KR102340247B1 - 상이한 성숙 단계의 인삼 열매로부터 기능성 성분을 수득하는 방법 - Google Patents

상이한 성숙 단계의 인삼 열매로부터 기능성 성분을 수득하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 진세노사이드 함량 또는 항산화 활성이 증가된 인삼 열매 또는 이의 가공물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 인삼 열매의 주요 유익성분 별로 수율을 극대화할 수 있는 최적의 수확시기에 대한 정보를 제공함으로써 목적하는 성분 또는 사용하고자 하는 용도에 따른 맞춤형 제조방법을 제공함으로써, 고가 작물인 인삼의 경제적 가치를 극대화시킬 수 있다.

Description

상이한 성숙 단계의 인삼 열매로부터 기능성 성분을 수득하는 방법{A Method for Obtaining Functional Components from ginseng berries of different maturation stages}
본 발명은 목적하는 기능성 성분의 수율을 극대화할 수 있는 인삼 열매의 각 성숙 단계를 동정함으로써 인삼 열매의 목적에 맞는 경제적 가치를 극대화시키기 위한 방법에 관한 것이다.
인삼(Ginseng)은 전세계적으로 가장 널리 사용되는 약용 식물 중의 하나로, 특히 아시아와 북미에서 항암, 항당뇨, 신경보호 및 자양강장 활성 등의 약리효과로 인해 가치를 인정받고 있다. 인삼에는 진세노사이드, 알칼로이드, 다당류, 폴리아세틸렌 및 페놀 등 다양한 약리 활성성분이 포함되어 있다. 그러나 다마란(dammarane) 골격을 가지는 구조 글리코시드인 진세노사이드는 인삼의 약리활성에 있어 가장 중요한 성분이다. 이들 화합물은 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 종자 및 열매를 포함하는 인삼의 여러 부위에 분포되어 있다.
그러나, 인삼에서 진세노사이드의 분포가 부위 별로 상이하기 때문에, 각 식물 부위에 따른 약리활성의 차이는 실질적으로 차이가 난다. 인삼 열매(ginseng berry; GB)의 항노화, 항염증, 항산화, 항비만, 항암, 혈당강하 및 아토피 개선 효과가 보고된 바 있다. 최근, 본 발명자들은 GB 추출물이 뿌리에 비해 훨씬 높은 항산화 활성을 가짐을 밝혔다. 이러한 발견은 인삼의 다른 부위보다 GB 추출물에서 진세노사이드 함량이 더 높다는 종래의 보고와 일치한다. 그러나, 생물학적 활성성분 및 기능성 성분이 풍부함에도 GB는 우수한 부위로 간주되지 않는다. GB는 다양한 요소에 영향을 받으나 대개 식물이 성숙한 후 3-4년 뒤 수확된다. 초기에는, 작은 열매가 푸른색이 되었다가 다시 붉은색으로 순차적인 발달단계를 거친다. 분자생물학적 수준에서, 열매의 성숙 및 숙성 과정은 수많은 생물학적 요인 및 환경요인에 의해 영향을 받으면서 성장 조절자, 식물 호르몬 및 역동 대사체군의 복잡한 상호작용을 통해 유전학적으로 조정된다. 식물에서 대사체 변형은 열매의 생장과 성숙에 주된 역할을 한다. 뿐만 아니라 열매에서 대사체의 특성은 감각수용 특성과 기능성성분의 조성을 결정한다.
대사체학은 식물 생장 및 발달을 평가하는 중요한 원리가 되고 있으며, 역동적으로 이화된 대사 화합물의 전반적 분석에 이용된다. 최근, 열매의 생장 및 발달 단계의 구분을 위해 질량 분광분석(MS)-기반의 대사체학적 접근이 이루어지고 있다. 기체 크로마토그래피(GC)-MS, 액체 크로마토그래피(LC)-MS 및 모세관 전기영동(CE)-MS와 같은 고속처리(high-throughput) 기술의 민감도와 정밀성이 향상되면서 복잡한 대사체군의 신속한 스크리닝이 가능해졌다. 이전의 연구로 인삼의 대사체학적 프로파일을 통해 뿌리를 포함한 식물 각 부위에 따른 대사체 수준의 공간적인 격차가 확인되었다. 그러나, GB 생장 및 성숙 단계별로 수반되는 대사체학적 변화는 아직 전반적으로 알려지지 않았다.
본 발명자들은 MS-기반 대사체학적 방법을 이용하여 5개의 서로 다른 GB 성숙단계 동안 발생하는 대사체학적 사건을 파악하였으며, 나아가 대사체군의 변화가 인삼의 기능성 생물활성 성분에 미치는 영향을 분석하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
특허문헌 1. 대한민국 출원 제2016-0151066호
비특허문헌 1. Ji Yeon Oh et al. J Ginseng Res 38(2014)270-277
본 발명자들은 중요 약리활성 성분을 다량 함유하는 고가의 유용 작물인 인삼에 있어서, 생육 시기별 유용 성분의 함량 차이를 무시한 획일적, 비효율적인 수확 및 가공방법에서 벗어나, 유용 성분의 수율을 극대화할 수 있는 새로운 제조 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인삼 열매의 성숙 단계와 관련된 대사체의 증감 경향 및 이로 인한 인삼 열매의 표현형 변화에 대한 정확한 분석을 통해 각 유용 성분별 최적 수득시점에 대한 가이드를 제공함으로써 작물의 경제적 가치를 극대화시킬 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 고함량의 진세노사이드를 포함하는 인삼 열매 또는 이의 가공물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 활성이 증가된 인삼 열매 또는 이의 가공물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 개화일로부터 12일 내지 31일이 경과한 시점에 인삼 열매(Ginseng berry)를 채취하는 단계를 포함하는 고함량의 진세노사이드를 포함하는 인삼 열매 또는 이의 가공물의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 중요 약리활성 성분을 다량 함유하는 고가의 유용 작물인 인삼에 있어서, 생육 시기별 유용 성분의 함량 차이를 무시한 획일적, 비효율적인 수확 및 가공방법에서 벗어나, 유용 성분의 수율을 극대화할 수 있는 새로운 제조 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인삼 열매의 성숙 단계와 관련된 대사체의 증감 경향 및 이로 인한 인삼 열매의 표현형 변화에 대한 정확한 분석을 통해 각 유용 성분별 최적 수득시점에 대한 가이드를 제공함으로써 작물의 경제적 가치를 극대화시킬 수 있음을 발견하게 되었다.
본 명세서에서 용어“채취”는 전체 식물개체(whole plant)의 일부분을 이루는 열매를 인위적으로 분리하여 수집하거나, 또는 자연적으로 전체 식물개체로부터 분리된 열매를 수집하는 것을 의미한다. 따라서, 용어“채취”는 “분리”,“수확”,“수집”.“채집”과 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어“고함량”은 진세노사이드를 비롯한 대사체의 함량이 본 발명에서 지정한 시기적 범위를 벗어난 특정 시기에 채취된 인삼 열매의 대사체 함량과 비교하여 유의하게 높은 것을 의미하며, 구체적으로는 125% 이상인 경우를 의미하고, 보다 구체적으로는 150% 이상인 경우를 의미하며, 가장 구체적으로는 175% 이상인 경우를 의미한다.
본 발명의 방법이 인삼 열매의 가공물을 제조하는 방법일 경우, 본 발명의 방법은 인삼을 채취하는 단계 후 채취한 인삼 열매를 가공하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 명세서에서 용어“가공”은 천연 상태의 원재료에 물성, 성상 또는 조성을 변형시키는 인위적인 물리, 화학적 조작을 가하는 것을 의미하며, 예를 들어 인삼 열매의 분쇄, 인삼 열매의 착즙, 인삼 열매의 추출, 인삼 열매 과육의 착즙 및 인삼 열매 과육의 추출을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "착즙"은 열이나 효소를 가하지 않고 기계적, 물리적인 힘을 가하여 식물 조직, 구체적으로는 인삼 열매의 내부에 포함된 수분 등을 외부로 유출시켜 얻어진 액상의 유체 또는 이러한 유체를 수득하는 과정을 의미한다.
본 명세서에서 용어“추출”은 고체 또는 액체 형태의 천연 원료 중에 함유된 가용성 성분을 용제로 용해하여 분리해내는 조작을 의미하며, 목적하는 성분의 극성에 따라 적합한 추출용매를 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 추출용매는 물 또는 알코올일 수 있으며, 보다 구체적으로는 알코올이고, 보다 더 구체적으로는 C1-C3의 저급 알코올이며, 가장 구체적으로는 C1 알코올(메탄올)이다.
본 발명의 방법으로 수득되는 추출물은 당업계에서 통용되는 조추출물(crude extract)의 의미는 물론, 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 본 발명의 방법으로 수득한 인삼 열매 추출물은 상술한 알코올 추출용매를 이용하여 수득한 결과물 뿐 아니라, 여기에 추가적인 정제과정을 적용한 결과물까지 포괄한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 인삼 열매 추출물에 포함된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 진세노사이드는 노토진세노사이드 Fe, 노토진세노사이드 Fd, 20(S)-진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Re, Ma-진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 노토진세노사이드 R1, 노토진세노사이드 R3, 진세노사이드 Rf 및 노토진세노사이드 R2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
본 발명자들은 개화일로부터의 경과일수 및 외형적 표현형 변화에 기반하여 인삼 열매의 성숙단계를 미성숙 초록(IG), 성숙 초록(MG), 부분적 붉은색(PR), 완전 붉은색(FR) 및 짙은 갈색의 과성숙(OR)의 다섯 단계로 구분하였다. 본 발명에 따르면, 인삼 열매 추출물에 대해 UHPLC-ESI-MS/MS를 이용한 2차 대사체 프로파일링을 수행한 결과 상술한 진세노사이드들의 함량이 IG 및 MG 단계에 고함량이 함유되어 있으며 이후의 성숙단계에서 급감함을 발견함으로써, 면역력 향상 등을 목적으로 진세노사이드 고함량 인삼 열매를 수득하기 위해서는 IG 단계 개시일로부터 MG 단계가 종료되기 전까지 인삼 열매를 채취해야 한다는 가이드를 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 개화일로부터 13일 내지 30일이 경과한 시점에, 보다 구체적으로는 14일 내지 29일이 경과한 시점에 인삼 열매를 채취하는 단계를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 개화일로부터 12일 내지 16일 후 인삼 열매(Ginseng berry)를 채취함으로써 수행된다.
보다 구체적으로는, 이 경우의 진세노사이드는 노토진세노사이드 Fe, 노토진세노사이드 Fd, 20(S)-진세노사이드 Rg3로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
본 발명에 따르면, 상기 3개의 진세노사이드는 IG 및 MG 단계 중에서도 인삼 열매의 가장 초기 성숙단계인 IG(미성숙 초록) 단계에서 가장 고함량을 나타내, 이들 진세노사이드를 목적 물질로 할 경우 개화일로부터 12 내지 16일 후 인삼 열매를 채취함으로써 수율을 극대화할 수 있다. 보다 구체적으로는 개화일로부터 13일 내지 15일이 경과한 시점에, 가장 구체적으로는 14일이 경과한 시점에 인삼 열매를 채취한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 개화일로부터 27일 내지 31일 후 인삼 열매(Ginseng berry)을 채취함으로써 수행된다.
보다 구체적으로는, 이 경우의 진세노사이드는 진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Re, Ma-진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 노토진세노사이드 R1, 노토진세노사이드 R3, 진세노사이드 Rf 및 노토진세노사이드 R2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
본 발명에 따르면, 상기 9개의 진세노사이드는 IG 및 MG 단계 중에서도 인삼 열매의 두 번째 성숙단계인 MG(성숙 초록) 단계에서 가장 고함량을 나타내, 이들 진세노사이드를 목적 물질로 할 경우 개화일로부터 27 내지 31일 후 인삼 열매를 채취함으로써 수율을 극대화할 수 있다. 보다 구체적으로는 개화일로부터 28일 내지 30일이 경과한 시점에, 가장 구체적으로는 29일이 경과한 시점에 인삼 열매를 채취한다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 방법은 상기 가공단계에서 수득한 가공물, 예를 들어 추출물 또는 착즙액에 대한 여과 및 농축단계를 임의의 순서로 추가적으로 포함한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 가공물을 최종적으로 활용하기 전에 여과 및 농축과정을 거침으로써 활용에 적합한 물성과 부피를 만들 수 있다. 구체적으로는, 여과 단계 및 농축 단계가 순차적으로 수행된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 개화일로부터 43일 내지 47일 후 인삼 열매(Ginseng berry)을 채취하는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Re 또는 이들의 조합을 고함량으로 함유하는 인삼 열매 또는 이의 가공물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 인삼 열매 및 이의 가공방법에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따르면, 진세노사이드 Rg1 및 진세노사이드 Re는 인삼 열매의 세 번째 성숙단계인 PR(부분적 붉은색) 단계에서 가장 고함량을 나타내, 이들 진세노사이드를 목적 물질로 할 경우 개화일로부터 43 내지 47일 후 인삼 열매를 채취함으로써 수율을 극대화할 수 있다. 보다 구체적으로는 개화일로부터 44일 내지 46일이 경과한 시점에, 가장 구체적으로는 45일이 경과한 시점에 인삼 열매를 채취한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 개화일로부터 43일 내지 78일 후 인삼 열매(Ginseng berry)을 채취하는 단계를 포함하는 항산화 활성이 증가된 인삼 열매 또는 이의 가공물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 인삼 열매 및 이의 가공방법에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어“항산화 활성”은 특정 유효성분이 생체 내에서 산화반응을 억제하는 활성을 의미하며, 구체적으로는 활성 산소종, 자유라디칼, 과산화수소 등의 산화물질 또는 이들의 작용을 소거 또는 저하시켜 궁극적으로 생체 내 산화적 스트레스를 제거하거나 감소시키는 작용을 총칭하는 의미이다. 인삼 열매 또는 이의 가공물의 항산화 활성이 증가되었다 함은 인삼 열매 또는 이의 가공물 내에 항산화 활성을 가지는 유효성분의 함량이 증가되었다는 것과 동일한 의미이다. 본 명세서에서“항산화 활성을 가지는 유효성분의 함량이 증가”되었다 함은 해당 유효성분이 본 발명에서 지정한 시기적 범위를 벗어난 특정 시기에 채취된 인삼 열매의 동일 유효성분 함량과 비교하여 유의하게 높은 경우를 의미하며, 구체적으로는 125% 이상인 경우를 의미하며, 보다 구체적으로는 150% 이상인 경우를 의미하며, 가장 구체적으로는 175% 이상인 경우를 의미한다.
발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 인삼 열매 또는 이의 가공물은 총 플라보노이드 함량(TFC), 총 페놀계 화합물 함량(TPC), ABTS(2,2-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설포닉애시드)디암모늄염) 및 철환원 항산화능(ferric reducing antioxidant power, FRAP)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지표가 증가된다.
본 발명에 따르면, 인삼 열매 추출물의 ABTS, FRAP, TFC 및 TPC는 PR(부분적 붉은색) 단계에서부터 FR(완전 붉은색) 단계를 거쳐 OR(과성숙) 단계에 이르기까지 크게 증가하였다(도 4). 이에, 산화 관련 질환을 예방 또는 치료하거나 체내 산화 스트레스를 경감시킬 목적으로 인삼 열매를 이용할 경우 개화일로부터 43 내지 78일 후 인삼 열매를 채취함으로써 효과를 극대화할 수 있다. 보다 구체적으로는 개화일로부터 44일 내지 47일이 경과한 시점에, 가장 구체적으로는 45일 내지 76일이 경과한 시점에 인삼 열매를 채취한다.
발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 개화일로부터 74일 내지 78일이 경과한 시점에 인삼 열매(Ginseng berry)을 채취함으로써 수행된다. 보다 구체적으로는 개화일로부터 75일 내지 77일이 경과한 시점에, 가장 구체적으로는 76일이 경과한 시점에 인삼 열매를 채취한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 진세노사이드 함량 또는 항산화 활성이 증가된 인삼 열매 또는 이의 가공물의 제조방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 인삼 열매의 주요 유익성분 별로 수율을 극대화할 수 있는 최적의 수확시기에 대한 정보를 제공함으로써 목적하는 성분 또는 사용하고자 하는 용도에 따른 맞춤형 제조방법을 제공함으로써, 고가 작물인 인삼의 경제적 가치를 극대화시킬 수 있다.
도 1은 인삼 열매(GB)의 발달 및 성숙의 각 단계를 보여주는 그림이다. 형태적 변화는 4년생 Panax ginseng Meyer 열매의 각기 다른 단계에서 수확한 GB를 나타낸다. 다섯 성숙 단계는 통상적인 GB 수확 시기에 따라 3개의 넓은 카테고리로 추가 분류하였다: 수확전 (IG 및 MG), 수확 (PR), 및 수확후 (FR 및 OR) 단계. FR, 완전 붉은색(60일); IG, 미성숙 초록(14일); MG, 성숙 초록(29일); OR, 과성숙 붉은색(76일); PR, 부분적 붉은색(45일).
도 2는 PLS-DA 스코어 곡선(도 2a), 로딩 곡선(도 2b) 및 상대적인 대사체 함량을 평균 배수 변화로 보여주는 열지도를 보여주는 그림(도 2c)으로, GC-TOF-MS 데이터 세트를 이용하여 분석함으로써 각각의 단계에서 수득한 GB 추출물 별 1차 대사체 함량 차이를 보여주는 그림이다. 대사체 번호는 표 S2와 동일하다. 도 2a 및 도 2b에서 GB 성숙 단계는 각각 IG, MG, PR, FR 및 OR에 해당하는 색깔의 삼각형으로 표시하였다. GC-TOF-MS, gas chromatography-time-of-flight-질량 분석; PLS-DA, partial least squares discriminant analysis7; QC, 품질관리.
도 3a는 PLS-DA 점수 플롯, 도 3b는 로딩 플롯, 도 3c는 상대적인 대사체 함량을 평균 배수 변화로 보여주는 열지도를 각각 나타내는 그림으로, 이들은 UHPLC-ESI-MS/MS 데이터 세트를 이용하여 분석함으로써 각각의 단계에서 수득한 GB 추출물 별 2차 대사체 함량 차이를 보여준다. 대사체 번호는 표 S3와 동일하다. GB 성숙 단계는 컬러 삼각형으로 표시하였다. UHPLC-ESI-MS/MS, ultrahigh performance liquid chromatography- 전기분무 ionization-tandem 질량 분석.
도 4는 항산화 활성 테스트 결과를 나타낸다. 상이한 성숙단계에서의 GB 추출물에서, 도 4a는 2,2-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설포닉애시드)디암모늄 염(ABTS), 도 4b는 FRAP(ferric reducing antioxidant power), 도 4c는 인삼 열매의 총 플라보노이드 함량, 도 4d는 인삼 열매의 총 페놀계 화합물의 함량을 각각 나타낸다. 여기서, 각 값은 3배수 실험결과에 대한 평균값이며(n=3), 동일한 문자로 표시된 막대그래프는 Duncan 다중 범위 검정에 의할 때 유의한 차이가 없다(p < 0.05).
도 5는 상이한 성숙단계에서의 GB 추출물의 유의하게 차이나는 대사체의 상대적 양과 항산화 활성(ABTS 및 FRAP), 총 플라보노이드 함량(TFC) 및 총 페놀계 화합물 함량(TPC) 간의 상관분석에 대한 열지도를 보여준다. 각 사각형은 피어슨 상관계수 값(r)을 나타낸다. 붉은색 및 파란색은 각각 양 (0<r<1) 및 음(1<r<0)의 상관관계를 나타낸다. ABTS, 2,2-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설포닉애시드)디암모늄염; FRAP, 철감소 항산화력.
도 6은 상이한 성숙 단계별로 수득한 GB 추출물 중에서 유의하게 구분되는 대사체를 도식적으로 보여주는 그림이다. 각 텍스트의 색은 특정 성숙단계의 GB에서 유의하게 높은 함량을 보이는 대사체를 나타낸다; 초록색: 수확전 단계 (IG 및 MG), 붉은색: 수확 단계 (PR), 보라색: 수확후 단계 (FR 및 OR). 검은 박스의 대사체는 본 발명에서 검출되지 않았다. KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes 및 Genomes; TCA 사이클, 스트르산 사이클.
도 7은 GC-TOF-MS(도 7a) 및 UHPLC-ESI-MS/MS(도 7b)의 데어터 세트에 기반하여 성숙 단계별 인삼 열매 추출물의 PCA 스코어 곡선을 보여주는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
1. 화합물 및 시약
메탄올, 아세토니트릴, 헥산 및 물을 포함하는 HPLC-grade 용매는 Fisher Scientific(Pittsburgh, PA, USA)에서 구매하였다. 본 발명에서 사용된 모든 표준 화합물과 분석등급시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
2. 식물
다섯 개의 상이한 발달 및 숙성 단계의 GB는 대한민국 충청도 금산군에서 재배한 4년생 인삼으로부터 수확하였다. 상이한 단계의 열매는 개화 후 14, 29, 45, 60 및 76일째에 각각 수확하였다. 15일 간격의 5개 시점은 2016년 6월 3일부터 동년 8월 4일까지로 각각 다음과 같다: 미성숙 초록(IG): 14일째 수확한 밝은 녹색 열매, 성숙 초록(MG): 29일째 수확한 어두운 초록 열매, 부분적 붉은색 (PR): 45일째 수확한 밝은 붉은색 열매, 완전 붉은색(FR): 60일째 수확한 어두운 붉은색 열매, 과성숙(OR): 76일째 수확한 어두운 짙은 갈색 열매(도 1). GB는 대개 과피색이 녹색에서 붉은색으로 변할 무렵에 수확하기 때문에, 본 발명자들은 상술한 다섯 단계를 수확전(preharvest)(IG 및 MG), 수확(harvest)(PR) 및 수확후(postharvest) (FR 및 OR) 단계의 보다 넓은 세 개의 카테고리로 추가적으로 분류하였다. 신선하게 수확된 GB는 추가분석을 하기까지 deep-freezing 조건(-20℃)에서 보관하였다. GB는 3일간 동결건조하고 대사체 추출을 위해 혼합기에서 균질화하였다.
3. 시료의 제작
각각의 분쇄된 GB 시료(600 mg)를 6mL 70% 메탄올과 함께 Retsch MM400 믹서 밀(Retsch GmbH, Haan, Germany)을 이용하여 30 Hz/s로 10분간 추출하였다. 이어서, 시료를 초음파 수조(Power Sonic 305; Hwashin Technology Co., Seoul, Korea)에서 5분간 초음파처리하고 17000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 상층액 0.2μm 폴리테트라플루오로에틸렌 필터로 여과하고 고속 진공 농축기(Modulspin 31; Biotron, Incheon, Korea)로 농축하였다. 시료를 최종적으로 수집하여 무게를 재고 70% 메탄올에서 회복시켰다. UHPLC-ESI-MS/MS(ultrahigh performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry), (UPLC-Q-TOF)-MS(ultraperformance liquid chromatography- quadrupole time-of-flight) 및 GC-TOF-MS 분석을 위한 시료의 최종 농도는 50 mg/mL였다. GC-TOF-MS 분석을 위한 시료는 2단계 반응으로 유도체화되었다. 우선, 50 mL 메톡시아민 하이드로클로라이드(피리딘 내 20 mg/mL)를 건조된 시료에 넣고 30℃에서 90분 간 가열하였다. 이후, 50 mL의 유도체화 시약인 MSTFA 50 mL를 시료에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 시료를 데웠다.
품질관리 시료는 각 시료의 혼합물 50 mL에서 수득하였다. 분석 시료는 블록에서 10번 시험된 후 간헐적인 품질관리 분석을 수행함으로써 데이터의 질과 신뢰도를 담보하고자 하였다. 각 GB 시료 추출물마다 생물학적 실험 및 분석 실험을 3회 반복하였다. 유사하게 항산화 활성 분석을 위한 시료제작도 상술한 방법으로 수행하였다.
4. GC-TOF-MS 분석
본 발명자들은 GC-TOF-MS 분석을 위해 Agilent 7693 자동시료주입기 및 TOF Pegasus Ⅲ 질량 분광계(LECO, St. Joseph, MI, USA)가 포함된 Agilent 7890A GC 시스템(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하였다. 대사체는 내부 직경, 필름두께 및 길이가 각각 0.25 mm, 0.25 mm 및 30 m인 Agilent Rtx-5MS 모세관 컬럼(J&W Scientific, Folsom, CA, USA)에서 분리되었다. 유도체화된 시료(1 mL)를 GC-TOF-MS 시스템에 10:1(v/v)의 분할비(split ratio)로 주입하였다. 헬륨을 1.5 mL/min 고정 유속에서 운반기체로 사용하였다. 주입기 온도는 250℃로 유지하고, 이온 온도는 230℃로 설정하였다. 오븐 온도는 2분 동안 75℃를 유지한 뒤 15℃/min의 속도로 300℃까지 상승시킨 후 300℃에서 3분간 유지하였다. 질량 획득 속도는 45-1000 m/z의 질량스캔 범위에서 20 scans/s로 설정하였다. 전자 이온화의 이온화 에너지는 70 eV 였다.
5. UHPLC-ESI-MS/MS 및 UPLC-Q-TOF-MS 분석
본 발명에서는 Dionex UltiMate 3000 RS Pump, RS 자동시료주입기, RS 컬럼 격실 및 RS 다이오드 어레이 검출기(Dionex Corporation, Q6 Sunnyvale, CA, USA)와 접촉하는 전기분무 경계면을 포함하는 LTQ XL 이온 트랩 질량 분광계(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)를 이용하였다. 고정 유속 0.3 mL/min에서 주입부피 10 mL의 시료를 Thermo Scientific Syncronis C18 UHPLC 컬럼(100 mm 2.1mm[i.d.] 1.7mm[입자 크기])에서 분리하였다. 구배 이동상은 용매 A(물 + 0.1% 포름산) 및 용매 B (아세토니트릴 + 0.1% 포름산)로 구성되었다. LC 구배는 10% 용매 B에서 100% 용매 B로 15분간 변화한 뒤 3분간 유지되고 4분 뒤 초기 조건으로 재평형화되었다. 대사체 검출을 위해, 광다이오드 배열 검출기를 200-600 nm의 파장 범위로 설정하고 3차원 장(field)으로 조작하였다. 장비는 150-1500 m/z의 질량 스캔 범위에서 작동시켰다. 작동 파라미터는 다음과 같다: 모세관 온도는 270℃이고, 쉬스(sheath) 기체 흐름 및 보조기체 흐름은 각각 40 및 20 임의 유닛(arbitrary unit)이다. ESI의 양성 이온( 및 음성 이온) 모드의 조건은 다음과 같다: 모세관 전압 45 kV(31 kV), 소스 전압 5V(4.5 V), 튜브렌즈 전압 120V(60 V).
UPLC는 Waters Micromass Q-Tof Premier 질량 분광계와, Waters ACQUITY UPLC tunable UV 검출기, 자동시료주입기 및 2원 용매전달 시스템이 장비된 ACQUITY UPLC 시스템(Waters Corporation, Milford, MA, USA)을 이용하여 수행하였다. 크로마토그래피는 ACQUITY UPLC BEH C18 컬럼(100mm 2.1mm[i.d.] 1.7mm[입자 크기])을 이용하여 유속 0.3 mL/min에서 수행하였다. 이동상은 0.1% 포름산(v/v)과 함께 물(A)과 아세토니트릴(B)을 포함하는데, 초기에는 5% B를 1분간 유지한다. 이동상 구배는 5%에서 100% B로 10분에 걸쳐 증가하며, 100% B를 1분간 유지하고, 5% B로 2분에 걸쳐 감소한 뒤, 1분간 유지시켰다. 시료(5 mL)는 0.3 mL/min 고정 유속으로 주입하였다. 질량 스펙트럼은 100-1500 m/z 범위에 걸쳐 풀-스펙트럼 모드로 기록하였다. 이온 소스 및 탈용매(desolvation) 온도는 각각 100℃ 및 200℃이며 탈용매 기체 유속은 700 L/h로 고정하였다. 양성이온 모드에서 콘 전압은 40 V이고 모세관 전압은 2.8 kV 이였으며, 음성이온 모드에서 콘 전압은 60 V인 반면 모세관 전압은 2.5 kV이다.
6. 데이터 처리 및 통계 분석
MS 미가공 데이터 파일을 ChromaTOF(version 4.44, LECO) 및 Xcalibur 소프트웨어(version 2.2; Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 NetCDF(*.cdf) 포맷으로 변환하였다. NetCDF 파일을 MetAlign 소프트웨어 패키지(http://www.metalign.nl)를 이용하여 프로세싱하여 기준선 수정, 피크 정렬, 피크 검출, 정확한 질량 및 표준화된 피크 강도를 수득하였다[2]. MetAlign의 파라미터는 특정 스케일 요구 및 실험에 사용된 크로마토그래피 및 질량 스펙트럼 조건(표 1)에 따라 설정되었다.
적용된 MetAlign 파라미터 세팅
파라미터 값
GC-MS　 LC-MS
Retention begin (scan nr.) 1 1
Retention end (scan nr.) 9,600 8,600
Maximum amplitude 10,000,000 10,000,000
Peak slope factor (x Noise) 2 1
Peak threshold factor (x Noise) 2 2
Peak threshold (Abs. Value) 80 100
Average peak width at half height (Scans) 40 60
Scaling Options None None
Maximum shift per scan 30 40
Select min nr per peak set 9　 9
시료명과 피크 면적을 변수로 하는 결과 매트릭스는 다변량 통계분석을 위해 SIMCA-P+ 12.0 (Umetrics, Umea, Sweden)을 이용하여 처리하였다. 데이터 세트는 주요 성분 분석(PCA) 및 PLS-DA(partial least squres discriminant) 분석 모델링 전에 로그 변환 및 UV-scaled 되었다. GB의 상이한 성숙 단계를 비교하기 위해 PCA 및 PLS-DA를 수행하였다. PLS-DA 모델을 사용하여 유의하게 차이나는 대사체 중 VIP(variable importance in projection) 값이 1.0을 넘어서고 p값<0.05인 대사체를 선정하였다. Statistica(version 7.0; StatSoft, Tulsa, OK, USA)를 이용하여 상이한 대사체-기반 클러스터에 대한 p값을 측정하였다. 변수는 액상 크로마토그래피-질량 분석 데이터 세트의 MetAlign을 통해 검출하였다.
PASW Statistics 18(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 피어슨 상관계수를 계산하였다. 총 플라보노이드 함량(TFC), 총 페놀계 화합물 함량(TPC) 및 항산화 활성(2,2-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설포닉애시드)디암모늄염[ABTS] 및 철환원 항산화능[ferric reducing antioxidant power, FRAP])에 대한 데이터의 중요도는 일원분산분석 및 SPSS를 이용한 Duncan 다중범위검정으로 결정하였다.
7. 대사체의 동정 및 시각화
GC-TOF-MS로 검출된 대사체를 인-하우스 라이브러리인 표준 화합물 및 National Institute of Standards 및 Technology(NIST MS Search Program, version 2.0, Gaithersburg, MD, USA) 데이터 베이스을 이용하여 존속시간과 질량 분석 데이터을 비교함으로써 동정하였다. 유사하게, UHPLC-ESI-MS/MS로 분석한 대사체를 표준화합물 및 문헌에 기초하여 존속시간, 분자량, 자외선 흡광도, 및 MSn 절편화 패턴을 비교함으로써 동정하였다. 정확한 질량 및 구성 성분은 UPLC-Q-TOF-MS에서 MassLynx(Waters Corporation)를 이용하여 조사하였다. 성숙 단계 간 유의하게 차이나는 대사체의 상대적인 양의 차이는 MultiExperiment Viewer(version 4.8.1, http://www.tm4.org/)로 형성된 열지도를 통해 시각화하였다. 대사체 수준 및 항산화 활성 간 상관 열지도를 생성하는 데도 MultiExperiment Viewer가 사용되었다.
8. ABTS 및 FRAP 어세이를 통한 항산화 활성의 평가
ABTS 자유 라디칼 소거 및 FRAP 어세이 방법은 Lee 등의 방법[1]을 사용하였다. 모든 실험은 GB 추출물에 대한 생물학적 복제시료에 대해 3회 수행하였다 .
9. TFC 및 TPC의 측정
TFC 및 TPC는 Lee 등의 방법을 사용하여 측정하였다[1]. 모든 실험은 GB 추출물에 대한 3배수의 생물학적 복제시료에 대해 수행하였다.
실험결과
1. GB 추출물에 대한 GC-TOF-MS-기반 1차 대사체 프로파일링
GC-TOF-MS를 이용하여 5개의 서로 다른 발달 및 성숙 단계의 GB 추출물에 대한 1차 대사체 프로파일링을 수행하였다. 정렬된 데이터 세트에 대한 다변량 분석은 PCA(도 7a) 및 PLS-DA(도 2A) 모델에서 각 단계별로 GB 추출물에 대한 클러스터 패턴을 나타낸다. PLS-DA 점수 플롯에 기반하여, 서로 다른 성숙 단계의 GB에 대한 1차 대사체 프로파일을 3개의 주요군, 이른바 IG, MG 및 세 개의 성숙(PR, FR 및 OR) 단계의 군으로 군집화하였다. PLS-DA 모델에서 X 및 Y 변수의 관찰된 만족 값은 각각 0.789(R2X) 및 0.989(R2Y)이며, 예측 정확도는 0.972(Q2)이다. 유사한 패턴이 상응하는 PCA(도 7a)에서 관찰되었다. 수확전(IG 및 MG) 단계는 PLS1 (34.9%)을 따라 수확/수확후(PR, FR 및 OR) 단계로 분리하였고 MG는 PLS2(18.2%)를 따라 다른 4개의 단계로부터 분리되었다. PLS-DA 모델을 이용하여 VIP 값>1.0 및 p 값<0.05으로 16개 아미노산 및 아민, 12개 유기산, 11개 당 및 당 유도체 및 4개의 지방산과 그 밖의 대사체를 포함하여 모두 43개의 유의하게 차이나는 대사체가 선정되었다(표 2). 나아가, 유의하게 차이나는 대사체 변수를 상응하는 로딩 플롯에 표시하고(도 2b), 상이한 단계의 GB 추출물에서의 상대적 양도 열지도를 이용하여 표시하였다(도 2c).
각 성숙단계별 인삼 열매의 유의하게 차이나는 대사체 및 GC-TOF-MS로 분석한 이들의 특성.
NO. 대사체 a RT
(분) 		MS MS 절편 b TMS ID c
아미노산 및 아민
1 Alanine 5.44 116 73, 116, 128, 147, 190, 218 2 STD/MS
2 Valine 6.64 144 45, 73, 100, 144, 218, 246 2 STD/MS
3 Ethanolamine 7.15 174 73, 86, 100, 147, 174, 262 3 STD/MS
4 Isoleucine 7.42 158 45, 73, 100, 158, 218, 232 2 STD/MS
5 Proline 7.47 142 45, 59, 73, 100, 142, 216 2 STD/MS
6 Glycine 7.56 174 45, 73, 86, 174, 248, 276 3 STD/MS
7 Serine 8.06 218 73, 100, 147, 188, 204, 218 3 STD/MS
8 Threonine 8.31 219 73, 117, 147, 203, 219, 291 3 STD/MS
9 Aspartic acid 9.45 232 73, 100, 147, 188, 218, 232 3 STD/MS
10 Pyroglutamic acid 9.52 258 59, 73, 147, 156, 230, 258 2 STD/MS
11 γ-Aminobutyric acid 9.54 174 73, 147, 174, 216, 246, 304 3 STD/MS
12 Glutamic acid 10.24 246 73, 100, 128, 230, 246, 348 3 STD/MS
13 Phenylalanine 10.34 218 73, 100, 147, 192, 218, 266 2 STD/MS
14 Glutamine 11.42 156 73, 128, 156, 203, 245, 347 3 STD/MS
15 Lysine 12.47 174 73, 86, 128, 156, 174, 230 4 STD/MS
16 Tryptophan 14.38 202 45, 59, 73, 147, 202, 291 3 STD/MS
유기산
17 Succinic acid 7.58 247 45, 73, 129, 147, 172, 247 2 STD/MS
18 Glyceric acid 7.79 189 73, 103, 133, 189, 205, 292 3 MS
19 Fumaric acid 7.88 247 73, 115, 147, 171, 217, 245 2 STD/MS
20 Malic acid 9.20 233 73, 101, 133, 147, 189, 233 3 STD/MS
21 Threonic acid 9.81 292 73, 117, 147, 220, 292, 409 4 STD/MS
22 Isobarbituric acid 9.87 344 45, 73, 147, 241, 329, 344 3 MS
23 2-Hydroxyglutaric acid 9.88 247 73, 129, 147, 203, 247, 349 3 MS
24 4-Hydroxybenzoic acid 10.30 223 73, 126, 193, 223, 267, 282 2 STD/MS
25 Aconitic acid 11.19 229 73, 133, 147, 211, 229, 285 3 MS
26 Citric acid 11.81 273 73, 133, 147, 183, 211, 273 4 STD/MS
27 Quinic acid 12.11 255 73, 147, 204, 255, 345, 372 5 STD/MS
28 Chlorogenic acid 19.47 345 73, 103, 147, 219, 255, 345 6 STD/MS
당 및 당 유도체
29 Glycerol 7.24 205 73, 103, 117, 133, 147, 205 3 STD/MS
30 Xylose 10.60 103 73, 103, 147, 217, 233, 307 4 STD/MS
31 Arabinose 10.64 217 73, 103, 147, 217, 277, 307 5 STD/MS
32 Xylitol 11.08 217 73, 103, 147, 217, 243, 319 5 STD/MS
33 Ribitol 11.11 129 73, 103, 117, 147, 217, 319 5 STD/MS
34 Fructose 12.22 103 73, 103, 147, 189, 217, 364 5 STD/MS
35 Mannose 12.29 262 73, 103, 147, 217, 307, 364 5 STD/MS
36 Glucose 12.39 201 73, 129, 147, 205, 217, 319 5 STD/MS
37 myo-Inositol 13.65 191 73, 147, 191, 217, 305, 318 6 STD/MS
38 Glyceryl-glycoside 14.91 204 73, 103, 147, 204, 305, 337 6 MS
39 Galactinol 18.41 204 73, 147, 204, 305, 361, 433 9 MS
지방산 및 기타
40 Palmitic acid 13.16 132 73, 117, 132, 201, 285, 313 1 STD/MS
41 Oleamide 15.35 144 55, 75, 116, 131, 198, 338 1 STD/MS
42 Adenosine 16.61 236 73, 103, 147, 192, 236, 280 4 STD/MS
43 Guanosine 17.29 324 73, 103, 245, 280, 324, 368 5 STD/MS
a 컷오프 1.0과 p-값 < 0.05의 VIP(variable importance in projection) 분석에 기반하여 동정된 대사체 bMS 절편은 잠정적인 화합물의 절편을 의미함. c동정
수확전 단계에서 GB 추출물은 아미노산, 특히 알라닌(1), 발린(2), 이소루신(4), 프롤린(5), 글리신(6), 세린(7), 쓰레오닌(8), 아스파르트산(9), 피로글루탐산(10), GABA(11), 페닐알라닌(13), 글루타민(14) 및 라이신(15)의 상대적 함량이 높았다. 초기 성숙단계에서 아미노산 대사의 증가는 호흡, 내과피 경화(hardening), 페닐프로파노이드 전구체 수준 및 방향성 화합물 합성을 증가시킴으로써 열매발달에 영향을 준다고 알려졌다. 특히, 전술한 지상 조직(잎, 줄기 및 열매)에서 세린의 고함량은 높은 광호흡률과 관련되어 있다. 그러나, 아미노산의 상대적 양은 GB 생장 및 숙성 이후단계에서는 감소하였다(도 2c).
에탄올아민(3) 수준은 초기 성숙 단계에서는 아미노산과 유사한 경향을 보였다. 생화학적으로, 에탄올아민은 아미노산(대부분 세린)의 탈카르복실반응을 통해 합성되고, 식물의 전반적인 생장 및 발달을 촉진시킨다. 유사하게, 아데노신(42) 및 구아노신(43)과 같은 퓨린계 뉴클레오사이드의 상대적인 양은 GB 발달의 수확전 단계 동안 높게 관찰되었다. 뉴클레오사이드는 주요 에너지 전달체 및 뉴클레오타이드 보조인자와 핵산 서브유닛 합성의 전구체 역할을 한다. 알려진 바에 따르면, 높은 뉴클레오사이드 수준은 높은 대사흐름에 영향을 미쳐 식물 생장 및 열매 숙성을 촉진한다. 따라서, 아미노산, 아민 및 뉴클레오사이드의 상대적인 고함량이 GB 발달 초기단계, 즉 IG 및 MG에서 필수적인 더 높은 생장 및 세포 팽창률을 유발했을 가능성이 있다.
열매의 유기산 함량은 당과 몇몇 아미노산에 의한 단맛을 가려주는 특징적인 신맛을 결정한다[28]. 본 발명자들은 GB 추출물에서 유기산, 특히 숙신산(17), 글리세린산(18), 푸마르산(19), 말산(20), 쓰레온산(21), 2-하이드록시글루타릭산(23) 및 퀸산(27)의 함량에 있어서 특유의 단계-특이적 패턴을 관찰하였다. 대개, 상대적인 유기산 수준은 수확전 단계(IG 및 MG)까지 선형으로 증가하고 이어지는 성숙 단계에서 급격히 감소한다. 일반적으로, 말산은 열매에서 가장 풍부한 유기산으로 숙신산 및 푸마르산과 함께 Kreb 사이클의 핵심 중간체 역할을 하여 열매 호흡 및 숙성에 영향을 미친다. 반대로, 이소바르비투르산 (22), 4-하이드록시벤조산(24), 아코니트산(25), 시트르산(26) 및 클로로겐산(28)을 포함하는 특정 유기산 수준의 상대적인 선형 증가 경향이 GB 성숙 이후 단계에서도 관찰되었다(도 2c). 클로로겐산의 높은 축적량(~20%)은 내유(endosperm) 초기단계 발달 및 커피 씨의 일시적 성숙을 동반하는 후기 단계의 리그닌 생합성과 관련이 있는 것으로 알려졌다[30]. 이에, 본 발명자들은 페놀계 화합물이 GB 성숙의 수확 및 수확후 단계를 나타내는 특정 대사체 바이오마커일 것이라 추측하였다(도 2). 페놀계 화합물은 당뇨, 알츠하이머병, 암, 및 특정 박테리아 감염 등의 만성 질환에 대한 강력한 약리 활성을 가지는 것으로 알려졌다[3].
열매 숙성은 과육의 견고함, 산도 및 클로로필 함량의 감소와 함께 전체 당 및 방향성의 휘발성 화합물의 증가로 특징지워진다[32]. 나아가, 당과 유기산 수준의 균형된 양적 비율은 과육의 맛과 산도를 결정하는데 중요하다[33]. 열매 생리학을 고려하면, 잎에서의 광합성을 통한 당의 생산과 이에 비례한 열매에의 축적은 영양반응 신호경로 및 호르몬을 조절함으로써 열매의 생장, 발달 및 성숙을 관장하는 환경적인 신호를 매개한다. 본 발명자들은 GB 발달 중 수확전 단계에서 자일로스(30), 아라비노스(31), 자일리톨(32), 리비톨(33), 글리세롤(29), 글리세릴 글리코사이드(38) 및 대부분의 5탄당 유도체가 수확/수확후 단계에 비하여 상대적으로 함량이 높음을 발견하였다. 반대로, 프룩토스(34), 만노스(35), 글루코스(36), myo-이노시톨(37) 및 갈락티놀(39)을 포함하는 6탄당 및 그 유도체는 상대적으로 후기 단계에서 함량이 높았다. 당 및 당 알콜의 축적 증가는 식물에서 호흡의 필요가 높아졌음을 의미한다. Yamaki 및 Ino[35]는 열매에서의 당 농도는 성숙 및 숙성 단계 동안 다양하게 변화한다고 보고한 바 있다. 특히, 열매 발달 후기단계 동안의 높은 수크로스 이화작용은 세포벽 및 공포(vacuolar) 전화효소의 활성 때문이다[30]. 열매의 자극반응성인 면을 고려할 때, 당도에 영향을 미치는 각 당(프룩토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스, 및 트레할로스)의 비율은 열매의 가장 중요한 질적 특징이며, 이는 당과 유기산 수준 간의 비율에 역의존(counter dependent)한다. GB에서, 프룩토스 및 글루코스는 진세노사이드 C3, C6, 및 C20에 결합하여 그 생물학적 활성에 영향을 주는 주요 당이다[38]. 나아가, 높은 탄소 대사율은 진세노사이드 생합성에 필요한 충분한 에너지와 탄소 골격을 제공한다.
각각의 단계에서 수확된 GB의 추출물에서 제한된 수의 지방산과 관련 화합물이 검출되었음에도, 16-C 지방산(팔미트산) 및 올레아마이드 등의 18-C(불포화 올레산) 유도체의 상대적인 수준에 대한 상응하는 패턴이 관찰되었다. 상대적 지방산 분포의 공간적인 차이가 제안된 바 있는데, 팔미트산은 잎과 열매에 높은 수준으로 축적된다(40). 올리브 열매에서, 불포화 지방산(올레산 및 리놀산) 수준은 숙성단계 동안 증가하는 반면, 포화 지방산은 점차적으로 감소한다(39). 본 발명자들은 GB 성숙의 후반기에 올레산 유도체인 올레아마이드(41) 수준이 상대적으로 높다는 것을 확인하였다. 대조적으로, 팔미트산은 수확전 단계에서 더 높고 이후 감소하였다.
2. GB 추출물에 대한 UHPLC-ESI-MS/MS-기반 2차 대사체 프로파일링
상이한 성숙단계의 GB 추출물에 대한 2차 대사체 프로파일링은 UHPLC-ESI-MS/MS 및 뒤이은 데이터 세트의 다변량 분석을 통해 수행하였다. 도 3a에서 보는 바와 같이, GB 추출물의 2차 대사체 프로파일은 성숙단계에 따라 전체 PLS-DA 점수 플롯 데이터 가변성 16.7%(PLS1:11.1%, PLS2:5.6%)를 보이면서 클러스터 분포 패턴을 보였다. PLS-DA 모델의 퀄리티 파라미터는 R2X ¼ 0.257, R2Y ¼ 0.993, 및 Q2Y ¼ 0.849로 입증하였다. PLS-DA 모델에서의 2차 대사체 데이터세트 패턴은 상응하는 PCA 점수 플롯과 들어맞았다(도 7b). 수확전 단계(IG 및 MG)의 데이터 세트를 PLS1를 따라 수확/수확후 단계(PR, FR, 및 OR)로부터 분리하고, MG 및 PR을 PLS2를 따라 IG, FR, 및 OR로부터 분리하였다. 상이한 성숙단계의 GB 추출물에서 유의하게 차이나는 2차 대사체는 LS-DA 모델을 이용하여 VIP 값 > 1.0 및 p 값 < 0.05를 기준으로 선별하였다. 전체적으로 페놀산, 2가지 플라보노이드, 5가지 노토진세노사이드, 6가지 진세노사이드, 3가지 말로닐(Ma)-진세노사이드 및 7가지 식별불가(NI) 대사체를 포함하는 24개 대사체가 유의하게 차이나는 대사체로 선정되었다(표 3).
Figure 112019059497806-pat00001
UHPLC-ESI-MS/MS 데이터 세트에 대한 상응하는 로딩 플롯은 유의하게 차이나는 대사체의 PLS1에 따른 분포를 보여주였다(도 3b). 진세노사이드 Rg1 및 Re를 제외하고, 대부분의 진세노사이드는 수확전 단계에서 상대적인으로 풍부하였다. 도 3c에서 보는 바와 같이, 노토진세노사이드 Fe(51), 노토진세노사이드 Fd(52) 및 20(S)-진세노사이드 Rg3(53)은 IG 단계에서 상대적으로 높았다. 그러나, 진세노사이드 Rb1(47), Ma-진세노사이드 Rb1(48), Ma-진세노사이드 Re(49), 진세노사이드 Rd(50), 노토진세노사이드 R1(54), Ma-진세노사이드 Re(57), 노토진세노사이드 R3(58), 진세노사이드 Rf(59) 및 노토진세노사이드 R2(60)는 MG 단계에서 상대적으로 높았다. 뿐만 아니라, 진세노사이드 Rg1(55) 및 진세노사이드 Re(56)의 수준은 PR 단계까지 점진적으로 증가한 후 급격히 감소하였다. 진세노사이드는 잎, 뿌리 및 열매에 공간적으로 분포하는 인삼의 활성성분이다(41). 진세노사이드의 평균 함량 및 기능적 효능, 즉 항산화, 항염증, 항당뇨 및 항암 성분은 식물 성숙단계에서 최상으로 증가한다[42,43]. 본 발명자들은 진세노사이드의 상대적 양이 GB 성숙의 MG 단계까지 증가하고 이후 급격히 감소함을 관찰하였다. 흥미롭게도, 진세노사이드 Rg 및 진세노사이드 Rd의 높은 상대적 양이 PR 단계에서 관찰되었는데, 이는 PLS-DA 플롯에서 PLS2을 따라 나타나는 단계 MG 및 PR에서의 가변성이 원인일 수 있다(도 3A). 식물에서 2차 대사체의 생합성 및 축적은 식물 생장 및 열매 발달에 중요한 유전자의 전사 조절과 밀접하게 관련되어 있다.
인삼의 생물학적 및 약리적 특성은 진세노사이드 외에 페놀산 함량에도 기인한다[4]. 복숭아, 감자, 사과, 포도, 토마토 및 인삼의 높은 폴리페놀 수준은 항암, 항산화, 항당뇨 및 세포사멸 활성과 관련있는 것으로 보고되었다[5,6]. 나아가, 페놀계 식물 성분으로서 식물 세포벽에 존재하는 페를산은 항산화, 항알러지, 간보호 및 항발암 활성에 대해 연구되어 왔다. 일반적으로, 열매 숙성에는 카르테노이드, 페놀화합물 및 및 휘발성 대사체와 같은 2차 대사체 생성으로 이어지는 몇몇 복잡한 생화학적 반응이 관여한다. 따라서, 본 발명자들은 켐페롤 3,7-디글루코사이드, 켐페롤 3-소포로사이드 및 페를산이 특징적인 대사체로서 GB 성숙의 후기 단계에서 상대적으로 다량 합성될 것으로 예측하였다(도 3c).
3. GB 추출물에서의 대사체 및 관련 생화학적 표현형 간의 상관관계
본 발명자들은 상이한 성숙 단계별 GB 추출물의 항산화 활성(ABTS 및 FRAP), TFC 및 TPC를 측정하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 수확/수확후 (PR, FR 및 OR)단계의 GB 추출물의 항산화 활성은 수확전(IG 및 MG) 시료에서보다 상대적으로 높았다. 후반부 성숙 단계 간의 차이는 크기 않았으나, FRAP 분석을 통해 측정된 항산화 활성은 PR 및 FR 단계에 비해 OR 단계에서 눈에 띄게 증가하였다(도 4b). TFC 및 TPC는 TFC 및 TPC 활성이 증가함에 따라 후기 성숙단계까지 선형으로 증가하였다.
67개의 유의하게 차이나는 대사체들과 관찰된 관련 표현형, 즉 ABTS, FRAP, TFC 및 TPC의 경향 간의 통계적 관련성을 평가하기 위해 상관분석을 수행하였다. 표준화된 변수의 컬러-플롯팅 값을 이용하여 양의 상관관계(붉은색, 0<r<1) 및/또는 음의 상관관계(파란색 1<r<0)를 모두 보여주는 상관지도(correlation map)를 작성하였다(도 5). 모든 대사체(60개의 동정된 대사체 및 7개의 미식별 대사체)에 대한 피어슨 상관계수와 p-값 및 상응하는 생체활성을 표 S4에 표시하였다. 모두 24개의 대사체가 상응하는 표현형과 양의 상관관계를 보인 반면, 나머지 43개는 음의 상관관계를 보였다. 흥미롭게도, 수확전 단계에서 상대적으로 고함량을 보이는 피로글루탐산(10), 숙신산(17), 2-하이드록시글루타릭산 (23), 글리세롤(29), 아라비노스(31), 자일리톨(32), 리비톨(33), 아데노신 (42), 구아노신(43), 노토진세노사이드 Fe(51), 노토진세노사이드 Fd(52), 20(S)-진세노사이드 Rg1(53) 및 3개의 미식별 대사체의 29개 대사체는 항산화 활성과 유의한 음의 상관관계를 보였다(p<0.05). 그러나, 수확/수확후 단계에서 풍부한 대사체, 특히 트립토판(16), 이소바르비투르산(22), 4-하이드록시벤조산(24), 아코니트산(25), 시트르산(26), 클로로겐산(28), 프룩토스(34), 만노스(35), 갈락티놀(39), 올레아마이드(41), 켐페롤 3-소포로사이드(44), 켐페롤 3,7-디글루코사이드(45) 및 하나의 미식별 대사체는 항산화 활성과 유의한 양의 상관관계를 보였다(p<0.05). 항산화 활성과 양의 상관관계를 보이는 대사체는 주로 페놀계 화합물이다[7]. 전형적으로, 4-하이드록시벤조산, 클로로겐산, 켐페롤 3-소포로사이드, 및 켐페롤 3,7-디글루코사이드는 상당한 연구가 진행된 인삼의 페놀계 화합물이다[4]. 그러나, 페놀계 화합물임에도, 페를산은 본 발명에서 약한 양의 상관관계를 보였다. 종래 연구에서, 클로로겐산, 켐페롤 및 페를산은 인삼에서의 주된 페놀계 항산화 화합물이며 열매에 더 많은 양이 분포한다고 보고된 바 있다[4].
GB 추출물에서 페놀계 화합물 농도는 성숙단계, 특히 GB의 진한 갈색으로 특징지워지는 OR에서 선형으로 증가한다. 열매의 갈색화는 폴리페놀옥시다제 활성의 증가에 영향을 받는 중요한 생화학적 현상으로, 열매가 부드러워지고 색상이 짙어지게 하면서 자극반응성을 약화시킨다. 그러나, 이러한 질감의 변화는 열매의 맛, 향 및 전체적인 자극 반응성에 부정적인 영향을 끼친다. 이에, 미성숙한 열매는 바람직한 자극반응성을 상실하고 과성숙한 열매는 보관시기가 짧아지기 때문에 최적의 열매 성숙도는 중요한 방향성 특징을 결정한다.
4. 상이한 성숙 단계에서 수확된 GB들에서 유의하게 차이나는 대사체의 대사경로
본 발명자들은 상이한 성숙단계에서 수확한 GB에서의 60개 이상의 유의하게 차이나는 1차 및 2차 대사체에 대해, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 데이터베이스의 관련 대사경로 지도를 시험하였다. 흥미롭게도, 이들 대사체는 시트르산 사이클(TCA cycle); 해당(glycolysis); 피리미딘, 아미노산, 지방산, 프롤린, 당 및 퓨린 경로; 진세노사이드 대사; 및 시키미산페닐프로파노이드 생합성을 포함하는 10개의 상이한 대사경로를 따라 교차 연결되어 있었다(도 6).
탄소 대사는 유기체의 생체 에너지에 영향을 미치고 및 생장, 발달 및 대사를 조절하는 복잡한 생체분자의 합성을 위한 탄소 골격을 제공한다. 식물에서, C 대사 경로, 즉 TCA 사이클, 해당, 당대사 및 시키미산-페닐프로파노이드 생합성은 식물 생장 및 노화와 주로 관련되어 있으며 식물의 생리적 반응과정을 조절한다[8]. 상이한 GB 성숙 단계에서의 대사체 수준의 변화는 탄수화물 대사, 특히 열매의 최종 대사체 조성을 결정하는데 중심적인 역할을 하는 해당 및 TCA 사이클의 변화를 수반한다[9]. 수크로스 및 이의 글루코스 및 프룩토스로의 상호변환은 TCA 사이클 및 해당과정에서 에너지 분자와 ATP 및 NADH와 같은 환원력의 근원을 생성한다. 아미노산 및 유기산과 함께, 이들 당은 식물에서 광합성과 호흡을 조합하여 에너지원을 구성한다. 해당(glycolysis)은 글루코스가 ATP로 분해되면서, 동시에 유기산, 아미노산, 안토시아닌 및 방향성 화합물을 포함한 수많은 다른 2차 대사체의 합성을 위한 전구체를 생성하는 첫 번째 과정이다. 축적된 유기산은 열매 성숙에 필수적 과정인 아미노산 이화에 영향을 미침으로써 열매 숙성을 촉진한다고 알려졌다. GB가 IG에서 MG로 넘어가는 과정을 수반하는 수확전 단계는 크기 증가 및 과피 색상변화가 나타난다(도 1). 이들 성숙 단계에서는 해당 및 TCA 사이클을 위한 대사체 전구체가 풍부하게 나타난다.
뿐만 아니라, 시키미산-페닐프로파노이드 경로는 방향성 화합물 합성을 위한 또 다른 경로를 제공하여 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판 등의 아미노산 생합성이 일어난다. 수확전 GB 추출물에서 상대적으로 높은 페닐알라닌 수준이 검출되었는데, 이는 후기 단계에서 급격히 감소하였다. 기능적으로, 이는 몇몇 항산화제(플라보노이드, 리그닌 페놀) 및 이들의 전구체(방향성 아미노산 및 시키미산)를 생성하는데, 이들은 식물 내 활성산소종의 활성을 억제하고 세포 단백질, 막지질 및 핵산을 보호한다. 방향성 아미노산에서 유래한 알칼로이드 및 페놀계 화합물은 유사한 생리학적 기능을 수행한다.
GB에서의 특징적인 기능성 대사체인 진세노사이드는 Cyt P450 효소에 의한 담마레네디올(dammarenediol)-Ⅱ 하이드록시화 후 글리코실 전이효소에 의한 글리코실화 단계를 통해 합성되는 테트라사이클릭 트리테르페노이드 사포닌의 일종이다. 결론적으로 트리테르펜 아글리콘에 글리코실 전이효소에 의해 만들어지는 단당류가 첨가된 후 다양한 진세노사이드가 생성된다. 본 발명자들은 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사트리올 타입을 포함한 15개 진세노사이드를 검출하였으며, 이들 대부분은 수확전 단계에서 보다 풍부하였다.
나아가, 본 발명자들은 시키미산-페닐프로파노이드 경로에서 유래된 페놀계 화합물이 GB의 수확/수확후(PR, FR, 및 OR) 단계의 추출물에서 풍부하다는 사실을 관찰하였다. 이들 대사체는 후기 단계에서 유의하게 차이나고, 동시적인 항산화 활성과 양의 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 대사체가 상응하는 종-특이적 전사체에 비하여 보다 일반적인 마커임을 고려하여, 본 발명자들은 상이한 인삼 종 간 보존적인, 열매 성숙에 영향을 미치는 대사 경로를 추축하였다.
결 론
본 발명자들은 GB의 대사체가 다양한 생체분자적, 생리학적, 형태적 상이점을 수반하는 각 성숙 단계에 따라 크게 차이가 날 것이라 가정하였다. 본 발명자들은 C 대사-관련 대사체(유기산 및 5탄당)와 대부분의 진세노사이드는 수확전 단계(IG 및 MG)에서 풍부함을 밝혔다. 그러나, 항산화 대사체(플라보노이드 및 페놀 화합물)은 GB 성숙단계 중 수확/수확후(PR, FR 및 OR) 단계에서 보다 많은 양이 축적되었다. 따라서, 성숙 단계와 관련된 대사체 경향 및 이로 인한 GB의 표현형에 대한 정확한 이해가 농경제의 특질 및 GB의 시장가치를 결정하는 미묘한 전사체학-대사체학 네트워크의 스냅샷을 제공할 수 있을 것으로 보인다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (12)

  1. 개화일로부터 12일 내지 16일이 경과한 시점에 인삼 열매(Ginseng berry)를 채취하는 단계를 포함하는, 노토진세노사이드 Fe, 노토진세노사이드 Fd 및 20(S)-진세노사이드 Rg3를 고함량으로 포함하는 인삼 열매 또는 이의 가공물의 제조방법으로서,
    상기 인삼 열매 또는 이의 가공물은,
    노토진세노사이드 Fe, 노토진세노사이드 Fd, 및 20(S)-진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Re, Ma-진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 노토진세노사이드 R1, 노토진세노사이드 R3, 진세노사이드 Rf, 노토진세노사이드 R2, 진세노사이드 Rg1 및 진세노사이드 Re로 구성된 총 진세노사이드 중에서,
    노토진세노사이드 Fe, 노토진세노사이드 Fd 및 20(S)-진세노사이드 Rg3를 고함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 개화일로부터 27일 내지 31일 후 인삼 열매(Ginseng berry)을 채취하는 단계를 포함하는, 진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Re, Ma-진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 노토진세노사이드 R1, 노토진세노사이드 R3, 진세노사이드 Rf 및 노토진세노사이드 R2를 고함량으로 포함하는 인삼 열매 또는 이의 가공물의 제조방법으로서,
    인삼 열매 또는 이의 가공물은,
    노토진세노사이드 Fe, 노토진세노사이드 Fd, 및 20(S)-진세노사이드 Rg3, 진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Re, Ma-진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 노토진세노사이드 R1, 노토진세노사이드 R3, 진세노사이드 Rf, 노토진세노사이드 R2, 진세노사이드 Rg1 및 진세노사이드 Re로 구성된 총 진세노사이드 중에서,
    진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Rb1, Ma-진세노사이드 Re, Ma-진세노사이드 Rc, 진세노사이드 Rd, 노토진세노사이드 R1, 노토진세노사이드 R3, 진세노사이드 Rf 및 노토진세노사이드 R2를 고함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 채취한 인삼 열매에 대해 인삼 열매의 착즙, 인삼 열매의 추출, 인삼 열매 과육의 착즙 및 인삼 열매 과육의 추출로 구성되는 군으로부터 선택되는 가공단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 방법은 상기 가공단계에서 수득한 추출물 또는 착즙액에 대한 여과 및 농축단계를 임의의 순서로 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
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