CN1133646C - 一种电场下蛋白质再折叠装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种电场下蛋白质再折叠装置，包括两个电极板，四个渗透膜；四个渗透膜依次平行置于两个电极板之间，其中第一渗透膜与正电极板之间形成电极腔室，第二渗透膜与第一渗透膜之间形成冲洗腔室，第三渗透膜与第二渗透膜之间形成样品腔室，第四渗透膜与第三渗透膜之间形成冲洗腔室，第四渗透膜与负电极板之间形成电极腔室。本发明的装置，操作灵活、简便，蛋白质再折叠效率高、复性率高，便于进行连续操作，适合工业应用。

Description

一种电场下蛋白质再折叠装置

技术领域：

本发明涉及一种电场下进行蛋白质再折叠的装置，属生物技术领域。

背景技术：

基因工程技术的发展使得蛋白质的异体表达成为生产医药和特殊化学品的新的重要途径。异体表达蛋白质通常需要经过体外折叠形成正确的高级结构从而获得预期的生物活性。大肠杆菌是目前基因工程生产重组蛋白的主要载体，异体蛋白在其中的过量表达可产生无活性的包含体，其优点是可获得高产量，可避免蛋白酶解，特别适宜于生产对宿主细胞有毒的蛋白质。为获得具有天然活性的复性蛋白，首先需要用变性剂将无活性包含体溶解，但同时也破坏了蛋白质的活性结构使蛋白质变性，因此需要再折叠得到正确构象的蛋白。蛋白质折叠分为体内和体外两种类型。体外折叠是通过模拟生物体内条件对变性蛋白质进行折叠的。传统的蛋白质折叠技术主要是稀释法，透析法，其主要原理是稀释用于蛋白变性的变性剂浓度，其缺点是操作时间长，被稀释的蛋白质溶液浓度过低，给后期分离提纯带来困难，没有在蛋白质折叠过程中实现蛋白质和变性剂的分离。将蛋白质折叠与分离相耦合的技术成为一个新的研究热点。其主要研究目标是提高初始变性蛋白的浓度，减少稀释过程的稀释倍数，缩短折叠时间，利用蛋白质分离装置与过程，在实现蛋白质与变性剂分离的同时实现蛋白质折叠。目前这方面已有的研究主要有：Boris Batas[Biotechnology and Bioengineering，Vol.50，1996，p16-23]等人提出利用体积排阻层析的方法来进行蛋白质的折叠复性和分离。实验证明体积排阻层析的介质——复合凝胶起到了减低变性分子局部浓度的作用，他们将此方法与稀释方法进行了比较，表明体积排阻层析更适用于高浓度蛋白质的折叠分离。所选用的模拟蛋白质溶菌酶的最高初始浓度可达到80mg/ml，溶菌酶的收率是63％，比活力的收率可达104％。谷振宇[J of Chromatography A，2001，918(2)：311-318.]等人在凝胶柱中预先形成尿素梯度，让变性溶菌酶通过这一梯度，进行复性，在初始变性蛋白质浓度为17mg/ml是活力收率为90％，整个折叠过程需要约40分钟，操作不连续。

发明内容：

本发明的目的是提出一种电场下蛋白质再折叠装置，利用电场产生的电泳与膜电渗来控制腔室中复性剂的施加速度及变性剂与目标蛋白质的分离速度，在折叠腔室中建立一个沿流动方向的变性剂梯度，实现连续折叠。

本发明提出的电场下蛋白质再折叠装置，包括两个电极板，四个渗透膜；四个渗透膜依次平行置于两个电极板之间，其中第一渗透膜与正电极板之间形成电极腔室，第二渗透膜与第一渗透膜之间形成冲洗腔室，第三渗透膜与第二渗透膜之间形成样品腔室，第四渗透膜与第三渗透膜之间形成冲洗腔室，第四渗透膜与负电极板之间形成电极腔室。

本发明设计的电场下蛋白质再折叠装置，操作灵活、简便，蛋白质再折叠效率高、复性率高，便于进行连续操作，适合工业应用。以蛋白质复性率为基准(以百分比表示)，与已有蛋白质折叠方法进行了比较，见附表1。

                         附表1

      表1电渗建立的变性剂梯度中蛋白质的折叠设备折叠结果

          与稀释法和凝胶色谱法的折叠效果比较

                        电渗建立的变性剂梯度中

溶菌酶浓度  静态氧化    蛋白质的折叠设备          短凝胶柱

  (mg/ml)    复性       脉冲进样      连续进样

0.2mg/ml      /         /              98％          /

1.0mg/ml      77％      93％           81％          73％

2.0mg/ml      /         84％           73％          63％

5.0mg/ml      /         65％           /             61％

10mg/ml       41％      58％           /             44％

附图说明：

图1是本发明设计的电场下蛋白质再折叠装置的结构示意图。

图1中1是正电极板，2是第一渗透膜，3是第二渗透膜，4是第三渗透膜，5是第四渗透膜，6是负电极板。图中的——代表变性蛋白质(去折叠态蛋白质)，

代表复性蛋白质(再折叠态蛋白质)，代表变性剂，□代表氧化还原剂。

具体实施方式：

如图1所示，本发明设计的电场下蛋白质再折叠装置，包括两个电极板1、6，四个渗透膜2、3、4、5。四个渗透膜依次平行置于两个电极板1和6之间。其中第一渗透膜2与正电极板1之间形成电极腔室，第二渗透膜3与第一渗透膜2之间形成冲洗腔室，第三渗透膜4与第二渗透膜3之间形成样品腔室，第四渗透膜5与第三渗透膜4之间形成冲洗腔室，第四渗透膜5与负电极板6之间形成电极腔室。

本发明装置的工作过程为：折叠操作在由膜隔开的5个腔室中进行，含高浓度变性剂的变性蛋白质样品液进入由第三和第四渗透膜组成的中间样品腔室，含低浓度变性剂的复性液分别进入由第一渗透膜和第二渗透膜组成的上冲洗腔室，以及由第三渗透膜和第四渗透膜组成的下冲洗腔室；通过控制外加电场的电压(稳压操作)或电流(恒流操作)，在腔室第二、三渗透膜的电渗作用下，上冲洗腔室中的低浓度变性剂复性液进入中间样品腔室，样品腔室的高浓度变性剂及氧化还原剂等小分子物质通过电渗作用进入下腔室；由于第二、三渗透膜的截留作用蛋白质停留在中间的样品腔室。这样，在沿中间腔室的流动方向上，变性剂浓度逐渐降低，形成变性剂浓度梯度，变性蛋白质通过这一变性剂梯度并在流动过程中完成连续折叠，同时通过中间腔室的变性剂及氧化还原剂被夹带进入下腔室，对蛋白质进行了分离、纯化。

Claims (1)

1、一种电场下蛋白质再折叠装置，其特征在于该装置包括两个电极板，四个渗透膜；四个渗透膜依次平行置于两个电极板之间，其中第一渗透膜与正电极板之间形成电极腔室，第二渗透膜与第一渗透膜之间形成冲洗腔室，第三渗透膜与第二渗透膜之间形成样品腔室，第四渗透膜与第三渗透膜之间形成冲洗腔室，第四渗透膜与负电极板之间形成电极腔室。

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