CN113358764A - 一种提高明月草有效成分的栽培方法及其分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高明月草有效成分的栽培方法及其分析方法,包括以下步骤:(1)明月草种植过程中喷施脱落酸;(2)采样:选取明月草叶片,将采摘下来的叶片用水清洗其表面的泥土后,待烘;(3)样品前处理:将烘干的明月草叶片样品取出,用研磨机研磨成粉末,称取粉末置于顶空瓶中,拧紧瓶口;(4)顶空萃取:将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上平衡,平衡完成后,顶空萃取中的定量环取气体进入到气相色谱‑质谱联用仪后进样口;(5)采用气相色谱‑质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析。本发明的分析方法具有操作简单、成本低、无需溶剂等优势,可在短时间内完成明月草挥发性成分从取样到萃取再到分析检测的整个流程。
Description
技术领域
本发明属于栽培学及化学分析技术领域,具体涉及一种提高明月草有效成分的栽培方法及其分析方法。
背景技术
明月草,又称之为白背三七、白子菜,菊科,菊三七属是一种双子叶生植物,多年生常绿植物,原产于有日本长寿岛之称的八丈岛,在我国云南、广东、广西均有分布。因其喜温暖、怕寒冷,故在阳光充足的环境中生长较快,民间采其茎叶作蔬菜食用。明月草既可作为食品开发,也可做药。研究表明:明月草具有降血糖、降血脂,舒张血管、抗组胺、抗癌、抑制胃酸分泌、增强人体免疫力等功能。
脱落酸是一种逆境响应激素,在植物应对逆境胁迫的过程中发挥着重要的作用。植物次级代谢产物被认为是多数中草药的有效成分,其被认为在多数情况下在植物受到环境胁迫的过程中产生。施用脱落酸则可以模拟植物胁迫过程,促进植物吃剩代谢物质的合成。
气相色谱法是以气体为流动相的色谱方法,利用物质在流动相(气相)和固定相(液相或固相)间分配系数的微小差异进行分离,可对有机化合物进行有效的定量分离分析,但定性分析比较困难。
质谱分析法是使样品中各组分在离子源中发生电离,生成不同质荷比的带正电荷离子,经过加速电场的作用,形成离子束,进入质量分析器,并利用电场和磁场将它们分别聚焦而得到质谱图,从而确定其质量,可进行有效的定性分析。因此,气相色谱法和质谱分析法的有效结合可对复杂的挥发性化合物进行高效的定性和定量分析。
当顶空气相色谱-质谱联用进行检测时,样品挥发性成分可以完成从取样到萃取再到分析检测的整个流程,从而达到短时间内同时分析多种挥发性化合物的目的。近年来,人们对明月草挥发性成分的检测研究甚少。
挥发性化合物的分离和萃取有许多传统方法,例如同时蒸馏萃取法、溶剂萃取法和超临界流体萃取法等,这些方法因采用有机溶剂萃取,易对人体和环境造成极大的影响,以及前处理繁琐等问题,逐渐被人们所不喜。而顶空技术近年来已被广泛应用于食品、药品、大气、土壤和水中挥发性成分的提取,具有操作简单、成本低、无需溶剂等诸多优势,但在使用过程中会受到平衡温度和平衡时间等参数影响,因此如何探究最优的温度和时间,成为了研发的难点。
发明内容
本提供一种提高明月草有效成分的栽培方法及其分析方法,以提高明月草中有效成分的含量并解决现有技术无法快速、简便提取挥发性成分的问题。
为解决以上技术问题,本发明采用以下技术方案:
一种提高明月草有效成分的栽培方法,包括以下步骤:
在明月草种植过程中喷施脱落酸,所述脱落酸的浓度为50~100mg/L。
进一步地,在明月草移摘的第15天,外源喷施50mg/L脱落酸2次或外源喷施100mg/L脱落酸2次,两次喷施间隔为7天。
本发明还提供一种明月草叶片挥发性成分的分析方法,包括以下步骤:
(1)明月草叶片的采样:选取明月草叶片,将采摘下来的叶片用水清洗其表面的泥土后,待烘;
(2)样品前处理:将烘干的明月草叶片样品取出,用研磨机研磨成粉末,称取粉末置于顶空瓶中,拧紧瓶口;
(3)顶空萃取:将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上平衡,平衡完成后,顶空萃取中的定量环取气体进入到气相色谱-质谱联用仪后进样口;
(4)采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析。
进一步地,步骤(2)中称取3.0g粉末置于20mL顶空瓶中。
进一步地,步骤(3)中将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上平衡的条件:在115~130℃下平衡30~75min。
进一步地,将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上平衡的条件:在125℃下平衡60min。
进一步地,步骤(3)中顶空萃取中的定量环取1mL气体进入到气相色谱-质谱联用仪后进样口。
进一步地,步骤(4)中采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析的气相色谱条件:
色谱柱:TG-5SiMS;进样口温度:250℃;载气:纯度≥99.999%的高纯氦气;柱流速1.0mL/min;进样方式:不分流进样;程序升温:初始温度30℃,保持3min,以3℃/min升温至100℃,保持3min,再以8℃/min升温至240℃,保持1min。
进一步地,步骤(4)中采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析的质谱条件:
电离方式:电子电离;电子能量:70e V;离子源温度:300℃;传输线温度:240℃;扫描方式:全扫描;扫描质量范围m/z:35~550amu;溶剂延迟:3.5min。
进一步地,步骤(4)中采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析的质谱库:明月草叶片挥发性成分的定性分析经标准质谱库分析完成。
本发明具有以下有益效果:
(1)本发明建立了一种促进明月草有效成分的栽培方法,首先通过在生长期内喷施一定浓度的脱落酸,模拟植物受到环境胁迫的情况。显著提高了明月草次生代谢产物的含量。研究发现,在明月草移摘的第15天,外源喷施50mg/L脱落酸2次或外源喷施100mg/L脱落酸2次,两次喷施间隔为7天,可显著提高明月草有效成分的含量。
(2)本发明建立了一种采用顶空气相色谱-质谱联用检测分析明月草叶片挥发性成分的方法,首先是利用顶空萃取、进样于一体技术,克服了原有萃取需有机溶剂、操作繁琐的缺点,加之气相色谱质谱联用法具备检测和分析物质的能力,进而对明月草叶片挥发性成分含有情况进行定性评价。
(3)本发明具有操作简单、成本低、无需溶剂等优势,可在短时间内完成明月草挥发性成分从取样到萃取再到分析检测的整个流程。
(4)本发明有助于阐明明月草叶片挥发性物质的种类,为进一步研究明月草代谢物产生机理以及明月草风味和营养品质改良提供一定的科学支持。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的明月草特征代谢物图;
图2是本发明实施例2提供的采用不同萃取温度得到的挥发性成分总离子流图;
图3是本发明实施例3提供的采用不同萃取时间得到的挥发性成分总离子流图;
图4是本发明实施例4提供的采用色谱条件未优化和色谱条件优化进行得到的挥发性成分总离子流图;
图5是本发明实施例5得到的空白总离子流图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
脱落酸作为植物生长调节剂,其作用效果受喷施浓度影响较大,本发明首先对不同脱落酸施用浓度进行了筛选优化,脱落酸作用效果以特征代谢物含量变化来确定,具体步骤如下:
(1)材料
明月草,种植于广西大学农学院农资系网室
(2)仪器与设备
喷壶
(3)农艺措施
在明月草生长期的第15天,进行脱落酸喷施处理。共喷施两次,间隔7天。其他管理措施与常规管理方法相同。
(4)不同脱落酸喷施浓度的比较
设置了10mg/L(处理1)、25mg/L(处理2)、50mg/L(处理3)、100mg/L(处理4)、250mg/L(处理5)、500mg/L(处理6)及清水对照(CK),使用实施例2中的方法对其挥发性成分进行了PCA分析,由其负载图(loading plot)筛选出15个特征代谢物(图1):2-甲基戊醛、烯丙基乙基醚、顺-2-戊烯-1-醇、5-氯戊酸、环戊醇、己醛、海因、4-甲基嘧啶、3-糠醛、3-呋喃甲醇、2,3-二甲基-4-戊烯-2-醇、异戊酸、甲基戊烷、2,6-二甲基吡嗪及异长叶稀酮,并利用积分峰面积对其相对含量进行了分析,结果表明,相较于清水处理,外源喷施脱落酸仅对2个代谢物含量产生了显著的影响(表1),而外源喷施50mg/L及100mg/L可以显著提高顺-2-戊烯-1-醇及3-糠醛的含量。因此在明月草生长期第15天,喷施50mg/L及100mg/L可显著提高明月草有效成分的含量。
表1喷施脱落酸影响的特征代谢物及其含量变化(单位面积/g FW)
实施例2
考虑到萃取温度是影响挥发性成分萃取效果的重要因素之一,本发明首先对不同萃取温度进行筛选优化,萃取效果主要根据明月草挥发性成分总离子流图的峰个数和峰面积来确定,具体步骤如下:
(1)材料
明月草(采摘于广西大学农学院农资网室)。
(2)仪器与设备
顶空气相色谱-质谱联用仪(赛默飞TRIPLUS 300-TRACE 1300-TSQ 9000)、TG-5SiMS(30m×0.25mm,0.25μm,赛默飞公司);20ml螺纹口顶空瓶、银白色开孔拧盖、硅胶隔垫(赛默飞公司);万分之一分析天平。
(3)样品前处理
将放在105℃烘干的明月草叶片样品取出,用研磨机研磨成粉末,称取3.0g粉末置于20mL顶空瓶中,拧紧瓶口。
(4)顶空萃取
将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上,在115~130℃下平衡30min,平衡时间完成后,顶空萃取中的定量环取1mL气体进入到气相色谱-质谱联用仪后进样口。
(5)采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析。
1)气相色谱条件:
色谱柱:TG-5SiMS(30m×0.25mm,0.25μm);进样口温度:250℃;载气:纯度≥99.999%的高纯氦气;柱流速1.0mL/min;进样方式:不分流进样;程序升温:初始温度30℃,保持3min,以6℃/min升温至100℃,再以10℃/min升温至240℃,保持15min。
2)质谱条件:
电离方式:电子电离(EI);电子能量:70e V;离子源温度:300℃;传输线温度:240℃;扫描方式:全扫描;扫描质量范围m/z:35~550amu;溶剂延迟:3.5min(忽略空气峰)
(6)不同萃取温度效果比较
明月草叶片挥发性成分经GC-MS分析鉴定后,得到如图2所示的总离子流图。经由标准质谱库(NIST MS Search 2.3)进行分析,根据峰个数和峰面积筛选最优萃取温度,结果如表2所示。
表2采用不同萃取温度得到的挥发性成分峰个数和峰面积
由表2和图2可以看出,不同萃取温度的挥发性物质数量和含量不尽相同,其中,萃取温度125℃从峰个数和峰面积上说萃取效果都是最好的,明显优于另外的萃取温度,故选取萃取温度125℃作为明月草挥发性成分检测的最优萃取温度。
实施例3
采用实施例2筛选的萃取温度125℃对明月草叶片挥发性成分萃取并进行测定。明月草叶片挥发性成分的测定,具体步骤如下:
(1)材料
明月草(采摘于广西大学农学院农资网室)。
(2)仪器与设备
同实施例2。
(3)样品前处理
同实施例2。
(4)顶空萃取
将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上,在125℃下平衡30/45/60/75min,平衡时间完成后,顶空萃取中的定量环取1mL气体进入到气相色谱-质谱联用仪后进样口。
(5)采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析。
1)气相色谱条件:
同实施例2。
2)质谱条件:
同实施例2。
(6)不同萃取时间效果比较
明月草叶片挥发性成分经GC-MS分析鉴定后,得到如图3所示的总离子流图。经由标准质谱库(NIST MS Search 2.3)进行分析,根据峰个数筛选最优萃取时间,结果如表3所示。
表3采用不同萃取时间得到的挥发性成分峰个数和峰面积
由表3和图3可以看出,不同萃取时间的挥发性物质数量和含量不尽相同,其中,萃取时间60min从峰个数上其萃取效果是最好的,明显优于另外的萃取时间,故选取萃取时间60min作为明月草挥发性成分检测的最优萃取时间。
实施例4
采用实施例2筛选的萃取温度125℃和实施例3萃取时间60min对明月草叶片挥发性成分萃取并进行测定。明月草叶片挥发性成分的测定,具体步骤如下:
(1)材料
明月草(采摘于广西大学农学院农资网室)。
(2)仪器与设备
同实施例2。
(3)样品前处理
同实施例2。
(4)顶空萃取
将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上,在125℃下平衡60min,平衡时间完成后,顶空萃取中的定量环取1mL气体进入到气相色谱-质谱联用仪后进样口。
(5)采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析。
1)气相色谱条件:
色谱柱:TG-5SiMS(30m×0.25mm,0.25μm);进样口温度:250℃;载气:纯度≥99.999%的高纯氦气;柱流速1.0mL/min;进样方式:不分流进样;程序升温:初始温度30℃,保持3min,以3℃/min升温至100℃,保持3min,再以8℃/min升温至240℃,保持1min。
3)质谱条件:
同实施例2。
(6)色谱条件未优化和色谱条件优化效果比较
采用色谱条件未优化和色谱条件优化进行,明月草叶片挥发性成分经GC-MS分析鉴定后,得到如图4所示的总离子流图。经由标准质谱库(NIST MS Search 2.3)进行分析,得到结果如表4所示。
表4实施例4得到的挥发性成分的定性分析
由图4可以看出,采用色谱条件未优化和色谱条件优化进行获得的峰分离效果不尽相同。其中,实施例4的峰分离效果较其它实施例的峰分离效果更好,故选取实施例4的色谱条件作为明月草挥发性成分检测的色谱条件(优化条件)。
实施例5
采用实施例2筛选的萃取温度125℃和实施例3筛选的萃取时间60min对空白样品进行萃取并测定。空白样品的测定,具体步骤如下:
(1)材料
空气
(2)仪器与设备
同实施例2。
(3)顶空萃取
同实施例4。
(4)采用气相色谱-质谱联用对空气成分进行分析。
1)气相色谱条件:
同实施例4。
2)质谱条件:
同实施例4。
(5)得到的空白总离子流图未有其它物质检测出来,如图5所示。
尽管已经描述和叙述了被看作本发明的示范实施例,本领域技术人员将会明白,可以对其作出各种改变和替换,而不会脱离本发明的精神。另外,可以做出许多修改以将特定情况适配到本发明的教义,而不会脱离在此描述的本发明中心概念。所以,本发明不受限于在此披露的特定实施例,但本发明可能还包括属于本发明范围的所有实施例及其等同物。
Claims (10)
1.一种提高明月草有效成分的栽培方法,其特征在于,包括以下步骤:
在明月草种植过程中喷施脱落酸,所述脱落酸的浓度为50~100mg/L。
2.根据权利要求1所述的提高明月草有效成分的栽培方法,其特征在于,在明月草移摘的第15天,外源喷施50mg/L脱落酸2次或外源喷施100mg/L脱落酸2次,两次喷施间隔为7天。
3.一种根据权利要求1或2所述方法栽培得到的明月草叶片挥发性成分的分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)明月草叶片的采样:选取明月草叶片,将采摘下来的叶片用水清洗其表面的泥土后,待烘;
(2)样品前处理:将烘干的明月草叶片样品取出,用研磨机研磨成粉末,称取粉末置于顶空瓶中,拧紧瓶口;
(3)顶空萃取:将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上平衡,平衡完成后,顶空萃取中的定量环取气体进入到气相色谱-质谱联用仪后进样口;
(4)采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析。
4.根据权利要求3所述的明月草叶片挥发性成分的分析方法,其特征在于,步骤(2)中称取3.0g粉末置于20mL顶空瓶中。
5.根据权利要求3所述的明月草叶片挥发性成分的分析方法,其特征在于,步骤(3)中将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上平衡的条件:在115~130℃下平衡30~75min。
6.根据权利要求5所述的明月草叶片挥发性成分的分析方法,其特征在于,将内装有样品的顶空瓶置于顶空样品盘上平衡的条件:在125℃下平衡60min。
7.根据权利要求3所述的明月草叶片挥发性成分的分析方法,其特征在于,步骤(3)中顶空萃取中的定量环取1mL气体进入到气相色谱-质谱联用仪后进样口。
8.根据权利要求3所述的明月草叶片挥发性成分的分析方法,其特征在于,步骤(4)中采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析的气相色谱条件:
色谱柱:TG-5SiMS;进样口温度:250℃;载气:纯度≥99.999%的高纯氦气;柱流速1.0mL/min;进样方式:不分流进样;程序升温:初始温度30℃,保持3min,以3℃/min升温至100℃,保持3min,再以8℃/min升温至240℃,保持1min。
9.根据权利要求3所述的明月草叶片挥发性成分的分析方法,其特征在于,步骤(4)中采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析的质谱条件:
电离方式:电子电离;电子能量:70e V;离子源温度:300℃;传输线温度:240℃;扫描方式:全扫描;扫描质量范围m/z:35~550amu;溶剂延迟:3.5min。
10.根据权利要求3所述的明月草叶片挥发性成分的分析方法,其特征在于,步骤(4)中采用气相色谱-质谱联用对明月草叶片挥发性成分进行定性分析的质谱库:明月草叶片挥发性成分的定性分析经标准质谱库分析完成。
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