siRNA分子
可以若干形式提供siRNA，包括例如作为一种或多种分离的小干扰RNA(siRNA)双链体、作为较长的双链RNA(dsRNA)或作为由DNA质粒中的转录盒转录的siRNA或dsRNA。在一些实施方案中，siRNA可以酶促产生或通过部分/完全有机合成产生，并且修饰的核糖核苷酸可以通过体外酶促或有机合成引入。在某些情况中，化学制备每条链。合成RNA分子的方法为本领域中已知的，例如在Verma和Eckstein(1998)中所描述或如本文所描述的化学合成方法。
用于分离RNA、合成RNA、杂交核酸、制备和筛选cDNA文库以及进行PCR的方法是本领域中熟知的(参见，例如，Gubler和Hoffman,Gene,25:263-269(1983)；Sambrook等,同上；Ausubel等,同上)，PCR方法同样如此(参见，美国专利号4,683,195和4,683,202；PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Innis等编,1990))。表达文库也是本领域技术人员众所周知的。公开了在本发明中使用的一般方法的另外的基础文章包括Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版1989)；Kriegler,GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等编,1994)。这些参考文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
典型地，化学合成siRNA。包含本发明的siRNA分子的寡核苷酸可以使用本领域已知的任何各种技术来合成，诸如Usman等,J.Am.Chem.Soc.,109:7845(1987)；Scaringe等,Nucl.Acids Res.,18:5433(1990)；Wincott等,Nucl.Acids Res.,23:2677-2684(1995)；以及Wincott等,Methods Mol.Bio.,74:59(1997)中描述的那些。寡核苷酸的合成使用了常见的核酸保护基和偶联基，诸如5’-末端上的二甲氧基三苯甲基和3’-末端上的亚磷酰胺。作为一个非限制性实例，小规模合成可以在使用0.2μmol规模方案的Applied Biosystems合成仪上进行。可替代地，在0.2μmol规模下的合成可以在来自Protogene(Palo Alto,CA)的96孔板合成仪上进行。然而，更大或更小规模的合成也在本发明的范围内。用于寡核苷酸合成的适合试剂、用于RNA去保护的方法以及用于RNA纯化的方法是本领域技术人员已知的。
可以由两个相异的寡核苷酸组装siRNA分子，其中一个寡核苷酸包含siRNA的有义链并且另一个包含siRNA的反义链。例如，可以分开合成每条链并且在合成和/或去保护之后通过杂交或连接接合在一起。
连接基团
本发明的缀合物可包括一个或多个连接基团(例如，L3或L4)。每个连接基团的结构可以变化，如本文所述提供缀合功能。例如，每个连接基团的结构在长度和原子组成上变化，并且每个连接基团可以是支化的、非支化的、环状的或其组合。连接基团还可调节缀合物的溶解性、稳定性或聚集特性。
在一个实施方案中，每个连接基团包括约3-1000个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包括约3-500个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包括约3-200个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包括约3-50个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包括约10-1000个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包括约10-500个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包括约10-200个原子。在一个实施方案中，每个连接基团包括约10-50个原子。
在一个实施方案中，每个连接基团包括选自H、C、N、S和O的原子。
在一个实施方案中，每个连接基团包括选自H、C、N、S、P和O的原子。
在一个实施方案中，每个连接基团包含支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，所述烃链具有约1至1000个(或1-750、1-500、1-250、1-100、1-50、1-25、1-10、1-5、5-1000、5-750、5-500、5-250、5-100、5-50、5-25、5-10或2-5个碳原子)，其中碳原子中的一个或多个任选地独立地被-O-、-S、-N(Ra)-、3-7元杂环、5-6元杂芳基或碳环替代，并且其中每条链、3-7元杂环、5-6元杂芳基或碳环任选地且独立地被一个或多个(例如，1、2、3、4、5或更多个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、-N(Ra)2、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基，其中每个Ra独立地为H或(C1-C6)烷基。在一个实施方案中，接头包含支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，所述烃链具有约1至1000个(或1-750、1-500、1-250、1-100、1-50、1-25、1-10、1-5、5-1000、5-750、5-500、5-250、5-100、5-50、5-25、5-10或2-5个碳原子)，其中碳原子中的一个或多个任选地独立地被-O-、-S、-N(Ra)-替代，其中每个Ra独立地为H或(C1-C6)烷基。
在一个实施方案中，每个连接基团包含聚乙二醇。在一个实施方案中，连接基团包含通过羰基与靶向缀合物的其余部分连接的聚乙二醇。在一个实施方案中，聚乙二醇包括约1至约500或约5至约500或约3至约100个重复(例如，-CH2CH2O-)单元(Greenwald,R.B.等,Poly(乙基ene glycol)Prodrugs:Altered Pharmacokinetics and Pharmacodynamics,第2.3.1.章,283-338；Filpula,D.等,Releasable PEGylation of proteins withcustomized linkers,Advanced Drug Delivery,60,2008,29-49；Zhao,H.等,DrugConjugates with Poly(Ethylene Glycol),Drug Delivery in Oncology,2012,627-656)。
实施方案
在一个实施方案中，A为与靶细胞表面上的分子特异性结合的靶向配体。
在一个实施方案中，核酸缀合物和膜去稳定化聚合物分开施用。
在一个实施方案中，膜去稳定化聚合物在核酸缀合物的施用之后施用。
在一个实施方案中，核酸缀合物和膜去稳定化聚合物在单一组合物内一起施用。
在一个实施方案中，靶向配体和T5是不同的，并且(i)特异性地结合相同的细胞表面分子或(ii)特异性地结合靶细胞上的不同细胞表面分子。
在一个实施方案中，靶向配体和T5是相同的并且各自特异性地结合相同的细胞表面分子。
在一个实施方案中，细胞为分泌细胞、软骨细胞、上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、血细胞、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞或树突细胞。
在一个实施方案中，细胞为癌细胞、免疫细胞、细菌感染的细胞、病毒感染的细胞，或具有异常代谢活性的细胞。
在一个实施方案中，靶向配体与细胞表面分子特异性结合，所述细胞表面分子选自由以下组成的组：转铁蛋白受体1型、转铁蛋白受体2型、EGF受体、HER2/Neu、VEGF受体、PDGF受体、整联蛋白、NGF受体、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、叶酸受体和σ受体。
在一个实施方案中，靶向配体包括小分子靶向部分。
在一个实施方案中，小分子靶向部分为糖、维生素、双膦酸酯或其类似物。
在一个实施方案中，糖选自乳糖、半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺(NAG)、甘露糖和甘露糖-6-磷酸(M6P)。
在一个实施方案中，维生素为叶酸。
在一个实施方案中，靶向配体包括蛋白质。
在一个实施方案中，蛋白质为抗体、肽适体或衍生自细胞表面分子的天然配体的蛋白质。
在一个实施方案中，靶向配体包括肽。
在一个实施方案中，肽为整联蛋白结合肽、LOX-1-结合肽，以及表皮生长因子(EGF)肽、神经降压素肽、NL4肽或YIGSR层粘连蛋白肽。
在一个实施方案中，细胞为肝细胞。
在一个实施方案中，靶向配体特异性地结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
在一个实施方案中，靶向配体包括N-乙酰基半乳糖胺(NAG)残基。
在一个实施方案中，膜去稳定化聚合物包括三个区域：
单糖，
亲水性区域，其包含聚乙二醇甲基丙烯酸酯4-5(PEGMA 4-5)和甲基丙烯酸羟乙酯(HMA)；以及
提供内体释放的区域。
在一个实施方案中，膜去稳定化聚合物为式(XX)的聚合物：
T5-L-[PEGMAm-M2 n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w(XX)
其中：
PEGMA为具有2-20个乙二醇单元的聚乙二醇甲基丙烯酸酯残基；M2为选自由以下组成的组的甲基丙烯酸酯残基：
(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；
(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
甲基丙烯酸胆固醇酯残基；
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；以及
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
BMA为甲基丙烯酸丁酯残基；
PAA为丙基丙烯酸残基；
DMAEMA为甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯残基；
m和n各自为大于0的摩尔分数，其中m大于n并且m+n＝1；
q为0.2至0.75的摩尔分数；
r为0.05至0.6的摩尔分数；
s为0.2至0.75的摩尔分数；
q+r+s＝1；
v为1至25kDa；
w为1至25kDa；
T5为靶向部分(例如，肽、聚合物或糖)；并且
L不存在或为连接部分。
在一个实施方案中，M2选自由以下组成的组：
甲基丙烯酸2,2,3,3,4,4,4-七氟丁酯残基、
甲基丙烯酸3,3,4,4,5,6,6,6-八氟-5(三氟甲基)己酯残基、
2-甲基丙烯酸2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十五氟辛酯残基、
甲基丙烯酸3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己酯残基、
甲基丙烯酸3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛酯残基、
甲基丙烯酸1,1,1-三氟-2-(三氟甲基)-2-羟基-4-甲基-5-戊酯残基、甲基丙烯酸2-[(1',1',1'-三氟-2'-(三氟甲基)-2'-羟基)丙基]-3-降冰片基酯残基、
甲基丙烯酸2-乙基己酯残基、
甲基丙烯酸丁酯残基、
甲基丙烯酸己酯残基、
甲基丙烯酸辛酯残基、
甲基丙烯酸正癸酯残基、
甲基丙烯酸月桂基酯残基、
甲基丙烯酸肉豆蔻基酯残基、
甲基丙烯酸硬脂基酯残基、
甲基丙烯酸胆固醇酯残基、
乙二醇苯基醚甲基丙烯酸酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-苯基乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-(1H-咪唑-1-基)乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,环己基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-[双(1-甲基乙基)氨基]乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,3-甲基丁基酯残基、
甲基丙烯酸新戊酯残基、
甲基丙烯酸叔丁酯残基、
甲基丙烯酸3,3,5-三甲基环己酯残基、
甲基丙烯酸2-羟丙基酯残基、
甲基丙烯酸5-壬基酯残基、
甲基丙烯酸2-丁基-1-辛酯残基、
甲基丙烯酸2-己基-1-癸酯残基，以及
甲基丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯残基。
在一个实施方案中，PEGMA具有4-5个乙二醇单元或7-8个乙二醇单元。
在一个实施方案中，存在T1和L，并且T1包含N-乙酰基半乳糖胺(NAG)残基。
在一个实施方案中，L包含具有2-20个乙二醇单元的聚乙二醇(PEG)部分。
在一个实施方案中，膜去稳定化聚合物为式(XXI)的聚合物：
Figure BDA0003143117940000401
其中px为约2至约50的整数，例如约2至约20，例如4至12(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)。在一些实施方案中，px为约8至约16的整数(例如，8、9、10、11、12、13、14、15或16)。在一些实施方案中，px为约12。在一些实施方案中，py为约2至约20的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。在一些实施方案中，py为约2至约10的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些实施方案中，py为约4至约5的整数(例如，4或5)。
在一个实施方案中，式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure BDA0003143117940000402
其中：
R1a为靶向配体；
L1不存在或为连接基团；
L2不存在或为连接基团；
R2为核酸；
环A为不存在、3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
每个RA独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORB、C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基；其中C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
RB为氢、保护基、连接至固体支持体的共价键，或连接至与固体支持体结合的连接基团的键；并且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
或其盐。
在一个实施方案中，
R1a为靶向配体；
L1不存在或为连接基团；
L2不存在或为连接基团；
R2为核酸；
环A为不存在、3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
每个RA独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORB以及C1-8烷基，其任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
RB为氢、保护基、连接至固体支持体的共价键，或连接至与固体支持体结合的连接基团的键；并且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个实施方案中，R1为–C(H)(3-p)(L3-糖)p，
其中每个L3独立地为连接基团；
p为1、2或3；并且
糖为单糖或二糖。
在一个实施方案中，糖为：
Figure BDA0003143117940000421
其中：
X为NR3，并且Y选自-(C＝O)R4、-SO2R5和-(C＝O)NR6R7；或X为-(C＝O)-并且Y为NR8R9；
R3为氢或(C1-C4)烷基；
R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；
R10为-OH、-NR8R9或-F；并且
R11为-OH、-NR8R9、-F或5元杂环，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、羟基、羧基、氨基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基。
在一个实施方案中，糖选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000431
在一个实施方案中，糖为：
Figure BDA0003143117940000432
N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)GalPro。
在一个实施方案中，每个L3独立地为具有0至50个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，每个L3独立地为具有1至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，L3为：
Figure BDA0003143117940000441
在一个实施方案中，R1为：
Figure BDA0003143117940000442
在一个实施方案中，R1为：
Figure BDA0003143117940000443
其中：
G为-NH-或-O-；
RC为氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C6)烷酰基、(C3-C20)环烷基、(C3-C20)杂环、芳基、杂芳基、单糖、二糖或三糖；并且其中环烷基、杂环、芳基、杂芳基和糖任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羧基、羟基、氨基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基。
在一个实施方案中，RC为：
Figure BDA0003143117940000451
在一个实施方案中，R1为：
Figure BDA0003143117940000452
在一个实施方案中，RC为：
Figure BDA0003143117940000453
在一个实施方案中，G为-NH-。
在一个实施方案中，R1为：
Figure BDA0003143117940000461
在一个实施方案中，R1为：
Figure BDA0003143117940000462
其中每个RD独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C6)烷基、(C9-C20)烷基甲硅烷基、(RW)3Si-、(C2-C6)烯基、四氢吡喃基、(C1-C6)烷酰基、苯甲酰基、芳基(C1-C3)烷基、TMTr(三甲氧基三苯甲基)、DMTr(二甲氧基三苯甲基)、MMTr(单甲氧基三苯甲基)和Tr(三苯甲基)；并且
每个RW独立地选自由(C1-C4)烷基和芳基组成的组。
在一个实施方案中，L1和L2独立地为具有1至50个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，L1和L2独立地为具有1至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，L1和L2独立地为具有1至14个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，L1通过-NH-、-O-、-S-、-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-O-、-NH-(C＝O)-NH-或–NH-(SO2)-与R1连接。
在一个实施方案中，L2通过-O-与R2连接。
在一个实施方案中，L1选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000481
在一个实施方案中，L2为-CH2-O-或-CH2-CH2-O-。
在一个实施方案中，
式(I)的化合物为式(Ia)的化合物：
Figure BDA0003143117940000482
其中：
每个D独立地选自由
Figure BDA0003143117940000483
和-N＝组成的组；
或其盐。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000491
其中：
Q1为氢并且Q2为R2；或Q1为R2并且Q2为氢；并且
Z为-L1-R1。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Ib)的化合物：
Figure BDA0003143117940000501
其中：
每个D独立地选自由
Figure BDA0003143117940000502
和-N＝组成的组；并且
每个m独立地为1或2。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000503
其中：
Q1为氢并且Q2为R2；或Q1为R2并且Q2为氢；并且
Z为-L1-R1。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Ic)的化合物：
Figure BDA0003143117940000504
其中：
E为-O-或-CH2-；
n选自由0、1、2、3和4组成的组；并且
n1和n2各自独立地选自由0、1、2和3组成的组。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000511
其中：Z为-L1-R1。
在一个实施方案中，-A-L2-R2为：
Figure BDA0003143117940000512
其中：
Q1为氢并且Q2为R2；或Q1为R2并且Q2为氢；并且
每个q独立地为0、1、2、3、4或5。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000521
在一个实施方案中，R1选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000531
其中：
RS为
Figure BDA0003143117940000532
n为2、3或4；并且
x为1或2。
在一个实施方案中，L1选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000541
在一个实施方案中，A为不存在、苯基、吡咯烷基或环戊基。
在一个实施方案中，L2为任选地被羟基取代的C1-4亚烷基-O-。
在一个实施方案中，L2为–CH2O-、-CH2CH2O-或-CH(OH)CH2O-。
在一个实施方案中，各RA独立地为羟基或任选地被羟基取代的C1-8烷基。
在一个实施方案中，各RA独立地选自由羟基、甲基和-CH2OH组成的组。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Ig)的化合物：
Figure BDA0003143117940000542
其中：
B为-N-或-CH-；
L2为任选地被羟基或卤素取代的C1-4亚烷基-O-；并且
n为0、1、2、3、4、5、6或7。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000551
其中Q为-L1-R1；并且
R’为C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基；其中C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基任选地被卤素或羟基取代。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000552
其中Q为-L1-R1
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000561
Figure BDA0003143117940000571
Figure BDA0003143117940000581
Figure BDA0003143117940000591
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Id)的化合物：
Figure BDA0003143117940000592
其中：
R1d选自：
Figure BDA0003143117940000601
并且
Figure BDA0003143117940000602
Xd为C2-10亚烷基；
nd为0或1；
R2d为核酸；并且
R3d为H。
在一个实施方案中，R1d为：
Figure BDA0003143117940000611
在一个实施方案中，R1d为：
Figure BDA0003143117940000612
在一个实施方案中，Xd为C8亚烷基。
在一个实施方案中，nd为0。
在一个实施方案中，R3d为H。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000621
在一个实施方案中，式(I)的化合物为式(Ig)的化合物：
Figure BDA0003143117940000622
Figure BDA0003143117940000631
其中：
B为-N-或-CH-；
L2为任选地被羟基或卤素取代的C1-4亚烷基-O-；并且
n为0、1、2、3、4、5、6或7。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000632
其中：
Q为-L1-R1；并且
R’为C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基；其中C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基任选地被卤素或羟基取代。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000633
Figure BDA0003143117940000641
其中：Q为-L1-R1。
在一个实施方案中，式(X)的化合物为式(XX)的化合物：
Figure BDA0003143117940000642
其中：
R1a为靶向配体；
L1不存在或为连接基团；
L2不存在或为连接基团；
R2为核酸；
B为二价的并且选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000643
Figure BDA0003143117940000651
其中：
各R’独立地为C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基；其中C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基任选地被卤素或羟基取代；
用*标记的化合价连接至L1，或在L1不存在时连接至R1；并且
用**标记的化合价连接至L2，或在L2不存在时连接至R2。
在一个实施方案中，R1包含2-8个糖。
在一个实施方案中，R1包含2-4个糖。
在一个实施方案中，R1包含3-8个糖。
在一个实施方案中，R1包含3-6个糖。
在一个实施方案中，R1包含3-4个糖。
在一个实施方案中，R1包含2个糖。
在一个实施方案中，R1包含3个糖。
在一个实施方案中，R1包含4个糖。
在一个实施方案中，R1具有下式：
Figure BDA0003143117940000661
其中：
B1为包括约1至约20个原子的三价基团，并且与L1、T1和T2共价键合。
B2为包括约1至约20个原子的三价基团，并且与T1、T3和T4共价键合；
B3为包括约1至约20个原子的三价基团，并且与T2、T5和T6共价键合；
T1不存在或为连接基团；
T2不存在或为连接基团；
T3不存在或为连接基团；
T4不存在或为连接基团；
T5不存在或为连接基团；并且
T6不存在或为连接基团。
在一个实施方案中，每个糖独立地选自：
Figure BDA0003143117940000671
其中：
X为NR3，并且Y选自-(C＝O)R4、-SO2R5和-(C＝O)NR6R7；或X为-(C＝O)-并且Y为NR8R9；
R3为氢或(C1-C4)烷基；
R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；
R10为-OH、-NR8R9或-F；并且
R11为-OH、-NR8R9、-F或5元杂环，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、羟基、羧基、氨基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基。
在一个实施方案中，每个糖独立地选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000672
在一个实施方案中，每个糖独立地为：
Figure BDA0003143117940000681
在一个实施方案中，T1和T2中的一个不存在。
在一个实施方案中，T1和T2均不存在。
在一个实施方案中，T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至50个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至20个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至50个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，或其盐，其中烃链中的一个或多个碳原子任选地被-O-或-NRX-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基和氧代基(＝O)。
在一个实施方案中，T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至20个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-替代，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基和氧代基(＝O)。
在一个实施方案中，T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至20个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-替代，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基和氧代基(＝O)。
在一个实施方案中，T3、T4、T5和T6中的至少一个为：
Figure BDA0003143117940000691
其中：
n＝1、2、3。
在一个实施方案中，T3、T4、T5和T6中的每一个独立地选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000692
其中：
n＝1、2、3。
在一个实施方案中，T1和T2中的至少一个为甘氨酸。
在一个实施方案中，T1和T2中的每一个为甘氨酸。
在一个实施方案中，B1为包括1至15个原子的三价基团，并且与L1、T1和T2共价键合。
在一个实施方案中，B1为包括1至10个原子的三价基团，并且与L1、T1和T2共价键合。
在一个实施方案中，B1包括(C1-C6)烷基。
在一个实施方案中，B1包括C3-8环烷基。
在一个实施方案中，B1包括甲硅烷基。
在一个实施方案中，B1包括D-或L-氨基酸。
在一个实施方案中，B1包括糖。
在一个实施方案中，B1包括磷酸酯基团。
在一个实施方案中，B1包括膦酸酯基团。
在一个实施方案中，B1包括芳基。
在一个实施方案中，B1包括苯基环。
在一个实施方案中，B1为苯基环。
在一个实施方案中，B1为CH。
在一个实施方案中，B1包括杂芳基。
在一个实施方案中，B1选自：
Figure BDA0003143117940000711
在一个实施方案中，B2为包括1至15个原子的三价基团，并且与T2、T5和T6共价键合。
在一个实施方案中，B2为包括1至10个原子的三价基团，并且与T2、T5和T6共价键合。
在一个实施方案中，B2包括(C1-C6)烷基。
在一个实施方案中，B2包括C3-8环烷基。
在一个实施方案中，B2包括甲硅烷基。
在一个实施方案中，B2包括D-或L-氨基酸。
在一个实施方案中，B2包括糖。
在一个实施方案中，B2包括磷酸酯基团。
在一个实施方案中，B2包括膦酸酯基团。
在一个实施方案中，B2包括芳基。
在一个实施方案中，B2包括苯基环。
在一个实施方案中，B2为苯基环。
在一个实施方案中，B2为CH。
在一个实施方案中，B2包括杂芳基。
在一个实施方案中，B2选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000721
在一个实施方案中，B3为包括1至15个原子的三价基团，并且与L1、T1和T2共价键合。
在一个实施方案中，B3为包括1至10个原子的三价基团，并且与L1、T1和T2共价键合。
在一个实施方案中，B3包括(C1-C6)烷基。
在一个实施方案中，B3包括C3-8环烷基。
在一个实施方案中，B3包括甲硅烷基。
在一个实施方案中，B3包括D-或L-氨基酸。
在一个实施方案中，B3包括糖。
在一个实施方案中，B3包括磷酸酯基团。
在一个实施方案中，B3包括膦酸酯基团。
在一个实施方案中，B3包括芳基。
在一个实施方案中，B3包括苯基环。
在一个实施方案中，B3为苯基环。
在一个实施方案中，B3为CH。
在一个实施方案中，B3包括杂芳基。
在一个实施方案中，B3选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000731
在一个实施方案中，B3选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000732
或其盐。
在一个实施方案中，L1和L2独立地为具有1至50个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，L1选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000733
或其盐。
在一个实施方案中，L1通过选自由以下组成的组的键与B1连接：-O-、-S-、-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-NH-(C＝O)-NH-或-NH-(SO2)-。
在一个实施方案中，L1选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000741
在一个实施方案中，L2通过-O-与R2连接。
在一个实施方案中，L2为任选地被羟基取代的C1-4亚烷基-O-。
在一个实施方案中，L2通过-O-与R2连接。
在一个实施方案中，L2不存在。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940000742
Figure BDA0003143117940000751
Figure BDA0003143117940000761
以及
Figure BDA0003143117940000771
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000772
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000781
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000782
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000791
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000792
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000801
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000802
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000803
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000811
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000812
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000821
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000822
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000831
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000832
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000841
其中：
L1不存在或为连接基团；
L2不存在或为连接基团；
R2为核酸；
环A为不存在、3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
每个RA独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORB、C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基；其中C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
RB为氢、保护基、连接至固体支持体的共价键，或连接至与固体支持体结合的连接基团的键；并且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000851
其中：
L2不存在或为连接基团；
R2为核酸；
环A为不存在、3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
每个RA独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORB、C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基；其中C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
RB为氢、保护基、连接至固体支持体的共价键，或连接至与固体支持体结合的连接基团的键；并且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
或其盐。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000861
或其盐，其中R2为核酸。
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000862
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000871
在一个实施方案中，式(I)的化合物为化合物，
Figure BDA0003143117940000872
其中：
R1c为糖；
L1c为具有0至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个选自氧代基(＝O)和卤素的取代基取代；
Bc为5-10元芳基或5-10元杂芳基，所述5-10元芳基或5-10元杂芳基任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、羟基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C3-C6)环烷基和(C3-C6)环烷基(C1-C6)烷基
L2c为具有0至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个选自氧代基(＝O)和卤素的取代基取代；
R2c为糖；
L3c不存在或为连接基团；
Ac为3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
各RAc独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORa、C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基；其中C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
nc为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
L4c不存在或为连接基团；
R3c为核酸；
Rac为氢；并且
L5c为连接基团；
或其盐。
在一个实施方案中，Bc为5-10元芳基。
在一个实施方案中，Bc为萘基或苯基。
在一个实施方案中，Bc为苯基。
在一个实施方案中，基团：
Figure BDA0003143117940000891
为：
Figure BDA0003143117940000892
在一个实施方案中，Bc为5-10元杂芳基。
在一个实施方案中，Bc为吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、咪唑基、噻唑基、噁二唑基或噁唑基。
在一个实施方案中，基团：
Figure BDA0003143117940000893
为：
Figure BDA0003143117940000894
在一个实施方案中，基团：
Figure BDA0003143117940000895
为：
Figure BDA0003143117940000901
在一个实施方案中，L1c为具有0至20个碳原子的二价的、非支化的饱和烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个选自氧代基(＝O)和卤素的取代基取代。
在一个实施方案中，L1c为具有0至12个碳原子的二价的、非支化的饱和烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-C(＝O)-或-C(＝O)-NRX-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基。
在一个实施方案中，L1c为：
–C(＝O)N(H)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、
–C(＝O)N(H)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、
–C(＝O)N(CH3)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，或
–C(＝O)N(CH3)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。
在一个实施方案中，L2c为具有0至20个碳原子的二价的、非支化的饱和烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个选自氧代基(＝O)和卤素的取代基取代。
在一个实施方案中，L2c为具有0至12个碳原子的二价的、非支化的饱和烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-C(＝O)-或-C(＝O)-NRX-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基。
在一个实施方案中，L2c为：
–C(＝O)N(H)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、
–C(＝O)N(H)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、
–C(＝O)N(CH3)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，或
–C(＝O)N(CH3)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。
在一个实施方案中，R1c为：
Figure BDA0003143117940000911
其中：
X为NR20并且Y选自-(C＝O)R21、-SO2R22和-(C＝O)NR23R24；或X为-(C＝O)-并且Y为NR25R26；或X为-NR37R38并且Y不存在
R20为氢或(C1-C4)烷基；
R21、R22、R23、R24、R25和R26各自独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基组成的组；
R27为-OH、-NR25R26或-F；
R28为-OH、-NR25R26或-F；
R29为-OH、-NR25R26、-F、-N3、-NR35R36或5元杂环，其任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、羧基、氨基、(C1-C4)烷基、芳基和(C1-C4)烷氧基，其中任何(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素组成的组，并且其中任何芳基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基；
各R35和R36独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素和(C1-C4)烷氧基组成的组；或R35和R36与它们所连接的氮一起形成5-6元杂芳基环，所述杂芳基环任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、芳基和(C3-C6)环烷基，其中任何芳基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团R39取代；
各R37和R38独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基；或R37和R38与它们所连接的氮一起形成5-8元杂环，所述5-8元杂环任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、羧基、氨基、氧代基(＝O)、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基，其中任何(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基任选地被一个或多个独立地选自卤素的基团取代；并且
各R39独立地选自由以下组成的组：(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个独立地选自卤素的基团取代。
在一个实施方案中，R1c为：
Figure BDA0003143117940000931
在一个实施方案中，R1c为：
Figure BDA0003143117940000932
在一个实施方案中，R1c为：
Figure BDA0003143117940000933
在一个实施方案中，R1c为
Figure BDA0003143117940000941
在一个实施方案中，R2c为：
Figure BDA0003143117940000942
其中：
X为NR20并且Y选自-(C＝O)R21、-SO2R22和-(C＝O)NR23R24；或X为-(C＝O)-并且Y为NR25R26；或X为-NR37R38并且Y不存在
R20为氢或(C1-C4)烷基；
R21、R22、R23、R24、R25和R26各自独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基组成的组；
R27为-OH、-NR25R26或-F；
R28为-OH、-NR25R26或-F；
R29为-OH、-NR25R26、-F、-N3、-NR35R36或5元杂环，其任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、羧基、氨基、(C1-C4)烷基、芳基和(C1-C4)烷氧基，其中任何(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素组成的组，并且其中任何芳基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基；
各R35和R36独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素和(C1-C4)烷氧基组成的组；或R35和R36与它们所连接的氮一起形成5-6元杂芳基环，所述杂芳基环任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、芳基和(C3-C6)环烷基，其中任何芳基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团R39取代；
各R37和R38独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基；或R37和R38与它们所连接的氮一起形成5-8元杂环，所述5-8元杂环任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、羧基、氨基、氧代基(＝O)、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基，其中任何(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基任选地被一个或多个独立地选自卤素的基团取代；并且
各R39独立地选自由以下组成的组：(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个独立地选自卤素的基团取代。
在一个实施方案中，R2c为：
Figure BDA0003143117940000961
在一个实施方案中，R2c为：
Figure BDA0003143117940000962
在一个实施方案中，R2c为：
Figure BDA0003143117940000963
在一个实施方案中，R2c为
Figure BDA0003143117940000971
在一个实施方案中，L3c为具有0至50个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，L3c为具有1至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，L3c为具有1至30个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中一个或多个碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个卤素或氧代基(＝O)取代。
在一个实施方案中，L3c为：
Figure BDA0003143117940000981
在一个实施方案中，L3c通过-NH-、-O-、-S-、-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-O-、-NH-(C＝O)-NH-或-NH-(SO2)-与B连接。
在一个实施方案中，L4c为具有0至50个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，L4c为具有1至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
在一个实施方案中，L4c为具有1至30个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中一个或多个碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中烃链任选地被一个或多个卤素或氧代基(＝O)取代。
在一个实施方案中，基团：
Figure BDA0003143117940000991
选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940001001
其中
各R’独立地为C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基；其中C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基任选地被卤素或羟基取代。
在一个实施方案中，基团：
Figure BDA0003143117940001002
选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940001003
其中：
各R’独立地为C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基；其中C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基任选地被卤素或羟基取代；
用*标记的化合价与L3c连接；并且
用**标记的化合价与R3c连接。
在一个实施方案中，基团：
Figure BDA0003143117940001011
为：
Figure BDA0003143117940001012
在一个实施方案中，L4c通过-O-与R3c连接。
在一个实施方案中，R3c通过核酸分子的磷酸酯的氧与缀合物的其余部分连接。
在一个实施方案中，R3c通过有义或反义链的5’末端处的磷酸酯的氧与缀合物的其余部分连接。
在一个实施方案中，R3c通过有义或反义链的3’末端处的磷酸酯的氧与缀合物的其余部分连接。
在一个实施方案中，R3c通过有义链的3’末端处的磷酸酯的氧与缀合物的其余部分连接
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure BDA0003143117940001021
Figure BDA0003143117940001031
Figure BDA0003143117940001041
Figure BDA0003143117940001051
Figure BDA0003143117940001061
Figure BDA0003143117940001071
Figure BDA0003143117940001081
以及
Figure BDA0003143117940001082
在一个实施方案中，靶向核酸缀合物是如WO2015/006740、WO2016/028649、US8,106,022B2、US8,450,467B2、US8,828,956B2、WO2016/149020、WO2017/156012、WO2018/044350、WO2016/100401、WO2018/039364、WO2018/044350、WO2017/174657、WO2018/185210、WO2018/185252、WO2018/185253、US9,943,604B2或US9,714,421B2中描述的靶向核酸缀合物。
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例以达成说明性目的，并且不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到，可以改变或修改各种非关键性参数以产生基本上相同的结果。
实施例
可以使用与国际专利申请公布号WO2015/017519和WO2016/118697中描述的那些类似的起始材料和合成方法制备膜去稳定化聚合物。
可以如国际专利申请公布号WO2017/177326中所述和如下文所述制备靶向核酸缀合物。
实施例1.缀合物1的合成
方案1.
Figure BDA0003143117940001091
方案2.
Figure BDA0003143117940001101
方案3.
Figure BDA0003143117940001102
方案4.
Figure BDA0003143117940001103
方案5.
Figure BDA0003143117940001111
步骤1.制备4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯3
Figure BDA0003143117940001112
将四乙二醇(934g，4.8mol)在THF(175mL)和NaOH水溶液(5M，145mL)中的溶液冷却(0℃)并用溶解于THF(605mL)中的对甲苯磺酰氯(91.4g，480mmol)处理，并且接着搅拌两小时(0℃)。将反应混合物用水(3L)稀释并用CH2Cl2萃取(3x500mL)。将合并的萃取物用水和盐水洗涤，然后干燥(MgSO4)，过滤并浓缩以得到为淡黄色油状物的4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯3(140g，84％)。Rf(0.57，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤2.制备2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇4
Figure BDA0003143117940001121
将3(140g，403mmol)在DMF(880mL)中的溶液用叠氮化钠(131g，2.02mol)处理并加热(45℃)过夜。在减压下除去大部分DMF并且将残余物溶解于CH2Cl2(500mL)中并用盐水洗涤(3x500mL)，接着干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。使残余物通过短的二氧化硅床(5％MeOH-CH2Cl2)并浓缩以得到为黄色油状物的2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇4(65g，74％)。Rf(0.56，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤3.制备全乙酰化的半乳糖胺6
Figure BDA0003143117940001122
将在吡啶(1.5L)中的D-半乳糖胺盐酸盐5(250g，1.16mol)用乙酸酐(1.25L，13.2mol)处理45分钟。在搅拌过夜后，将反应混合物分成三个1L部分。将每个1L部分倒入3L冰水中并混合一小时。混合之后，将固体过滤出来，合并，经液氮冷冻并且接着冻干五天，以得到为白色固体的全乙酰化的半乳糖胺6(369.4g，82％)。Rf(0.58，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤4.制备二乙酸(3aR,5R,6R,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-甲基-3a,6,7,7a-四氢-5H-吡喃并[3,2-d]噁唑-6,7-二基酯7
Figure BDA0003143117940001131
将全乙酰化的半乳糖胺6(8.45g，21.7mmol)在CHCl3(320mL)中的溶液用TMSOTf(4.32mL，23.9mmol)逐滴处理。在搅拌(1.5hr，40℃)后，通过添加三乙胺(5mL)将反应物淬灭并浓缩至干燥，以得到为淡黄色玻璃的化合物7(7.2g，定量)。产物不经进一步纯化即使用。Rf(0.59，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤5.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯8
Figure BDA0003143117940001132
将化合物7(7.2g，21.7mmol)和2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇4(2.65g，15.2mmol)从甲苯(150mL)中共沸(3x)以除去痕量水。将干燥的材料溶解于1,2-二氯乙烷(150mL)中，冷却(～5℃)并用TMSOTf(784μL，4.34mmol)处理。在搅拌过夜后，通过添加三乙胺(5mL)将反应物淬灭并浓缩。通过色谱(1％→5％MeOH-CH2Cl2)纯化残余物以得到为棕色油状物的8(7.12g，85％)。Rf(0.3，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤6.制备2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵2,2,2-三氟乙酸盐9
Figure BDA0003143117940001133
将叠氮化物8(7.12g，13mmol)在EtOAc(150mL)和三氟乙酸(2mL)中的溶液用披钯炭(1.5g，10％w/w湿基)处理。然后将反应混合物用氢气吹扫并剧烈搅拌过夜。在用氮气吹扫后，通过硅藻土过滤混合物，用MeOH冲洗。将滤液浓缩并通过色谱纯化(5％→10％→20％MeOH-CH2Cl2)以得到为棕色油状物的9(5.8g，72％)。Rf(0.34，15％MeOH-CH2Cl2)。
步骤7.制备4-(((苄氧基)羰基)氨基)-4-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)庚二酸二叔丁酯11
Figure BDA0003143117940001141
向4-氨基-4-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)庚二酸二叔丁酯10(13.5g，33mmol)、25％Na2CO3(水溶液)(150mL)和二氯甲烷(300mL)的溶液中缓慢添加氯甲酸苄基酯(14mL，98mmol)。将溶液在室温下剧烈搅拌过夜(16h)。在完成时，添加另外的二氯甲烷(100mL)并分离二氯甲烷层。用二氯甲烷(2x100mL)萃取水层。将合并的二氯甲烷萃取物在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥。分离出为无色油状物的产物11，其不需要进一步纯化(15.8g，88％)。Rf(0.7，1:1EtOAc-己烷)。
步骤8.制备4-(((苄氧基)羰基)氨基)-4-(2-羧乙基)庚二酸12
Figure BDA0003143117940001142
将11(15.6g，28.8mmol)在甲酸(50mL)中的溶液在室温下搅拌2小时。将溶液浓缩至干燥并溶解于乙酸乙酯(～25mL)中。在静置时，产物结晶为无色固体。将固体过滤，用乙酸乙酯洗涤并空气干燥以得到为无色固体的12(10.2g，93％)。Rf(0.1，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤9.制备化合物13
Figure BDA0003143117940001151
将12(793mg，2.08mmol)和9(5.8g，9.36mmol)在DMF(50mL)中的溶液用BOP(3.67g，8.32mmol)处理，接着用N,N-二异丙基乙胺(4.31mL，25mmol)处理。在搅拌过夜后，将混合物浓缩至干燥并进行色谱(1％→2％→5％→10％→15％MeOH-CH2Cl2)以得到13(5.71g[粗产物]，>100％-含有不影响下一步骤的偶联副产物)。Rf(0.45，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤10.制备化合物14
Figure BDA0003143117940001152
将化合物13(5.7g)溶解于MeOH(150mL)和TFA(1.5mL)中并用披钯炭(1g，10％w/w湿基)处理。然后将反应混合物用氢气吹扫并剧烈搅拌过夜。用氮气吹扫后，通过硅藻土过滤混合物，用MeOH冲洗。将滤液浓缩并通过色谱纯化(5％→10％→20％MeOH-CH2Cl2)以得到为棕色油状物的14(2.15g，56％经两步)。Rf(0.32，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤11.制备(5-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇15
Figure BDA0003143117940001153
经一小时将5-氨基异邻苯二甲酸二甲酯(20.0g，96mmol)在THF(350mL)中的溶液逐滴添加到3.75当量LiAlH4(13.6g，358mmol)在THF(440mL)中的回流混合物中。将混合物在回流下再搅拌两小时，然后冷却至室温并通过小心添加MeOH(27mL)和随后的水(40mL)进行淬灭。将淬灭的混合物搅拌两小时后，过滤并浓缩至干燥。将残余物从EtOAc中重结晶(2X)以得到为褐黄色晶体的15(10.2g，70％)。
步骤12.制备10-((3,5-双(羟甲基)苯基)氨基)-10-氧代癸酸甲酯16
Figure BDA0003143117940001161
将癸二酸甲酯(3.8g，17mmol)、15(2.5g，17mmol)和EEDQ(8.1g，33mmol)在2:1二氯甲烷/甲醇(200mL)中的溶液在室温下搅拌2小时。在完成时，将溶液浓缩至干燥。获得的固体用二氯甲烷(50mL)研磨并过滤。将固体用冰冷的二氯甲烷冲洗并空气干燥以得到为无色固体的16(4.3g，72％)。Rf(0.33，EtOAc)。
步骤13.制备10-((3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(羟甲基)苯基)氨基)-10-氧代癸酸甲酯17
Figure BDA0003143117940001162
向16(4.3g，12mmol)在吡啶(50mL)中的溶液中添加4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(4.1g，12mmol)。在室温下将溶液在氮气下搅拌过夜。在完成时，将溶液浓缩至干燥并且通过柱色谱(0.5％→0.75％→1％→1.5％MeOH-CH2Cl2)纯化残余物以得到为黄色固体的17(2.9g，35％)。Rf(0.6，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤14.制备10-((3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(羟甲基)苯基)氨基)-10-氧代癸酸锂18
Figure BDA0003143117940001171
向17(2.9g，4.3mmol)在THF(60mL)中的溶液中添加水(15mL)和氢氧化锂(112mg，4.7mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将溶液浓缩以除去THF。将其余水溶液在液氮上快速冷冻并冻干过夜以得到无色固体(2.9g，定量)。Rf(0.3，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤15.制备化合物19
Figure BDA0003143117940001172
向14(454mg，0.67mmol)、18(1.25g，0.67mmol)和HBTU(381mg，1.0mmol)在无水DMF(25mL)中的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(0.35mL，2.0mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将溶液倒入乙酸乙酯(250mL)中并用盐水(3x200mL)洗涤。将乙酸乙酯层在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥。通过柱色谱进行纯化(5％→7.5％→10％→15％MeOH/CH2Cl2)得到为淡橙色泡沫的19(1.5g，94％)。Rf(0.25，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤16.制备化合物20
Figure BDA0003143117940001173
将化合物19(1.5g，0.6mmol)、琥珀酸酐(120mg，1.2mmol)、DMAP(220mg，1.8mmol)和三甲胺(250μL，1.8mmol)在无水CH2Cl2(50mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将溶液浓缩至干燥并通过短的二氧化硅塞子过滤(100％CH2Cl2→15％MeOH/CH2Cl2)以得到为浅米黄色泡沫的产物20(1.1g，70％)。质量m/z(ES-TOF MS)727.7[M+3H-DMTr]+,1091.1[M+2H-DMTr]。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.92(br s,1H),7.78(s,1H),7.49-7.47(m,3H),7.41(brs,1H),7.38-7.34(m,5H),7.32-7.26(m,4H),7.24-7.08(br s,3H),7.08(s,1H),6.90-6.80(m,7H),5.31(d,3H,J＝2.7Hz),5.12(s,2H),5.06(dd,3H,J＝11.2,3.2Hz),4.78(d,3H,J＝8.5Hz),4.24-4.08(m,12H),3.95-3.88(m,7H),3.85-3.76(m,4H),3.78(s,6H),3.68-3.56(m,34H),3.54-3.44(m,8H),3.41-3.33(m,6H),2.70-2.60(m,4H),2.52-2.30(m,30H),2.24-2.16(m,8H),2.14(s,9H),2.04(s,9H),2.02-1.96(m,6H),1.98(s,9H),1.96(s,9H),1.74-1.52(m,4H),1.36-1.24(m,12H)。
步骤17.制备缀合物1
Figure BDA0003143117940001181
使用标准酰胺偶联化学将琥珀酸酯20加载到
Figure BDA0003143117940001182
LCAA(长链氨基烷基)CPG(对照孔玻璃)上。将二异丙基碳化二亚胺(52.6μmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.3mg，2.6μmol)和吡啶(10μL)在无水乙腈(0.3mL)中的溶液添加到含20(20.6mg，8μmol)的无水二氯甲烷(0.2mL)中。将此混合物添加至LCAA CPG(183mg)。将悬浮液在室温下轻轻混合过夜。在20消失(HPLC)时，将反应混合物过滤并且将CPG用1mL的各二氯甲烷、乙腈、5％乙酸酐/5％N-甲基咪唑/5％吡啶在THF中的溶液洗涤，接着用THF、乙腈和二氯甲烷洗涤。然后将CPG在高真空下干燥过夜。通过标准DMTr测定通过UV/Vis(504nm)确定负载为25μmol/g。使用标准程序，在自动寡核苷酸合成中采用所得的负载GalNAc的CPG固体支持体。核苷酸去保护和随后从固体支持体上移除(同时伴随半乳糖胺乙酸酯去保护)得到作为代表性实施例的GalNAc-寡核苷酸缀合物1。
实施例2：缀合物34的合成
方案6.
Figure BDA0003143117940001191
方案7.
Figure BDA0003143117940001201
方案8.
Figure BDA0003143117940001202
步骤1.制备4-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-4-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)庚二酸二叔丁酯21
Figure BDA0003143117940001211
将4-氨基-4-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)庚二酸二叔丁酯(25g，60mmol)和Z-甘氨酸(18.9g，90.2mmol)在CH2Cl2(300mL)中的溶液依次用EDC(23g，120mmol)、二异丙基乙胺(32mL，180mmol)和DMAP(催化剂17mg)处理。在搅拌(16h)后，将反应混合物倒入NaHCO3(饱和水溶液)中，用CH2Cl2萃取，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩以得到为非晶形固体的4-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-4-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)庚二酸二叔丁酯21并且在不进一步处理的情况下使用(36g，定量)。Rf(0.85，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤2.制备4-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-4-(2-羧乙基)庚二酸22
Figure BDA0003143117940001212
将4-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)-4-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)庚二酸二叔丁酯21(59.3mmol，36g)的溶液在纯净甲酸(150mL)中搅拌72小时。在完成时，在减压下除去甲酸并且将粗固体在高真空下干燥过夜以得到为无色固体的22(15.9g，61％)。Rf(0.15，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤3.制备化合物23
Figure BDA0003143117940001221
将22(6.2g，14.1mmol)和2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵2,2,2-三氟乙酸盐(35g，56.5mmol)在DMF(250mL)中的溶液用BOP(25g，56.5mmol)处理，接着用N,N-二异丙基乙胺(29mL，170mmol)处理。在搅拌过夜后，将混合物浓缩至干燥并进行色谱(100％CH2Cl2至15％MeOH-CH2Cl2)以得到化合物23(24.6g，89％)。Rf(0.55，15％MeOH-CH2Cl2)。
步骤4.制备化合物24
Figure BDA0003143117940001222
将化合物23(24.6g)溶解于MeOH(200mL)和TFA(1.5mL)中并用氮气吹扫。添加披钯炭(1g，10％w/w湿基)，接着将反应混合物用氢气吹扫并剧烈搅拌过夜。在完成时，将反应物用氮气吹扫，通过硅藻土过滤并用MeOH冲洗。将滤液浓缩并在硅胶60上通过柱色谱纯化(梯度：5％→10％→20％MeOH-CH2Cl2)以得到为淡棕色粘稠油状物的24(23g)。Rf(0.32，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤5.制备(5-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇26
Figure BDA0003143117940001223
使氢化铝锂(13.6g，358mmol)在无水四氢呋喃(450mL)中的悬浮液在氮气气氛下达到回流并且用二甲基-5-氨基异邻苯二甲酸酯25(20g，96mmol)在无水四氢呋喃(350mL)中的溶液逐滴处理。在添加完成后，将混合物加热至回流，再持续2小时。在完成时，将溶液冷却至室温并通过缓慢添加MeOH(27mL)和随后的水(40mL)进行淬灭。搅拌2小时后，将混合物过滤，浓缩并从EtOAc中重结晶以得到为灰白色晶体的(5-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇26(10.2g，70％)。Rf 0.5(15％MeOH-CH2Cl2)。
步骤6.制备3,5-双(羟甲基)苯甲腈27
Figure BDA0003143117940001231
将26(5g，33mmol)在2N盐酸(100mL)中的溶液冷却至0℃并且用亚硝酸钠(3.53g，36mmol)在水(50mL)中的冰冷溶液处理。将反应混合物在≤5℃的温度下保持30min，然后一次性用氰化亚铜(I)(3.19g，35.6mmol)和氰化钠(3.53g，72mmol)在水(50mL)中的溶液处理。在室温下搅拌过夜后，过滤混合物，用二氯甲烷(3x100mL)萃取，浓缩并不经进一步纯化即使用。获得为黄色固体的二醇,3,5-双(羟甲基)苯甲腈27(2.19g，41％)。Rf 0.75(15％MeOH-CH2Cl2)。
步骤7.制备3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(羟甲基)苯甲腈28
Figure BDA0003143117940001232
将3,5-双(羟甲基)苯甲腈27(538mg，3.3mmol)在吡啶(14mL)中的溶液用4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(1.17g，3.46mmol)处理并在室温下搅拌过夜。一旦完成，就将混合物浓缩并分散在二乙醚(25mL)中，过滤并浓缩。通过硅胶60的柱色谱(梯度：10％至50％EtOAc-己烷)纯化粗产物，以得到为黄色固体的28(725mg，47％)。Rf 0.5(1:1EtOAc-己烷)。
步骤8.制备(3-(氨基甲基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)甲醇29
Figure BDA0003143117940001241
将28(100mg，0.22mmol)在甲基四氢呋喃(5mL)中的溶液冷却至0℃并用氢化铝锂(0.64mmol＝0.28mL的在MeTHF中的2.3M溶液)缓慢处理。搅拌一小时后，通过添加甲醇(1mL)，接着添加水(0.3mL)并搅拌30min淬灭反应物。将混合物过滤并浓缩以得到(3-(氨基甲基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)苯基)甲醇29(78mg，77％)。Rf 0.15(10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤9.制备10-((3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(羟甲基)苄基)氨基)-10-氧代癸酸甲酯30
Figure BDA0003143117940001242
将(3-(氨基甲基)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-甲基)苯基)甲醇29(78mg，0.17mmol)和癸二酸单甲酯(38mg，0.17mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液依次用EDC(48mg，0.25mmol)、DMAP(催化剂，5mg)和二异丙基乙胺(57μL，0.33mmol)进行处理。搅拌(3.5hr)后，将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液(50mL)中。将碳酸氢钠溶液用二氯甲烷(3x50mL)萃取，用盐水(50mL)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱(梯度：2％至5％MeOH-CH2Cl2)纯化粗材料，以得到为黄色油状物的10-((3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(羟甲基)苄基)氨基)-10-氧代癸酸甲酯30(57mg，53％)。Rf 0.45(10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤10.制备10-((3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(羟甲基)苄基)氨基)-10-氧代癸酸锂31
Figure BDA0003143117940001251
将化合物30(188mg，0.28mmol)溶解于四氢呋喃(5mL)中并用LiOH(7mg，0.30mmol)在水(1mL)中的溶液处理。在完成时，真空除去四氢呋喃并且将其余含水混合物冷冻并冻干以得到为无色固体的10-((3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(羟甲基)苄基)氨基)-10-氧代癸酸锂31(180mg，99％)。Rf 0.45(10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤11.制备化合物32、33和34
根据与用于合成化合物19、20和1相同的程序相应地制备化合物32、33和34。
实施例3.缀合物36的合成
Figure BDA0003143117940001252
步骤1.制备缀合物36
使用与用于合成化合物34和所有对应中间体相同的程序制备缀合物36。唯一的例外是化合物6的合成，其中使用丙酸酐代替乙酸酐。
实施例4.缀合物42的合成
方案9.
Figure BDA0003143117940001261
方案10.
Figure BDA0003143117940001262
步骤1.制备化合物37
Figure BDA0003143117940001271
向18β-甘草次酸(2.5g，5.3mmol)、(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯(1.1g，6.4mmol)和HBTU(3.0g，8.0mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(20mL)的溶液中添加二异丙基乙胺(2.75mL，15.9mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将溶液在真空中浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱(梯度：2％至5％MeOH/CH2Cl2)纯化残余物，以得到为无色固体的产物(2.1g，63％)。
步骤2.制备化合物38
Figure BDA0003143117940001272
向37(2.1g，3.3mmol)和三乙胺(3.5mL，10mmol)在二氯甲烷(25mL)中的溶液中添加乙酸酐(850μL，5.3mmol)和DMAP(5mg)。将溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将溶液浓缩至干燥并溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用水(100mL)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥以得到淡棕色泡沫(1.9g，85％)。
步骤3.制备化合物39
Figure BDA0003143117940001273
向38(1.5g，2.3mmol)在无水二噁烷(25mL)中的溶液中添加在二噁烷中的2M氯化氢(25mL)。将溶液在室温下搅拌过夜，接着在真空中浓缩至干燥以得到浅棕色固体(1.3g，96％)。
步骤4.制备化合物40、41和42
根据与用于合成化合物19、20和1相同的程序相应地制备化合物40、41和42。
实施例5.缀合物43的合成
方案11.
Figure BDA0003143117940001281
方案12.
Figure BDA0003143117940001291
步骤1.制备11-(2,6-双(羟甲基)-4-甲基苯氧基)十一烷酸甲酯44
Figure BDA0003143117940001292
使2,6-双(羟甲基)-对甲酚(2.7g，16.3mmol)、11-溴十一烷酸甲酯(5.0g，17.9mmol)和碳酸钾(4.5g，32.6mmol)在丙酮(100mL)中的溶液回流16小时。在完成时，将溶液在真空中浓缩至干燥，悬浮于乙酸乙酯(150mL)中并用水(2x100mL)和盐水(100mL)洗涤。将乙酸乙酯层在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱(梯度100％己烷→50％EtOAc/己烷)纯化残余物，以得到为无色油状物的11-(2,6-双(羟甲基)-4-甲基苯氧基)十一烷酸甲酯44(1.6g，27％)。
步骤2.制备11-(2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-6-(羟甲基)-4-甲基苯氧基)十一烷酸甲酯45
Figure BDA0003143117940001301
向11-(2,6-双(羟甲基)-4-甲基苯氧基)十一烷酸甲酯44(1.5g，4.1mmol)在无水吡啶(20mL)中的溶液中添加4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(1.4g，4.1mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将溶液在真空中浓缩至干燥并且在硅胶60上通过柱色谱纯化(0.5至1％MeOH/CH2Cl2)，以得到为淡黄色固体的11-(2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-6-(羟甲基)-4-甲基苯氧基)十一烷酸甲酯45(1.1g，40％)。
步骤3.制备11-(2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-6-(羟甲基)-4-甲基苯氧基)十一烷酸锂46
Figure BDA0003143117940001302
向11-(2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-6-(羟甲基)-4-甲基苯氧基)十一烷酸甲酯45(1.1g，1.7mmol)在无水四氢呋喃(40mL)和水(10mL)中的溶液中添加氢氧化锂(44mg，1.8mmol)。将溶液真空浓缩以除去所有的四氢呋喃。将剩余的水溶液在液氮上快速冷冻，接着冻干过夜以得到为淡粉色固体的11-(2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-6-(羟甲基)-4-甲基苯氧基)十一烷酸锂46(1.1g，94％)。
步骤4.制备化合物47
向10(1.33g，0.66mmol)、46(0.5g，0.73mmol)、HBTU(400mg，1mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(25mL)中的溶液中添加二异丙基乙胺(0.35mL，2mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜(18小时)。在完成时，真空除去溶剂并在硅胶上通过柱色谱(梯度：100％CH2Cl2-5％-10％-15％MeOH/CH2Cl2)纯化残余物，以得到为无色固体的47(710mg，41％)。
步骤5.制备化合物48
向47(0.71g，0.3mmol)、三乙胺(0.4mL，3.0mmol)和聚苯乙烯-DMAP(3mmol/g负载，200mg，0.6mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中添加琥珀酸酐(60mg，0.6mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜并且在完成时过滤并在真空中浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱(梯度5％至20％MeOH/CH2Cl2)纯化残余物，以得到为淡黄色固体的48(570mg，70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.91(m,1H),7.86-7.76(m,6H),7.45-7.40(m,2H),7.36-7.14(m,10H),7.10(s,1H),6.91(d,J＝8.9Hz,4H),5.21(d,J＝3.3Hz,3H),5.01(s,2H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,3H),4.56(d,J＝8.5Hz,3H),4.06-3.98(m,11H),3.93-3.84(m,3H),3.81-3.72(m,3H),3.74(s,6H),3.65-3.46(m,38H),3.40-3.35(m,6H),3.20-3.16(m,6H),2.56-2.44(m,4H),2.33(s,3H),2.15-2.08(m,2H),2.10(s,9H),2.04-1.96(m,6H),1.89(s,9H),1.82-1.76(m,4H),1.77(s,9H),1.54-1.34(m,4H),1.28-1.10(m,12H),
步骤6.制备化合物49
向48(100mg，40μmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(30mg/mL在乙腈中的溶液，50μL，13μmol)、N,N'-二异丙基碳化二亚胺(40μL，264μmol)和吡啶(50μL)在二氯甲烷(2mL)和乙腈(3mL)中的溶液中添加
Figure BDA0003143117940001311
lcaa CPG(引发合成，920mg)。将溶液在轨道式振荡器上在室温下搅拌过夜。反应溶液的TLC分析显示活化的N-羟基琥珀酸酯仅部分消耗，因此添加另外的CPG(500mg)。再次将溶液搅拌过夜。在完成时，将CPG过滤并用二氯甲烷(25mL)、乙腈(25mL)和四氢呋喃(25mL)洗涤。通过添加含乙酸酐的乙腈(3mL)和含10％N-甲基咪唑/10％吡啶的四氢呋喃(3mL)的1:1溶液使CPG上的未反应的胺残余物乙酰化(封端)。使悬浮液静置2小时，然后过滤并用等分的四氢呋喃(25mL)、乙腈(25mL)和二氯甲烷(25mL)冲洗。将负载的CPG 49在真空下干燥过夜。使用标准DMT负载测定(3％三氯乙酸/CH2Cl2，UV-VIS，A504)确定配体负载效率为22μmol/g。
步骤7.制备缀合物43
使用标准程序，在自动寡核苷酸合成中采用所得的负载GalNAc的CPG固体支持体49。核苷酸去保护和随后从固体支持体上移除(同时伴随半乳糖胺乙酸酯去保护)得到GalNAc-寡核苷酸缀合物43。
实施例6.缀合物50的合成
方案13.
Figure BDA0003143117940001321
方案14.
Figure BDA0003143117940001322
Figure BDA0003143117940001331
步骤1.制备2-((2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)氨基)乙-1-醇51
Figure BDA0003143117940001332
将乙醇胺(77mL，1.25mol)和(2-溴乙氧基)-叔丁基二甲基硅烷(15g，62.7mmol)在无水乙腈(200mL)中的溶液回流3小时。在完成时，将反应物冷却至室温，用水(400mL)稀释并用乙酸乙酯(3x150mL)萃取。将合并的乙酸乙酯萃取物在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。通过二氧化硅垫进行过滤来纯化残余物，首先用50％乙酸乙酯/己烷，接着用50％MeOH/EtOAc以得到为淡黄色油状物的51(14g，100％)。
步骤2.制备2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)乙-1-胺52
Figure BDA0003143117940001333
向2-((2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)氨基)乙-1-醇51(14g，64mmol)和三乙胺(17.5mL，128mmol)在无水二氯甲烷(250mL)中的溶液中添加4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(24g，70mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜，接着在真空中浓缩至干燥。将残余物溶解于乙酸乙酯(300mL)中并用水(250mL)和盐水(250mL)洗涤。将乙酸乙酯在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱进行纯化(1％至5％MeOH/CH2Cl2)得到为淡黄色粘稠油状物的52(13g，39％)。
步骤3.制备10-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)氨基)-10-氧代癸酸甲酯53
Figure BDA0003143117940001341
将2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-N-(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)乙-1-胺52(5.4g，10.3mmol)、癸二酸单甲酯(2.2g，10.3g)、HBTU(4.9g，12.9mmol)、DIPEA(5.3mL，30.9mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液在室温下搅拌3小时。在完成时，将溶液倒入水(400mL)中并用乙酸乙酯(1x500mL)萃取。将乙酸乙酯萃取物用盐水(2x250mL)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱进行纯化(10％至25％乙酸乙酯/己烷)得到为粘稠黄色油状物的53(6.5g，87％)。
步骤4.制备10-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(2-羟乙基)氨基)-10-氧代癸酸甲酯54
Figure BDA0003143117940001342
向10-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)乙基)氨基)-10-氧代癸酸甲酯53(2.0g，2.8mmol)和三乙胺(1mL)在无水四氢呋喃(20mL)中的溶液中添加TBAF(1M，在THF中，3.4mL，3.3mmol)。将溶液搅拌6h，但是通过TLC(5％MeOH/CH2Cl2)仅观察到部分转化。添加另外1.7mL TBAF并且将溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将溶液真空浓缩并在硅胶60上通过柱色谱纯化(10％至50％EtOAc/己烷，接着100％EtOAc)以得到为粘稠无色油状物的54(0.5g，29％)。
步骤5.制备10-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(2-羟乙基)氨基)-10-氧代癸酸锂55
Figure BDA0003143117940001351
向10-((2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)(2-羟乙基)氨基)-10-氧代癸酸甲酯54(0.5g，0.83mmol)在THF(40mL)中的溶液中添加水(10mL)和氢氧化锂(24mg，1.0mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩以除去THF。将其余水溶液在液氮上快速冷冻并冻干以得到为无色固体的55(485mg，95％)。
步骤6.制备化合物56、57、58和50
使用与用于合成化合物47、48、49和43的那些相同的程序相应地制备化合物56、57、58和50。
实施例7.缀合物59的合成
方案15.
Figure BDA0003143117940001352
Figure BDA0003143117940001361
方案16.
Figure BDA0003143117940001362
步骤1.制备(2R,5R)-5-羟基哌啶-2-羧酸甲酯61
Figure BDA0003143117940001363
将(2R,5R)-5-羟基哌啶-2-羧酸60(3.5g，24.1mmol)在MeOH(50mL)中搅拌。使HCl(g)鼓泡通过溶液2min并且在回流下搅拌反应物1.5h。将反应物真空浓缩以便以定量收率得到(2R,5R)-5-羟基哌啶-2-羧酸甲酯61，其不经进一步纯化即使用。
步骤2.制备(2R,5R)-5-羟基哌啶-1,2-二羧酸1-(叔丁基)2-甲基酯62
Figure BDA0003143117940001371
在室温下，将(2R,5R)-5-羟基哌啶-2-羧酸甲酯61(24.1mmol)和TEA(7.2mL，53.02mmol)在DCM(100mL)中搅拌。分批添加二碳酸二叔丁酯(5.7g，26.5mmol)并搅拌反应物2h。将反应物用DCM(100mL)稀释并且顺序地用1M HCl(2x75mL)、饱和NaHCO3(2x75mL)、H2O(2x75mL)以及饱和NaCl溶液(2x75mL)洗涤。将有机物分离、干燥(Na2SO4)并真空浓缩以得到(2R,5R)-5-羟基哌啶-1,2-二羧酸1-(叔丁基)2-甲基酯62(5.53g，88％)，其不经进一步纯化即使用。
步骤3.制备(2R,5R)-5-羟基-2-(羟甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯63
Figure BDA0003143117940001373
在0℃下，将(2R,5R)-1-(叔丁氧羰基)-5-羟基哌啶-2-羧酸62(5.53g，21.4mmol)在THF中搅拌。经1hr逐滴添加LiBH4(3.0M在THF中的溶液)(8.9mL，27.7mmol)。使反应物升温至室温并继续搅拌16h。用1M NaOH淬灭反应物，真空除去THF并且用EtOAc(10x100mL)彻底地萃取水溶液。将合并的有机物用H2O(50mL)、饱和NaCl溶液(2x50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩，以得到(2R,5R)-5-羟基-2-(羟甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯63(2.4g，49.0％)，其不经进一步纯化即使用。
步骤4.制备(3R,6R)-6-(羟甲基)哌啶-3-醇64
Figure BDA0003143117940001372
在室温下，将(2R,5R)-5-羟基-2-(羟甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯63(2.4g，10.4mmol)在Et2O中搅拌。使HCl(g)鼓泡通过45秒并且将反应物在室温下搅拌45min。将反应物真空浓缩并在高真空下干燥以得到(3R,6R)-6-(羟甲基)哌啶-3-醇64。产物不经进一步纯化即使用。
步骤5.制备2,2,2-三氟-1-((2R,5R)-5-羟基-2-(羟甲基)哌啶-1-基)乙-1-酮65
Figure BDA0003143117940001381
在室温下，将来自先前反应的粗(3R,6R)-6-(羟甲基)哌啶-3-醇64在具有TEA(3.5mL，25.2mmol)的MeCN(50mL)中搅拌。添加三氟乙酸乙酯(3mL，25.2mmol)并且将反应物在室温下搅拌16hr，然后真空浓缩以得到2,2,2-三氟-1-((2R,5R)-5-羟基-2-(羟甲基)哌啶-1-基)乙-1-酮65。产物不经进一步纯化即使用。
步骤6.制备1-((2R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-羟基哌啶-1-基)-2,2,2-三氟乙-1-酮66
Figure BDA0003143117940001382
在室温下，将来自先前反应的粗2,2,2-三氟-1-((2R,5R)-5-羟基-2-(羟甲基)哌啶-1-基)乙-1-酮65在具有TEA(50mL)的DCM中搅拌。一次性添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl)(3.87g，11.44mmol)并且在室温下搅拌反应物3小时。将反应物用DCM(50mL)稀释并且顺序地用饱和NaHCO3(2x75mL)、H2O(2x75mL)以及饱和NaCl溶液(2x75mL)洗涤。将有机物分离，干燥(Na2SO4)，真空浓缩并通过柱色谱纯化(100％己烷–60％EtOAc/己烷)(0.1％TEA)以得到1-((2R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-羟基哌啶-1-基)-2,2,2-三氟乙-1-酮66(3.14g，57％)。
步骤7.制备(3R,6R)-6-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-哌啶-3-醇67
Figure BDA0003143117940001391
在室温下，将1-((2R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-羟基哌啶-1-基)-2,2,2-三氟乙-1-酮66(3.14g，6.0mmol)在MeOH(50mL)中搅拌。添加KOH(672mg，12mmol)并且在室温下搅拌反应物16小时。添加另外的KOH(300mg，6mmol)并且再继续搅拌24h。将反应物真空浓缩，溶解于DCM(150mL)中，用H2O(4x50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩，以得到(3R,6R)-6-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)哌啶-3-醇67(2.34g，90％)，其不经进一步纯化即使用。
步骤8.制备12-((2R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)-甲氧基)甲基)-5-羟基哌啶-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯68
Figure BDA0003143117940001392
在室温下，将(3R,6R)-6-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)哌啶-3-醇67(2.34g，5.34mmol)在DCM(75mL)中搅拌。添加三乙胺(2.2mL，16.2mmol)、HATU(3.5g，9.2mmol)和12-甲氧基-12-氧代十二烷酸(1.32g，5.4mmol)并且将反应物在室温下搅拌3h。通过过滤除去所得的固体沉淀，将滤液真空浓缩并且通过柱色谱(2.5％MeOH/DCM，0.1％TEA)纯化残余物，以便以定量收率得到12-((2R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-羟基哌啶-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯68。
步骤9.制备12-((2R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-甲基)-5-羟基哌啶-1-基)-12-氧代十二烷酸锂69
Figure BDA0003143117940001401
在室温下，将12-((2R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-羟基哌啶-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯68(5.4mmol)和LiOH(140mg，5.94mmol)在THF:H2O(1:1，100mL)中搅拌48h。真空除去THF，并且将水溶液冷冻并冻干以得到12-((2R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-羟基哌啶-1-基)-12-氧代十二烷酸锂69(3.2g，91％)。其不进行另外的纯化即用于后续反应。
步骤10.制备化合物70、71、72和59
使用与用于合成化合物47、48、49和43的那些相同的程序相应地制备化合物70、71、72和59。
实施例8.缀合物142的合成
方案17.
Figure BDA0003143117940001402
Figure BDA0003143117940001411
方案18.
Figure BDA0003143117940001412
步骤1.制备3,4,5-三乙酰氧基苯甲酸73
向没食子酸(20g)在吡啶(50mL)和乙酸酐(50mL)中的溶液。将溶液在室温下搅拌过夜，然后倒入冰水(1L)中。用浓盐酸使溶液为酸性，此时无色固体沉淀出来。通过过滤收集固体并用水(5x100mL)洗涤。将湿固体在液氮上冰冻并冷冻干燥，以得到3,4,5-三乙酰氧基苯甲酸(26g，75％)。
步骤2.制备三乙酸5-((2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯-1,2,3-三苯甲基酯74
向3,4,5-三乙酰氧基苯甲酸(10g，33.8mmol)、N-苄氧羰基-1,2-二氨基乙烷盐酸盐(5.3g，33.8mmol)和HBTU(13.5g，35.5mmol)在DMF(200mL)中的溶液中添加DIPEA(17.5mL，101mmol)。将溶液搅拌16小时，然后用乙酸乙酯(250mL)稀释，用盐水(3x200mL)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。在硅胶上通过柱色谱(梯度1％至5％MeOH/DCM)纯化粗产物，以得到为灰白色固体的三乙酸5-((2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯-1,2,3-三苯甲基酯(5.5g)。
步骤3.制备3,4,5-三羟基-N-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)苯甲酰胺75
将三乙酸5-((2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯-1,2,3-三苯甲基酯(5g，1.1mmol)在1:1MeOH/CH2Cl2(100mL)中的溶液在室温下搅拌3天。在完成时，除去溶剂以得到为无色固体的3,4,5-三羟基-N-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)苯甲酰胺(4g，定量)。
步骤4.制备2,2',2”-((5-((2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯-1,2,3-三苯甲基)三(氧基))三乙酸三甲基酯76
将3,4,5-三羟基-N-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)苯甲酰胺(4g，11.6mmol)、溴乙酸甲酯(7.7g，46.4mmol)和碳酸钾(9.6g，69.4mmol)在DMF(100mL)中的溶液在60℃下搅拌过夜。在完成时，将溶液冷却至室温，用乙酸乙酯(200mL)稀释，用水(200mL)、盐水(3x100mL)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。在硅胶上通过柱色谱(梯度2％至10％MeOH/DCM)纯化粗产物，以得到为米黄色固体的2,2',2”-((5-((2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯-1,2,3-三苯甲基)三(氧基))-三乙酸三甲基酯(5g，79％)。
步骤5.制备2,2',2”-((5-((2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)-氨基甲酰基)苯-1,2,3-三苯甲基)三(氧基))三乙酸77
将2,2',2”-((5-((2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)-氨基甲酰基)苯-1,2,3-三苯甲基)三(氧基))三乙酸三甲基酯(5g，9.2mmol)和1MNaOH(30mL)在甲醇(100mL)中的溶液在室温下搅拌2小时。在完成时，将反应物浓缩以除去甲醇并用水(75mL)稀释。将混合物冷却至0℃，用2M HCl酸化并用乙酸乙酯(5x150mL)萃取。将合并的乙酸乙酯萃取物在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥，以得到为无色固体的2,2',2”-((5-((2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯-1,2,3-三苯甲基)三(氧基))三乙酸(2.3g，50％)。
步骤6.制备化合物78
使用与用于化合物13相同的程序由化合物9(2.75g，4.3mmol)和77(0.5g，0.96mmol)制备化合物78。收率：600mg。
步骤7.制备化合物79
使用与用于化合物14相同的程序由化合物78(0.6g)制备化合物79。收率：500mg。
步骤8.制备化合物140
使用与用于化合物19相同的程序由化合物79(500mg，0.25mmol)和化合物18(175mg，0.25mmol)制备化合物140。收率：250mg，44％。
步骤9.制备化合物141
使用与用于化合物20相同的程序由化合物140(250mg，0.11mmol)制备化合物141。收率：200mg。
步骤10.制备缀合物142
使用与用于化合物1相同的程序由化合物141(200mg)和1000A lcaa CPG(1.8g)制备缀合物142。收率：1.9g，22μmol/g CPG负载。使用标准程序，在自动寡核苷酸合成中采用所得的负载GalNAc的CPG固体支持体。核苷酸去保护和随后从固体支持体上移除(同时伴随半乳糖胺乙酸酯去保护)得到GalNAc-寡核苷酸缀合物142。
实施例9.缀合物145的合成
方案19.
Figure BDA0003143117940001441
方案20.
Figure BDA0003143117940001442
步骤1.制备外消旋(顺式)5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮123
向3,4-二甲基呋喃-2,5-二酮(3g，24mmol)和N-苄基-1-甲氧基-N-((三甲基甲硅烷基)甲基)甲胺(7g，29.8mmol)在二氯甲烷(75mL)中的冰冷溶液(0℃)中缓慢添加三氟乙酸(75μL)。搅拌过夜使溶液在冰浴溶化时缓慢升温至室温。将反应混合物浓缩至干燥，溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用饱和碳酸氢钠(2x100mL)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥。在硅胶上通过柱色谱进行纯化(梯度：20％乙酸乙酯/己烷至100％乙酸乙酯)得到为黄色油状物的外消旋(顺式)5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(3.5g，56％)。
步骤2.制备外消旋(顺式)1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇124
向(3aR,6aS)-5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(3.5g，13.4mmol)在无水二乙醚(50mL)中的冰冷(0℃)溶液中分三批缓慢添加氢化铝锂丸粒(1.5g，40mmol)。将溶液搅拌过夜，在冰水浴溶化时升温至室温。在完成时，将反应物冷却至0℃并且用1.5mL的5M NaOH，接着用1.5mL的水非常缓慢地淬灭。搅拌30分钟，然后添加硫酸镁并过滤。将滤液浓缩以得到为无色油状物的外消旋(顺式)1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(2.7g)。
步骤3.制备外消旋(顺式)3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇125
向((3R,4S)-1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(10g，40mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中添加负载10％钯的湿式活性炭(palladium on activated charcoalwet，1g)。将溶液在氢气气氛下剧烈搅拌16小时。在完成时，通过硅藻土过滤溶液，并且浓缩至干燥以得到为无色固体的外消旋(顺式)3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(5.5g，86％)。
步骤4.制备外消旋(顺式)10-(3,4-双(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯126
使用与用于化合物17相同的程序由化合物125(1.3g，8.2mmol)和癸二酸单甲酯(1.8g，8.2mmol)制备化合物126。收率：1.8g，61％。
步骤5.制备外消旋(顺式)10-(3-((双(4-甲氧基苯基-)(苯基)甲氧基)-甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯127
使用与用于化合物18相同的程序由化合物126(1.8g，5.0mmol)和4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(1.7g，5.0mmol)制备化合物127。收率：1.4g，42％。
步骤6.制备外消旋(顺式)10-(3-((双(4-甲氧基苯基)-(苯基)甲氧基)-甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂128
向化合物127(3.0g，4.6mmol)在THF(50mL)和水(50mL)中的溶液中添加氢氧化锂(121mg，5.0mmol)。将溶液在室温下搅拌4小时，然后浓缩以除去THF。将剩余的水溶液冷冻干燥过夜以得到淡粉色固体(2.9g，定量)。
步骤7.制备化合物143
使用与用于化合物19相同的程序由化合物128(270mg，0.42mmol)和化合物14(800mg，0.42mmol)制备化合物143。收率：900mg，87％。
步骤8.制备化合物144
使用与用于化合物20相同的程序由化合物143(500mg，0.2mmol)制备化合物144。收率：200mg。
步骤9.制备缀合物145
使用与用于化合物1相同的程序由化合物144(200mg)和1000A lcaa CPG(1.8g)制备缀合物145。收率：1.9g，20μmol/g CPG负载。使用标准程序，在自动寡核苷酸合成中采用所得的负载GalNAc的CPG固体支持体。核苷酸去保护和随后从固体支持体上移除(同时伴随半乳糖胺乙酸酯去保护)得到GalNAc-寡核苷酸缀合物145。
实施例10.缀合物150的合成
方案21.
Figure BDA0003143117940001471
步骤1.制备146-1
向十二烷二酸的单甲基酯(12.2g，50.0mmol)在二氯甲烷(300mL)中的溶液中添加N-羟基琥珀酰亚胺(6.10g，53.0mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)(10.52g，55.0mmol)。将浑浊混合物在室温下搅拌过夜并且溶液变成澄清溶液。TLC指示反应完成。用饱和NH4Cl(300mL)和盐水(100mL)洗涤有机物。将有机层分离，经MgSO4干燥并浓缩至干燥，得到为白色固体的纯十二烷二酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)12-甲基酯146-1(16.7g，97.8％)。
步骤2.制备环戊-3-烯-1-基甲醇146-2
在0℃下，在氮气下经5hr向氢化铝锂(15.2g，0.40mol)在无水醚(1L)中的悬浮液中逐滴添加环戊-3-烯羧酸甲酯(50g，0.40mol)在醚(300mL)中的溶液。将混悬液在室温下搅拌过夜。TLC指示反应完成。将反应物再次冷却至0℃。逐滴添加Na2SO4(32mL)的饱和溶液以淬灭反应物。添加完成后，将混合物再搅拌3hr并且通过硅藻土垫过滤。蒸发溶剂，得到为无色液体的环戊-3-烯基甲醇146-2(37.3g，95％)。
步骤3.制备(6-氧杂二环[3.1.0]己-3-基)甲醇146-3
在0℃下向环戊-3-烯基甲醇146-2(4.0g，41mmol)在二氯甲烷(150mL)中的溶液中分批添加3-氯过苯甲酸(10g，45mmol，77％纯度)。将反应物搅拌过夜。添加二氯甲烷(150mL)。将有机物用硫代硫酸钠(12g，在10mL水中)洗涤，接着用饱和NaHCO3(40mL)洗涤。重复这一过程，直到所有的剩余3-氯过苯甲酸均被洗掉。将有机物经MgSO4干燥。蒸发溶剂得到为黄色油状物的顺式-和反式-6-氧杂二环[3.1.0]己-3-基甲醇146-3的混合物(2.6g，57％)。GC-MS:m/z 114(5)(M+),95(15),88(100),81(15)。
步骤4.制备2-氨基-4-(羟甲基)环戊-1-醇146-4
在0℃下向6-氧杂二环[3.1.0]己-3-基甲醇146-3(2.0g，17.6mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中吹扫氨气，持续10min。将反应物在室温下搅拌过夜。TLC指示反应未完成。除去甲醇并添加NH3 .H2O(50mL)，并且将此在室温下搅拌一周。TLC证实反应完成。通过与乙醇共沸除去水以得到为黄色油状物的2-氨基-4-(羟甲基)环戊醇146-4(2.1g，91％)。
步骤5.制备12-(2-羟基-4-(羟甲基)环戊基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯146-5
使用与12-(2-(叔丁氧羰基氨基)乙基氨基)-12-氧代十二烷酸酯(3-2)的合成中所描述的相同程序，由2-氨基-4-(羟甲基)环戊醇146-4和十二烷二酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)12-甲基酯146-1制备化合物146-5。获得收率87.4％的为灰白色固体的12-(2-羟基-4-(羟甲基)环戊基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯146-5。
步骤6.制备化合物147
使用与用于化合物18相同的程序由化合物146(1.4g，2.33mmol)定量地制备化合物147。
步骤7.制备化合物148
使用与用于化合物19相同的程序由化合物147(150mg，0.23mmol)和化合物14(431mg，0.23mmol)制备化合物148。收率：460mg，84％。
步骤8.制备化合物149
使用与用于化合物20相同的程序由化合物148(460mg，0.19mmol)制备化合物149。收率：436mg，91％。
步骤9.制备缀合物150
使用与用于化合物1相同的程序由化合物149(436mg)和1000A lcaa CPG(2.62g)制备化合物150。收率：2.7g，21.3μmol/g CPG负载。使用标准程序，在自动寡核苷酸合成中采用所得的负载GalNAc的CPG固体支持体。核苷酸去保护和随后从固体支持体上移除(同时伴随半乳糖胺乙酸酯去保护)得到GalNAc-寡核苷酸缀合物150。
实施例11.缀合物153、158、163、168和173的合成
方案22.
Figure BDA0003143117940001501
步骤1.制备(2S,4R)-4-羟基吡咯烷-1,2-二羧酸1-(叔丁基)2-甲基酯(133)
在室温下，将(2S,4R)-4-羟基吡咯烷-2-羧酸甲酯(25.9g，46mmol)、BOC酸酐(65.9g，302.5mmol)和TEA(42ml，302.5mmol)在DCM中搅拌16h。将有机物顺序地用1M HCl(x2)、饱和NaHCO3(x2)、H2O和盐水洗涤，干燥并真空浓缩，以得到(2S,4R)-4-羟基吡咯烷-1,2-二羧酸1-(叔丁基)2-甲基酯(133)(58.1g，85％)。
步骤2.制备(4R)-4-羟基-2-甲基吡咯烷-1,2-二羧酸1-(叔丁基)2-甲基酯(134)
在-40℃下，将(2S,4R)-4-羟基吡咯烷-1,2-二羧酸1-(叔丁基)2-甲基酯(133)(5g，20.4mmol)和MeI(12g，84.5mmol)在无水THF中搅拌。逐滴添加LDA(2.0M在THF中的溶液)(37.5mL，75mmol)。使反应物升温至室温并搅拌4h，接着用饱和NH4Cl淬灭。将反应物用EtOAc萃取，用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过柱色谱50:50EtOAc//己烷纯化残余物以得到为外消旋混合物的(4R)-4-羟基-2-甲基吡咯烷-1,2-二羧酸1-(叔丁基)2-甲基酯(134)(3.6g，68％)。
步骤3.制备(2S,4R)-4-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(135a)
将(4R)-4-羟基-2-甲基吡咯烷-1,2-二羧酸1-(叔丁基)2-甲基酯(134)(19g，73.5mmol)在N2下在无水THF中搅拌。逐滴添加LiBH4溶液(48ml，96mmol)并且将反应物在室温下搅拌48h。用1M NaOH淬灭反应物，真空除去THF并用EtOAc(4x100ml)萃取残余物。将有机物用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过柱色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到为主要产物的(2S,4R)-4-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(135a)(8g，47％)。结构根据参考文献指定。
步骤4.制备(3R,5S)-5-(羟甲基)-5-甲基吡咯烷-3-醇盐酸盐(136)
在室温下，将(2S,4R)-4-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(135a)(8g，34.6mmol)在EtOAc中搅拌并且施加气态HCl，持续大约两分钟。将反应物搅拌一小时，然后真空浓缩并且在高真空下干燥，以便以定量方式得到(3R,5S)-5-(羟甲基)-5-甲基吡咯烷-3-醇盐酸盐(136)。
步骤5.制备12-((2S,4R)-4-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基吡咯烷-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯(137)
在室温下，将(3R,5S)-5-(羟甲基)-5-甲基吡咯烷-3-醇盐酸盐(136)(7.9g，47.4mmol)、12-甲氧基-12-氧代十二烷酸(11.5g，47.4mmol)、HBTU(36g，76mmol)和TEA20mL，142.2mmol)在DCM中搅拌16h。通过过滤除去沉淀并且将有机物用1M HCl(x2)、饱和NaHCO3(x2)、H2O和盐水洗涤。干燥后，将有机物真空浓缩并且通过柱色谱(5％MeOH/DCM)纯化，以得到12-((2S,4R)-4-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基吡咯烷-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯(137)(3.1g，18.3％)。
步骤6.制备12-((2S,4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-甲基)-4-羟基-2-甲基吡咯烷-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯(138)
在室温下，将12-((2S,4R)-4-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基吡咯烷-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯(137)(3.1g，9.0mmol)、DMTr-Cl(2.8g，8.2mmol)和TEA(1.1ml，8.2mmol)在DC<中搅拌16h。将反应物真空浓缩并且通过柱色谱(5％MeOH/DCM，0.1％TEA)纯化残余物，以得到12-((2S,4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基-2-甲基吡咯烷-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯(138)(2.7g，45.5mmol)。
方案23
Figure BDA0003143117940001521
步骤7.制备化合物154-1
在0℃下，在氮气下，向N-(2-羟乙基)邻苯二甲酰亚胺(4.80g，25.0mmol)和4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(8.8g，26.0mmol)在二氯甲烷(200mL)中的溶液中逐滴添加三乙胺(10.4mL，74.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3hr。TLC指示反应完成。将有机层用盐水(100mL)洗涤，经MgSO4干燥并浓缩至干燥。在不经纯化的情况下将其直接用于下一反应。
步骤8.制备化合物154-2
将在乙醇(100mL)中的上文获得的2-(2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)异吲哚啉-1,3-二酮(154-1)和一水合肼(3.6mL，74mmol)在室温下搅拌过夜。TLC指示反应完成。将沉淀过滤出来。蒸发滤液。通过乙酸乙酯(100mL)溶解残余物。将有机溶液用10％NaOH、水和盐水洗涤，并且经MgSO4干燥。蒸发溶剂，得到为黄色液体的2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙胺(154-2)(8.11g，89.3％收率，经两步)。在不经进一步纯化的情况下将其用于下一反应。
步骤9.制备化合物154-3
向L-苏氨酸(1.19g，10.0mmol)和NaHCO3(2.3g，27mmol)在水(20mL)和二噁烷(10mL)中的溶液中逐滴添加在二噁烷(10mL)中的十二烷二酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)12-甲基酯146-1(3.1g，9.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。添加4N HCl(10mL)。通过过滤收集沉淀并用水(3x10mL)洗涤。将固体在干燥器中经P2O5干燥以得到为灰白色固体的(2S,3R)-3-羟基-2-(12-甲氧基-12-氧代十二烷酰氨基)丁酸154-3(2.84g，82.2％)。LC-MS(ESI):m/z:346(100),(M+H+)。
步骤10.制备化合物154
在室温下，将(2S,3R)-3-羟基-2-(12-甲氧基-12-氧代十二烷酰氨基)丁酸154-3(2.47g，7.15mmol)、2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙胺154-2(2.60g，7.15mmol)、EDC(1.64g，8.58mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(1.16g，8.58mmol)和TEA(2.4mL，17.2mmol)在二氯甲烷(72mL)中搅拌2hr。添加水(30mL)。将有机层分离并用盐水(2x30mL)洗涤。蒸发溶剂，接着进行柱色谱(30％乙酸乙酯/己烷-50％乙酸乙酯/己烷)，得到为蜡状黄色半固体的12-((2S,3R)-1-(2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基氨基)-3-羟基-1-氧代丁-2-基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯154(2.60g，52.6％)。1HNMR(400MHz,丙酮-d6,ppm):δ7.51(t,J＝5.5Hz,1H),7.45-7.49(m,2H),7.28-7.36(m,6H),7.21(tt,J＝7.2,1.2Hz,1H),7.08(d,J＝8.1Hz,1H),6.88(dt,J＝8.9,2.5Hz,4H),4.39(dd,J＝8.2,3.0Hz,1H),4.20-4.27(m,1H),3.78(s,6H),3.60(s,1H),3.35-3.52(m,2H),3.07-3.16(m,2H),2.23-2.37(m,4H),1.53-1.65(m,4H),1.23-1.36(m,12H),1.10(d,J＝6.4Hz,3H)。
方案24
Figure BDA0003143117940001541
步骤11.制备化合物164-1
向叔丁醇钾(14.6g，130mol)在THF(120mL)/醚(360mL)中的悬浮液中添加甲基三苯基溴化鏻(46.6g，130mmol)。将混合物回流2hr，接着冷却至0℃。逐滴添加在醚(50mL)中的2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(13.0g，65.2mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌，并且接着通过添加水(250mL)淬灭。分离有机层并用醚(250mL)萃取水溶液。合并的萃取物经MgSO4干燥。蒸发溶剂，接着进行柱色谱纯化(5％乙酸乙酯/己烷)得到为无色液体的3-乙烯基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯164-1(11.5g，89.4％)。GC-MS:m/z:197(2)(M+),141(40),124(30),57(100)。
步骤12.制备化合物164-2
向叔丁醇(140mL)和水(70mL)的混合物中装入AD-mix-β(47.4g)和甲烷磺酰胺(2.89g，30.4mmol)。将混合物在室温下搅拌30min并且接着冷却至0℃。添加3-乙烯基吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯164-1(6.00g，30.4mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。将反应混合物冷却至0℃。添加五水合硫代硫酸钠(96g，387mmol)并且使温度升温至室温。添加水(700mL)并用乙酸乙酯(500mL)萃取混合物。将萃取物用水(2x50mL)和盐水(50mL)洗涤，并且经MgSO4干燥。蒸发溶剂，接着进行柱色谱(2％甲醇/二氯甲烷-7％甲醇/二氯甲烷)得到为浅棕色油状物的3-(1,2-二羟乙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯164-2(5.4g，77％)。
步骤13.制备化合物164-3
向3-(1,2-二羟基乙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯164-2(3.1g，13.4mmol)在乙醇(10mL)中的溶液中添加3N HCl(30mL，90mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC指示反应完成。蒸发乙醇。添加甲苯并蒸发。这重复三次，以得到为棕色油状物的1-(吡咯烷-3-基)乙烷-1,2-二醇盐酸盐164-3(2.0g，89％)。LC-MS(ESI):m/z:132(100),(M+H+,游离胺)。
步骤14制备化合物164-4
向1-(吡咯烷-3-基)乙烷-1,2-二醇盐酸盐164-2(2.0g，12mmol)在水(30mL)中的溶液中分批添加NaHCO3(3.7g，44mmol)。接着添加二噁烷(20mL)。向以上溶液中添加在二噁烷(30mL)中的十二烷二酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)12-甲基酯146-1(3.7g，11mmol)。将反应混合物搅拌过夜。将其用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。将合并的萃取物用0.5N HCl(50mL)和盐水(50mL)洗涤，并经MgSO4干燥。
步骤15.制备化合物164
使用与2-(2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)乙基)异吲哚啉-1,3-二酮138的合成中描述的相同程序由12-(3-(1,2-二羟基乙基)吡咯烷-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯164-4和4,4-二甲氧基三苯甲基氯(1当量)制备此物质。通过柱色谱(1.5％甲醇/二氯甲烷)纯化产物。获得收率51％的为黄色油状物的12-(3-(2-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-1-羟乙基)吡咯烷-1-基)-12-氧代十二烷酸甲酯164。1HNMR(400MHz,丙酮-d6,ppm):δ7.49-7.54(m,2H),7.35-7.40(m,4H),7.28-7.34(m,2H),7.19-7.25(m,1H),6.86-6.91(m,4H),4.11-4.20(m,1H),3.79(s,6H),3.68-3.77(m,1H),3.60(s,3H),3.29-3.59(m,3H),3.06-3.20(m,3H),2.33-2.55(m,1H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.19(t,J＝7.6Hz,2H),1.65-2.0(m,2H),1.51-1.62(m,4H),1.26-1.35(m,12H)。
方案25
Figure BDA0003143117940001561
步骤16.制备化合物170-1
在室温下向2-氨基乙基氨基甲酸叔丁酯(2.88g，18.0mmol)和三乙胺(2.98g，29.4mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中逐滴添加在二氯甲烷(50mL)中的十二烷二酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)12-甲基酯(146-1)(5.09g，14.9mmol)。将反应混合物搅拌过夜并且TLC指示反应完成。添加100mL盐水并分离有机层。将有机层用0.5N HCl(150mL)、盐水(2x100mL)洗涤并经MgSO4干燥。蒸发溶剂，得到为白色固体的纯12-(2-(叔丁氧羰基氨基)乙基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯170-1(5.85g，100％)。
步骤17.制备化合物170-2
向0℃的12-(2-(叔丁氧羰基氨基)乙基氨基)-12-氧代十二烷酸酯170-1(5.55g，14.4mmol)在甲醇(100mL)中的溶液中逐滴添加亚硫酰氯(3.3mL，45.5mmol)。然后将反应物在室温下搅拌过夜。TLC指示反应完成。将溶剂和挥发性有机物蒸发。然后将残余物与庚烷一起共蒸发两次，以定量地得到为白色固体的12-(2-氨基乙基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯盐酸盐170-2。LC-MS(ESI):m/z:287(100),(M+H+,游离胺)。
步骤18.制备化合物170-3
将(-)-(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸甲酯(5.01g，31.2mmol)和LiOH.H2O(2.55g，60.8mmol)在THF(50mL)和水(50mL)中搅拌过夜。TLC指示反应完成。蒸发THF并且将水溶液用1N HCl酸化至pH＝1。将其用乙酸乙酯(5x50mL)萃取。合并的萃取物经MgSO4干燥。蒸发溶剂，得到为浅黄色液体的(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸170-3(2.93g，64.3％)。
步骤19.制备化合物170-4
使用与十二烷二酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)12-甲基酯146-1的合成中描述的相同程序，以86％的收率由(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸170-3和N-羟基琥珀酰亚胺合成化合物170-4。以86％的收率获得为白色固体的(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯170-4。
步骤20.制备化合物170-5
在0℃下，经4hr向12-(2-氨基乙基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯盐酸盐170-2(14.4mmol)和(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-羧酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯170-4(3.80g，15.6mmol)在二氯甲烷(100mL)中的悬浮液中添加在二氯甲烷(25mL)中的三乙胺(6mL，43.0mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌过夜。LC-MS指示起始材料170-2完全转化。将有机层用盐水(50mL)、1N HCl(50mL)、盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥并浓缩至干燥以得到为白色固体的(S)-12-(2-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲酰氨基)乙基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯170-5(5.93g，99.3％)。
步骤21.制备化合物170-6
向(S)-12-(2-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲酰氨基)乙基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯170-5(5.93g，14.3mmol)的溶液中添加一滴浓硫酸。将其回流6hr并且接着冷却至室温。通过过滤收集固体并用冷甲醇洗涤两次。将固体在空气中干燥(3.32g)。由母液获得第二茬产物(second crop)(0.42g)，以得到为白色晶体的(S)-12-(2-(2,3-二羟基丙酰氨基)乙基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯170-6(总计3.74g，69.4％)。LC-MS(ESI):m/z:375(100),(M+H+)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.79(br,2H),5.49(d,J＝5.3Hz,1H),4.66(t,J＝5.8Hz,1H),3.83-3.88(m,1H),3.55-3.61(m,4H),3.41-3.47(m,1H),3.05-3.15(m,4H),2.29(t,J＝7.4Hz,2H),2.03(t,J＝7.6Hz,2H),1.42-1.52(m,4H),1.18-1.29(m,12H)。
步骤22.制备化合物170
在氮气下向(S)-12-(2-(2,3-二羟基丙酰氨基)乙基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯170-6(2.99g，7.99mmol)在无水吡啶(57.5mL)中的溶液中一次性添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(2.84g，8.38mmol)。将反应物在室温下搅拌两天。添加甲醇(5mL)以淬灭反应物。将吡啶蒸发。添加甲苯并且接着蒸发。将此重复三次。添加水(100mL)并将其用乙酸乙酯(5x250mL)萃取。合并萃取物并经MgSO4干燥。蒸发溶剂，接着进行柱色谱(1％甲醇/二氯甲烷-3％甲醇/二氯甲烷)，得到为粘稠油状物的(S)-12-(2-(3-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-2-羟基丙酰氨基)-乙基氨基)-12-氧代十二烷酸甲酯170(1.70g，31.4％)。1HNMR(400MHz,丙酮-d6,ppm):δ7.64-7.70(br,1H),7.47-7.51(m,2H),7.33-7.37(m,4H),7.26-7.32(m,2H),7.20(dt,J＝7.3,2.1Hz,1H),7.11(br,1H),6.86(d,J＝8.7Hz,4H),4.84(br,1H),4.21(dd,J＝5.1,3.8Hz,1H),3.78(s,6H),3.60(s,1H),3.25-3.42(m,6H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H),1.48-1.62(m,4H),1.21-1.34(m,12H)。
方案26.
Figure BDA0003143117940001591
步骤23.制备化合物139、155、160、165和170
使用与用于化合物18相同的程序由化合物138、154、159、164和169制备化合物139、155、160、165和170。
步骤24.制备缀合物153、158、163、168和173
使用与用于化合物1相同的程序由化合物139、154、159、164和169制备缀合物153、158、163、168和173。
实施例12.缀合物176的合成
方案27.
Figure BDA0003143117940001601
方案28.
Figure BDA0003143117940001602
步骤1.制备12-氨基十二烷酸甲酯132
在室温下，将12-氨基十一烷酸(131)(10g，4.64mmol)在MeOH中搅拌。逐滴添加乙酰氯(856μL，12mmol)并且将反应物搅拌1.5hr。真空除去溶剂，将残余物溶解于MTBE中并在冰箱中冷冻过夜。通过过滤收集所得沉淀，用冰冷的MTBE洗涤并在高真空下干燥，以得到12-氨基十二烷酸甲酯132。
步骤2.制备外消旋(顺式)12-(12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)-(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酰氨基)十二烷酸甲酯129
在室温O/N下，将外消旋(顺式)10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂(128)(2g，3.1mmol)、12-氨基十二烷酸甲酯(132)(778mg，3.1mmol)、HBTU(1.2g，3.1mmol)和TEA(1.4mL，10mmol)在DCM中搅拌。通过过滤除去沉淀，将滤液真空浓缩并通过柱色谱(5％MeOH，DCM)纯化残余物。TLC显示出具有相同质量的两个接近的流动点(running spot)，将其指定为几何异构体并汇集在一起，以便以定量方式得到12-(12-(10-((3R,4S)-3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酰氨基)十二烷酸甲酯(129)。
步骤3.制备外消旋(顺式)12-(12-(10-(-3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)-甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)-十二烷酰氨基)十二烷酸锂130
在室温O/N下，将外消旋(顺式)12-(12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酰氨基)十二烷酸甲酯(129)(3.1mmol)在具有LiOH(88mg，3.7mmol)的THF:H2O(50:50)中搅拌。通过TLC证实反应并且真空除去THF。将水溶液在液体N2中冷冻并冻干48小时，以定量地得到外消旋(顺式)12-(12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)-甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)-十二烷酰氨基)十二烷酸锂130。
步骤4.制备缀合物176
使用与用于化合物1相同的程序由化合物24和130制备缀合物176。
实施例13.缀合物179的合成
方案29.
Figure BDA0003143117940001621
方案30.
Figure BDA0003143117940001631
步骤1.制备化合物80
在室温O/N下，将化合物24(2g，0.86mmol)、N-苄氧羰基-L-谷氨酸(120mg，0.43mmol)、HBTU(326mg，0.86mmol)和TEA(353μL，2.6mmol)在DCM中搅拌。将混合物真空浓缩并且通过柱色谱纯化，以得到化合物80(2.88g，83％)。
步骤2.制备化合物81
使用与用于化合物14相同的程序由化合物80(670mg，0.17mmol)制备化合物81。将粗化合物用于后续反应中并作为定量值获得收率。
步骤3.制备缀合物179
使用与用于化合物1相同的程序由化合物18和81制备缀合物179。
实施例14.缀合物182的合成
方案31.
Figure BDA0003143117940001641
方案32.
Figure BDA0003143117940001642
步骤1.制备化合物93
使用与用于化合物89相同的程序由(2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)-D-谷氨酸(2.25g，8.1mmol)和9(13g，21mmol)制备化合物93。收率：11.2g。
步骤2.制备化合物94
使用与用于化合物90相同的程序由化合物93(11.1g)制备化合物94。收率：10.2g。
步骤3.制备缀合物182
使用与用于化合物1相同的程序由化合物18和94制备缀合物182。
实施例15.缀合物185和188的合成
方案33.
Figure BDA0003143117940001651
方案34.
Figure BDA0003143117940001661
方案35.
Figure BDA0003143117940001662
步骤1.制备4-甲基苯磺酸14-羟基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基酯82
将戊乙二醇(35g，147mmol)、TEA(41mL，294mmol)和三甲胺-HCl(1.4g，14.7mmol)在CH2Cl2(600mL)中的溶液用对甲苯磺酰氯(29.4g，154mmol)处理。搅拌(18h)后，将反应混合物用H2O-盐水(1:1)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩并进行色谱以得到为淡黄色油状物的82(24.6g，43％)。Rf 0.8(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤2.14-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-醇83
使用与用于化合物4相同的程序由82(24.6g，62.7mmol)和叠氮化钠(7.13g，110mmol)制备14-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-醇(83)。收率：14.8g，90％。
步骤3.制备化合物84
将GalNAc 6(12.2g，31.4mmol)和HO-PEG-N3 83(9.2g，35mmol)在1,2-二氯乙烷(150mL)中的溶液用Sc(OTf)3(771mg，1.6mmol)处理。搅拌(85℃，2hr)后，将反应物冷却(室温)，通过添加TEA(40mL)淬灭并浓缩。对粗材料进行色谱，以得到为淡黄色泡沫的84(11.16g，60％)。Rf 0.7(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤4.制备化合物85
将84(11.16g，18.8mmol)和Pd/C(1.1g，10％-潮湿支持体)在EtOAc(120mL)中的溶液用TFA(4.32mL，56.5mmol)处理并用H2吹扫。剧烈搅拌(4.5h)后，将反应物用N2吹扫，通过硅藻土过滤并浓缩。对粗材料进行色谱以得到为无色泡沫的85(5.77g，45％)。Rf 0.5(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤5.制备化合物95
使用与用于化合物91相同的程序由(2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)-D-谷氨酸(1.04g，3.7mmol)和化合物94(10.2g)制备化合物95。收率：7.2g。
步骤6.制备化合物96
使用与用于化合物92相同的程序由化合物95(11.1g)制备化合物96。收率：6.5g。
步骤7.制备化合物97
使用与用于化合物89相同的程序由(2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)-D-谷氨酸(2g，7.1mmol)和85(12.1g，17.8mmol)制备化合物97。收率：10g，定量。
步骤8.制备化合物98
使用与用于化合物90相同的程序由化合物97(10g，7.2mmol)制备化合物98。收率：3.5g，36％。
步骤9.制备化合物99
使用与用于化合物91相同的程序由(2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)-D-谷氨酸(350mg，1.25mmol)和化合物98(2.86mg，2.5mmol)定量地制备化合物99。
步骤10.制备化合物100
使用与用于化合物92相同的程序由化合物99(3.2g，1.25mmol)定量地制备化合物100。
步骤11.制备缀合物185和188
使用与用于化合物1相同的程序由化合物18和96或18和100制备缀合物185和188。
实施例16.缀合物191、194、197和200的合成
方案36
Figure BDA0003143117940001691
方案37.
Figure BDA0003143117940001692
方案38.
Figure BDA0003143117940001701
步骤1.制备2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇86
向2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(13g，77mmol)在水(200mL)中的溶液中添加叠氮化钠(10g，154mmol)。将反应物加热至100℃，持续18小时。将反应物冷却至室温并且倒入1L分液漏斗中并用二氯甲烷(3x200mL)萃取。将合并的二氯甲烷萃取物在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥以得到为无色油状物的2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(11.7g)。
步骤2.制备化合物87
使用与用于化合物84相同的程序由86(4.95g，28.3mmol)和6(10g，25.7mmol)制备化合物87。收率：10g，77％。
步骤3.制备化合物88
使用与用于化合物85相同的程序由87(10g，19.8mmol)制备化合物88。收率：7.63g，65％。
步骤4.制备化合物89
将88(2g，3.38mmol)和Z-谷氨酸(427mg，1.52mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液用HBTU(1.41g，3.7mmol)和Hünig碱(Hünig’s base)(1.77mL，10.1mmol)处理。搅拌(18h)后，将混合物浓缩并进行色谱以得到为无色泡沫的89(871mg，48％)。Rf 0.5(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤5.制备化合物90
将89(870mg，0.72mmol)和Pd/C(90mg，10％-潮湿支持体)在EtOAc(10mL)中的溶液用TFA(84μL，1.1mmol)处理并用H2吹扫。剧烈搅拌(2h)后，将反应物用N2吹扫，通过硅藻土过滤并浓缩。粗材料不经进一步处理即使用并且得到为无色泡沫的90(850mg，定量)。Rf 0.25(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤6.制备化合物91
将90(850mg，0.72mmol)和Z-谷氨酸(91mg，0.32mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液用HBTU(300mg，0.79mmol)和Hünig碱(502μL，2.9mmol)处理。在搅拌(1.5h)后，将混合物用CH2Cl2稀释并用NaHCO3(饱和水溶液)洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。对粗材料进行色谱以得到为无色泡沫的91(590mg，76％)。Rf 0.5(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤7.制备化合物92
将91(590mg，0.25mmol)和Pd/C(100mg，10％-潮湿支持体)在CH3OH(30mL)中的溶液用TFA(29μL，0.37mmol)处理并用H2吹扫。在搅拌(3h)之后，将混合物用N2吹扫，接着通过硅藻土过滤并浓缩。粗材料不经进一步处理即使用并且得到为无色泡沫的92(600mg，定量)。Rf 0.1(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤8.制备化合物101
使用与化合物89相同的程序由(R)-2-((2-氧代-2-苯基-1l2-乙基)氨基)己二酸(2.51g，8.6mmol)和9(11g，17.2mmol)制备化合物101。收率：4.2g，37％。
步骤9.制备化合物102
使用与用于化合物90相同的程序由化合物101(4.2g，3.2mmol)制备化合物102。收率：2.1g，47％。
步骤10.制备化合物103
使用与用于化合物91相同的程序由(R)-2-((2-氧代-2-苯基-1l2-乙基)氨基)己二酸(265mg，0.9mmol)和化合物102(2.1g，1.8mmol)制备化合物103。收率：(560mg，24％)。
步骤11.制备化合物104
使用与用于化合物92相同的程序由化合物103(560mg)定量地制备化合物104。化合物不经纯化即使用。
步骤12.制备缀合物191、194和197
使用与用于化合物1相同的程序由化合物128以及92、96和100制备缀合物191、194和197。
实施例16a.缀合物191a的合成
方案36a
Figure BDA0003143117940001721
方案37a.
Figure BDA0003143117940001731
方案38a.
Figure BDA0003143117940001732
步骤1.制备2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇86a
向2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(13g，77mmol)在水(200mL)中的溶液中添加叠氮化钠(10g，154mmol)。将反应物加热至100℃，持续18小时。将反应物冷却至室温并倒入1L分液漏斗中并且用二氯甲烷(3x200mL)萃取。将合并的二氯甲烷萃取物在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥，以得到为无色油状物的2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(11.7g)。
步骤2.制备化合物87a
使用与用于化合物84相同的程序由86a(4.95g，28.3mmol)和6a(10g，25.7mmol)制备化合物87a。收率：10g，77％。
步骤3.制备化合物88a
使用与用于化合物85相同的程序由87a(10g，19.8mmol)制备化合物88a。收率：7.63g，65％。
步骤4.制备化合物89a
将88a(2g，3.38mmol)和Z-L-谷氨酸(427mg，1.52mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液用HBTU(1.41g，3.7mmol)和Hünig碱(1.77mL，10.1mmol)处理。搅拌(18h)后，将混合物浓缩并进行色谱以得到为无色泡沫的89a(871mg，48％)。Rf 0.5(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤5.制备化合物90a
将89a(870mg，0.72mmol)和Pd/C(90mg，10％-潮湿支持体)在EtOAc(10mL)中的溶液用TFA(84μL，1.1mmol)处理并用H2吹扫。剧烈搅拌(2h)后，将反应物用N2吹扫，通过硅藻土过滤并浓缩。粗材料不经进一步处理即使用并且得到为无色泡沫的90a(850mg，定量)。Rf0.25(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤6.制备化合物91a
将90a(850mg，0.72mmol)和Z-谷氨酸(91mg，0.32mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液用HBTU(300mg，0.79mmol)和Hünig碱(502μL，2.9mmol)处理。在搅拌(1.5h)后，将混合物用CH2Cl2稀释并用NaHCO3(饱和水溶液)洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。对粗材料进行色谱以得到为无色泡沫的91a(590mg，76％)。Rf 0.5(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤7.制备化合物92a
将91a(590mg，0.25mmol)和Pd/C(100mg，10％-潮湿支持体)在CH3OH(30mL)中的溶液用TFA(29μL，0.37mmol)处理并用H2吹扫。在搅拌(3h)之后，将混合物用N2吹扫，接着通过硅藻土过滤并浓缩。粗材料不经进一步处理即使用并且得到为无色泡沫的92a(600mg，定量)。Rf 0.1(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤8.制备缀合物191a
使用与用于化合物1相同的程序由化合物128和化合物92a制备缀合物191a。
实施例16b.缀合物191b的合成
方案36b
Figure BDA0003143117940001751
方案37b.
Figure BDA0003143117940001761
方案38b.
Figure BDA0003143117940001762
步骤1.制备2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇86b
向2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(13g，77mmol)在水(200mL)中的溶液中添加叠氮化钠(10g，154mmol)。将反应物加热至100℃，持续18小时。将反应物冷却至室温并倒入1L分液漏斗中并且用二氯甲烷(3x200mL)萃取。将合并的二氯甲烷萃取物在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥，以得到为无色油状物的2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(11.7g)。
步骤2.制备化合物87b
使用与用于化合物84相同的程序由86b(4.95g，28.3mmol)和6b(10g，25.7mmol)制备化合物87a。收率：10g，77％。
步骤3.制备化合物88b
使用与用于化合物85相同的程序由87b(10g，19.8mmol)制备化合物88a。收率：7.63g，65％。
步骤4.制备化合物89b
将88b(2g，3.38mmol)和外消旋Z-谷氨酸(427mg，1.52mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液用HBTU(1.41g，3.7mmol)和Hünig碱(1.77mL，10.1mmol)处理。搅拌(18h)后，将混合物浓缩并进行色谱以得到为无色泡沫的89b(871mg，48％)。Rf 0.5(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤5.制备化合物90b
将89b(870mg，0.72mmol)和Pd/C(90mg，10％-潮湿支持体)在EtOAc(10mL)中的溶液用TFA(84μL，1.1mmol)处理并用H2吹扫。剧烈搅拌(2h)后，将反应物用N2吹扫，通过硅藻土过滤并浓缩。粗材料不经进一步处理即使用并且得到为无色泡沫的90b(850mg，定量)。Rf0.25(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤6.制备化合物91b
将90b(850mg，0.72mmol)和Z-谷氨酸(91mg，0.32mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液用HBTU(300mg，0.79mmol)和Hünig碱(502μL，2.9mmol)处理。在搅拌(1.5h)后，将混合物用CH2Cl2稀释并用NaHCO3(饱和水溶液)洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。对粗材料进行色谱以得到为无色泡沫的91b(590mg，76％)。Rf0.5(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤7.制备化合物92b
将91b(590mg，0.25mmol)和Pd/C(100mg，10％-潮湿支持体)在CH3OH(30mL)中的溶液用TFA(29μL，0.37mmol)处理并用H2吹扫。在搅拌(3h)之后，将混合物用N2吹扫，接着通过硅藻土过滤并浓缩。粗材料不经进一步处理即使用并且得到为无色泡沫的92b(600mg，定量)。Rf 0.1(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤8.制备缀合物191b
使用与用于化合物1相同的程序由化合物128和化合物92b制备缀合物191b。
实施例16c.缀合物191c的合成
方案36c
Figure BDA0003143117940001781
方案37c.
Figure BDA0003143117940001791
方案38c.
Figure BDA0003143117940001792
步骤1.制备2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇86c
向2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(13g，77mmol)在水(200mL)中的溶液中添加叠氮化钠(10g，154mmol)。将反应物加热至100℃，持续18小时。将反应物冷却至室温并倒入1L分液漏斗中并且用二氯甲烷(3x200mL)萃取。将合并的二氯甲烷萃取物在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥，以得到为无色油状物的2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(11.7g)。
步骤2.制备化合物87c
使用与用于化合物84相同的程序由86c(4.95g，28.3mmol)和6c(10g，25.7mmol)制备化合物87c。收率：10g，77％。
步骤3.制备化合物88c
使用与用于化合物85相同的程序由87c(10g，19.8mmol)制备化合物88c。收率：7.63g，65％。
步骤4.制备化合物89c
将88c(2g，3.38mmol)和外消旋Z-谷氨酸(427mg，1.52mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液用HBTU(1.41g，3.7mmol)和Hünig碱(1.77mL，10.1mmol)处理。搅拌(18h)后，将混合物浓缩并进行色谱以得到为无色泡沫的89c(871mg，48％)。Rf 0.5(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤5.制备化合物90c
将89c(870mg，0.72mmol)和Pd/C(90mg，10％-潮湿支持体)在EtOAc(10mL)中的溶液用TFA(84μL，1.1mmol)处理并用H2吹扫。剧烈搅拌(2h)后，将反应物用N2吹扫，通过硅藻土过滤并浓缩。粗材料不经进一步处理即使用并且得到为无色泡沫的90c(850mg，定量)。Rf0.25(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤6.制备化合物91c
将90c(850mg，0.72mmol)和Z-谷氨酸(91mg，0.32mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液用HBTU(300mg，0.79mmol)和Hünig碱(502μL，2.9mmol)处理。在搅拌(1.5h)后，将混合物用CH2Cl2稀释并用NaHCO3(饱和水溶液)洗涤，干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。对粗材料进行色谱以得到为无色泡沫的91c(590mg，76％)。Rf 0.5(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤7.制备化合物92c
将91c(590mg，0.25mmol)和Pd/C(100mg，10％-潮湿支持体)在CH3OH(30mL)中的溶液用TFA(29μL，0.37mmol)处理并用H2吹扫。在搅拌(3h)之后，将混合物用N2吹扫，接着通过硅藻土过滤并浓缩。粗材料不经进一步处理即使用并且得到为无色泡沫的92c(600mg，定量)。Rf 0.1(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤8.制备缀合物191c
使用与用于化合物1相同的程序由化合物128和化合物92c制备缀合物191c。
实施例17.缀合物203和206的合成
方案39.
Figure BDA0003143117940001811
Figure BDA0003143117940001821
步骤1.制备化合物69b
使用与用于化合物69相同的程序由(2S,4R)-4-羟基吡咯烷-2-羧酸制备化合物69b。
步骤2.制备缀合物203和206
使用与用于化合物1相同的程序由化合物96和100制备缀合物203和206。
实施例18.缀合物209的合成
方案40.
Figure BDA0003143117940001822
Figure BDA0003143117940001831
步骤1.制备缀合物209
使用与用于化合物1相同的程序由化合物96和160制备缀合物209。
实施例18a.缀合物209a的合成
方案40a.
Figure BDA0003143117940001832
Figure BDA0003143117940001841
步骤1.制备缀合物209a
使用与用于化合物1相同的程序由化合物96a和160制备缀合物209a。
实施例19.缀合物212和215的合成
方案41.
Figure BDA0003143117940001842
方案42.
Figure BDA0003143117940001851
步骤1.制备5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)-异邻苯二甲酸二甲酯105
将5-氨基异邻苯二甲酸二甲酯(5g，24mmol)、Z-Gly-OH(5g，24mmol)、EDC(5g，26.3mmol)、HOBt(3.6g，26.3mmol)、NMM(2.9mL，26.3mmol)在DMF(50mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将反应混合物用乙酸乙酯(250mL)稀释并用1M HCl(2x100mL)、饱和碳酸氢钠(1x100mL)和盐水(2x100mL)中的每一个洗涤。在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥，以得到为无色固体的5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸二甲酯(7.2g，79％)。
步骤2.制备5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸106
向5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸甲酯(7.2g)在甲醇(25mL)和THF(25mL)中的溶液中添加1M NaOH(25mL)。将溶液在室温下搅拌2小时，然后浓缩以除去THF和MeOH。将剩余的水溶液用水(75mL)稀释，在冰水浴上冷却并用6M HCl酸化至pH＝1。过滤固体并用水(3x100mL)洗涤。将固体冷冻干燥以得到5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)-异邻苯二甲酸(6.9g，定量)。
步骤3.制备化合物107
使用与用于化合物95相同的程序由5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸106(200mg，0.54mmol)和94(1.7g，1.3mmol)制备化合物107。收率：600mg。
步骤4.制备化合物108
使用与用于化合物96相同的程序由化合物107(600mg)制备化合物108。收率：650mg，定量。
步骤5.制备化合物109
使用与用于化合物99相同的程序由5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸106(180mg，0.48mmol)和98(1.5g，1.1mmol)制备化合物109。收率：900mg。
步骤6.制备化合物110
使用与用于化合物100相同的程序由化合物109(900mg)制备化合物110。收率：920mg，定量。
步骤7.制备缀合物212和215
使用与用于化合物1相同的程序由化合物128和108或110制备缀合物212和215。
实施例19a.缀合物212a和215a的合成
方案41a.
Figure BDA0003143117940001871
方案42a.
Figure BDA0003143117940001872
步骤1.制备5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)-异邻苯二甲酸二甲酯105a
将5-氨基异邻苯二甲酸二甲酯(5g，24mmol)、Z-Gly-OH(5g，24mmol)、EDC(5g，26.3mmol)、HOBt(3.6g，26.3mmol)、NMM(2.9mL，26.3mmol)在DMF(50mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将反应混合物用乙酸乙酯(250mL)稀释并用1M HCl(2x100mL)、饱和碳酸氢钠(1x100mL)和盐水(2x100mL)中的每一个洗涤。在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥，以得到为无色固体的5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸二甲酯(7.2g，79％)。
步骤2.制备5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸106a
向5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸甲酯(7.2g)在甲醇(25mL)和THF(25mL)中的溶液中添加1M NaOH(25mL)。将溶液在室温下搅拌2小时，接着浓缩以除去THF和MeOH。将剩余的水溶液用水(75mL)稀释，在冰水浴上冷却并且用6M HCl酸化至pH＝1。过滤固体并用水(3x100mL)洗涤。将固体冷冻干燥以得到5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)-异邻苯二甲酸(6.9g，定量)。
步骤3.制备化合物107a
使用与用于化合物95相同的程序由5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸106a(200mg，0.54mmol)和94a(1.7g，1.3mmol)制备化合物107a。收率：600mg。
步骤4.制备化合物108a
使用与用于化合物96a相同的程序由化合物107a(600mg)制备化合物108a。收率：650mg，定量。
步骤5.制备化合物109a
使用与用于化合物99相同的程序由5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸106a(180mg，0.48mmol)和9a8(1.5g，1.1mmol)制备化合物109a。收率：900mg。
步骤6.制备化合物110a
使用与用于化合物100相同的程序由化合物109(900mg)制备化合物110a。收率：920mg，定量。
步骤7.制备缀合物212a和215a
使用与用于化合物1相同的程序由化合物128和108a或110a制备缀合物212a和21a5。
实施例20.缀合物218和221的合成
方案43.
Figure BDA0003143117940001891
方案44.
Figure BDA0003143117940001901
步骤1.制备化合物111
使用与用于化合物89相同的程序由4-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)邻苯二甲酸(1.13g，3.84mmol)和88(5g，8.44mmol)制备化合物111。收率：2.21g，49％。
步骤2.制备化合物112
将111(2.21g，1.87mmol)在CH2Cl2(40mL)中的溶液用TFA(5mL)缓慢处理。搅拌(2h)后，将混合物浓缩并进行色谱以得到为无色泡沫的112(1.08g，47％)。Rf 0.1(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤3.制备化合物113
使用与用于化合物91相同的程序由化合物112(1.08g，0.88mmol)和(2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)-D-谷氨酸(112mg，0.39mmol)制备化合物113。收率：600mg，62％。
步骤4.制备化合物114
使用与用于化合物92相同的程序由化合物113制备化合物114。
步骤5.制备化合物115
使用与用于化合物93相同的程序由4-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)邻苯二甲酸(3.94g，13.3mmol)和9(18.2g，29.4mmol)制备化合物115。收率：9.02g，53％。
步骤6.制备化合物116
使用与用于化合物112相同的程序由化合物115(8g，6.3mmol)制备化合物116。收率：3.23g，39％。
步骤7.制备化合物117
使用与用于化合物95相同的程序由化合物116(3.23g，2.45mmol)和(2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)-D-谷氨酸(192mg，1.1mmol)制备化合物117。收率：2.22g，34％。
步骤8.制备化合物118
使用与用于化合物96相同的程序由化合物117(2.22g，0.84mmol)制备化合物118。收率：2.02g，91％。
步骤9.制备缀合物218和221
使用与用于化合物1相同的程序由化合物128和114或118制备缀合物218和221。
实施例20a.缀合物218a和221a的合成方案43a.
Figure BDA0003143117940001921
方案44a.
Figure BDA0003143117940001922
步骤1.制备化合物111a
使用与用于化合物89相同的程序由4-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)邻苯二甲酸(1.13g，3.84mmol)和88(5g，8.44mmol)制备化合物111a。收率：2.21g，49％。
步骤2.制备化合物112a
将111a(2.21g，1.87mmol)在CH2Cl2(40mL)中的溶液用TFA(5mL)缓慢处理。搅拌(2h)后，将混合物浓缩并进行色谱以得到为无色泡沫的112a(1.08g，47％)。Rf 0.1(10％CH3OH-CH2Cl2)。
步骤3.制备化合物113a
使用与用于化合物91相同的程序由化合物112a(1.08g，0.88mmol)和(2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)-D-谷氨酸(112mg，0.39mmol)制备化合物113a。收率：600mg，62％。
步骤4.制备化合物114a
使用与用于化合物92相同的程序由化合物113a制备化合物114a。
步骤5.制备化合物115a
使用与用于化合物93相同的程序由4-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)邻苯二甲酸(3.94g，13.3mmol)和9(18.2g，29.4mmol)制备化合物115a。收率：9.02g，53％。
步骤6.制备化合物116a
使用与用于化合物11a相同的程序由化合物115a(8g，6.3mmol)制备化合物116a。收率：3.23g，39％。
步骤7.制备化合物117a
使用与用于化合物95相同的程序由化合物116a(3.23g，2.45mmol)和(2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)谷氨酸(192mg，1.1mmol)制备化合物117a。收率：2.22g，34％。
步骤8.制备化合物118a
使用与用于化合物96相同的程序由化合物117a(2.22g，0.84mmol)制备化合物118a。收率：2.02g，91％。
步骤9.制备缀合物21a8和221a
使用与用于化合物1相同的程序由化合物128和114a或118a制备缀合物218a和22a1。
实施例21.缀合物224的合成
方案45.
Figure BDA0003143117940001941
步骤1.制备化合物224
使用与用于化合物1相同的程序由化合物96和130制备缀合物224。
实施例21a.缀合物224b的合成
方案45a.
Figure BDA0003143117940001951
步骤1.制备化合物224b
使用与用于化合物1相同的程序由化合物96b和130制备缀合物224b。
实施例22缀合物231的合成
方案46
Figure BDA0003143117940001961
方案47
Figure BDA0003143117940001962
Figure BDA0003143117940001971
步骤1制备化合物225
使用与用于89相同的程序由5-(2-氨基乙酰氨基)异邻苯二甲酸106(560mg，1.5mmol)和9(2.24g，3.6mmol)制备化合物225。收率1.6g，80％。
步骤2制备化合物226
化合物226以与14相同的方式制备。收率1.22g，78％。
步骤3制备化合物227
化合物227以与89相同的方式由Z-谷氨酸(108mg，0.38mmol)和226(1.22g，0.92mmol)制备。收率471mg，45％。
步骤4制备化合物228
化合物228以与14相同的方式制备。收率460mg，定量。
步骤5制备化合物229
化合物229以与89相同的方式由228(460mg，0.17mmol)和128(125mg，0.19mmol)制备。收率365mg，66％。
步骤6制备化合物231
使用与用于化合物1相同的程序制备缀合物231。
实施例22a缀合物231a的合成
方案46a
Figure BDA0003143117940001981
方案47a
Figure BDA0003143117940001982
Figure BDA0003143117940001991
步骤1制备化合物225a
使用与用于89相同的程序由5-(2-氨基乙酰氨基)异邻苯二甲酸106(560mg，1.5mmol)和9(2.24g，3.6mmol)制备化合物225a。收率1.6g，80％。
步骤2制备化合物226a
化合物226a以与14相同的方式制备。收率1.22g，78％。
步骤3制备化合物227a
化合物227a以与89相同的方式由Z-谷氨酸(108mg，0.38mmol)和226a(1.22g，0.92mmol)制备。收率471mg，45％。
步骤4制备化合物228a
化合物228a以与14相同的方式制备。收率460mg，定量。
步骤5制备化合物229a
化合物229a以与89相同的方式由228a(460mg，0.17mmol)和128(125mg，0.19mmol)制备。收率365mg，66％。
步骤6制备化合物231a
使用与用于化合物1相同的程序制备缀合物231a。
实施例22b缀合物231b的合成
方案46b
Figure BDA0003143117940002001
方案47b
Figure BDA0003143117940002002
Figure BDA0003143117940002011
步骤1制备化合物225b
使用与用于89相同的程序由5-(2-氨基乙酰氨基)异邻苯二甲酸106(560mg，1.5mmol)和9(2.24g，3.6mmol)制备化合物225b。收率1.6g，80％。
步骤2制备化合物226b
化合物226b以与14相同的方式制备。收率1.22g，78％。
步骤3制备化合物227b
化合物227b以与89相同的方式由Z-谷氨酸(108mg，0.38mmol)和226b(1.22g，0.92mmol)制备。收率471mg，45％。
步骤4制备化合物228b
化合物228b以与14相同的方式制备。收率460mg，定量。
步骤5制备化合物229b
化合物229b以与89相同的方式由228b(460mg，0.17mmol)和128(125mg，0.19mmol)制备。收率365mg，66％。
步骤6制备化合物231b
使用与用于化合物1相同的程序制备缀合物231b。
实施例23.缀合物233的合成
方案48
Figure BDA0003143117940002021
步骤1.制备化合物232
使用与用于化合物19相同的程序由化合物24(650mg，0.33mmol)和化合物69b(175mg，0.33mmol)制备化合物232。收率：380mg，47％。
步骤2.制备化合物233
使用与用于化合物1相同的程序由化合物232制备化合物233。
实施例24.缀合物235的合成
方案49
Figure BDA0003143117940002031
Figure BDA0003143117940002041
步骤1.制备化合物234
使用与用于化合物19相同的程序由化合物24(1.1g，0.55mmol)和化合物18(175mg，0.33mmol)制备化合物234。收率：685mg，51％。
步骤2.制备化合物235
使用与用于化合物1相同的程序由化合物234制备化合物235。
实施例25缀合物320的合成
方案50制备活化接头
Figure BDA0003143117940002042
步骤1.制备外消旋(顺式)5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮301
向3,4-二甲基呋喃-2,5-二酮(3g，24mmol)和N-苄基-1-甲氧基-N-((三甲基甲硅烷基)甲基)甲胺(7g，29.8mmol)在二氯甲烷(75mL)中的冰冷溶液(0℃)中缓慢添加三氟乙酸(75μL)。搅拌过夜使溶液在冰浴溶化时缓慢升温至室温。将反应混合物浓缩至干燥，溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用饱和碳酸氢钠(2x100mL)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥。在硅胶上通过柱色谱进行纯化(梯度：20％乙酸乙酯/己烷至100％乙酸乙酯)，得到为黄色油状物的(3aR,6aS)-5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(3.5g，56％)。
步骤2.制备外消旋(顺式)(1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇302
向(3aR,6aS)-5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(3.5g，13.4mmol)在无水二乙醚(50mL)中的冰冷(0℃)溶液中分三批缓慢添加氢化铝锂丸粒(1.5g，40mmol)。将溶液搅拌过夜，在冰水浴溶化时升温至室温。在完成时，将反应物冷却至0℃并且用1.5mL的5M NaOH，接着用1.5mL的水非常缓慢地淬灭。搅拌30分钟，然后添加硫酸镁并过滤。浓缩滤液以得到为无色油状物的((3R,4S)-1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(2.7g)。
步骤3.制备外消旋(顺式)(3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇303
向((3R,4S)-1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(10g，40mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中添加负载10％钯的湿式活性炭(1g)。将溶液在氢气气氛下剧烈搅拌16小时。在完成时，通过硅藻土过滤溶液，并且浓缩至干燥以得到为无色固体的((3R,4S)-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(5.5g，86％)。
步骤4.制备外消旋(顺式)10-(3,4-双(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯304
将3(1.3g，8.2mmol)和癸二酸单甲酯(1.8g，8.2mmol)在CH2Cl2(100mL)中的溶液用HBTU(3.41g，9.02mmol)和Hunig碱(5.71mL，32.8mmol)处理。在搅拌过夜后，将混合物用NaHCO3(饱和水溶液)、水和盐水洗涤，接着干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。对粗材料进行色谱(梯度：0％CH3OH-CH2Cl2至20％)以得到4(1.8g，61％)。
步骤5.制备外消旋(顺式)10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)-甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯305
将304(1.8g，5.0mmol)和4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(1.7g,5.0mmol)在吡啶(180mL)中的溶液搅拌过夜。接着在减压下除去吡啶并对粗材料进行色谱(梯度：0％CH3OH-CH2Cl2至10％)以得到为黄色油状物的5(1.4g，42％)。
步骤6.制备外消旋(顺式)10-(3-((双(4-甲氧基苯基)-(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂306
向化合物305(3.0g，4.6mmol)在THF(50mL)和水(50mL)中的溶液中添加氢氧化锂(121mg，5.0mmol)。将溶液在室温下搅拌4小时，然后浓缩以除去THF。将剩余的水溶液冷冻干燥过夜以得到淡粉色固体(2.9g，定量)。化合物306制备为两种顺式-非对映异构体的混合物。
方案51全乙酰化的半乳糖胺307的合成
Figure BDA0003143117940002061
将在吡啶(1.5L)中的D-半乳糖胺盐酸盐(250g，1.16mol)用乙酸酐(1.25L，13.2mol)处理45分钟。在搅拌过夜后，将反应混合物分成三个1L部分。将每个1L部分倒入3L冰水中并混合一小时。混合之后，将固体过滤出来，合并，经液氮冷冻并且接着冻干五天，以得到为白色固体的全乙酰化的半乳糖胺7(369.4g，82％)。Rf(0.58，10％MeOH-CH2Cl2)。
方案52 GalNAc单体的合成
Figure BDA0003143117940002071
步骤1制备化合物309
将2-[2-(2-氯乙氧基)]乙醇308(100g，593mmol)在水(1L)中的溶液用NaN3(77g，1.19mol)处理并加热(90℃)。在搅拌(72小时)之后，将溶液冷却(室温)并用CH2Cl2萃取(4x)。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)、过滤、浓缩并且在不经进一步处理的情况下使用。获得为淡黄色油状物的化合物9(88.9g，86％)。
步骤2制备化合物310
将7(2.76g，7.1mmol)和309(1.37g，7.8mmol)在1,2-二氯乙烷(40mL)中的溶液用Sc(OTf)3(174mg，0.36mmol)处理并加热(85℃)。搅拌(2小时)后，将混合物冷却(室温)并且通过添加TEA(4mL)淬灭并浓缩。对粗材料进行色谱，以得到为淡黄色泡沫的310(3.03g，85％)。
步骤3制备化合物311
将310(3.02g，5.99mmol)和Pd/C(300mg，10％Pd负载-潮湿支持体)在EtOAc(30mL)中的溶液用TFA(576μL，7.5mmol)处理。将反应混合物用氢气气体(45min)吹扫，接着用氮气气体吹扫(10min)，然后通过硅藻土过滤。浓缩滤液并且接着进行色谱以得到为棕色泡沫的311(2.67g，75％)。
方案53芳族核心的合成
Figure BDA0003143117940002081
步骤1.制备5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)-异邻苯二甲酸二甲酯312
将5-氨基异邻苯二甲酸二甲酯(5g，24mmol)、Z-Gly-OH(5g，24mmol)、EDC(5g，26.3mmol)、HOBt(3.6g，26.3mmol)、NMM(2.9mL，26.3mmol)在DMF(50mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将反应混合物用乙酸乙酯(250mL)稀释并用1M HCl(2x100mL)、饱和碳酸氢钠(1x100mL)和盐水(2x100mL)中的每一个洗涤。在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥，以得到为无色固体的5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸二甲酯(7.2g，79％)。
步骤2.制备5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸313
向5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸甲酯(7.2g)在甲醇(25mL)和THF(25mL)中的溶液中添加1M NaOH(25mL)。将溶液在室温下搅拌2小时，接着浓缩以除去THF和MeOH。将剩余的水溶液用水(75mL)稀释，在冰水浴上冷却并且用6M HCl酸化至pH＝1。过滤固体并用水(3x100mL)洗涤。将固体冷冻干燥以得到5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)-异邻苯二甲酸(6.9g，定量)。
方案54：制备四聚体
Figure BDA0003143117940002091
步骤1制备化合物314
将313(2.09g，5.6mmol)和311(8.34g，14.07mmol)在CH2Cl2(150mL)中的溶液用HBTU(6.4g，16.9mmol)和Hunig碱(7.35mL，42.2mmol)处理。在搅拌(过夜)之后，将反应混合物倒入NaHCO3(饱和水溶液)中，接着用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。对粗材料进行色谱(梯度1-12％CH3OH-CH2Cl2)以得到为淡黄色泡沫的6(3.97g，55％)。
步骤2制备化合物315
将化合物314(3.92g，3.07mmol)、Pd/C(400mg，10％负载-潮湿支持体)和三氟乙酸(308μL，4mmol)用H2吹扫。在H2下搅拌(过夜)之后，用N2(15-20min)吹扫混合物，接着通过硅藻土过滤并浓缩。对粗材料进行色谱，以得到为白色至乳酪色泡沫的7(3.36g，86％)。
步骤3制备化合物316
化合物316以与314相同的方式由Z-谷氨酸(306mg，1.09mmol)和315(3.3g，2.6mmol)制备。收率1.66g，60％。
步骤4制备化合物317
化合物317以与315相同的方式制备。收率1.65g，定量。
方案55制备完整缀合物
Figure BDA0003143117940002101
步骤1制备化合物318
将317(1.91g，0.75mmol)在CH2Cl2(100mL)中的溶液首先用Hunig碱(392μL，2.25mmol)处理，接着用6(两种顺式-非对映异构体的混合物，509mg，0.79mmol)以及随后的HBTU(356mg，0.94mmol)处理。在搅拌(过夜)之后，将溶液倒入NaHCO3(饱和水溶液)中，接着用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。对粗材料进行色谱以得到为白色泡沫的318(1.19g，52％)。
步骤2制备化合物319
将318(1.19g，0.39mmol)在1,2二氯乙烷(100mL)中的溶液用TEA(542μL，3.9mmol)、DMAP(238mg，1.95mmol)和琥珀酸酐(195mg，1.95mmol)处理并加热(85℃)。在搅拌(2.5小时)之后，将溶液从加热中移除并用CH3OH(10mL)处理并且对其进行搅拌(1小时)。在搅拌之后，将混合物倒入NaHCO3(饱和水溶液)中，接着用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。获得的残余物不经进一步处理即使用。收率＝1.4g，定量
步骤3制备缀合物320
使用标准酰胺偶联化学将琥珀酸酯319加载到
Figure BDA0003143117940002111
LCAA(长链氨基烷基)CPG(对照孔玻璃)上。将二异丙基碳化二亚胺(52.6μmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.3mg，2.6μmol)和吡啶(10μL)在无水乙腈(0.3mL)中的溶液添加到含319(20.6mg，8μmol)的无水二氯甲烷(0.2mL)中。将此混合物添加至LCAA CPG(183mg)。将悬浮液在室温下轻轻混合过夜。在319(HPLC)消失时，将反应混合物过滤并且将CPG用1mL的各二氯甲烷、乙腈、5％乙酸酐/5％N-甲基咪唑/5％吡啶在THF中的溶液洗涤，接着用THF、乙腈和二氯甲烷洗涤。然后将CPG在高真空下干燥过夜。通过标准DMTr测定通过UV/Vis(504nm)确定负载为19μmol/g。使用标准程序，在自动寡核苷酸合成中采用所得的负载GalNAc的CPG固体支持体。核苷酸去保护和随后从固体支持体上移除(同时伴随半乳糖胺乙酸酯去保护)得到GalNAc-寡核苷酸缀合物320。
实施例26缀合物520的合成
方案56制备活化接头
Figure BDA0003143117940002121
步骤1.制备外消旋(顺式)5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮301
向3,4-二甲基呋喃-2,5-二酮(3g，24mmol)和N-苄基-1-甲氧基-N-((三甲基甲硅烷基)甲基)甲胺(7g，29.8mmol)在二氯甲烷(75mL)中的冰冷溶液(0℃)中缓慢添加三氟乙酸(75μL)。搅拌过夜使溶液在冰浴溶化时缓慢升温至室温。将反应混合物浓缩至干燥，溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用饱和碳酸氢钠(2x100mL)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥。在硅胶上通过柱色谱进行纯化(梯度：20％乙酸乙酯/己烷至100％乙酸乙酯)，得到为黄色油状物的(3aR,6aS)-5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(3.5g，56％)。
步骤2.制备外消旋(顺式)(1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇302
向(3aR,6aS)-5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(3.5g，13.4mmol)在无水二乙醚(50mL)中的冰冷(0℃)溶液中分三批缓慢添加氢化铝锂丸粒(1.5g，40mmol)。将溶液搅拌过夜，在冰水浴溶化时升温至室温。在完成时，将反应物冷却至0℃并且用1.5mL的5M NaOH，接着用1.5mL的水非常缓慢地淬灭。搅拌30分钟，然后添加硫酸镁并过滤。浓缩滤液以得到为无色油状物的((3R,4S)-1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(2.7g)。
步骤3.制备外消旋(顺式)(3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇303
向((3R,4S)-1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(10g，40mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中添加负载10％钯的湿式活性炭(1g)。将溶液在氢气气氛下剧烈搅拌16小时。在完成时，通过硅藻土过滤溶液，并且浓缩至干燥以得到为无色固体的((3R,4S)-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(5.5g，86％)。
步骤4.制备外消旋(顺式)10-(3,4-双(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯304
将3(1.3g，8.2mmol)和癸二酸单甲酯(1.8g，8.2mmol)在CH2Cl2(100mL)中的溶液用HBTU(3.41g，9.02mmol)和Hunig碱(5.71mL，32.8mmol)处理。在搅拌过夜后，将混合物用NaHCO3(饱和水溶液)、水和盐水洗涤，接着干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。对粗材料进行色谱(梯度：0％CH3OH-CH2Cl2至20％)以得到4(1.8g，61％)。
步骤5.制备外消旋(顺式)10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)-甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯305
将304(1.8g，5.0mmol)和4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(1.7g,5.0mmol)在吡啶(180mL)中的溶液搅拌过夜。然后在减压下除去吡啶并且对粗材料进行色谱(梯度：0％CH3OH-CH2Cl2至10％)以得到为黄色油状物的5(1.4g，42％)。
步骤6.制备外消旋(顺式)10-(3-((双(4-甲氧基苯基)-(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂306
向化合物305(3.0g，4.6mmol)在THF(50mL)和水(50mL)中的溶液中添加氢氧化锂(121mg，5.0mmol)。将溶液在室温下搅拌4小时，然后浓缩以除去THF。将剩余的水溶液冷冻干燥过夜以得到淡粉色固体(2.9g，定量)。化合物306制备为两种顺式-非对映异构体的混合物。
方案57全乙酰化的半乳糖胺507的合成
Figure BDA0003143117940002141
将在吡啶(1.5L)中的半乳糖胺盐酸盐(250g，1.16mol)用乙酸酐(1.25L，13.2mol)处理45分钟。在搅拌过夜后，将反应混合物分成三个1L部分。将每个1L部分倒入3L冰水中并混合一小时。混合之后，将固体过滤出来，合并，经液氮冷冻并且接着冻干五天，以得到为白色固体的全乙酰化的半乳糖胺507(369.4g，82％)。Rf(0.58，10％MeOH-CH2Cl2)。
方案58 GalNAc单体的合成
Figure BDA0003143117940002142
步骤1制备化合物509
将2-[2-(2-氯乙氧基)]乙醇508(100g，593mmol)在水(1L)中的溶液用NaN3(77g，1.19mol)处理并加热(90℃)。在搅拌(72小时)之后，将溶液冷却(室温)并用CH2Cl2萃取(4x)。将合并的有机物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)、过滤、浓缩并且在不经进一步处理的情况下使用。获得为淡黄色油状物的化合物509(88.9g，86％)。
步骤2制备化合物510
将507(2.76g，7.1mmol)和509(1.37g，7.8mmol)在1,2-二氯乙烷(40mL)中的溶液用Sc(OTf)3(174mg，0.36mmol)处理并加热(85℃)。搅拌(2小时)后，将混合物冷却(室温)并且通过添加TEA(4mL)淬灭并浓缩。对粗材料进行色谱，以得到为淡黄色泡沫的510(3.03g，85％)。
步骤3制备化合物511
将510(3.02g，5.99mmol)和Pd/C(300mg，10％Pd负载-潮湿支持体)在EtOAc(30mL)中的溶液用TFA(576μL，7.5mmol)处理。将反应混合物用氢气气体(45min)吹扫，接着用氮气气体吹扫(10min)，然后通过硅藻土过滤。浓缩滤液并且接着进行色谱以得到为棕色泡沫的511(2.67g，75％)。
方案59芳族核心的合成
Figure BDA0003143117940002151
步骤1.制备5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)-异邻苯二甲酸二甲酯312
将5-氨基异邻苯二甲酸二甲酯(5g，24mmol)、Z-Gly-OH(5g，24mmol)、EDC(5g，26.3mmol)、HOBt(3.6g，26.3mmol)、NMM(2.9mL，26.3mmol)在DMF(50mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将反应混合物用乙酸乙酯(250mL)稀释并用1M HCl(2x100mL)、饱和碳酸氢钠(1x100mL)和盐水(2x100mL)中的每一个洗涤。在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥，以得到为无色固体的5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸二甲酯(7.2g，79％)。
步骤2.制备5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸313
向5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)异邻苯二甲酸甲酯(7.2g)在甲醇(25mL)和THF(25mL)中的溶液中添加1M NaOH(25mL)。将溶液在室温下搅拌2小时，接着浓缩以除去THF和MeOH。将剩余的水溶液用水(75mL)稀释，在冰水浴上冷却并且用6M HCl酸化至pH＝1。过滤固体并用水(3x100mL)洗涤。将固体冷冻干燥以得到5-(2-((2-氧代-2-苯基-1λ2-乙基)氨基)乙酰氨基)-异邻苯二甲酸(6.9g，定量)。
方案60：制备四聚体
Figure BDA0003143117940002161
步骤1制备化合物514
将313(2.09g，5.6mmol)和511(8.34g，14.07mmol)在CH2Cl2(150mL)中的溶液用HBTU(6.4g，16.9mmol)和Hunig碱(7.35mL，42.2mmol)处理。在搅拌(过夜)之后，将反应混合物倒入NaHCO3(饱和水溶液)中，接着用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。对粗材料进行色谱(梯度1-12％CH3OH-CH2Cl2)以得到为淡黄色泡沫的6(3.97g，55％)。
步骤2制备化合物515
将化合物514(3.92g，3.07mmol)、Pd/C(400mg，10％负载-潮湿支持体)和三氟乙酸(308μL，4mmol)用H2吹扫。在H2下搅拌(过夜)之后，用N2(15-20min)吹扫混合物，接着通过硅藻土过滤并浓缩。对粗材料进行色谱，以得到为白色至乳酪色泡沫的7(3.36g，86％)。
步骤3制备化合物516
化合物516以与514相同的方式由Z-谷氨酸(306mg，1.09mmol)和515(3.3g，2.6mmol)制备。收率1.66g，60％。
步骤4制备化合物517
化合物517以与515相同的方式制备。收率1.65g，定量。
方案61制备完整缀合物
Figure BDA0003143117940002171
Figure BDA0003143117940002181
步骤1制备化合物518
将517(1.91g，0.75mmol)在CH2Cl2(100mL)中的溶液首先用Hunig碱(392μL，2.25mmol)处理，接着用306(两种顺式-非对映异构体的混合物，509mg，0.79mmol)以及随后的HBTU(356mg，0.94mmol)处理。在搅拌(过夜)之后，将溶液倒入NaHCO3(饱和水溶液)中，接着用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。对粗材料进行色谱以得到为白色泡沫的518(1.19g，52％)。
步骤2制备化合物519
将518(1.19g，0.39mmol)在1,2二氯乙烷(100mL)中的溶液用TEA(542μL，3.9mmol)、DMAP(238mg，1.95mmol)和琥珀酸酐(195mg，1.95mmol)处理并加热(85℃)。在搅拌(2.5小时)之后，将溶液从加热中移除并用CH3OH(10mL)处理并且对其进行搅拌(1小时)。在搅拌之后，将混合物倒入NaHCO3(饱和水溶液)中，接着用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。获得的残余物不经进一步处理即使用。收率＝1.4g，定量
步骤3制备缀合物520
使用标准酰胺偶联化学将琥珀酸酯519加载到
Figure BDA0003143117940002182
LCAA(长链氨基烷基)CPG(对照孔玻璃)上。将二异丙基碳化二亚胺(52.6μmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.3mg，2.6μmol)和吡啶(10μL)在无水乙腈(0.3mL)中的溶液添加到含519(20.6mg，8μmol)的无水二氯甲烷(0.2mL)中。将此混合物添加至LCAA CPG(183mg)。将悬浮液在室温下轻轻混合过夜。在519消失(HPLC)时，将反应混合物过滤并且将CPG用1mL的各二氯甲烷、乙腈、5％乙酸酐/5％N-甲基咪唑/5％吡啶在THF中的溶液洗涤，接着用THF、乙腈和二氯甲烷洗涤。然后将CPG在高真空下干燥过夜。通过标准DMTr测定通过UV/Vis(504nm)确定负载为19μmol/g。使用标准程序，在自动寡核苷酸合成中采用所得的负载GalNAc的CPG固体支持体。核苷酸去保护和随后从固体支持体上移除(同时伴随半乳糖胺乙酸酯去保护)得到GalNAc-寡核苷酸缀合物520。
实施例27靶向核酸缀合物的合成
以下方案101-122示出可以用于制备式I的缀合物的中间体化合物的制备。方案1-22中所示的中间体化合物和合成工艺是本发明的实施方案。
方案101制备化合物606
Figure BDA0003143117940002191
步骤1.制备(3aR,6aS)-5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮601
向3,4-二甲基呋喃-2,5-二酮(40g，317mmol)和N-苄基-1-甲氧基-N-((三甲基甲硅烷基)甲基)甲胺(94.1g，396.5mmol)在DCM(600ml)中的冰冷溶液(0℃)中缓慢添加三氟乙酸(732μL)。搅拌过夜，使溶液缓慢升温至室温。将反应混合物浓缩至干燥，溶解于EtOAc(500ml)中，用饱和碳酸氢钠(2x500ml)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥。在硅胶上通过柱色谱进行纯化(梯度：20％乙酸乙酯/己烷至100％乙酸乙酯)，得到为黄色油状物的(3aR,6aS)-5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(53.7g，65％)。Rf 0.85 40％EtOAc-己烷
步骤2.制备((3R,4S)-1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇602
经一个下午向(3aR,6aS)-5-苄基-3a,6a-二甲基四氢-1H-呋喃并[3,4-c]吡咯-1,3(3aH)-二酮(53.7g，205.7mmol)在无水二乙醚(750ml)中的冰冷(0℃)溶液中分批缓慢添加氢化铝锂丸粒(17.6g，463mmol)。将溶液搅拌过夜，在冰水浴溶化时升温至室温。在完成时，将反应物冷却至0℃并且用25ml的5M NaOH，接着用12ml的水非常缓慢地淬灭。搅拌30分钟，然后添加硫酸镁并过滤。浓缩滤液以得到为无色油状物的((3R,4S)-1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(33.6g，65％)。Rf 0.25 10％CH3OH-CH2Cl2
步骤3.制备((3R,4S)-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇603
向((3R,4S)-1-苄基-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(40.1g，161mmol)在甲醇(300ml)中的溶液中添加负载10％钯的湿式活性炭(4g)。将溶液在氢气气氛下剧烈搅拌16小时。在完成时，通过硅藻土过滤溶液，并且浓缩至干燥以得到为无色固体的((3R,4S)-3,4-二甲基吡咯烷-3,4-二基)二甲醇(24g，94％)。Rf 0.05 10％CH3OH-CH2Cl2
步骤4.制备10-((3R,4S)-3,4-双(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯604
将3(24g，151mmol)和癸二酸单甲酯(34.2g，159mmol)在CH2Cl2(1l)中的溶液用HBTU(62.9g，166mmol)和Hunig碱(105ml，604mmol)处理。在搅拌过夜后，将混合物用NaHCO3(饱和水溶液)、水和盐水洗涤，接着干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。对粗材料进行色谱(梯度：0％CH3OH-CH2Cl2至20％)以得到604(41.5g，77％)。Rf 0.55 10％CH3OH-CH2Cl2
步骤5.制备10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸甲酯605
将604(41.5g，116mmol)和4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(38.8g,116mmol)在吡啶(400ml)中的溶液搅拌过夜。然后在减压下除去吡啶并且对粗材料进行色谱(梯度：0％CH3OH-CH2Cl2至10％)以得到为黄色油状物的605(29.5g，39％)。Rf 0.5 5％CH3OH-CH2Cl2
步骤6.制备10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂606
向化合物605(29.5g，45mmol)在THF(250ml)和水(250ml)中的溶液中添加氢氧化锂(1.19g，50mmol)。将溶液在室温下搅拌18小时，然后浓缩以除去THF。将剩余的水溶液冷冻干燥过夜以得到为淡紫色固体的606(28.5g，98％)。Rf 0.56 10％CH3OH-CH2Cl2
方案102制备化合物610
Figure BDA0003143117940002221
步骤1.制备12-氨基十二烷酸甲酯608
在室温下，将12-氨基十一烷酸607(10g，4.64mmol)在MeOH中搅拌。逐滴添加乙酰氯(856μl，12mmol)并且将反应物搅拌1.5hr。真空除去溶剂，将残余物溶解于MTBE中并在冰箱中冷冻过夜。通过过滤收集所得沉淀，用冰冷的MTBE洗涤并在高真空下干燥，以得到12-氨基十二烷酸甲酯608。
步骤2.制备12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酸甲酯609
在室温O/N下，将10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂(606)(2g，3.1mmol)、12-氨基十二烷酸甲酯(608)(778mg，3.1mmol)、HBTU(1.2g，3.1mmol)和TEA(1.4ml，10mmol)在DCM中搅拌。通过过滤除去沉淀，将滤液真空浓缩并且通过柱色谱纯化残余物(5％MeOH，DCM)。TLC显示出具有相同质量的两个接近的流动点，将其指定为几何异构体并汇集在一起，以便以定量方式得到12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酸甲酯(609)。
步骤3.制备12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)-十二烷酸锂610
在室温O/N下，将12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酸甲酯609(3.1mmol)在具有LiOH(88mg，3.7mmol)的THF:H2O(50:50)中搅拌。通过TLC证实反应并且真空除去THF。将水溶液在液体N2中冷冻并冻干48小时以定量地得到12-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)十二烷酸锂610。
方案103制备化合物613
Figure BDA0003143117940002231
步骤1.制备4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基酯612
将四乙二醇(611)(934g，4.8mol)在THF(175ml)和NaOH水溶液(5M，145ml)中的溶液冷却(0℃)并用溶解于THF(605ml)中的对甲苯磺酰氯(91.4g，480mmol)处理，并且接着搅拌两小时(0℃)。将反应混合物用水(3L)稀释并用CH2Cl2萃取(3x500ml)。将合并的萃取物用水和盐水洗涤，然后干燥(MgSO4)，过滤并浓缩以得到为淡黄色油状物的4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基酯(612)(140g，84％)。Rf(0.57，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤2.制备2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇613
将612(140g，403mmol)在DMF(880ml)中的溶液用叠氮化钠(131g，2.02mol)处理并加热(45℃)过夜。在减压下除去大部分DMF并且将残余物溶解于CH2Cl2(500ml)中并用盐水洗涤(3x500ml)，接着干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。使残余物通过短的二氧化硅床(5％MeOH-CH2Cl2)并浓缩以得到为黄色油状物的2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇613(65g，74％)。Rf(0.56，10％MeOH-CH2Cl2)。
方案104制备化合物619a-619c
Figure BDA0003143117940002241
步骤1.制备(3R,4R,5R,6R)-6-(羟甲基)-3-(((E)-4-甲氧基亚苄基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三醇616
在室温下将D-半乳糖胺HCl(614)(9g，41.7mmol)在1M NaOH溶液中搅拌。添加茴香醛(51ml，420mmol)并且将反应物剧烈搅拌，直到固化。将固体反应物在4℃下保持16h。添加冰冷的水(200ml)并且通过过滤收集所得固体，用冰冷的EtOH/Et2O(1:1)洗涤。将固体干燥至恒定重量，以得到(3R,4R,5R,6R)-6-(羟甲基)-3-(((E)-4-甲氧基亚苄基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三醇(616)(9.81g，78％)。
步骤2.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(((E)-4-甲氧基亚苄基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯617
在0℃下，将(3R,4R,5R,6R)-6-(羟甲基)-3-(((E)-4-甲氧基亚苄基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三醇(616)(9.81g，30mmol)在吡啶中搅拌。添加乙酸酐(34ml)，接着添加DMAP(100mg，催化剂)并且将反应物搅拌16h，使其缓慢升温至室温。将所得溶液倒在碎冰上并在4℃下保持16h。用EtOAc(x 3)萃取反应物并且将合并的有机物用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩，以得到三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(((E)-4-甲氧基亚苄基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯(617)(6.0g，43％)。
步骤3.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯盐酸盐618
将三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(((E)-4-甲氧基亚苄基)氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯(617)(6.0g，43％)在回流下在丙酮(300ml)中加热。添加HCl(水溶液)(5N，3.0ml)并将反应物搅拌15min。在冷却之后，添加Et2O(400ml)并且将反应物在4℃下保持16h。通过过滤收集所得固体，用冰冷的Et2O洗涤两次。将固体干燥至恒定重量以得到三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯盐酸盐(618)(4.17g，84.4％)。
步骤4a.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯619a
在室温下，将三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯盐酸盐(618)(13.5g，35.2mmol)和TEA(7.83g，77.4mmol)在DCM中搅拌。逐滴添加在DCM中的TFAA(8.13g，38.7mmol)并将反应物搅拌1h。将反应物用DCM稀释，顺序地用1M HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯(619a)(9.64g，61.8％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤4b.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-丙酰氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯619b
使用丙酸酐代替TFAA以与三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯(619a)类似的方式制备此化合物，以得到三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-丙酰氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯(619b)(1.2g，85.3％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤4c.制备三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2-二氟丙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯619c
在室温下，将三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯盐酸盐(618)(15.34g，39.98mmol)、2,2-二氟丙酸(4.4g，39.98mmol)、HATU(24.37g，64mmol)和TEA(12.14g，120mmol)在DMF中搅拌16h。使反应物在EtOAc与水之间分配。将有机物分离，顺序地用1M HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱((3％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2-二氟丙酰氨基)-四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯(619c)(15.8g，90％)。产物通过
MS(ESI+ve)证实。
方案105制备化合物624
Figure BDA0003143117940002271
步骤1.制备(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯622
将氨基醇(620)(313.6g，2.1mol)在THF(3.5L)中的溶液用N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(621)(550g，2.21mol)分批处理。一旦反应完成(18h)，在减压下除去THF并且将残余物溶解于CH2Cl2(2.5L)中，接着用相等体积的HCl(1M)、NaHCO3(饱和水溶液)、H2O和盐水洗涤。将有机萃取物干燥(MgSO4)、过滤并浓缩。对粗材料(600g)进行色谱(4kg二氧化硅；1-12％CH3OH-CH2Cl2)以得到为澄清的黄色粘稠油状物的HO-Trig-NHZ(622)(468g，78％)。
步骤2.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯623
将半乳糖胺五乙酸酯(715.2g，1.84mol)和HO-Trig-NHZ(622)(400g，1.41mol)在1,2二氯乙烷(10L)中的异质混合物用5mol％Sc(OTf)3(34.6g，70.5mmol)处理并加热(85℃)。在搅拌(5.5h)之后，溶液变得澄清且同质，将反应物冷却并用NaHCO3(饱和水溶液)、HCl(1M)、H2O和盐水洗涤。将有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤并浓缩。将粗材料(900g)用EtOAc(900ml)处理，得到乳状异质混合物，将其通过粗玻璃料(course frit)过滤，从而除去残余的五乙酸酯。浓缩滤液，并且对粗材料进行色谱(5kg二氧化硅；0-10％CH3OH-EtOAc)以得到为浅棕色泡沫的糖基化产物(623)(751g，87％)。
步骤3.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯624
将Gal-trig-NHZ(623)(750g，1.22mol)、TFA(103.8ml，1.35mol)和Pd/C(10％-潮湿支持体，75g)的溶液用H2吹扫。在剧烈搅拌(4.5h)之后，将反应混合物用N2(30min)吹扫，接着通过硅藻土过滤并浓缩。所得棕色泡沫(712g，99％)不经进一步处理即用于下一步骤。
方案106制备化合物634
Figure BDA0003143117940002281
Figure BDA0003143117940002291
步骤1.制备2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇625
在室温下，将2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(613)(70.0g，318mmol)在MeOH中搅拌。将反应物经10％PD-C(7g)氢化16h。将反应物通过硅藻土过滤并真空浓缩以得到2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(625)(61.4g，100％)，其不经进一步纯化即使用。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤2.制备(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-氨基甲酸苄基酯627
在5℃下，将2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-醇(625)(61.4g，318mmol)在具有Na2CO3(50.51g，476mmol)的H2O(500ml)中搅拌。逐滴添加在THF(480ml)中的氯甲酸苄基酯(626)(65.0g，381mmol)并且将反应物搅拌16h，使其升温至室温。真空除去THF并用EtOAc(×3)萃取水层。将合并的有机物干燥(Na2SO4)，真空浓缩并且通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯(627)(23.6g，22.7％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤3.制备(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)氨基甲酸苄基酯628
在室温下，将(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(627)(23.6g，72.1mmol)和TEA(7.7g，75.7mmol)在DCM中搅拌。添加DMTr-Cl(25.65g，75.7mmol)并且将反应物在室温下搅拌2h。将反应物顺序地用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(50％EtOAc/己烷)纯化残余物，以得到(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)氨基甲酸酯(v28)(25.5g，56.2％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤4.制备(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸苄基酯629
在0℃下，将(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)氨基甲酸酯(628)(25.5g，40.5mmol)和MeI(46.0g，324mmol)在无水THF中搅拌。添加NaH(60％在矿物油中的分散体)(2.92g，121.5mmol)并且在0℃搅拌反应物，接着在室温下搅拌1h。使反应物在EtOAc与H2O之间分配。将有机物分离，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(50％EtOAc/己烷)纯化残余物，以得到(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸苄基酯(629)(26.06g，100％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤5.制备(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸苄基酯630
在室温下，将(1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基-2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)(甲基)氨基甲酸苄基酯(629)(26.06g，40.5mmol)在DCM中搅拌。添加TFA(5.1g，44.5mmol)并搅拌1h。添加另外2当量的TFA并搅拌反应物16h。真空浓缩反应物并且通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物以得到(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸苄基酯(630)(6.76g，48.9％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤6.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((4-甲基-3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯631
将(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸酯(630)(6.76g，19.8mmol)、三乙酸(3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯(7.71g，19.8mmol)和Sc(III)OTf(0.49g，1.0mmol)在回流下在DCE中加热2h。在冷却之后，将反应物用TEA淬灭并且顺序地用1M HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱纯化残余物以得到二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((4-甲基-3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(631)(9.37g，70.6％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤7.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-3-甲基-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯632
在室温下，将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((4-甲基-3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(631)(9.37g，14.0mmol)和TFA(1.76g，15.4mmol)在MeOH中搅拌。将反应物经10％Pd-C(1g)氢化大约2h。将反应物通过硅藻土过滤并真空浓缩以得到二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-3-甲基-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(632)(9.0g，98.9％)。产物不经纯化即使用。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤8.制备(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((4-硝基-1,2-亚苯基)双(2-甲基-1-氧代-5',8',11'-三氧杂-2'-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯634
在室温下，将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-3-甲基-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(32)(4.5g，6.93mmol)、4-硝基邻苯二甲酸(33)(0.73g，3.46mmol)、HATU(8.45g，22.18mmol)和TEA(4.21g，41.6mmol)在DCM中搅拌16h。将反应物用DCM稀释，并且顺序地用1M HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速柱色谱(10％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((4-硝基-1,2-亚苯基)双(2-甲基-1-氧代-5',8',11'-三氧杂-2'-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(634)(5.0g，57.4％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
方案107制备化合物643
Figure BDA0003143117940002331
Figure BDA0003143117940002341
步骤1.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯
在室温下，将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(45.0g，70.8mmol)和Na2CO3(11.3g，106mmol)在THF/H2O(50:50)中搅拌。逐滴添加氯甲酸苄基酯(626)(14.5g，85mmol)并将反应物搅拌16h。真空除去THF并用EtOAc(×3)萃取水溶液。将有机物顺序地用1M HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物以得到二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(635)(25.12g，54％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤2.制备(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯636
在室温下，将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(635)(25.12g，38.3mmol)在空气密封的反应容器中在处于MeOH中的7N氨溶液中搅拌16h。使反应物在50℃下蒸发，以除去氨并且真空浓缩残留物以得到(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯(636)(20.3g,100％)，其不经进一步纯化即用于后续反应。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤3.制备(2-(2-(2-(2-(((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(羟甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯637
在室温下，将(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯(636)(20.3g，38.3mmol)在DMF(200ml)中搅拌。添加2,2-二甲氧基丙烷(274g，1.6mol)和pTsOH(催化剂)并将反应物在65℃下加热16h。将反应物冷却至室温，添加TEA(20ml)并搅拌30min。真空除去溶剂，将残余物溶解于MeOH/H2O(10:1)中并使反应物回流1h。将反应物真空浓缩(与甲苯(×2)共沸，并通过自动快速色谱(10％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到(2-(2-(2-(2-(((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(羟基-甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯(637)(24.9g，100％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤4.制备4-甲基苯磺酸((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-2,2-二甲基-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-4-基)甲基酯638
在0℃下，将(2-(2-(2-(2-(((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(羟甲基)-2,2-二甲基-四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯(637)(25.5g，44.8mmol)和TEA(9.97g，98.5mmol)在DCM中搅拌。添加在DCM中的对甲苯磺酰氯(18.8g，98.5mmol)并将反应物搅拌16h，使其升温至室温。将反应物用DCM稀释，顺序地用1M HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到4-甲基苯磺酸((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-2,2-二甲基-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-4-基)甲基酯(638)(25.5g，78.8％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤5.制备(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(叠氮基甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲酸苄基酯639
将4-甲基苯磺酸((3aR,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-2,2-二甲基-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-4-基)甲基酯(638)(25.0g，34.5mmol)和NaN3(28.7g，434.6mmol)在DMSO/H2O(200ml/20ml)中在100℃下加热12h。将反应物冷却并在EtOAc与饱和NaHCO3之间分配。再进一步萃取水溶液两次，并且将合并的有机物用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(叠氮基甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯(639)(16.1g，78.2％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤6.制备(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯640
在室温下，将(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-(叠氮基甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯(39)(16.1g，27.0mmol)在MeOH(200ml)中搅拌。顺序地添加1-乙炔基-3-甲氧基苯(4.28g，32.4mmol)、三(苄基三唑基甲基)胺(0.72g，1.35mmol)、CuSO4(0.07g，0.27mmol，在1ml H2O中)和抗坏血酸钠(0.53g，2.7mmol，在5ml H2O中)并且将反应物在室温下搅拌16h。真空除去溶剂，将残余物溶解于DCM(200ml)中并用水洗涤。用DCM反萃取水层并且将合并的有机物用盐水洗涤并干燥(Na2SO4)。将反应物真空浓缩并通过自动快速色谱(10％MeOH/EtOAc)纯化残余物，以得到(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯(640)(15.0g，76.4％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤7.制备(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯641
在室温下，将(2-(2-(2-(2-(((3aS,4R,7R,7aR)-7-乙酰氨基-4-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-2,2-二甲基四氢-4H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡喃-6-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸苄基酯(640)(15.0g，20.6mmol)在MeCN(200ml)和1.84％H2SO4(180ml)中搅拌96h。将反应物用EtOAc(3×250ml)萃取，用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩，以得到(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-氨基甲酸苄基酯(641)(11.0g，16.0mmol)。产物以粗产物形式用于后续反应。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤8.制备二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯642
在室温下，将(2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲酸苄基酯(641)(11.0g，16.0mmol)在吡啶(200ml)中搅拌。添加乙酸酐(16.3g，160mmol)并且将反应物在室温下搅拌16h，接着在50℃下搅拌3h。将反应物倒在水中并用DCM(250ml)萃取三次。将合并的有机物用饱和NaHCO3(×2)、1N HCl(×2)、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(642)(10.7g，86.7％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤9.制备二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯643
在室温下，将二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((3-氧代-1-苯基-2,7,10,13-四氧杂-4-氮杂十五烷-15-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(642)(9.06g，11.74mmol)和TFA(1.47g，12.91mmol)在MeOH中搅拌。将反应物经10％Pd-C氢化1h。将反应物通过硅藻土过滤并真空浓缩，以得到二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(643)(8.8g，99.7％)，其不经纯化即用于后续反应。产物通过MS(ESI+ve)证实。
方案108制备化合物654
Figure BDA0003143117940002391
Figure BDA0003143117940002401
Figure BDA0003143117940002411
步骤1.制备全乙酰化的半乳糖胺644
将在吡啶(1.5L)中的D-半乳糖胺盐酸盐(614)(250g，1.16mol)用乙酸酐(1.25L，13.2mol)处理45分钟。在搅拌过夜后，将反应混合物分成三个1L部分。将每个1L部分倒入3L冰水中并混合一小时。混合之后，将固体过滤出来，合并，经液氮冷冻并且接着冻干五天，以得到为白色固体的全乙酰化的半乳糖胺(644)(369.4g，82％)。Rf(0.58，10％MeOH-CH2Cl2)。
步骤2.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯645
将全乙酰化的半乳糖胺(644)(25g，64.21mmol)与三氟甲磺酸钪(1.58g，3.21mmol)一起在无水DCE中在90℃下加热3小时。将反应物冷却至室温，用5ml TEA淬灭并真空浓缩。通过自动柱色谱(2-10％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(645)(27g，76.5％)。产物通过MS证实。
步骤3.制备2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵2,2,2-三氟乙酸盐646
将叠氮化物645(7.12g，13mmol)在EtOAc(150ml)和三氟乙酸(2ml)中的溶液用披钯炭(1.5g，10％w/w湿基)处理。然后将反应混合物用氢气吹扫并剧烈搅拌过夜。用氮气吹扫后，通过硅藻土过滤混合物，用MeOH冲洗。6Rf(0.34，15％MeOH-CH2Cl2)。
步骤4.制备(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-硝基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯648
在室温下，将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(646)(13.25g，20.84mmol)、5-硝基异邻苯二甲酸(647)(2.0g，9.5mmol)、HATU(12.3g，32.21mmol)和TEA(5.75g，59.0mmol)在DCM中搅拌16h。将反应物用DCM稀释，顺序地用1MHCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并真空浓缩。通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-硝基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(648)(4.43g，38.3％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤5.制备(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-氨基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯649
在室温下，将(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-硝基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(648)(26.1g，23.05mmol)在MeOH中搅拌。在室温下，将反应物经10％Pd-C(2.6g)氢化2小时。将反应物通过硅藻土过滤并真空浓缩，以得到(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-氨基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(649)(28.0g，99.9％)，其不经进一步纯化即用于后续反应。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤6.制备二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-6-((1-(3-((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-5-乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)苯基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯651
在室温下，将(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-氨基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(649)(0.5g，0.45mmol)和CBZ-gly(650)(0.09g，0.45mmol)在EtOAc中搅拌。添加T3P(50％在EtOAc中的溶液)(0.29g，0.91mmol)并且将反应物在室温O/N下搅拌。添加另外的T3P(0.3当量)并且将反应物再搅拌1h。将反应物用饱和NaHCO3和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，真空浓缩并且通过自动快速色谱(10％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-6-((1-(3-((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-5-乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)苯基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(651)(0.33g，56.8％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤7.制备(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯652
在室温下，将二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-6-((1-(3-((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-5-乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙酰氨基)苯基)-1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-13-基)氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(651)(3.3g，2.39mmol)和TFA(0.29g，2.51mmol)在MeOH中搅拌。将反应物经10％Pd-C(400mg)氢化两小时，通过硅藻土过滤并真空浓缩以得到(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)-乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(652)(3.21g，98.7％)，其不经进一步纯化即用于后续反应。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤8.制备(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯653
在室温下，将(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(652)(1.0g，0.73mmol)、10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基-吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂(606)(0.45g，0.73mmol)、HATU(0.47g，1.25mmol)和TEA(0.22g，2.2mmol)在DCM中搅拌4h。将反应物用DCM稀释并且顺序地用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-(10-(3-((双(4-甲氧基-苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(653)(1.02g，75.2％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤9.制备4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸654
将(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(2-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)乙酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(653)(1.05g，0.57mmol)、琥珀酸酐(0.28g，2.84mmol)、DMAP(0.35g，2.84mmol)和TEA(0.58g，5.68mm ol)在无水DCE中在60℃下加热2小时。添加MeOH(5ml)并且将反应物再搅拌30min，接着冷却并真空浓缩。将残余物溶解于DCM中并且顺序地用饱和NaHCO3(x 4)、水和盐水洗涤。将有机物干燥(Na2SO4)并真空浓缩以得到4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(654)(1.1g，99.4％)，其作为粗产物用于后续反应。产物通过MS(ESI+ve)证实。
方案109制备化合物656
Figure BDA0003143117940002461
步骤1.制备(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(10-(3-((双(4-甲氧基-苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯655
在室温下，将(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-氨基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(649)(4g，3.36mmol)、10-(3-((双(4-甲氧基苯基)-(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂(6)(2.13g，3.36mmol)、TEA(1ml，6.7mmol)和T3P(50％W/W在EtOAc中的溶液)(4.3g，6.72mmol)在DCM中搅拌16h。将反应物顺序地用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(10％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟基-甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(655)(1.37g，22.5％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤2.制备4-((1-(10-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸656
此化合物以与4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(654)类似的方式制备。
方案110制备化合物657
Figure BDA0003143117940002471
合成3-((((1-(10-((3,5-双((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)羰基)氧基)丙酸657
此化合物以与4-((1-(10-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(654)类似的方式制备
方案111制备化合物666
Figure BDA0003143117940002481
Figure BDA0003143117940002491
步骤1.制备5-(羟甲基)异邻苯二甲酸二甲酯659
在室温下，将苯-1,3,5-三羧酸三甲酯(658)(40g，159mmol)和NaBH4在THF中搅拌。缓慢地逐滴添加在THF(120ml)中的MeOH(30ml)。完成添加后，使反应物回流30min。在冷却后，将反应物用1M HCl淬灭并萃取到EtOAc中。将有机物顺序地用1M HCl、NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(50/50EtOAc/己烷)纯化残余物，以得到5-(羟甲基)异邻苯二甲酸二甲酯(659)(20.5g，53.2％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.59(s,1H),8.23(s,2H),4.81(s,2H),3.95(s,6H)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤2.制备5-(氯甲基)异邻苯二甲酸二甲酯660
使5-(羟甲基)异邻苯二甲酸二甲酯(659)(20.5g，80.5％)在SOCl2(11.1g，94mmol)中回流1.5h。将反应物冷却，用DCM稀释并且顺序地用0.1M NaOH(×2)、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(20％EtOAc/己烷)纯化残余物，以得到5-(氯甲基)异邻苯二甲酸二甲酯(660)(10.84g，53％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(s,1H),8.27(s,2H),4.66(s,2H),3.97(s,6H)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤3.制备5-(叠氮基甲基)异邻苯二甲酸二甲酯661
使5-(氯甲基)异邻苯二甲酸二甲酯(660)(10.84g，45mmol)和NaN3(18g，270mmol)在丙酮/水(3/1)中回流16h。将反应物冷却，真空浓缩并且将残余物溶解于DCM中。将有机物用水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过快速色谱(15％EtOAc/己烷)纯化残余物，以得到5-(叠氮基甲基)异邻苯二甲酸二甲酯(661)(9.84g，88％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(s,2H),8.2(s,2H),4.49(s,2H),3.97(s,2H)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤4.制备5-(叠氮基甲基)异邻苯二甲酸662
在室温下，将5-(叠氮基甲基)异邻苯二甲酸二甲酯(661)(9.84g，39.5mmol)和LiOH(2.1g，87mmol)在THF/H2O/MeOH中搅拌48h。真空除去有机溶剂并用1M HCl酸化残余物。用EtOAc(×3)萃取水溶液并将合并的有机物干燥(Na2SO4)并真空浓缩，以得到5-(叠氮基甲基)异邻苯二甲酸(662)(8.0g，91.6％)，其不经进一步纯化即用于后续反应。
步骤5.制备(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(叠氮基甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯663
在室温下，将5-(叠氮基甲基)异邻苯二甲酸(662)(4.42g，20mmol)、2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵2,2,2-三氟乙酸盐(646)(25g，40mmol)、HATU(24.4g，64mmol)和TEA(17ml，120mmol)在DCM中搅拌16h。将反应物顺序地用1M HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(7％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(叠氮基甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(663)(10.9g，44.5％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤6.制备(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯664
在室温下，将(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(叠氮基甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(663)(10.9g，8.9mmol)和TFA(0.68ml，8.9mmol)在MeOH中搅拌。将反应物经10％Pd-C氢化1h。将反应物通过硅藻土过滤，真空浓缩并且通过自动快速色谱(15％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(664)(6.41g，54.7％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤7.制备(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-((10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯665
在室温O/N下，搅拌(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-(((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(3.0g，2.3mmol)、10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酸锂(665)(1.5g，2.3mmol)、HATU(1.4g，3.7mmol)和TEA(1ml，7.0mmol)。将反应物用DCM稀释，用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩。通过自动快速色谱(5％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R)-(((5-((10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(665)(1.8g，43.0％)。产物通过MS(ESI+ve)证实。
步骤8.制备4-((1-(10-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苄基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸666
此化合物以与4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸(654)类似的方式制备。产物通过MS(ESI+ve)证实。
方案112制备化合物667
Figure BDA0003143117940002521
合成4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸667
此化合物以与654(方案8)类似的方式，使用三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2,2-三氟乙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯代替全乙酰化的半乳糖胺(606)制备。产物通过MS(ESI+ve)证实。
方案113制备化合物668
Figure BDA0003143117940002531
合成4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-3-丙酰氨基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸668
此化合物以与654(方案8)类似的方式，使用三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-丙酰氨基四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯(619b)代替全乙酰化的半乳糖胺(644)制备。产物通过MS(ESI+ve)证实。
方案114制备化合物669
Figure BDA0003143117940002541
合成4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2-二氟丙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸669
此化合物以与654(方案8)类似的方式，使用三乙酸(3R,4R,5R,6R)-6-(乙酰氧基甲基)-3-(2,2-二氟丙酰氨基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三苯甲基酯(619c)代替全乙酰化的半乳糖胺(644)制备。产物通过MS(ESI+ve)证实。
方案115制备化合物670
Figure BDA0003143117940002551
合成4-((1-(10-((2-((3,4-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸670
此化合物以与化合物654(方案8)类似的方式，使用(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((4-硝基-1,2-亚苯基)双(2-甲基-1-氧代-5',8',11'-三氧杂-2'-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(634)代替(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-(((5-硝基-1,3-亚苯基)双(1-氧代-5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷-1,13-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯(648)制备。
方案116制备化合物671
Figure BDA0003143117940002561
合成4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5S,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸671
此化合物以与化合物654(方案8)类似的方式，使用二乙酸(2R,3S,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-((4-(3-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-((1,1,1-三氟-2-氧代-6,9,12-三氧杂-3l4-氮杂十四烷-14-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(643)代替2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵2,2,2-三氟乙酸盐(646)制备。
方案117制备化合物672
Figure BDA0003143117940002571
合成4-((4-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-1,2-二甲基环戊基)甲氧基)-4-氧代丁酸672
此化合物以与化合物654(方案8)类似的方式，使用二乙酸(2R,3R,4R,5R)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-(2-(2-((2,2,2-三氟乙酰基)-l4-氮烷基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(624)代替2-(2-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-铵2,2,2-三氟乙酸盐(646)制备。
方案118制备化合物681
Figure BDA0003143117940002572
Figure BDA0003143117940002581
步骤1.制备12-(苄氧基)-12-氧代十二烷酸676
向十二烷二酸(674)(21.0g，91.3mmol)在DMF(200ml)中的溶液中添加碳酸钾(10g，72.4mmol)和苄基溴(675)(10ml，84.2mmol)。将溶液在80℃下搅拌4小时，冷却至0℃，接着小心地用6M HCl酸化。用水(250ml)稀释并用乙酸乙酯(500ml)萃取。将乙酸乙酯萃取物用盐水(3x250ml)洗涤，在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥。将固体悬浮于二氯甲烷(200ml)中并过滤。将现在富含产物的滤液浓缩，接着在硅胶60上通过柱色谱(梯度：0至10％甲醇/DCM)纯化，以得到为无色固体的12-(苄氧基)-12-氧代十二烷酸6(76)(13g，45％)。
结构通过质谱证实
步骤2.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(12-(苄氧基)-12-氧代十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯678
向二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-氨基苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)-四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(677)(4.0g，3.6mmol)、12-(苄氧基)-12-氧代十二烷酸(676)(1.3g，4.1mmol)和三乙胺(1.5ml，10.8mmol)在二氯甲烷(75ml)中的溶液中逐滴添加T3P(4.5g，～9ml，50％在乙酸乙酯中的溶液)。将溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将反应混合物用二氯甲烷稀释并且小心地用碳酸氢钠的饱和溶液(200ml)淬灭。将两相溶液剧烈搅拌30分钟。将DCM层分离并用二氯甲烷(1x100ml)萃取水相。将合并的萃取物在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱(梯度：0-10％MeOH/DCM)纯化残余物，以得到为无色固体的标题化合物(1.5g，30％)。
步骤3.制备12-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-12-氧代十二烷酸679
向二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲酰基)-5-(12-(苄氧基)-12-氧代十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)-乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(678)(1.5g，1.1mmol)在甲醇(25ml)中的溶液中添加10％披钯炭(湿基，150mg，10％重量/重量)。将溶液用氢气缓慢地喷射1小时。在完成时，将溶液用氮气喷射，通过硅藻土过滤，并在真空中浓缩至干燥，以得到无色固体(1.1g，79％)。
步骤4.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(12-氧代-12-(全氟苯氧基)十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯681
向12-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-12-氧代十二烷酸(679)(0.6g，0.46mmol)和三乙胺(125μL，0.92mmol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液中添加三氟乙酸五氟苯酯(680)(150mg，1.1mmol)。将溶液在室温下搅拌30分钟，然后在真空中浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱(梯度：0至10％甲醇/二氯甲烷)纯化残余物，以得到为无色固体的标题化合物(475mg，70％)。质量(ESI+)m/z 741.0(M+2H)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.52(t,J＝5.6Hz,2H),8.14(d,J＝1.4Hz,2H),7.91(t,J＝1.6Hz,1H),7.80(d,J＝9.2Hz,2H),5.21(d,J＝3.4Hz,2H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,2H),4.54(d,J＝8.5Hz,2H),4.06–3.99(m,7H),3.88(dt,J＝11.2,8.8Hz,2H),3.77(ddd,J＝11.1,5.6,3.9Hz,2H),3.62–3.46(m,22H),3.46–3.38(m,5H),2.77(t,J＝7.2Hz,2H),2.31(t,J＝7.4Hz,2H),2.10(s,7H),1.99(s,7H),1.89(s,7H),1.77(s,7H),1.69–1.54(m,4H),1.40-1.20(m,14H)。质量(ESI+)m/z 741.0(M+2H)。
方案119制备化合物690
Figure BDA0003143117940002611
Figure BDA0003143117940002621
步骤1.制备12-((叔丁氧羰基)氨基)十二烷酸684
将12-氨基十二烷酸(682)(5.0g，23.3mmol)、二碳酸二叔丁酯(683)(6.1g，27.9mmol)和三乙胺(6.3ml，46.6mmol)在甲醇(75ml)中的溶液加热至60℃，持续3h，接着在室温下过夜。在完成时，将溶液在真空中浓缩至干燥并且不经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤2.制备12-((叔丁氧羰基)氨基)十二烷酸苄基酯685
将粗12-((叔丁氧羰基)氨基)十二烷酸(684)(9.0g，30.0mmol)、苄醇(685)(3.1g，30.0mmol)、EDC盐酸盐(6.9g，36.0mmol)和三乙胺(12ml，90.0mmol)在二氯甲烷(100ml)中的溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将溶液用饱和碳酸氢钠溶液(100ml)和盐水(100ml)洗涤。将二氯甲烷溶液在硫酸镁上干燥，过滤并浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱进行纯化(梯度：0至50％乙酸乙酯/己烷)得到为无色固体的标题化合物(2.0g，21％，经两步)。
步骤3.制备12-(苄氧基)-12-氧代十二烷-1-铵三氟乙酸盐687
将12-((叔丁氧羰基)氨基)十二烷酸苄基酯(686)(2.0g，4.9mmol)、二氯甲烷(15ml)和TFA(5ml)的溶液在室温下搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干燥，以得到为粘稠油状物的产物(2.1g，定量)。
步骤4.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(12-((12-(苄氧基)-12-氧代十二烷基)氨基)-12-氧代十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯688
将12-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-12-氧代十二烷酸(688)(750mg，0.54mmol)、12-(苄氧基)-12-氧代十二烷-1-铵三氟乙酸盐(687)(225mg，0.54mmol)、HBTU(210mg，0.54mmol)和二异丙基乙胺(0.3ml，1.62mmol)在二氯甲烷(30ml)中的溶液在室温下搅拌过夜。将溶液用二氯甲烷(50ml)稀释并且用饱和碳酸氢盐溶液(100ml)洗涤。将二氯甲烷在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱(梯度：0至10％甲醇/二氯甲烷)纯化残余物，以得到为无色固体的标题化合物(688)(605mg，70％)。
步骤5.制备12-(12-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-12-氧代十二烷酰氨基)十二烷酸689
如先前所述进行氢化，以得到(689)(350mg，55％)
步骤6.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(12-氧代-12-((12-氧代-12-(全氟苯氧基)-十二烷基)氨基)十二烷酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)-四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯690
如先前所述进行PFP酯形成，以得到所需产物(690)(112mg，23％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.91(s,1H),8.65(t,J＝5.5Hz,1H),8.52(t,J＝5.6Hz,1H),8.23(d,J＝1.5Hz,1H),8.14(t,J＝1.4Hz,2H),7.91(d,J＝1.6Hz,1H),7.80(d,J＝9.2Hz,2H),7.68(t,J＝5.6Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,2H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,2H),4.54(d,J＝8.5Hz,2H),4.07–3.96(m,6H),3.88(dt,J＝11.2,8.9Hz,2H),3.81–3.74(m,2H),3.64–3.36(m,24H),3.15–3.03(m,6H),2.99(q,J＝6.5Hz,2H),2.76(t,J＝7.2Hz,1H),2.31(t,J＝7.4Hz,1H),2.10(s,6H),1.99(s,7H),1.89(s,7H),1.76(s,6H),1.70–1.53(m,3H),1.47(q,J＝7.1Hz,2H),1.40–1.10(m,29H)。质量(ESI+)m/z 839.7(M+2H)。
方案120制备化合物694
Figure BDA0003143117940002651
Figure BDA0003143117940002661
步骤1.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(2-(12-(苄氧基)-12-氧代十二烷酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯692
将2-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙-1-铵三氟乙酸盐(691)(1.0g，0.8mmol)、12-(苄氧基)-12-氧代十二烷酸(676)(256mg，0.8mmol)、HBTU(341mg，0.9mmol)和二异丙基乙胺(0.4ml，2.4mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液在室温下搅拌过夜。在完成时，将反应混合物用二氯甲烷(80ml)稀释并且用饱和碳酸氢钠(100ml)洗涤。将溶液在硫酸镁上干燥，过滤并在真空中浓缩至干燥。在硅胶60上通过柱色谱(梯度：0至10％甲醇/二氯甲烷)纯化残余物，以得到为无色固体的标题化合物(0.8g，68％)。
步骤2.制备12-((2-((3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-((2-(2-(2-(((3S,4S,5S,6S)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-12-氧代十二烷酸693
化合物693使用与本文针对类似转化所述的那些类似的条件制备(450mg，60％)。
步骤3.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(2-(12-氧代-12-(全氟苯氧基)十二烷酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯694
化合物694使用与本文针对类似转化所述的那些类似的条件制备(460mg，91％)。质量(ESI+)m/z 1537.8(M+H)。
方案121制备化合物695
Figure BDA0003143117940002681
合成(2R,2'R,3R,3'R,4R,4'R,5R,5'R)-((((((((5-(2-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((((2-氰基乙氧基)(二异丙基氨基)磷烷基)-氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)乙酰氨基)-异邻苯二甲酰基)双(氮烷二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))-双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-6,3,4-三苯甲基)四乙酸酯695
向二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲酰基)-5-(2-(10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯(672)(1.6g，0.9mmol)和二异丙基乙胺(0.4ml，1.8mmol)在无水二氯甲烷(25ml)中的溶液中添加2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.3ml，1.35mmol)。将溶液在室温下搅拌75分钟，然后浓缩至干燥。通过柱色谱(梯度：0至10％MeOH/DCM(0.1％TEA))纯化残余物，以得到为无色固体的产物(1.1g，62％)。31P NMR(400MHz,DMSO-d6):δ146.76(s),146.42(s,2个重叠信号),146.34(s)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),8.54(t,J＝5.6Hz,2H),8.17–8.09(m,3H),7.94(s,1H),7.80(d,J＝9.2Hz,2H),7.39–7.26(m,4H),7.26–7.17(m,6H),6.91–6.83(m,4H),5.21(d,J＝3.4Hz,2H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,2H),4.54(d,J＝8.5Hz,2H),4.02(s,6H),3.93–3.82(m,4H),3.73(s,10H),3.66–3.36(m,35H),3.28–3.06(m,6H),3.06–2.87(m,3H),2.72–2.63(m,J＝11.5,5.8Hz,2H),2.10(m,12H),1.99(s,6H),1.89(s,6H),1.77(s,6H),1.47(d,J＝7.2Hz,4H),1.23(dq,J＝13.9,6.4Hz,18H),1.17–1.04(m,10H),0.98(dt,J＝13.4,5.9Hz,10H)。
方案122制备化合物696
Figure BDA0003143117940002691
步骤1.制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(2-(12-((10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(羟甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸基)氨基)十二烷酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯695
化合物695使用与本文针对类似转化所述的那些类似的条件制备(1.9g，61％)。
步骤2：制备二乙酸(2S,3S,4S,5S)-5-乙酰氨基-6-(2-(2-(2-(3-((2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)-乙氧基)乙基)氨基甲酰基)-5-(2-(12-((10-(3-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-甲基)-4-((((2-氰基乙氧基)(二异丙基氨基)磷烷基)氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-1-基)-10-氧代癸基)氨基)十二烷酰氨基)乙酰氨基)苯甲酰氨基)-乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基酯696
化合物96使用与本文针对类似转化所述的那些类似的条件制备(1.35g，65％)。31PNMR(400MHz,DMSO-d6):δ146.79(s),146.76(s),146.42(s),146.36(s)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),8.54(t,J＝5.6Hz,2H),8.13(dd,J＝6.1,3.5Hz,3H),7.94(s,1H),7.80(d,J＝9.2Hz,2H),7.71–7.65(m,1H),7.39–7.25(m,4H),7.25–7.17(m,4H),6.92–6.83(m,4H),5.21(d,J＝3.4Hz,2H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,2H),4.54(d,J＝8.5Hz,2H),4.07–3.97(m,6H),3.94–3.82(m,4H),3.82–3.74(m,2H),3.73(s,6H),3.62–3.45(m,23H),3.42(m,6H),3.27–2.92(m,14H),2.73–2.62(m,2H),2.10(s,8H),1.99(s,9H),1.89(s,6H),1.77(s,6H),1.52–1.42(m,6H),1.22(d,J＝8.0Hz,24H),1.17(t,J＝7.3Hz,11H),1.09(dt,J＝6.7,3.3Hz,9H),1.03–0.92(m,9H)。
方案123具有偶联在3’末端的寡核苷酸的式I的缀合物的一般合成(化合物673)
Figure BDA0003143117940002711
针对4-((1-(10-((2-((3,5-双((2-(2-(2-(2-(((3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-10-氧代癸酰基)-4-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3,4-二甲基吡咯烷-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸673例示的用于由琥珀酸酯配体合成双齿ASGPr靶向配体的一般方法
使用标准酰胺偶联化学将琥珀酸酯加载到
Figure BDA0003143117940002712
LCAA(长链氨基烷基)CPG(对照孔玻璃)上。将LCAA CPG(2.0g)悬浮于DCM(5ml)和MeCN(7.6ml)中。添加二异丙基碳化二亚胺(100μl)、N-羟基琥珀酰亚胺(110μl，30μM/g)、吡啶(110μL)和656(200mg，0.1mmol)并且将悬浮液在室温下轻轻混合16h。通过过滤回收CPG，用DCM(×3)和MeCN(×3)洗涤并且在高真空下干燥。添加5％乙酸酐/5％N-甲基咪唑/5％吡啶在THF中的溶液并且将悬浮液在室温下搅拌2h。通过过滤回收CPG，用DCM(×3)和MeCN(×3)洗涤并且在高真空下干燥。负载确定为31.3μmol/g(DMTr测定，通过UV/Vis 504nm)。使用标准程序，在自动寡核苷酸合成中采用所得的负载GalNAc的CPG固体支持体。核苷酸去保护和随后从固体支持体上移除(同时伴随半乳糖胺乙酸酯去保护)得到GalNAc-寡核苷酸缀合物673。
实施例27a-27i
使用方案123中所示的一般程序，制备以下缀合物(27a-27i)，其中R3为下表A中所述的修饰的TTR siRNA。
实施例27a
Figure BDA0003143117940002721
MS(+VE)计算值:8184.7；测量值:8184.2
实施例27b
Figure BDA0003143117940002731
MS(+VE)计算值:8212.7；测量值:8211.9
实施例27c
Figure BDA0003143117940002741
MS(+VE)计算值:8212.7；测量值:8212.8
实施例27d
Figure BDA0003143117940002751
MS(+VE)计算值:8096.6；测量值:8097.0
实施例27e
Figure BDA0003143117940002752
MS(+VE)计算值:8499.0；测量值:8498.7
实施例27f
Figure BDA0003143117940002761
MS(+VE)计算值:8284.7；测量值:8283.8
实施例27g
Figure BDA0003143117940002771
MS(+VE)计算值:7596.0；测量值:7596.8
实施例27h
Figure BDA0003143117940002772
实施例27i
Figure BDA0003143117940002781
方案124和125具有偶联在5’末端的寡核苷酸的式I的缀合物的一般合成(化合物698)
使用标准偶联条件，利用有义链寡核苷酸上的磷酸酯/硫代磷酸酯键将五氟苯基酯偶联至C6 5’-氨基修饰物。标准的切割和去保护得到期望的有义链缀合物。例如，使用五氟苯基酯681得到以下缀合物698(方案124)。
Figure BDA0003143117940002791
使用标准亚磷酰胺偶联化学，将亚磷酰胺偶联至有义链末端核苷酸的5’羟基。标准的切割和去保护得到期望的有义链缀合物。例如，使用亚磷酰胺695得到以下缀合物699(方案125)。
Figure BDA0003143117940002801
实施例27j-27k
使用方案124和125中所示的一般程序，制备以下缀合物(27j-27k)，其中R3为下表A中所述的修饰的TTR siRNA。
实施例27j
Figure BDA0003143117940002811
MS(+VE)计算值:8056.7；测量值:8056.1
实施例27k
Figure BDA0003143117940002812
MS(+VE)计算值:8254.0；测量值:8253.5
实施例28与聚合物胶束共同递送的TTR siRNA缀合物的体内测试
在TTR敲低的野生型小鼠模型中测试其中R3为以下表28-1中所述的修饰的TTRsiRNA(配体)的实施例27d的缀合物的体内活性。所述配体是TTR(转甲状腺素蛋白)淀粉样变性的罕见疾病的可能治疗剂。下式的膜去稳定化聚合物：
Figure BDA0003143117940002821
与配体的包括被发现在通过肝细胞进行细胞摄取之后增强缀合物的内体释放。在患有TTR淀粉样变性的那些中，已知转甲状腺素蛋白的错误折叠和聚集与疾病进展相关。通过使用与膜去稳定化聚合物组合的配体，可以减少患者中错误折叠/聚集的蛋白质的量，并且伴随着中止疾病进展的可能结果。
表28-1.化学修饰的TTR siRNA双链体
Figure BDA0003143117940002822
2’-O-甲基核苷酸＝小写字母；2’-氟核苷酸＝大写字母；硫代磷酸酯接头＝s；未修饰＝大写字母
TTR siRNA序列和动物模型均由Nair等J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),第16958–16961页描述。所有动物相关程序均按照书面操作程序、根据加拿大动物护理委员会(CCAC)的良好动物实践指南(Canadian Council onAnimal Care(CCAC)Guidelines on GoodAnimal Practices)进行并且由地方机构动物护理和使用委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee，IACUC)批准。
处理：在第0天，通过在肩胛区中进行皮下注射，向三组雌性C57BL/6小鼠(n＝4)施用与10mg/kg、20mg/kg或30mg/kg聚合物组合的单次0.35mg/kg剂量的配体一次(每只动物1个剂量)。作为对照，两组动物仅施用1.8mg/kg或0.35mg/kg剂量的配体(无聚合物)。仅施用媒介物(PBS)的动物用作阴性对照。
收集：在测试制品施用后的限定时间点(第2、5、7、14和21天)对所有动物进行放血，以确定血浆TTR水平的最大降低和药理学活性的持续时间。
分析：使用Abnova Prealbumin(Mouse)ELISA试剂盒(Cedar Lane,目录号KA2070)根据制造商的说明书确定血浆样品中的TTR蛋白水平。计算各个血浆样品的TTR血浆蛋白值并且确定每组的平均值。由这些平均值，确定相对于对照的TTR蛋白水平(相对于PBS处理动物的％)。
结果：实验数据在表28-2中给出。值代表处理后第2、5、7、14、21和28天的％TTR蛋白水平(相对于PBS对照)。
结论：用与仅仅10mg/kg的聚合物组合的配体处理的动物与仅配体相比表现出靶mRNA的敲低的显著增加。此外，在聚合物的存在下，活性的发作更加快速并且作用的持续时间显著延长。仅以30mg/kg剂量的聚合物处理的小鼠相对于PBS不显示出TTR蛋白的减少。
在存在或不存在各种聚合物量的情况下，单次皮下施用来自表28-1的配体之后小鼠中的血浆TTR蛋白水平。
TTR蛋白数据表示为PBS处理的小鼠的值的百分比。
Figure BDA0003143117940002831
实施例29.以皮下方式与膜去稳定化聚合物共同递送的来自实施例28的配体的剂量滴定
在TTR敲低的野生型小鼠模型中测试来自实施例28的配体的体内活性。下式聚合物：
Figure BDA0003143117940002841
体共同递送。
处理：使用PBS、仅配体(以2.5mg/kg、0.50mg/kg和0.05mg/kg缀合物给药)以及与聚合物组合的配体(缀合物以0.50mg/kg或0.05mg/kg给药并且聚合物以0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg给药)作为单次剂量皮下(肩胛区)处理雌性C57BL/6小鼠(n＝3)。
收集：在测试制品施用后的限定时间点(第1、2、6、9、14和21天)对所有动物进行放血，以确定血浆TTR水平的最大降低和药理学活性的持续时间。
分析：使用Abnova Prealbumin(Mouse)ELISA试剂盒(Cedar Lane,目录号KA2070)根据制造商的说明书确定血浆样品中的TTR蛋白水平。计算各个血浆样品的TTR血浆蛋白值并且确定每组的平均值。由这些平均值，确定相对于对照的TTR蛋白水平(相对于PBS处理动物的％)。
结果：实验数据在表29-1中给出。值代表处理后第1、2、6、9、14和21天的％TTR蛋白水平(相对于PBS对照)。
结论：用与≥10mg/kg的聚合物组合的配体处理的动物相对于仅用配体处理的动物表现出靶mRNA的敲低的显著增加。聚合物的滴定表明，10mg/kg或更大的聚合物剂量增强内体释放，尤其是在较低的缀合物剂量(例如0.05mg/kg)下。当聚合物剂量增加至30mg/kg时，在0.05mg/kg与0.50mg/kg缀合物剂量之间观察到类似的TTR敲低。同样观察到活性的快速发作和作用持续时间的延长。
在存在或不存在各种聚合物量的情况下，单次皮下施用配体之后小鼠中的血浆TTR蛋白水平。
TTR蛋白数据表示为PBS处理的小鼠的值的百分比。
Figure BDA0003143117940002851
所有公布、专利和专利文件均以引用方式并入本文，恰如个别地以引用方式并入。本发明已参考各种具体和优选实施方案和技术加以描述。然而，应当理解，可在保持处于本发明的精神和范围内的同时作出许多变化和修改。

Claims (238)

1.一种用于将核酸递送至细胞的方法，其包括使所述细胞接触1)膜去稳定化聚合物；以及2)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中：A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸；
其中所述膜去稳定化聚合物为式(XX)的聚合物：
T5-L-[PEGMAm-M2 n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w(XX)
其中：
PEGMA为具有2-20个乙二醇单元的聚乙二醇甲基丙烯酸酯残基；M2为选自由以下组成的组的甲基丙烯酸酯残基：
(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；
(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
甲基丙烯酸胆固醇酯残基；
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；以及
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
BMA为甲基丙烯酸丁酯残基；
PAA为丙基丙烯酸残基；
DMAEMA为甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯残基；
m和n各自为大于0的摩尔分数，其中m大于n并且m+n＝1；
q为0.2至0.75的摩尔分数；
r为0.05至0.6的摩尔分数；
s为0.2至0.75的摩尔分数；
q+r+s＝1；
v为1至25kDa；
w为1至25kDa；
T5为靶向部分；并且
L不存在或为连接部分。
2.一种用于将核酸递送至动物体内的靶细胞的胞质溶胶的方法，所述方法包括：向所述动物施用(a)膜去稳定化聚合物，以及(b)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸，其中所述核酸被递送至所述靶细胞的胞质溶胶；
其中所述膜去稳定化聚合物为式(XX)的聚合物：
T5-L-[PEGMAm-M2n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w(XX)
其中：
PEGMA为具有2-20个乙二醇单元的聚乙二醇甲基丙烯酸酯残基；M2为选自由以下组成的组的甲基丙烯酸酯残基：
(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；
(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
甲基丙烯酸胆固醇酯残基；
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；以及
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
BMA为甲基丙烯酸丁酯残基；
PAA为丙基丙烯酸残基；
DMAEMA为甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯残基；
m和n各自为大于0的摩尔分数，其中m大于n并且m+n＝1；
q为0.2至0.75的摩尔分数；
r为0.05至0.6的摩尔分数；
s为0.2至0.75的摩尔分数；
q+r+s＝1；
v为1至25kDa；
w为1至25kDa；
T5为靶向部分；并且
L不存在或为连接部分。
3.一种方法，其包括向动物施用1)膜去稳定化聚合物；以及2)式(X)的核酸缀合物：
A-B-C
(X)
其中A为靶向配体，B为任选的接头，并且C为核酸；
其中所述膜去稳定化聚合物为式(XX)的聚合物：
T5-L-[PEGMAm-M2 n]v-[DMAEMAq-PAAr-BMAs]w(XX)
其中：
PEGMA为具有2-20个乙二醇单元的聚乙二醇甲基丙烯酸酯残基；M2为选自由以下组成的组的甲基丙烯酸酯残基：
(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；
(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
甲基丙烯酸胆固醇酯残基；
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)烷基-甲基丙烯酸酯残基；以及
被一个或多个氟原子取代的(C4-C18)支化烷基-甲基丙烯酸酯残基；
BMA为甲基丙烯酸丁酯残基；
PAA为丙基丙烯酸残基；
DMAEMA为甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯残基；
m和n各自为大于0的摩尔分数，其中m大于n并且m+n＝1；
q为0.2至0.75的摩尔分数；
r为0.05至0.6的摩尔分数；
s为0.2至0.75的摩尔分数；
q+r+s＝1；
v为1至25kDa；
w为1至25kDa；
T5为靶向部分；并且
L不存在或为连接部分。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中A为与所述靶细胞的表面上的分子特异性结合的靶向配体。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中T5特异性地结合所述靶细胞的表面上的分子。
6.如权利要求2或3所述的方法，其中所述核酸缀合物和所述膜去稳定化聚合物分开施用。
7.如权利要求2或3所述的方法，其中所述膜去稳定化聚合物在所述核酸缀合物的施用之后施用。
8.如权利要求2或3所述的方法，其中所述核酸缀合物和所述膜去稳定化聚合物在单一组合物内一起施用。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述靶向配体和T5是不同的，并且(i)特异性地结合相同的细胞表面分子或(ii)特异性地结合所述靶细胞上的不同细胞表面分子。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述靶向配体和T5是相同的并且各自特异性地结合相同的细胞表面分子。
11.如权利要求1-2和4-10中任一项所述的方法，其中所述细胞为分泌细胞、软骨细胞、上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、血细胞、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞或树突细胞。
12.如权利要求1-2和4-10中任一项所述的方法，其中所述细胞为癌细胞、免疫细胞、细菌感染的细胞、病毒感染的细胞，或具有异常代谢活性的细胞。
13.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述靶向配体特异性地结合细胞表面分子，所述细胞表面分子选自由以下组成的组：转铁蛋白受体1型、转铁蛋白受体2型、EGF受体、HER2/Neu、VEGF受体、PDGF受体、整联蛋白、NGF受体、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、叶酸受体和σ受体。
14.如权利要求5-13中任一项所述的方法，其中T5特异性地结合细胞表面分子，所述细胞表面分子选自由以下组成的组：转铁蛋白受体1型、转铁蛋白受体2型、EGF受体、HER2/Neu、VEGF受体、PDGF受体、整联蛋白、NGF受体、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、叶酸受体和σ受体。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述靶向配体包括小分子靶向部分。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述小分子靶向部分为糖、维生素、双膦酸酯或其类似物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述糖选自乳糖、半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺(NAG)、N-乙酰基半乳糖胺衍生物以及甘露糖-6-磷酸(M6P)。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述维生素为叶酸。
19.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述靶向配体包括蛋白质。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质为抗体、肽适体或衍生自所述细胞表面分子的天然配体的蛋白质。
21.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述靶向配体包括肽。
22.如权利要求21所述的方法，其中肽为整联蛋白结合肽、LOX-1-结合肽，以及表皮生长因子(EGF)肽、神经降压素肽、NL4肽或YIGSR层粘连蛋白肽。
23.如权利要求1-2和4-22中任一项所述的方法，其中所述细胞为肝细胞。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述靶向配体特异性地结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述靶向配体包括N-乙酰基半乳糖胺(NAG)残基。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中M2选自由以下组成的组：
甲基丙烯酸2,2,3,3,4,4,4-七氟丁酯残基、
甲基丙烯酸3,3,4,4,5,6,6,6-八氟-5(三氟甲基)己酯残基、
2-甲基丙烯酸2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十五氟辛酯残基、
甲基丙烯酸3,3,4,4,5,5,6,6,6-九氟己酯残基、
甲基丙烯酸3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛酯残基、
甲基丙烯酸1,1,1-三氟-2-(三氟甲基)-2-羟基-4-甲基-5-戊酯残基、甲基丙烯酸2-[(1',1',1'-三氟-2'-(三氟甲基)-2'-羟基)丙基]-3-降冰片基酯残基、
甲基丙烯酸2-乙基己酯残基、
甲基丙烯酸丁酯残基、
甲基丙烯酸己酯残基、
甲基丙烯酸辛酯残基、
甲基丙烯酸正癸酯残基、
甲基丙烯酸月桂基酯残基、
甲基丙烯酸肉豆蔻基酯残基、
甲基丙烯酸硬脂基酯残基、
甲基丙烯酸胆固醇酯残基、
乙二醇苯基醚甲基丙烯酸酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-苯基乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-(1H-咪唑-1-基)乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,环己基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,2-[双(1-甲基乙基)氨基]乙基酯残基、
2-丙烯酸,2-甲基-,3-甲基丁基酯残基、
甲基丙烯酸新戊酯残基、
甲基丙烯酸叔丁酯残基、
甲基丙烯酸3,3,5-三甲基环己酯残基、
甲基丙烯酸2-羟丙基酯残基、
甲基丙烯酸5-壬基酯残基、
甲基丙烯酸2-丁基-1-辛酯残基、
甲基丙烯酸2-己基-1-癸酯残基，以及
甲基丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯残基。
27.如权利要求26所述的方法，其中PEGMA具有4-5个乙二醇单元或7-8个乙二醇单元。
28.如权利要求27所述的方法，其中L包含具有2-20个乙二醇单元的聚乙二醇(PEG)部分。
29.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述膜去稳定化聚合物为式(XXI)的聚合物：
Figure FDA0003143117930000101
其中px为约2至约50的整数，例如约2至约20，例如4至12，例如约8至约16，例如，px为约12，并且py为约2至约20的整数，例如，py为约2至约10的整数，例如，py为约4至约5的整数(例如，4或5)。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000102
其中：
R1a为靶向配体；
L1不存在或为连接基团；
L2不存在或为连接基团；
R2为所述核酸；
环A为不存在、3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
每个RA独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORB、C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基；其中所述C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
RB为氢、保护基、连接至固体支持体的共价键，或连接至与固体支持体结合的连接基团的键；并且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
或其盐。
31.如权利要求30所述的方法，其中：
R1a为靶向配体；
L1不存在或为连接基团；
L2不存在或为连接基团；
R2为所述核酸；
环A为不存在、3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
每个RA独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORB以及C1-8烷基，其任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
RB为氢、保护基、连接至固体支持体的共价键，或连接至与固体支持体结合的连接基团的键；并且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述式(I)的化合物为式(Ia)的化合物：
Figure FDA0003143117930000121
其中：
每个D独立地选自由
Figure FDA0003143117930000122
和-N＝组成的组。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述式(I)的化合物为式(Ib)的化合物：
Figure FDA0003143117930000123
其中：
每个D独立地选自由
Figure FDA0003143117930000124
和-N＝组成的组；并且
每个m独立地为1或2。
34.如权利要求30所述的方法，其中所述式(I)的化合物为式(Ic)的化合物：
Figure FDA0003143117930000125
其中：
E为-O-或-CH2-；
n选自由0、1、2、3和4组成的组；并且
n1和n2各自独立地选自由0、1、2和3组成的组。
35.如权利要求30所述的方法，其中所述式(I)的化合物为式(Ig)的化合物：
Figure FDA0003143117930000131
其中：
G为-N-或-CH-；
L2为任选地被羟基或卤素取代的C1-4亚烷基-O-；并且
n为0、1、2、3、4、5、6或7。
36.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(XXX)的化合物：
Figure FDA0003143117930000132
其中：
R1a为靶向配体；
L1不存在或为连接基团；
L2不存在或为连接基团；
R2为核酸；
B为二价的并且选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000141
其中：
各R’独立地为C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基；其中所述C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基任选地被卤素或羟基取代；
用*标记的化合价连接至L1，或在L1不存在时连接至R1；并且
用**标记的化合价连接至L2，或在L2不存在时连接至R2。
37.如权利要求32所述的方法，所述式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000151
Figure FDA0003143117930000161
其中：
Q1为氢并且Q2为R2；或Q1为R2并且Q2为氢；并且
Z为-L1-R1。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000162
其中：
Q1为氢并且Q2为R2；或Q1为R2并且Q2为氢；并且
Z为-L1-R1。
39.如权利要求34所述的方法，其中所述式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000163
Figure FDA0003143117930000171
其中：Z为-L1-R1。
40.如权利要求30所述的方法，其中所述式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000172
其中Q为-L1-R1；并且
R’为C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基；其中所述C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基任选地被卤素或羟基取代。
41.如权利要求30所述的方法，其中所述式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000173
Figure FDA0003143117930000181
其中Q为-L1-R1。
42.如权利要求30-31中任一项所述的方法，其中A为不存在、苯基、吡咯烷基或环戊基。
43.如权利要求34-35中任一项所述的方法，其中每个RA独立地为羟基或任选地被羟基取代的C1-8烷基。
44.如权利要求34-35中任一项所述的方法，其中每个RA独立地选自由羟基、甲基和-CH2OH组成的组。
45.如权利要求30-44中任一项所述的方法，其中L1通过-NH-、-O-、-S-、-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-O-、-NH-(C＝O)-NH-或-NH-(SO2)-与R1连接。
46.如权利要求30-44中任一项所述的方法，其中L1选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000182
47.如权利要求30-44中任一项所述的方法，其中L1选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000191
48.如权利要求30-44中任一项所述的方法，其中L1选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000192
49.如权利要求30-44中任一项所述的方法，其中L1通过选自由以下组成的组的键与B1连接：-O-、-S-、-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)、-(C＝O)-O-、-NH-(C＝O)-NH-或-NH-(SO2)-。
50.如权利要求30-44中任一项所述的方法，其中L1选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000193
51.如权利要求30-50中任一项所述的方法，其中L2通过-O-与R2连接。
52.如权利要求30-50中任一项所述的方法，其中L2为任选地被羟基取代的C1-4亚烷基-O-。
53.如权利要求30-50中任一项所述的方法，其中L2为-CH2O-、-CH2CH2O-或-CH(OH)CH2O-。
54.如权利要求30-50中任一项所述的方法，其中L2为-CH2-O-或-CH2-CH2-O-。
55.如权利要求30-50中任一项所述的方法，其中L2不存在。
56.如权利要求30-44中任一项所述的方法，其中L1和L2独立地为具有1至50个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
57.如权利要求30-44中任一项所述的方法，其中L1和L2独立地为具有1至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
58.如权利要求30-44中任一项所述的方法，其中L1和L2独立地为具有1至14个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
59.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中所述靶向配体R1包含3-8个糖。
60.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中所述靶向配体R1包含3-6个糖。
61.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中所述靶向配体R1包含3-4个糖。
62.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中所述靶向配体R1包含3个糖。
63.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中所述靶向配体R1包含4个糖。
64.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中所述靶向配体R1具有下式：
Figure FDA0003143117930000211
其中：
B1为包括约1至约20个原子的三价基团，并且与L1、T1和T2共价键合。
B2为包括约1至约20个原子的三价基团，并且与T1、T3和T4共价键合；
B3为包括约1至约20个原子的三价基团，并且与T2、T5和T6共价键合；
T1不存在或为连接基团；
T2不存在或为连接基团；
T3不存在或为连接基团；
T4不存在或为连接基团；
T5不存在或为连接基团；并且
T6不存在或为连接基团。
65.如权利要求64所述的方法，其中T1和T2中的一个不存在。
66.如权利要求64所述的方法，其中T1和T2均不存在。
67.如权利要求64所述的方法，其中T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至50个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
68.如权利要求64所述的方法，其中T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至20个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
69.如权利要求64所述的方法，其中T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至50个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个所述碳原子任选地被-O-或-NRX-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基和氧代基(＝O)。
70.如权利要求64所述的方法，其中T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至20个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-替代，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基和氧代基(＝O)。
71.如权利要求64所述的方法，其中T1、T2、T3、T4、T5和T6中的每一个独立地为不存在或具有1至20个碳原子的支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-替代，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基和氧代基(＝O)。
72.如权利要求64-66中任一项所述的方法，其中T3、T4、T5和T6中的至少一个为：
Figure FDA0003143117930000241
其中：
n＝1、2、3。
73.如权利要求64-66中任一项所述的方法，其中T3、T4、T5和T6中的每一个独立地选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000242
其中：
n＝1、2、3。
74.如权利要求64所述的方法，其中T1和T2中的至少一个为甘氨酸。
75.如权利要求64所述的方法，其中T1和T2中的每一个为甘氨酸。
76.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1为包括1至15个原子的三价基团，并且与L1、T1和T2共价键合。
77.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1为包括1至10个原子的三价基团，并且与L1、T1和T2共价键合。
78.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括(C1-C6)烷基。
79.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括C3-8环烷基。
80.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括甲硅烷基。
81.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括D-或L-氨基酸。
82.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括糖。
83.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括磷酸酯基团。
84.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括膦酸酯基团。
85.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括芳基。
86.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括苯基环。
87.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1为苯基环。
88.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1为CH。
89.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1包括杂芳基。
90.如权利要求64-75中任一项所述的方法，其中B1为：
Figure FDA0003143117930000251
91.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2为包括1至15个原子的三价基团，并且与T1、T3和T4共价键合。
92.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2为包括1至10个原子的三价基团，并且与T1、T3和T4共价键合。
93.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括(C1-C6)烷基。
94.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括C3-8环烷基。
95.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括甲硅烷基。
96.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括D-或L-氨基酸。
97.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括糖。
98.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括磷酸酯基团。
99.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括膦酸酯基团。
100.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括芳基。
101.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括苯基环。
102.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2为苯基环。
103.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2为CH。
104.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2包括杂芳基。
105.如权利要求64-90中任一项所述的方法，其中B2选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000271
106.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3为包括1至15个原子的三价基团，并且与T2、T5和T6共价键合。
107.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3为包括1至10个原子的三价基团，并且与T2、T5和T6共价键合。
108.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括(C1-C6)烷基。
109.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括C3-8环烷基。
110.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括甲硅烷基。
111.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括D-或L-氨基酸。
112.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括糖。
113.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括磷酸酯基团。
114.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括膦酸酯基团。
115.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括芳基。
116.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括苯基环。
117.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3为苯基环。
118.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3为CH。
119.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3包括杂芳基。
120.如权利要求64-105中任一项所述的方法，其中B3选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000281
121.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中R1为：
Figure FDA0003143117930000282
122.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中R1为：
Figure FDA0003143117930000291
其中：
G为-NH-或-O-；
RC为氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C6)烷酰基、(C3-C20)环烷基、(C3-C20)杂环、芳基、杂芳基、单糖、二糖或三糖；并且其中所述环烷基、杂环、芳基、杂芳基和糖任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羧基、羟基、氨基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基。
123.如权利要求122所述的方法，其中RC为：
Figure FDA0003143117930000292
124.如权利要求122所述的方法，其中RC为：
Figure FDA0003143117930000293
125.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中R1为：
Figure FDA0003143117930000301
126.如权利要求122-125中任一项所述的方法，其中G为-NH-。
127.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中R1为：
Figure FDA0003143117930000302
128.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中R1为：
Figure FDA0003143117930000303
其中每个RD独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C6)烷基、(C9-C20)烷基甲硅烷基、(RW)3Si-、(C2-C6)烯基、四氢吡喃基、(C1-C6)烷酰基、苯甲酰基、芳基(C1-C3)烷基、TMTr(三甲氧基三苯甲基)、DMTr(二甲氧基三苯甲基)、MMTr(单甲氧基三苯甲基)和Tr(三苯甲基)；并且
每个RW独立地选自由(C1-C4)烷基和芳基组成的组。
129.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中R1选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000311
其中：
RS为
Figure FDA0003143117930000321
n为2、3或4；并且
x为1或2。
130.如权利要求30-58中任一项所述的方法，其中R1为-C(H)(3-p)(L3-糖a)p，
其中每个L3独立地为连接基团；p为1、2或3；并且糖a为单糖或二糖。
131.如权利要求130所述的方法，其中每个L3独立地为具有0至50个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
132.如权利要求130所述的方法，其中每个L3独立地为具有1至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
133.如权利要求130所述的方法，其中L3为：
Figure FDA0003143117930000331
134.如权利要求59-120中任一项所述的方法，其中每个糖独立地为：
Figure FDA0003143117930000332
其中：
X为NR3，并且Y选自-(C＝O)R4、-SO2R5和-(C＝O)NR6R7；或X为-(C＝O)-并且Y为NR8R9；
R3为氢或(C1-C4)烷基；
R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；
R10为-OH、-NR8R9或-F；并且
R11为-OH、-NR8R9、-F或5元杂环，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、羟基、羧基、氨基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基。
135.如权利要求59-120中任一项所述的方法，其中每个糖独立地选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000341
136.如权利要求59-120中任一项所述的方法，其中每个糖独立地为：
Figure FDA0003143117930000342
137.如权利要求1-136中任一项所述的方法，其中T5为：
Figure FDA0003143117930000343
其中：
X为NR3，并且Y选自-(C＝O)R4、-SO2R5和-(C＝O)NR6R7；或X为-(C＝O)-并且Y为NR8R9；
R3为氢或(C1-C4)烷基；
R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；
R10为-OH、-NR8R9或-F；并且
R11为-OH、-NR8R9、-F或5元杂环，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、羟基、羧基、氨基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基。
138.如权利要求1-136中任一项所述的方法，其中T5选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000351
139.如权利要求1-136中任一项所述的方法，其中T5为：
Figure FDA0003143117930000352
140.如权利要求130-133中任一项所述的方法，其中糖a为：
Figure FDA0003143117930000353
其中：
X为NR3，并且Y选自-(C＝O)R4、-SO2R5和-(C＝O)NR6R7；或X为-(C＝O)-并且Y为NR8R9；
R3为氢或(C1-C4)烷基；
R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)卤代烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基；
R10为-OH、-NR8R9或-F；并且
R11为-OH、-NR8R9、-F或5元杂环，其任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、羟基、羧基、氨基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)卤代烷基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)卤代烷氧基。
141.如权利要求130-133中任一项所述的方法，其中糖a选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000361
142.如权利要求130-133中任一项所述的方法，其中糖a为：
Figure FDA0003143117930000362
143.如权利要求30所述的方法，其中所述式(I)的化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000371
Figure FDA0003143117930000381
Figure FDA0003143117930000391
Figure FDA0003143117930000401
以及
Figure FDA0003143117930000402
144.如权利要求30所述的方法，其中所述式(I)的化合物为式(Id)的化合物：
Figure FDA0003143117930000411
其中：
R1d选自：
Figure FDA0003143117930000412
以及
Figure FDA0003143117930000413
Xd为C2-10亚烷基；
nd为0或1；
R2d为核酸；并且
R3d为H。
145.如权利要求144所述的方法，其中R1d为：
Figure FDA0003143117930000421
146.如权利要求144所述的方法，其中R1d为：
Figure FDA0003143117930000422
147.如权利要求144-146中任一项所述的方法，其中Xd为C8亚烷基。
148.如权利要求144-146中任一项所述的方法，其中nd为0。
149.如权利要求144-148中任一项所述的方法，其中R3d为H。
150.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为选自由以下组成的组的式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000431
Figure FDA0003143117930000441
151.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为选自由以下组成的组的式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000442
Figure FDA0003143117930000451
152.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为选自由以下组成的组的式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000452
Figure FDA0003143117930000461
Figure FDA0003143117930000471
以及
Figure FDA0003143117930000481
153.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物，所述式(I)的化合物为：
Figure FDA0003143117930000482
154.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000491
155.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000492
156.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000501
157.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000502
158.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000511
159.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000512
160.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000521
161.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000522
162.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000531
163.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000532
164.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000541
165.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000542
166.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为式(I)的化合物：
Figure FDA0003143117930000551
167.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为下式的化合物：
Figure FDA0003143117930000552
其中：
L1不存在或为连接基团；
L2不存在或为连接基团；
R2为核酸；
环A为不存在、3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
每个RA独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORB、C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基；其中所述C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
RB为氢、保护基、连接至固体支持体的共价键，或连接至与固体支持体结合的连接基团的键；并且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
168.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为下式的化合物：
Figure FDA0003143117930000561
其中：
L2不存在或为连接基团；
R2为核酸；
环A为不存在、3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
每个RA独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORB、C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基；其中所述C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
RB为氢、保护基、连接至固体支持体的共价键，或连接至与固体支持体结合的连接基团的键；并且
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
169.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为下式的化合物：
Figure FDA0003143117930000571
170.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为下式的化合物：
Figure FDA0003143117930000581
171.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为下式的化合物：
Figure FDA0003143117930000582
172.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物为下式的化合物：
Figure FDA0003143117930000583
其中：
R1c为糖；
L1c为具有0至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个选自氧代基(＝O)和卤素的取代基取代；
Bc为5-10元芳基或5-10元杂芳基，所述5-10元芳基或5-10元杂芳基任选地被一个或多个独立地选自由以下组成的组的基团取代：卤素、羟基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C3-C6)环烷基和(C3-C6)环烷基(C1-C6)烷基
L2c为具有0至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个选自氧代基(＝O)和卤素的取代基取代；
R2c为糖；
L3c不存在或为连接基团；
Ac为3-20元环烷基、5-20元芳基、5-20元杂芳基或3-20元杂环烷基；
各RAc独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、CN、F、Cl、Br、I、-C1-2烷基-ORa、C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基；其中所述C1-10烷基C2-10烯基和C2-10炔基任选地被一个或多个独立地选自卤素、羟基和C1-3烷氧基的基团取代；
nc为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
L4c不存在或为连接基团；
R3c为核酸；
Rac为氢；并且
L5c为连接基团。
173.如权利要求172所述的方法，其中Bc为5-10元芳基。
174.如权利要求172所述的方法，其中Bc为萘基或苯基。
175.如权利要求172所述的方法，其中Bc为苯基。
176.如权利要求172所述的方法，其中基团：
Figure FDA0003143117930000601
为：
Figure FDA0003143117930000602
177.如权利要求172所述的方法，其中Bc为5-10元杂芳基。
178.如权利要求172所述的方法，其中Bc为吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基、咪唑基、噻唑基、噁二唑基或噁唑基。
179.如权利要求172所述的方法，其中基团：
Figure FDA0003143117930000611
为：
Figure FDA0003143117930000612
180.如权利要求172所述的方法，其中基团：
Figure FDA0003143117930000613
为：
Figure FDA0003143117930000614
181.如权利要求172-180中任一项所述的方法，其中L1c为具有0至20个碳原子的二价的、非支化的饱和烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个选自氧代基(＝O)和卤素的取代基取代。
182.如权利要求172-180中任一项所述的方法，其中L1c为具有0至12个碳原子的二价的、非支化的饱和烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-C(＝O)-或-C(＝O)-NRX-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基。
183.如权利要求172-180中任一项所述的方法，其中L1c为：
–C(＝O)N(H)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、
–C(＝O)N(H)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、
–C(＝O)N(CH3)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，或
–C(＝O)N(CH3)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。
184.如权利要求172-183中任一项所述的方法，其中L2c为具有0至20个碳原子的二价的、非支化的饱和烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个选自氧代基(＝O)和卤素的取代基取代。
185.如权利要求172-183中任一项所述的方法，其中L2c为具有0至12个碳原子的二价的、非支化的饱和烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-C(＝O)-或-C(＝O)-NRX-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基。
186.如权利要求172-183中任一项所述的方法，其中L2c为：
–C(＝O)N(H)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、
–C(＝O)N(H)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-、
–C(＝O)N(CH3)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，或
–C(＝O)N(CH3)-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。
187.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R1c为：
Figure FDA0003143117930000631
其中：
X为NR20并且Y选自-(C＝O)R21、-SO2R22和-(C＝O)NR23R24；或X为-(C＝O)-并且Y为NR25R26；或X为-NR37R38并且Y不存在
R20为氢或(C1-C4)烷基；
R21、R22、R23、R24、R25和R26各自独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基组成的组；
R27为-OH、-NR25R26或-F；
R28为-OH、-NR25R26或-F；
R29为-OH、-NR25R26、-F、-N3、-NR35R36或5元杂环，其任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、羧基、氨基、(C1-C4)烷基、芳基和(C1-C4)烷氧基，其中任何(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素组成的组，并且其中任何芳基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基；
各R35和R36独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素和(C1-C4)烷氧基组成的组；或R35和R36与它们所连接的氮一起形成5-6元杂芳基环，所述杂芳基环任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、芳基和(C3-C6)环烷基，其中任何芳基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团R39取代；
各R37和R38独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基；或R37和R38与它们所连接的氮一起形成5-8元杂环，所述5-8元杂环任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、羧基、氨基、氧代基(＝O)、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基，其中任何(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基任选地被一个或多个独立地选自卤素的基团取代；并且
各R39独立地选自由以下组成的组：(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个独立地选自卤素的基团取代。
188.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R1c为：
Figure FDA0003143117930000641
Figure FDA0003143117930000651
189.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R1c为：
Figure FDA0003143117930000652
190.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R1c为：
Figure FDA0003143117930000653
191.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R1c为
Figure FDA0003143117930000654
192.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R2c为：
Figure FDA0003143117930000661
其中：
X为NR20并且Y选自-(C＝O)R21、-SO2R22和-(C＝O)NR23R24；或
X为-(C＝O)-并且Y为NR25R26；或X为-NR37R38并且Y不存在
R20为氢或(C1-C4)烷基；
R21、R22、R23、R24、R25和R26各自独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基组成的组；
R27为-OH、-NR25R26或-F；
R28为-OH、-NR25R26或-F；
R29为-OH、-NR25R26、-F、-N3、-NR35R36或5元杂环，其任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、羧基、氨基、(C1-C4)烷基、芳基和(C1-C4)烷氧基，其中任何(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素组成的组，并且其中任何芳基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基；
各R35和R36独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由卤素和(C1-C4)烷氧基组成的组；或R35和R36与它们所连接的氮一起形成5-6元杂芳基环，所述杂芳基环任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、芳基和(C3-C6)环烷基，其中任何芳基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团R39取代；
各R37和R38独立地选自由以下组成的组：氢、(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基、(C1-C8)烷酰基、(C1-C8)烷氧羰基、(C1-C8)烷酰氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基；或R37和R38与它们所连接的氮一起形成5-8元杂环，所述5-8元杂环任选地被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自由以下组成的组：卤素、羟基、羧基、氨基、氧代基(＝O)、(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基，其中任何(C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基任选地被一个或多个独立地选自卤素的基团取代；并且
各R39独立地选自由以下组成的组：(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基，其中任何(C1-C8)烷基、(C1-C8)烷氧基和(C3-C6)环烷基任选地被一个或多个独立地选自卤素的基团取代。
193.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R2c为：
Figure FDA0003143117930000671
Figure FDA0003143117930000681
194.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R2c为：
Figure FDA0003143117930000682
195.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R2c为：
Figure FDA0003143117930000683
196.如权利要求172-186中任一项所述的方法，其中R2c为
Figure FDA0003143117930000684
197.如权利要求172-196中任一项所述的方法，其中L3c为具有0至50个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
198.如权利要求172-196中任一项所述的方法，其中L3c为具有1至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
199.如权利要求184-196中任一项所述的方法，其中L3c为具有1至30个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中一个或多个所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个卤素或氧代基(＝O)取代。
200.如权利要求172-196中任一项所述的方法，其中L3c为：
Figure FDA0003143117930000701
201.如权利要求172-196中任一项所述的方法，其中L3c通过-NH-、-O-、-S-、-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-O-、-NH-(C＝O)-NH-或-NH-(SO2)-与B连接。
202.如权利要求172-201中任一项所述的方法，其中L4c为具有0至50个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
203.如权利要求172-201中任一项所述的方法，其中L4c为具有1至20个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中所述烃链中的一个或多个(例如1、2、3或4个)所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个(例如1、2、3或4个)取代基取代，所述取代基选自(C1-C6)烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C1-C6)烷酰基、(C1-C6)烷酰氧基、(C1-C6)烷氧羰基、(C1-C6)烷硫基、叠氮基、氰基、硝基、卤素、羟基、氧代基(＝O)、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基和杂芳氧基。
204.如权利要求172-201中任一项所述的方法，其中L4c为具有1至30个碳原子的二价的、支化或非支化的、饱和或不饱和的烃链，其中一个或多个所述碳原子任选地被-O-、-NRX-、-NRX-C(＝O)-、-C(＝O)-NRX-或-S-替代，并且其中RX为氢或(C1-C6)烷基，并且其中所述烃链任选地被一个或多个卤素或氧代基(＝O)取代。
205.如权利要求172所述的方法，其中基团：
Figure FDA0003143117930000711
选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000712
其中
各R’独立地为C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基；其中所述C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基任选地被卤素或羟基取代。
206.如权利要求172所述的方法，其中基团：
Figure FDA0003143117930000721
选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000722
其中：
各R’独立地为C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基；其中所述C1-9烷基、C2-9烯基或C2-9炔基任选地被卤素或羟基取代；
用*标记的化合价与L3c连接；并且
用**标记的化合价与R3c连接。
207.如权利要求172所述的方法，其中基团：
Figure FDA0003143117930000731
为：
Figure FDA0003143117930000732
208.如权利要求172-204中任一项所述的方法，其中L4c通过-O-与R3c连接。
209.如权利要求172-204中任一项所述的方法，其中R3c通过所述核酸分子的磷酸酯的氧与所述缀合物的其余部分连接。
210.如权利要求172-204中任一项所述的方法，其中R3c通过有义或反义链的5’末端处的磷酸酯的氧与所述缀合物的其余部分连接。
211.如权利要求172-204中任一项所述的方法，其中R3c通过有义或反义链的3’末端处的磷酸酯的氧与所述缀合物的其余部分连接。
212.如权利要求172-204中任一项所述的方法，其中R3c通过有义链的3’末端处的磷酸酯的氧与所述缀合物的其余部分连接。
213.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述式(X)的化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0003143117930000741
Figure FDA0003143117930000751
Figure FDA0003143117930000761
Figure FDA0003143117930000771
Figure FDA0003143117930000781
Figure FDA0003143117930000791
Figure FDA0003143117930000801
214.如权利要求1-213中任一项所述的方法，其中所述核酸为siRNA。
215.如权利要求214所述的方法，其中所述siRNA通过有义链的3’末端与所述式(X)的化合物的其余部分连接。
216.如权利要求214所述的方法，其中所述siRNA通过有义链的5’末端与所述式(X)的化合物的其余部分连接。
217.如权利要求214所述的方法，其中所述siRNA通过反义链的3’末端与所述式(X)的化合物的其余部分连接。
218.如权利要求214所述的方法，其中所述siRNA通过反义链的5’末端与所述式(X)的化合物的其余部分连接。
219.如权利要求214-218中任一项所述的方法，其中所述siRNA通过所述siRNA上的磷酸酯与所述式(X)的化合物的其余部分连接。
220.一种组合物，其包含：
如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；
如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物；以及
药学上可接受的载剂。
221.如权利要求220所述的组合物，其被配制用于通过注射进行施用。
222.如权利要求220所述的组合物，其被配制用于通过皮下注射进行施用。
223.一种用于治疗通过多肽的过表达进行表征的疾病的方法，其包括向患有所述疾病的受试者施用治疗有效量的(a)如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物，其中C为靶向所述过表达多肽的表达的siRNA的残基，以及(b)如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物。
224.一种将siRNA递送至动物的肝脏的方法，其包括向所述动物施用如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物；以及如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；其中所述靶向配体被选择用于促进所述缀合物的肝细胞特异性递送，并且其中所述核酸为所述siRNA。
225.一种治疗动物的乙型肝炎病毒感染的方法，其包括向所述动物施用a)如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物)；其中所述靶向配体被选择用于促进所述缀合物的肝细胞特异性递送，并且其中所述siRNA对于治疗所述乙型肝炎病毒感染是有用的；以及b)如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物。
226.一种试剂盒，其包括：1)如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物；2)如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；以及3)用于将核酸递送至细胞的说明书，其包括使所述细胞与所述核酸缀合物和所述膜去稳定化聚合物接触。
227.一种试剂盒，其包括：1)如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物；2)如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；以及3)用于将核酸递送至受试者体内的靶细胞的胞质溶胶的说明书，这通过向所述受试者施用所述核酸缀合物和所述膜去稳定化聚合物来实现。
228.如权利要求227的试剂盒，其中所述膜去稳定化聚合物是如权利要求1-3和26-29中任一项所述的聚合物。
229.一种试剂盒，其包括：1)如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物；2)如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；以及3)用于将所述核酸缀合物和所述膜去稳定化聚合物施用给动物的说明书。
230.一种如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物；以及一种如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；其用于医学疗法。
231.一种如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；其用于使用与如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物组合的所述核酸能够治疗的疾病的预防或治疗性治疗。
232.如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物的用途，其用于制备用于治疗使用与如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物组合的所述核酸能够治疗的疾病的药物。
233.一种如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；其与如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物非共价缔合。
234.一种如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；其被包含多种如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物的胶束部分或完全包封。
235.一种如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；其被包含多种如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物的胶束部分包封。
236.一种如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；其被包含多种如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物的胶束完全包封。
237.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和如权利要求1-219中任一项所述的式(X)的核酸缀合物；其被包含多种如权利要求1-3和26-29中任一项所述的膜去稳定化聚合物的胶束部分或完全包封。
238.如权利要求1-6和9-221中任一项所述的方法，其中所述核酸缀合物在所述膜去稳定化聚合物的施用之后施用。
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