CN113350331A - 橘皮素和/或其衍生物在制备或作为预防和/或治疗肾细胞癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了橘皮素和/或其衍生物在制备或作为预防和/或治疗肾细胞癌的药物中的应用。本发明首次研究发现橘皮素可有效抑制肾癌细胞活力，抑制肾癌细胞的增殖、克隆、迁移作用以及肾癌细胞中Cx43的表达，表明橘皮素及其衍生物对肾细胞癌具有良好的防治效果。本发明提供了橘皮素及其衍生物的一种新用途，也为肾细胞癌的靶向治疗提供了一种新的选择方案。

Description

橘皮素和/或其衍生物在制备或作为预防和/或治疗肾细胞癌 的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及橘皮素和/或其衍生物在制备或作为预防和/或治疗肾细胞癌的药物中的应用。
背景技术
肾细胞癌(Renal cell carcinoma，RCC，简称肾癌)起源于肾实质泌尿小管上皮系统，起病时隐匿，早期常缺乏一定的临床表现，是泌尿系统中恶性程度较高的肿瘤。肾细胞癌约占成人恶性肿瘤的2％～3％，占成人肾脏恶性肿瘤的80％～90％。世界范围内各国或各地区的发病率各不相同，总体上发达国家发病率高于发展中国家，城市地区高于农村地区，男性多于女性，男女患者比例约为2∶1，发病年龄可见于各年龄段，高发年龄50～70岁。据全国肿瘤防治研究办公室和卫生部卫生统计信息中心统计我国试点市、县肿瘤发病及死亡资料显示我国肾细胞癌发病率呈逐年上升趋势，至2008年已经成为我国男性恶性肿瘤发病率第10位。
橘皮素(Tangeretin)是柑橘类水果果皮中的多甲氧基黄酮，其别称为5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮，分子量是372.37。最近研究表明，橘皮素作为黄酮类药物之一，具有抗增殖、抗入侵、抗转移和抗氧化的活性，还可以抑制乳腺癌、口腔癌等肿瘤细胞的增殖，如专利CN201510590605.5公开了橘皮素在制备预防和治疗口腔癌药物或保健品中的应用，但不同癌症的致病机制是完全不同的，肿瘤用药不具有普适性，能够适用于制备预防和治疗口腔癌药物的物质并不一定能适用于制备预防和/或治疗肾细胞癌的药物，橘皮素对肾细胞癌是否有作用还未见相关研究报道。
发明内容
本发明旨在研究开发橘皮素及其衍生物的新用途，提供了橘皮素和/或其衍生物在制备或作为预防和/或治疗肾细胞癌的药物中的应用，为肾细胞癌的靶向治疗提供了一种新的选择方案，为肾细胞癌的新药研发奠定了一定的基础。
本发明的首要目的是提供橘皮素和/或其衍生物在制备或作为预防和/或治疗肾细胞癌的药物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种预防和/或治疗肾细胞癌的药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先请求保护橘皮素和/或其衍生物在制备或作为预防和/或治疗肾细胞癌的药物中的应用。
本发明首次研究发现橘皮素可有效抑制肾癌细胞的增殖、克隆、迁移作用，以及抑制肾癌细胞中Cx43的表达，表现较好的预防和/或治疗肾细胞癌的效果。本发明提供了橘皮素及其衍生物的一种新用途，为肾细胞癌的靶向治疗提供了一种新的选择方案，也为肾细胞癌的新药研发奠定了一定的基础。
优选地，所述预防和/或治疗肾细胞癌包括抑制肾癌细胞的增殖、克隆、迁移的一种或几种能力。
进一步优选地，所述预防和/或治疗肾细胞癌包括抑制肾癌细胞缝隙连接蛋白43(Cx43，又名GJA1)的表达。
进一步优选地，所述肾癌细胞包括OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1或ACHN的一种或几种。
优选地，所述肾细胞癌包括肾透明细胞癌。
优选地，所述橘皮素的衍生物包括以橘皮素或其糖类、氨基酸衍生物为母核的分子、类似物或其药物可接受的盐。
本发明还提供了一种预防和/或治疗肾细胞癌的药物，该药物以橘皮素和/或其衍生物为活性成分，其余为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
优选地，还包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型。本发明所述药物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的，如固体剂型、半固体剂型、液体制剂或气雾制剂，具体可以包括散剂、颗粒剂、丸剂、胶剂、外用膏剂、糊剂、汤剂、酒剂、注射剂、气雾剂、吸入剂、缓控释制剂或肠溶剂。
本发明的橘皮素是柑橘类水果果皮中的多甲氧基黄酮，对机体并无毒副作用，可用于日常服用以预防特定人群的肾细胞癌变。
本发明的橘皮素别称为5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮，分子量是372.37，其计算化学数据为：ALogP值3.054；LogD值3.054；疏水参数计算参考值(XlogP)3；氢键供体数量为0；氢键受体数量为7；可旋转化学键数量为6。其结构式见图1所示，化学结构球棍图见图2所示。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次研究发现橘皮素可有效抑制肾癌细胞的增殖、克隆、迁移作用，以及抑制肾癌细胞中Cx43的表达，表现出较好的预防和/或治疗肾细胞癌的效果。本发明提供了橘皮素及其衍生物的一种新用途，为肾细胞癌的靶向治疗提供了一种新的选择方案，也为肾细胞癌的新药研发奠定了一定的基础。
附图说明
图1是橘皮素的结构式。
图2是橘皮素的化学结构球棍图。
图3A是Cx43和RTKs的相关性分析结果，图3B是Cx43和RTKs的表达与肾透明细胞癌的预后关系分析结果。
图4A是Cx43在肾透明细胞癌(KIRC)中的表达结果，图4B是磷酸化Cx43蛋白在KIRC的表达结果，图4C是Cx43蛋白和磷酸化Cx43蛋白在KIRC不同分级中的表达结果，图4D是Cx43表达与KIRC预后的关系分析结果，图4E是Cx43在KIRC、KIRP和KICH中的表达结果，图4F是Cx43与KIRP、KICH预后的关系分析结果，图4G是FLT1与KIRC预后的关系分析结果，图4H是FLT4与KIRC预后的关系分析结果，图4I是KDR与KIRC预后的关系分析结果，图4J是EFNB2与KIRC预后的关系分析结果，图4K是PDGFD与KIRC预后的相关性分析结果，图4L是Cx43与FLT1在KIRC中的相关性分析结果，图4M是Cx43与KDR在KIRC中的相关性分析结果，图4N是Cx43与FLT4在KIRC中的相关性分析结果，图4O是Cx43与EFNB2在KIRC中的相关性分析结果。
图5A是Cx43在不同肾细胞的表达结果，图5B是用不同的小分子干扰RNA抑制ACHN细胞Cx43表达的验证，图5C是抑制Cx43表达后ACHN细胞的增殖能力变化情况，图5D是抑制Cx43表达后ACHN细胞的迁移能力变化情况，图5E是抑制Cx43表达后ACHN细胞的侵袭能力变化情况，图5F是11种不同中药单体对OS-RC-2细胞Cx43表达的影响，图5G是不同浓度的橘皮素对OS-RC-2的Cx43表达的抑制情况，图5H是橘皮素对OS-RC-2细胞活力的抑制情况，图5I是橘皮素对Caki-1细胞迁移的抑制情况，图5J是橘皮素对ACHN细胞活力的抑制情况，图5K是橘皮素对786-O细胞活力的抑制情况。
图6A是橘皮素对786-O细胞克隆形成的抑制情况；图6B是橘皮素对769P细胞克隆形成的抑制情况；图6C是橘皮素对ACHN细胞克隆形成的抑制情况；图6D是橘皮素对786-O细胞迁移的抑制情况；图6E是橘皮素对769-P细胞迁移的抑制情况。
图7A是ACHN细胞中干扰Cx43后磷酸化EGFR、AR、MMP-9和SOD-1表达的下调情况；图7B是ACHN细胞中干扰Cx43的表达后CD44的表达抑制情况；图7C是橘皮素是对OS-RC-2细胞中磷酸化ERK表达的抑制情况；图7D是干扰Cx43的表达后磷酸化EGFR、磷酸化ERK、P65和Survivin在肾癌OS-RC-2细胞中表达的抑制情况；图7E是橘皮素对786-O细胞磷酸化Stat3、Survivin、BCL-2和磷酸化AKT表达的抑制情况。
其中，*表示线条所指示的组之间比较，P<0.05；图中tan是指橘皮素，NC指的是阴性对照，S1、S2和S3分别为针对Cx43的不同小分子干扰RNA片段。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
1、主要试剂
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium干粉(DMEM，低糖)、胎牛血清(FBS)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)；
橘皮素购自Selleck Chemicals(Houston,TX,USA)公司；
肾癌细胞(OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1和ACHN)购自中科院上海细胞库；
AR(androgen receptor)、EGFR、磷酸化EGFR、磷酸化ERK、CD44、MMP-9、P65、SOD1、BCL-2、Survivin、pAKT、磷酸化FoxO3a、磷酸化ERK、Cx43和Tubulin的一抗抗体购自CellSignaling Technology(Danvers,Massachusetts,USA)；
RIPA裂解液购自南京凯基生物；
其它常用的实验室试剂均为国产分析纯级。
2、细胞培养
在37℃、5％CO2及湿度饱和的条件下，用含10％胎牛血清的DMEM(低糖)培养基来培养人HK-2细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养OS-RC-2、786-O、769-P和Caki-1细胞，用含10％胎牛血清的MEM培养基培养ACHN细胞。细胞培养在培养皿中进行，约2～3天用PBS清洗1～2次后再更换培养液。
3、MTT或MTS法检测细胞活力
首先将细胞按一定密度(约3000～5000个每孔)接种到96孔板中，待24小时后细胞已贴壁，换液加入含不同浓度药物的培养基处理24小时(如为Cx43的各干扰序列，则转染72h)。将培养基吸弃后加入配好的每孔含15μL MTT或MTS的培养基，经过一段时间后(MTT用4h，MTS用2～4h)，用酶标仪(Bio-Tek Instruments)在490nm波长时测定其吸光度A，计算其与对应空白组(不加细胞)的吸光度A0的差值，再计算对照组吸光度A1和A0的差值，将两差值的比值换算成百分率，即得细胞存活率，公式如下：细胞存活率＝(A-A0)/(A1-A0)*100％。
4、Western blot检测蛋白的表达
4.1肾细胞处理
将细胞用不同的条件进行处理24h之后，进行细胞标本的处理，具体步骤如下：
①将1.5mL的EP管做好标记，放置于冰上预冷。
②裂解和收集细胞：细胞用PBS洗三次后，放置在冰上；用RIPA裂解液溶解细胞，用刮板将细胞刮下后，收集到EP管中(裂解液的量根据细胞量调整，使最终测出的蛋白浓度大概一致)。
③超声破碎：使用超声破碎仪进行破碎，整个过程在冰上进行(注：保证探头放入细胞液下之后再开机，每破碎完一管后将探头用75％乙醇冲洗，再用超纯水冲洗，最后用吸水纸吸干后再用)。
④低温离心：将标记好的样品放入对应的EP管中后放入离心机，然后转移到低温离心机中进行离心，温度设为4℃，按12000rpm的转速离心30分钟。离心后转移上清液至新的EP管中，用于定量或保存在-80℃冰箱。
⑤标准蛋白定量：使用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher)按说明书进行定量。
将不同浓度的标准品加入至96孔板后，以50：1的比例将reagent A和reagent B混匀，然后在不同浓度标准品的孔中加入200μL混合液，37℃孵育30分钟后测定450nm吸光度值，绘制吸光度与蛋白浓度的标准曲线。
待测蛋白处理同上，以50：1的比例将reagent A和reagent B混匀，37℃孵育30分钟后测定450nm吸光度值，由上述标准曲线计算蛋白浓度。
⑥制备蛋白样品：根据定量结果里的蛋白浓度(μg/μL)，计算好(25～50μg)蛋白所需的样品量和超纯水的量(μL)，在预冷的EP管内，先加所需水，再加4×上样缓冲液5μL，最后加样品蛋白至总体积为20～30μL。将样品混匀后，在85～90℃中水浴5分钟，取出后置于冰上。
⑦配胶：先用洗洁精充分洗净玻璃板，再用自来水冲净后，用超纯水冲净，晾干或用吹风机吹干。将两块板底部对齐，保证水平，夹于模板上，加入超纯水检查是否漏胶，如不漏，则倒掉水，用滤纸吸干水。先将玻璃板装入到模具中，按照分离胶比例的对应配方将分离胶(5mL/板)配好，倒入玻璃板中至浓缩胶的分离线，然后加入1mL 0.1％SDS进行压胶，待分离胶凝固并出现分界线后，倒掉上层的0.1％SDS，用滤纸吸干残余的0.1％SDS。按照配方配好浓缩胶，倒入分离胶上方，插入梳子。待分离胶凝固后，用吸水纸包好整个胶，使之湿润，外层再用保鲜膜包裹，放到4℃冰箱中保存备用。
⑧上样，跑电泳和转膜
先将玻璃板固定好，然后放在电泳槽内，加入电泳液，将插在浓缩胶中的梳子拔出。
上样：第一泳道加Marker 4μL，最后泳道加Marker 1μL，待检测蛋白的上样体积为20～30μL。
电泳：样品在浓缩胶时将电压设在80V，当Marker前沿进入分离胶后，将电压提高到100V，继续电泳至Marker到达分离胶底部。
转膜：首先在黑色筛板处放一块海绵垫，再放入滤纸，将凝胶放在滤纸的上方，用PVDF膜与凝胶紧贴，保持两者之间无气泡，然后依次在PVDF膜的上方放滤纸和海绵垫，最后将筛板固定，插入已有预冷的电转液的电转槽。于冰浴中设定电压为100V，电转90分钟。
⑨封闭，孵抗体
将PVDF膜按照Marker的分子量剪好并标记，然后在含5％脱脂奶粉的TBST(封闭液)中室温孵育60～150分钟。根据说明书按照Cx43(1：1000)、磷酸化ERK(1：1000)、tubulin(1：1000)和anti-CD44(1：1000)等抗体于4℃孵育，摇床振摇过夜。第二天在回收一抗后，用TBST洗三次膜，3次×5分钟；二抗的稀释比例为1：7500，然后将二抗加入至PVDF膜中，在室温下摇床摇60分钟；最后用TBST/PBST洗三次膜3次，每次10分钟。
⑩凝胶图像分析
通过双色红外荧光蛋白分析系统扫描PVDF膜，扫描时的曝光强度设为自动，用LI-COR Image Studio Ver5.2工作软件扫描完成后，将扫描后的图像导出，然后用Image J软件并进行灰度分析。
5、克隆形成实验
取各组对数生长期的OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1和ACHN等肾癌细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，将细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM或RMPI-1640或MEM培养液中后，分别以500个/mL细胞的密度接种到含4mL、37℃预温培养液的培养皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置于37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养24小时后换液，加入含不同浓度(0、10或30μmol/L)的橘皮素的培养基1～2周内定期观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液后用PBS小心浸洗2次，再加入4％乙醇结晶紫固定细胞并染色20分钟后，用流水缓慢洗去染色液，自然空气干燥。将平皿拍照后用肉眼直接计数克隆，或用Image pro plus16.0(Media Cybernetics,Inc.)软件计算细胞的克隆数。
6、细胞划痕法检测细胞的迁移能力
将5×105～10×105个/mL的细胞接种于6孔细胞培养板(500μL/孔)，用含10％FBS的细胞培养基培养，待细胞生长形成单层细胞后，用200μL的无菌黄色枪头在单层细胞上划“∣”字划痕，PBS洗3次后继续用含低血清(2～3％FBS)的细胞培养基进行培养，分别在划痕后的24h、48h、72h和96h(不同细胞迁移速度不同，时间上有差异)进行拍照，拍照前用PBS洗3次并更换细胞培养基，检测橘皮素对肾癌细胞迁移能力的影响。
7、Transwell小室培养法检测细胞侵袭能力
按1×105～5×105个/孔的细胞数量，用含0.1％BSA的无血清培养基将稳定转染的细胞接种于24孔板Transwell小室，24孔板下室加入500μL含10％FBS的细胞培养基，细胞培养24～48小时后通过0.1％结晶紫染色法进行细胞计数，检测Cx43表达对肾癌细胞侵袭能力的影响。
8、统计学方法
实验数据以SPSS16.0软件统计分析，2组的组间比较采用Student test比较，3组以上的组间比较采用单因素方差分析，LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3法(方差不齐时)行组间两两比较，以P<0.05为显著性差异；*表示与相应的组比较，P<0.05。图中的柱状图以均值和标准误的形式表示；柱状图和散点图用GraphPad Prism 6.0软件。
实施例1 Cx43表达、相关性及其与肾细胞癌预后的关系分析
除少数细胞(如精子、血小板等)之外，哺乳动物中的几乎所有细胞都通过缝隙连接(Gap junction,GJ)彼此相连。1～1.5kDa以下的小分子如：钙离子、IP3、cAMP和游离氨基酸等可以经由GJ在细胞间通过，从而让细胞共享一些小分子代谢物，并调节细胞间的信号传递。一些小分子核糖核酸(miRNA)也可以经由GJ从细胞传递到相邻细胞。Cx43是细胞间形成的GJ中表达最丰富的连接蛋白之一，与多种疾病如缺血再灌注损伤、炎症、糖尿病、肿瘤的发生发展有关。然而，Cx43在肾癌中的表达却少见报道，在此基础上，我们进一步探究Cx43与肾细胞癌进展的关系。
GJA1(Cx43)和其它受体酪氨酸激酶(RTKs，是肾癌治疗的关键靶点)的表达、相关性、及Cx43和RTKs与不同肿瘤预后的关系可由TIMER2(Tumor immune estimationresource,version 2)数据库(http://timer.cistrome.org/)里的“Gene_DE”、“Gene_Corr”或“Gene_Outcome”模块中分析后获得。相关性分析结果显示，GJA1和RTKs在多个不同肿瘤中呈显著的相关性(图3A)，GJA1(Cx43)和RTKs(FLT1、KDR、FLT4、EFNB2等)的表达与肾透明细胞癌(KIRC)预后的关系呈现相同的趋势(图3B)。
Cx43在不同肾透明细胞癌亚型和分级的表达分析通过UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html)数据库的“TCGA analysis”模块进行，结果显示，与癌旁正常组织相比，Cx43在KIRC中显著升高，其在不同亚型、不同肿瘤级别中的表达均高于正常组织(图4A)。
蛋白表达分析通过UALCAN网站中的CPTAC(Clinical proteomic tumor analysisconsortium)单元进行，结果显示，Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白的表达较正常组织显著上调(图4B、图4C)，Cx43的表达与KIRC的预后有关(图4D)。
肾癌的癌和癌旁组织的表达差异箱线图可在GEPIA2(Gene expressionprofiling interactive analysis,version 2)网上分析工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/#analysis)的“Expression analysis-Box Plots”模块中选择GTEx(Genotype-tissue expression)数据、设定P-value cutoff＝0.01，log2FC(Fold change)cutoff＝1，勾选“Match TCGA normal and GTEx data”后获得，对Cx43在KIRC、肾乳头状细胞癌(KIRP)和肾嫌色性细胞癌(KICH)中的表达及其与KIRP、KICH预后的关系也进行了分析(图4E、图4F)，结果显示未见Cx43与KIRP、KICH的显著相关性。
通过GEPIA2的“Survival Analysis”模块还可分析不同的RTKs(FLT1、FLT4、KDR、EFNB2、PDGFD)与KIRC的总生存和疾病无进展生存的关系(图4G～图4K)，可设定Cutoff-high(50％)和cutoff-low(50％)来区分高表达组和低表达组；并通过UALCAN的TCGAanalysis”模块分析了Cx43与FLT1、KDR、FLT4、EFNB2在KIRC中的关系，结果显示，Cx43与FLT1、KDR、FLT4、EFNB2在KIRC中呈现高度的相关性(图4L～图4O)。
实施例2橘皮素对Cx43表达和肾癌细胞的抑制
一、实验方法
(1)根据前述“Western blot检测蛋白的表达”中的方法，收集肾癌患者临床组织样本、不同肾细胞样本后，进行蛋白提取和制样，并用蛋白免疫印迹检测Cx43和EGFR等蛋白的表达；并用前述“克隆形成实验”、“细胞划痕法检测细胞的迁移能力”、“Transwell小室培养法检测细胞侵袭能力”中的方法，检测细胞的克隆形成、迁移和侵袭的能力。
(2)将细胞按一定密度(约3000～5000个每孔)接种到96孔板中，待24小时细胞贴壁后，换液加入11种相同浓度的中药单体(1-Cyclocytidine HCl、2-Apigenin、3-Berberine HCl、4-Cytisine、5-Glycyrrhizin、6-Icariin、7-(+)-Matrine、8-Neohesperidin、9-(-)-Parthenolide、10-Salicin、11-Tangeretin)处理24小时后，进行蛋白提取和制样，并用蛋白免疫印迹检测Cx43等蛋白的表达。
(3)根据前述“MTT或MTS法检测细胞活力”中的方法，在细胞接种到96孔板中24小时后，设定不同的组别，换液加入要进行不同处理的Cx43 siRNA或对照，并在72小时后加入相应的MTS后测定各组的吸光度，并通过设定相应空白对照组后计算存活率。
(4)根据前述“克隆形成实验”、“细胞划痕法检测细胞的迁移能力”中的方法，检测肾癌细胞的克隆和迁移的能力。
二、实验结果
(1)通过对Cx43在人肾细胞(正常细胞HK-2，肾癌细胞769-P、ACHN、Caki-1、OS-RC-2、786-O)中的表达对比研究显示，与人正常的肾HK-2细胞相比，Cx43在肾癌细胞ACHN、Caki-1、OS-RC-2中的表达更高(图5A)；使用siRNA抑制ACHN细胞中的Cx43表达(图5B)后，肾癌ACHN细胞的增殖(图5C)、迁移(图5D)和侵袭(图5E)能力显著下降，说明Cx43表达与肾癌ACHN细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关。
(2)在11种中药单体对肾癌OS-RC-2细胞Cx43表达的影响中(图5F)，11号-橘皮素是有效抑制Cx43表达的化合物之一。不同浓度(3、10、30μmol/L)的橘皮素对OS-RC-2的Cx43表达的抑制作用如图5G所示，从图5G可以看出橘皮素可以显著抑制肾癌细胞Cx43的表达，且由于Cx43的表达与肾癌细胞的预后密切相关，可以证明橘皮素能够显著治疗/预防肾癌。
(3)无血清条件下用橘皮素处理各细胞24小时后的MTS检测，结果显示，橘皮素可显著抑制OS-RC-2(图5H)、ACHN(图5J)和786-O细胞(图5K)的活力。橘皮素还可显著抑制Caki-1细胞的迁移(图5I)。
(4)克隆形成能力和划痕实验的结果显示，橘皮素能抑制肾癌细胞的克隆和迁移能力。橘皮素(10μmol/L、30μmol/L)可抑制786-O细胞的克隆形成(图6A)；橘皮素(10μmol/L、30μmol/L)可抑制769P细胞的克隆形成(图6B)；橘皮素(10μmol/L、30μmol/L)可抑制ACHN细胞的克隆形成(图6C)；橘皮素(10μmol/L、30μmol/L)可抑制786-O细胞的迁移(图6D)；橘皮素(10μmol/L，30μmol/L)可抑制769-P细胞的迁移(图6E)。
实施例3橘皮素对肾癌细胞增殖、克隆、迁移相关分子表达的抑制
一、实验方法
根据前述“Western blot检测蛋白的表达”中的方法，利用Cx43的小分子干扰RNA、橘皮素对不同的肾癌细胞进行处理给药，考查橘皮素和Cx43的表达对肾癌细胞增殖、克隆、迁移密切相关的分子(磷酸化EGFR、AR、MMP-9、SOD-1、CD44、磷酸化ERK、磷酸化Stat3、BCL-2、P65、磷酸化AKT和Survivin)表达的影响。
二、实验结果
用橘皮素抑制ACHN细胞中Cx43的表达后，磷酸化EGFR、AR、MMP-9和SOD-1的表达下调(图7A)，且抑制了ACHN细胞中CD44的表达(图7B)；橘皮素可抑制磷酸化ERK在OS-RC-2细胞中的表达(图7C)，且用橘皮素抑制Cx43的表达后，降低了磷酸化EGFR、磷酸化ERK、P65和Survivin在肾癌OS-RC-2细胞中的表达(图7D)；橘皮素可抑制磷酸化Stat3、Survivin、BCL-2和磷酸化AKT在786-O细胞中的表达(图7E)。
综上实验结果可以得到：橘皮素可以抑制肾癌细胞中Cx43的表达，抑制肾癌细胞(OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1或ACHN)的增殖、克隆、迁移，可实现对肾细胞癌良好的防治效果，为肾细胞癌的靶向治疗提供了一种新的选择方案。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.橘皮素和/或其衍生物在制备或作为预防和/或治疗肾细胞癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述预防和/或治疗肾细胞癌包括抑制肾癌细胞的增殖、克隆、迁移的一种或几种能力。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述预防和/或治疗肾细胞癌包括抑制肾癌细胞中Cx43的表达。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述肾癌细胞包括OS-RC-2、769-P、786-O、Caki-1或ACHN的一种或几种。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肾细胞癌包括肾透明细胞癌。
6.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，所述橘皮素的衍生物包括以橘皮素或其糖类、氨基酸衍生物为母核的分子、类似物或其药物可接受的盐。
7.一种预防和/或治疗肾细胞癌的药物，其特征在于，以橘皮素和/或其衍生物为活性成分。
8.根据权利要求7所述药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体或赋形剂，制成不同的剂型。
9.根据权利要求8所述药物，其特征在于，所述剂型包括固体剂型、半固体剂型、液体制剂或气雾制剂。
10.根据权利要求9所述药物，其特征在于，所述剂型包括散剂、颗粒剂、丸剂、胶剂、外用膏剂、糊剂、汤剂、酒剂、注射剂、气雾剂、吸入剂、缓控释制剂或肠溶剂。
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