CN113350428A - 一种三叶青的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三叶青的发酵方法，包括以下步骤：（1）将干燥后的三叶青地下块根进行粉碎过筛，得三叶青粉碎料；（2）向三叶青粉碎料中加水，调pH值至6‑6.5，高压灭菌，冷却至室温，得发酵基质；（3）向发酵基质中加入发酵菌种菌液；然后进行厌氧发酵，发酵温度为25‑35℃，发酵时间为3‑5天，得发酵料；发酵菌种菌液为地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液组成；（4）发酵料高压灭菌，然后进行冻干处理，得三叶青发酵冻干粉。本发明所得三叶青发酵冻干粉中黄酮、总酚、多糖等的活性物质的含量高，且发酵方法简单，所得产品性能稳定。

Description

一种三叶青的发酵方法
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种三叶青的发酵方法。
背景技术
传统的中药发酵仅是利用环境中的自然菌，如细菌、霉菌、酵母等菌种进行发酵，菌种纯度不高，目操作方法粗劣，劳动强度大，生产力低下。由于概念的复杂性，技术的局限性，以及当时的调查研究方法的局限性，中药发展缓慢。传统中药发酵与多利因素相关，参与发酵的菌种种类及数量、发酵温度湿度、氧气等受环境影响较大，且发酵工艺是凭主经验判断和控制，存在较大的主观性和随意性，其质量的稳定性难以保证。
现代中药发酵技术起步于上世纪80年代，最早多为单味中药发酵，且主要集中在真菌自身发酵方面，如灵芝菌、冬虫夏草菌丝体发酵。目前，发酵菌种除了真菌类外，也扩大到有益细菌类，比如光合细菌类、乳酸菌类、芽孢杆菌类、酵母菌类等。微生物发酵过程中，产生的各种酶类可能会将中药的某些成分分解转化成新的有效成分，或将毒性成分分解以降低药物的毒副作用。现代中药发酵工艺以优选的有益菌群中的一种或几种，加入中草药制成了含有中药活性成分、菌体及其代谢产物的新型中药微生态制剂。
三叶青又名金线吊葫芦、蛇附子、土经丸、石老鼠,为畲族著名草药。其全草均可入药,以地下块根药用效果最好,具有清热解毒、活血散结、消炎止痛、祛风化痰、理气健脾等功效,常用于小儿高热惊厥、痢疾、支气管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性脑膜炎、毒蛇咬伤、扁桃体炎、蜂窝织炎、跌打损伤等疾病的治疗。
三叶青中含有黄酮、多糖、多酚等活性成分，但现有的三叶青加工的方法，活性成分的提取率相对较低，对于三叶青药材的进一步应用具有一定得阻碍。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三叶青的发酵方法，所得三叶青发酵冻干粉中黄酮、总酚、多糖等的活性物质的含量高，且发酵方法简单，所得产品性能稳定。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种三叶青的发酵方法，包括以下步骤：
(1)将干燥后的三叶青地下块根进行粉碎过筛，得三叶青粉碎料；
(2)向三叶青粉碎料中加水，三叶青粉碎料与水的质量比为1：2-3.5，调pH值至6-6.5，然后于121℃下高压灭菌30-40min，冷却至室温，得发酵基质；
(3)向发酵基质中加入发酵菌种菌液；然后进行厌氧发酵，发酵温度为25-35℃，发酵时间为3-5天，得发酵料；
所述发酵菌种菌液为地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液按一定比例组成；
(4)将发酵料于121℃下高压灭菌25-30min，然后进行冻干处理，得三叶青发酵冻干粉。
优选地，步骤(3)中，三叶青生药粉碎后过30-60目筛。
优选地，步骤(3)中，所述发酵菌种菌液加入量为发酵基质质量的2-5％。
优选地，步骤(3)中，发酵时转速为150-300r/min。
优选地，步骤(3)中，发酵温度为30-33℃。
优选地，所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌CICC 10181；所述黑曲霉为黑曲霉CICC 40384。
优选地，所述地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液的制备方法为：分别将地衣芽孢杆菌和黑曲霉接种于斜面培养基上，37℃培养4-6天，然后用接种环挑取菌块接种到相应得液体MRS培养基中，并置于摇床中培养，摇床转速150-200r/min，37℃下培养10-12天，分别得到地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液。
优选地，步骤(3)中，所述地衣芽孢杆菌菌液的浓度为1-10×108cfu/mL，所述黑曲霉菌液的浓度为1-10×108cfu/mL。
优选地，步骤(3)中，所述地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液的体积比为1：2-10。
本发明的有益效果是：
1、本发明中，采用特定的地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液对三叶青发酵基质进行发酵，且合理控制发酵条件，发酵后可使活性物质更好的从细胞中溶出，提高了所得三叶青发酵冻干粉中黄酮、总酚、多糖等的含量。同时可将三叶青中的不能被人体直接吸收利用的大分子有效活性物质降解成人体易于吸收的活性小分子。
2、本发明中，地衣芽孢杆菌和黑曲霉在发酵过程中会产生初级、次级代谢的产物等，而这些产物一部分为新的药物成分，使得到的产物的治疗效果更好。
3、本发明中，三叶青的发酵方法简单，发酵条件稳定且温和，易于控制，所得产品性能稳定，适用于大规模的生产。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明下述实施例中，地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌CICC 10181；黑曲霉为黑曲霉CICC 40384。
地衣芽孢杆菌菌液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基上，37℃培养6天，然后用接种环挑取菌块接种到相应得液体MRS培养基中，并置于摇床中培养，摇床转速200r/min，37℃培养12天，得到地衣芽孢杆菌菌液。地衣芽孢杆菌菌液的浓度为5×108cfu/mL，
黑曲霉菌液的制备方法为：将黑曲霉接种于斜面培养基上，37℃培养4天，然后用接种环挑取菌块接种到相应得液体MRS培养基中，并置于摇床中培养，摇床转速150r/min，37℃培养10天，得到黑曲霉菌液。黑曲霉菌液的浓度为7×108cfu/mL。
实施例1：
一种三叶青的发酵方法，包括以下步骤：
(1)将干燥后的三叶青地下块根进行粉碎过50目筛，得三叶青粉碎料。
(2)向三叶青粉碎料中加水，三叶青粉碎料与水的质量比为1：3，调pH值至6.5，然后于121℃下高压灭菌35min，冷却至室温，得发酵基质。
(3)向发酵基质中加入发酵菌种菌液，发酵菌种菌液加入量为发酵基质质量的3.5％；然后进行厌氧发酵，发酵温度为33℃，转速为200r/min，发酵时间为5天，得发酵料；
其中发酵菌种菌液为地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液按1：8的体积比组成。
(4)将发酵料于121℃下高压灭菌30min，然后进行冻干处理，得三叶青发酵冻干粉。
实施例2：
一种三叶青的发酵方法，包括以下步骤：
(1)将干燥后的三叶青地下块根进行粉碎过30目筛，得三叶青粉碎料。
(2)向三叶青粉碎料中加水，三叶青粉碎料与水的质量比为1：2，调pH值至6.5，然后于121℃下高压灭菌40min，冷却至室温，得发酵基质。
(3)向发酵基质中加入发酵菌种菌液，发酵菌种菌液加入量为发酵基质质量的2％；然后进行厌氧发酵，发酵温度为25℃，转速为300r/min，发酵时间为3天，得发酵料；
其中发酵菌种菌液为地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液按1：10的体积比组成。
(4)将发酵料于121℃下高压灭菌30min，然后进行冻干处理，得三叶青发酵冻干粉。
实施例3：
一种三叶青的发酵方法，包括以下步骤：
(1)将干燥后的三叶青地下块根进行粉碎过60目筛，得三叶青粉碎料。
(2)向三叶青粉碎料中加水，三叶青粉碎料与水的质量比为1：2.5，调pH值至6.5，然后于121℃下高压灭菌35min，冷却至室温，得发酵基质。
(3)向发酵基质中加入发酵菌种菌液，发酵菌种菌液加入量为发酵基质质量的3％；然后进行厌氧发酵，发酵温度为30℃，转速为300r/min，发酵时间为3天，得发酵料；
其中发酵菌种菌液为地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液按1：8的体积比组成。
(4)将发酵料于121℃下高压灭菌25min，然后进行冻干处理，得三叶青发酵冻干粉。
实施例4：
一种三叶青的发酵方法，包括以下步骤：
(1)将干燥后的三叶青地下块根进行粉碎过60目筛，得三叶青粉碎料。
(2)向三叶青粉碎料中加水，三叶青粉碎料与水的质量比为1：3.5，调pH值至6，然后于121℃下高压灭菌40min，冷却至室温，得发酵基质。
(3)向发酵基质中加入发酵菌种菌液，发酵菌种菌液加入量为发酵基质质量的4％；然后进行厌氧发酵，发酵温度为30℃，转速为300r/min，发酵时间为5天，得发酵料；
其中发酵菌种菌液为地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液按1：8的体积比组成。
(4)将发酵料于121℃下高压灭菌30min，然后进行冻干处理，得三叶青发酵冻干粉。
实施例5：
一种三叶青的发酵方法，包括以下步骤：
(1)将干燥后的三叶青地下块根进行粉碎过30目筛，得三叶青粉碎料。
(2)向三叶青粉碎料中加水，三叶青粉碎料与水的质量比为1：2，调pH值至6.5，然后于121℃下高压灭菌30min，冷却至室温，得发酵基质。
(3)向发酵基质中加入发酵菌种菌液，发酵菌种菌液加入量为发酵基质质量的3％；然后进行厌氧发酵，发酵温度为28℃，转速为150r/min，发酵时间为4天，得发酵料；
其中发酵菌种菌液为地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液按1：10的体积比组成。
(4)将发酵料于121℃下高压灭菌25min，然后进行冻干处理，得三叶青发酵冻干粉。
实施例6：
一种三叶青的发酵方法，包括以下步骤：
(1)将干燥后的三叶青地下块根进行粉碎过50目筛，得三叶青粉碎料。
(2)向三叶青粉碎料中加水，三叶青粉碎料与水的质量比为1：3，调pH值至6，然后于121℃下高压灭菌35min，冷却至室温，得发酵基质。
(3)向发酵基质中加入发酵菌种菌液，发酵菌种菌液加入量为发酵基质质量的5％；然后进行厌氧发酵，发酵温度为33℃，转速为200r/min，发酵时间为5天，得发酵料；
其中发酵菌种菌液为地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液按1：5的体积比组成。
(4)将发酵料于121℃下高压灭菌30min，然后进行冻干处理，得三叶青发酵冻干粉。
对实施例1-6中得到的三叶青发酵冻干粉中的三叶青粉含量进行测定。具体结果见表1。
表1：
三叶青粉含量/％
实施例1 81.2
实施例2 83.2
实施例3 82.5
实施例4 81.9
实施例5 81.5
实施例6 82.3
由表1可知，通过发酵后，可溶出较多的活性物质以及产生较多的代谢产物。
然后将实施例1-6中得到的三叶青发酵冻干粉进行进一步提取，并设置对照组，对照组为将三叶青地下块根进粉碎料进行提取。提取方法为：向三叶青发酵冻干粉或三叶青地下块根粉碎料中加入其质量10倍的质量分数为70％的乙醇，进行回流提取3次，每次1.5h，然后合并提取液，并进行减压浓缩，得到总黄酮粗提物，然后加入采用HPD-100大孔吸附树脂对总黄酮粗提物进行纯化，之后收集洗脱液，减压浓缩，得总黄酮。测定所得总黄酮相对三叶青发酵冻干粉的收率以及所得总黄酮的纯度。具体结果见表2。
表2：
收率/％ 纯度/％
实施例1 2.72 68.3
实施例2 2.49 65.6
实施例3 2.54 67.9
实施例4 2.57 67.3
实施例5 2.68 67.5
实施例6 2.62 66.8
对照组 1.76 53.6
由表2可知，通过本发明发酵方法制备得到的三叶青发酵冻干粉，其在进行后续提取时，可使得到的总黄酮量显著增加，且具有较高的纯度。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种三叶青的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将干燥后的三叶青地下块根进行粉碎过筛，得三叶青粉碎料；
（2）向三叶青粉碎料中加水，三叶青粉碎料与水的质量比为1：2-3.5，调pH值至6-6.5，然后于121℃ 下高压灭菌30-40min，冷却至室温，得发酵基质；
（3）向发酵基质中加入发酵菌种菌液；然后进行厌氧发酵，发酵温度为25-35℃，发酵时间为3-5天，得发酵料；
所述发酵菌种菌液为地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液按一定比例组成；
（4）将发酵料于121℃ 下高压灭菌25-30min，然后进行冻干处理，得三叶青发酵冻干粉。
2.根据权利要求1所述的三叶青的发酵方法，其特征在于，步骤（3）中，三叶青生药粉碎后过30-60目筛。
3.根据权利要求1所述的三叶青的发酵方法，其特征在于，步骤（3）中，所述发酵菌种菌液加入量为发酵基质质量的2-5%。
4.根据权利要求1所述的三叶青的发酵方法，其特征在于，步骤（3）中，发酵时转速为150-300r/min。
5.根据权利要求1所述的三叶青的发酵方法，其特征在于，步骤（3）中，发酵温度为30-33℃。
6.根据权利要求1所述的三叶青的发酵方法，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌CICC 10181；所述黑曲霉为黑曲霉 CICC 40384。
7.根据权利要求1所述的三叶青的发酵方法，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液的制备方法为：分别将地衣芽孢杆菌和黑曲霉接种于斜面培养基上，37℃培养4-6天，然后用接种环挑取菌块接种到相应得液体MRS培养基中，并置于摇床中培养，摇床转速150-200r/min，37℃下培养10-12天，分别得到地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液。
8.根据权利要求1所述的三叶青的发酵方法，其特征在于，步骤（3）中，所述地衣芽孢杆菌菌液的浓度为 1-10×108 cfu/mL，所述黑曲霉菌液的浓度为 1-10×108 cfu/mL。
9.根据权利要求1所述的三叶青的发酵方法，其特征在于，步骤（3）中，所述地衣芽孢杆菌菌液和黑曲霉菌液的体积比为1：2-10。
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