CN111759836A - 异补骨脂色烯查耳酮在制备抗炎药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药应用技术领域，具体涉及化合物异补骨脂色烯查耳酮的新应用，即其在制备抗炎药物方面的应用。本发明通过试验发现了异补骨脂色烯查耳酮的新用途，其能够抑制巨噬细胞和脂肪细胞的炎症反应。因此，异补骨脂色烯查耳酮可被用作抗炎药物，即可被用作制备改善炎症作用药物。

Description

异补骨脂色烯查耳酮在制备抗炎药物方面的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种化合物异补骨脂色烯查耳酮在制备抗炎药物方面的新应用。

背景技术

异补骨脂色烯查耳酮(英文名称：Isobavachromene)，结构式如下所示：

分子式：C₂₀H₁₈O₄；

分子量：322.35；

性状：黄色结晶；

来源：豆科(Leguminosae)，补骨脂属(Psoralen)，补骨脂(Psoralea corylifoliaLinn.)。异补骨脂色烯查耳酮可以直接购买普通市售产品，或者参见现有文献的方法提取获得。

异补骨脂色烯查耳酮，当前对其活性研究不多。本申请主要是以脂肪细胞为研究对象，探讨了异补骨脂色烯查耳酮改善脂肪炎症的作用，并探究了其作用机制。它可能是通过抑制巨噬细胞炎症因子分泌以及抑制炎症信号通路(MAPK、NF-κB)相关蛋白的表达改善炎症。同时，异补骨脂色烯查耳酮可通过抑制巨噬细胞浸润脂肪组织、减少脂肪细胞趋化因子和炎症因子分泌，以及抑制JNK、SOCS-3和NF-κB信号通路表达来减少脂肪细胞炎症。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种化合物异补骨脂色烯查耳酮在制备抗炎药物方面的新应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了上述异补骨脂色烯查耳酮在制备抗炎药物方面的应用。

本发明中，异补骨脂色烯查耳酮通过抑制巨噬细胞浸润脂肪细胞，及减少脂肪细胞炎症因子释放来改善炎症。具体的，异补骨脂色烯查耳酮可以改善炎症，其机制主要是：它可能通过减少RAW264.7巨噬细胞炎症因子的释放及炎症信号通路NF-κB、MAPK关键蛋白的表达，抑制巨噬细胞向脂肪细胞浸润。此外，异补骨脂色烯查耳酮可能通过抑制脂肪细胞NF-κB、JNK和SOCS-3炎症信号通路，来抑制脂肪细胞炎症因子的分泌，从而减少脂肪细胞炎症。

本发明还提供了上述异补骨脂色烯查耳酮与本领域常规辅料复配制成具有抗炎功效的复方制剂。

进一步的，所述的复方制剂，其剂型可以为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂或注射剂等。

和现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过大量研究和试验发现了化合物异补骨脂色烯查耳酮的一种新用途，其能够改善脂肪细胞炎症，其作用机制具体可能是异补骨脂色烯查耳酮可通过抑制其自分泌趋化因子，从而减少巨噬细胞向脂肪细胞浸润；可通过抑制巨噬细胞炎症因子分泌，及抑制巨噬细胞内炎症信号通路NF-κB和MAPK，来减少巨噬细胞炎症反应。同时异补骨脂色烯查耳酮可能通过抑制脂肪细胞NF-κB、JNK和SOCS-3炎症信号通路，来抑制脂肪细胞分泌促炎症因子，减少脂肪细胞炎症。因此，异补骨脂色烯查耳酮可被用来制作抗炎药物，也就是说可以用作制备改善脂肪细胞炎症作用的药物。

附图说明

图1中，A为异补骨脂色烯查耳酮对巨噬细胞NO分泌的影响，B为异补骨脂色烯查耳酮对巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响。注：数据表示为

与空白组相比^###P<0.001，与模型组相比^***P<0.001，^**P<0.01；

图2为异补骨脂色烯查耳酮对RAW264.7巨噬细胞向3T3-L1脂肪细胞迁移的影响；

图3中，A-C为异补骨脂色烯查耳酮对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6及IL-1β水平，D-F为TNF-α、IL-6及IL-1β的mRNA表达的影响。注：数据表示为

与空白组相比^###P<0.001，与LPS组相比^***P<0.001；

图4中，A为异补骨脂色烯查耳酮对3T3-L1脂肪细胞分泌MCP-1水平的影响，B为异补骨脂色烯查耳酮对3T3-L1脂肪细胞MCP-1mRNA转录水平的影响，C为异补骨脂色烯查耳酮对3T3-L1脂肪细胞MCP-1αmRNA转录水平的影响，D，E为异补骨脂色烯查耳酮对3T3-L1脂肪细胞IL-6和IL-1βmRNA转录水平的影响。注：数据表示为

与空白组相比^###P<0.001，^##P<0.01，与TNF-α相比^***P<0.001，^**P<0.01；

图5为异补骨脂色烯查耳酮对RAW264.7巨噬细胞内和MAPK(A)和NF-κB(B)信号通路的影响。注：与空白组相比^###P<0.001，与模型组相比^***P<0.001，^**P<0.01；

图6为免疫荧光观察异补骨脂色烯查耳酮对p65向细胞核转移的影响；

图7为异补骨脂色烯查耳酮对3T3-L1脂肪细胞内NF-κB(A)、JNK(B)和SOCS-3(C)信号通路的影响。注：数据表示为

与空白组相比^###P<0.001，与模型组相比^***P<0.001，^**P<0.01；

上述图中数据表示为平均值±SD，图中，IB指异补骨脂色烯查耳酮，Control为空白组，TNF-α和LPS为模型组，100、50、25、12.5、6.25分别指代的异补骨脂色烯查耳酮不同浓度组。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

应用实施例异补骨脂色烯查耳酮改善炎症作用

(1)实验细胞

3T3-L1前脂肪细胞和RAW264.7巨噬细胞，均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

(2)实验样品

异补骨脂色烯查耳酮，由河南大学国家食用菌加工技术研发专业中心参照现有文献(Choi YH,Yon GH,Hong DS,et al.In vitro BACE-1inhibitory phenolic componentsfrom the seeds of psoralea corylifolia.Planta Med.2008,74(11):1405-8.)从补骨脂中分离纯化而得(纯度>95％)。

(3)仪器与试剂

(4)实验方法

1、异补骨脂色烯查耳酮对RAW264.7细胞释放NO水平的影响

将RAW264.7细胞接种在24孔板(1×10⁵个/孔)中，设置空白对照组、模型组、药物处理组。药物处理组加入不同浓度IB(异补骨脂色烯查耳酮)预处理1h后，与模型组同时加入LPS(1μg/mL)处理24h。收集上清，1500r/min离心5min。根据硝酸还原法NO试剂盒说明书，检测上清液中的NO水平。结果见图1。

2、ELISA法检测异补骨脂色烯查耳酮对炎症因子水平的影响

将分化成熟的3T3-L1脂肪细胞，设置空白对照组、模型组和药物处理组。药物处理组加入IB预处理1h后，与模型组同时加入TNF-α(15ng/mL)处理24h。收集上清，1500r/min离心5min。

将RAW264.7细胞接种在24孔板(1×10⁵个/孔)中，设置空白对照组、模型组、药物处理组。药物处理组加入不同浓度IB预处理1h后，与模型组同时加入LPS(1μg/mL)处理24h。收集上清，1500r/min离心5min。

根据所测因子相应ELISA酶联免疫试剂盒说明书进行操作。设置空白孔和待测标本孔加样，37℃温育30min后洗涤，之后除空白孔外加入酶试剂，温育30min后洗涤。加显色剂，避光显色15min，添加终止液，450nm波长测量吸光度。依次分析RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β炎症因子水平。结果见图3。

3、Western blotting法检测异补骨脂色烯查耳酮对炎症信号通路相关蛋白表达的影响

(a)实验所需溶液配制：

①10×TBS配制：称取NaCl 80g，Tris-base 24.2g，加入900mL双蒸水，置于磁力搅拌器上搅拌溶解。使用浓盐酸调至pH为7.6，使用1000mL容量瓶定容，室温保存备用。

②TBST溶液配制：先将10×TBS稀释成1×TBS，每500mL 1×TBS加入2.5mL吐温20即得，室温保存备用。

③1.5M Tris HCl配制：精确称取18.17g Tris-base，加入80mL双蒸水，置于磁力搅拌器上搅拌溶解。用浓盐酸调pH至8.8，定容至100mL，室温保存备用。

④1.0M Tris-HCl配制：称取12.11g的Tris-base加入到80mL的双蒸水中，然后用单双向磁力加热搅拌器搅拌至均匀，采用100mL容量瓶定容至100mL，最后用浓盐酸调pH至6.8，室温保存备用。

⑤30％丙烯酰胺配制：取29g的丙烯酰胺和1g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺，加入到100mL的蒸馏水中，然后使用磁力搅拌器使其完全溶解，最后于4℃保存备用。

⑥1×蛋白电泳缓冲液配制：取Tris-base 3.03g，甘氨酸18.77g，SDS 1g加蒸馏水定容至1000mL，室温保存备用。

⑦10×转膜缓冲液配制：取Tris-base 30.3g，glycine 142.6g，加蒸馏水900mL，使用磁力搅拌器搅拌溶解，定容至1L，室温保存备用。

⑧1×转膜缓冲液配制：50mL 10×转膜缓冲液中先加入350mL蒸馏水，再加入100mL甲醇，混匀即得，4℃保存备用。

⑨细胞裂解混合液配制：RIPA强裂解液:磷酸酶抑制剂:PMSF＝100:1:1的比例进行配制混匀，置于冰上，现用现配。

(b)实验方法：

①总蛋白提取：确定造模成功的脂肪细胞，给予不同浓度异补骨脂色烯查耳酮作用48h。收集细胞，加入细胞裂解混合液，于冰上裂解30min。将裂解物在4℃下12000g离心10min，取上清。

②蛋白浓度测定：用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。首先取BCA工作液：Cu试剂以50:1的比例配制备用。于96孔板中加入18μL PBS稀释液，再加入2μL蛋白样品(设置3个复孔)，最后每孔加入200μL BCA工作液，充分混匀，37℃温育30min，后置于265nm波长测量吸光度。代入标准曲线y＝0.766x+0.998，得出蛋白浓度。

③分离目标蛋白：在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶(使用表1配制的8％分离胶，37℃恒温放置30min，然后加入5％浓缩胶，37℃恒温放置30min即获得10％SDS聚丙烯酰胺凝胶)中，加入指示Marker，分离相同量的蛋白样品(30/60μg)。将其在含有1×电泳缓冲液的垂直电泳槽中，80V，30min，进行蛋白浓缩。待蛋白跑至分离胶时，将电压调为120V，60min，进行蛋白分离。

表1. 10％SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制

④转膜：为了方便抗体的孵育，将胶转移至PVDF膜上。使用转印槽，加入预冷的1×转膜缓冲液。72V，60min，进行转膜。

⑤封闭：用于减少抗体的非特异性结合。将PVDF膜用5％脱脂奶粉(TBST为溶剂)封闭2h。

⑥孵育一抗：根据Marker指示，确定目标蛋白位置。根据抗体说明书所述比例，使用TBST稀释一抗，-20℃保存备用。将含有目标蛋白的PVDF膜条带与其相对应的一抗于4℃分别孵育过夜。

⑦洗膜：一抗孵育过后，洗去抗体非特异性结合。将蛋白条带放入含有TBST溶液中，置于摇床240r/min洗涤5次，每次5min。

⑧孵育二抗：根据抗体说明书所述比例，使用TBST稀释二抗，–20℃保存备用。根据一抗来源，将洗涤过后的膜转至相应辣根过氧化物酶标记的相应二抗中，室温孵育1h。

⑨洗膜：二抗孵育过后，洗去抗体非特异性结合。将蛋白条带放入含有TBST溶液中，置于摇床240r/min洗涤5次，每次5min。

⑩显影分析：使用Ecl Plus超敏发光液，根据使用说明配制显影液(现用现配，注意避光)。滤纸吸去条带上多余的TBST，将显影液均匀涂抹在条带上。与多色荧光、化学发光和可见光成像仪上进行显影，分析。条带灰度采用Image软件定量分析，以GAPDH作为内参。结果见图5和图7。

4、实时荧光定量PCR法检测异补骨脂色烯查耳酮对炎症因子mRNA表达量的影响

细胞处理与收集：3T3-L1脂肪细胞接种于6孔板(6×10⁵/孔)，使用TNF-α(15ng/mL)造模。

RAW264.7巨噬细胞，接种于6孔板(1×10⁶/孔)，使用LPS(1μg/mL)进行造模。

分别设置空白对照组、模型组、药物处理组。药物处理组给予浓度为50μM的异补骨脂色烯查耳酮。不同处理组作用24h后，移弃上清液，PBS洗3次。移弃PBS控净晾干，Trizol法提取各孔总RNA。于6孔板中每孔加入1mL Trizol混匀，室温放置5min，使细胞充分裂解，收集全部细胞于EP管中，加入约200μL氯仿，上下摇动混匀，室温下静置5min，于4℃离心机12000rpm，15min。吸取上层水相。加入等体积异丙醇，摇晃混匀，静置10min，于4℃离心机12000rpm，10min。吸弃上清液，此时RNA 沉于管底。加入1mL 75％预冷乙醇，移液枪小心洗涤沉淀。于4℃离心机12000rpm，10min，离心后移弃上清液。通风处放置样品5min使其晾干，加入30μL无酶水，吹打使其溶解。检测RNA浓度与纯度。根据制造商的说明使用带有gDNAEraser试剂盒的PrimeScriptTMRT试剂盒逆转成cDNA。由TB GreenTM ExTaqTMⅡ(TliRNadeH Plus)，Bulk试剂盒测定mRNA的表达。数据表示为2^-ΔΔct。相关引物序列见表2。结果见图3(D、E和F)

表2引物序列

5、免疫荧光检测异补骨脂色烯查耳酮对RAW264.7巨噬细胞NF-κB通路中p65核移位的影响

爬片：于6孔板中央滴100μL DMEM高糖培养基，选用灭菌处理的盖玻片，小心铺在6孔板底部(注意避免气泡，以免盖玻片漂浮)。

细胞处理：将RAW264.7细胞(1×10⁶个/孔)接种于6孔板中，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜。设置空白对照组、模型组、药物处理组。药物处理组给予IB(50μmol/L)预处理1h，然后同模型组同时用LPS(1μg/mL)刺激12h。

细胞固定：细胞处理后，小心弃去培养基，每孔加入1mL PBS洗涤3次，动作轻柔，避免细胞掉落。弃尽PBS，每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定20min，后用PBS洗涤3次。

细胞穿透：使用0.5％Triton X-100在室温下渗透10min。PBS洗涤3次。

孵育一抗：小心取出盖玻片，与抗NF-κB/p65的一抗(1:100稀释)在4℃孵育过夜。

孵育二抗：将盖玻片重新放入6孔板中，PBS洗涤3次，用荧光IgG兔二抗体室温孵育1h。

细胞核染色：PBS洗涤2次，每孔加入500μL DAPI进行细胞核染色，5min。

观察拍照：于载玻片上加入100μL抗荧光淬灭剂，小心放上盖玻片。与共聚焦显微镜观察p65在细胞核中的易位。结果见图6。

6、Transwell检测异补骨脂色烯查耳酮对巨噬细胞浸润脂肪细胞的影响

将分化成熟的3T3-L1脂肪细胞与DMEM培养基一起培养24h，收集培养基(CM)置于Transwell小室的下室。将RAW264.7细胞接种在24孔板(1×10⁶个/孔)中，设置空白对照组、模型组和药物处理组。药物处理组加入异补骨脂色烯查耳酮(50μm)50预处理1h后，与模型组同时加入LPS(1μg/mL)处理6h。各组分别收集处理过后的细胞(5×10³个/孔)接种于上室。

将分化的3T3-L1脂肪细胞设置空白对照组、模型组和药物处理组。药物处理组加入异补骨脂色烯查耳酮(50μm)预处理1h后，与模型组同时加入TNF-α(15ng/mL)处理12h。分别收集培养基置于小室的下室。将RAW 264.7细胞(5×10³个/孔)接种于上室。

小室按上述方法分别处理后，放置于37℃、5％CO₂培养箱迁移4h。取出小室，用PBS洗涤3次，4％甲醛固定30min，结晶紫染色15min。用棉签擦去上室细胞，置于镜下20倍拍照。结果见图2。

(5)数据处理

以上实验均进行3次重复，实验结果采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。实验数据以

表示。两组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05为有统计学意义。

(6)试验结果

图1给出了不同浓度异补骨脂色烯查耳酮对巨噬细胞NO水平的影响。使用ELISA与实时荧光定量PCR法检测异补骨脂色烯查耳酮对RAW264.7细胞分泌NO水平及iNOS mRNA表达的影响。结果显示，与空白对照组相比，模型组中LPS显著增加NO水平(P<0.001)，表明巨噬细胞炎症模型建立成功。加入异补骨脂色烯查耳酮处理后，细胞极显著降低了NO的含量(P<0.001)。实时荧光定量PCR结果显示，异补骨脂色烯查耳酮在浓度为50μmol/L时显著降低iNOS的基因转录水平(P<0.001)，这与抑制NO释放的结果相一致。据此推测，异补骨脂色烯查耳酮可抑制iNOS的基因表达，进而抑制RAW264.7细胞释放NO。

图2给出了异补骨脂色烯查耳酮对巨噬细胞向脂肪细胞迁移的影响。通过Transwell小室观察巨噬细胞向脂肪细胞迁移的现象，检测异补骨脂色烯查耳酮对巨噬细胞浸润脂肪细胞的影响。由图可知，经LPS处理后的巨噬细胞，和经TNF-α处理后的脂肪细胞，都会进入炎症状态，导致巨噬细胞向脂肪细胞迁移的数量增加。加入IB处理后，可抑制巨噬细胞向脂肪细胞浸润的现象。

图3给出了异补骨脂色烯查耳酮对巨噬细胞炎症因子及趋化因子分泌的影响。使用ELISA与实时荧光定量PCR法检测异补骨脂色烯查耳酮对RAW264.7细胞炎症因子分泌及其mRNA表达的影响。结果显示，异补骨脂色烯查耳酮可抑制RAW264.7细胞的TNF-α、IL-6和IL-1β炎症因子(图3A、B和C)的产生及对应基因表达(图3D、E和F)。

图4给出了异补骨脂色烯查耳酮对脂肪细胞炎症因子及趋化因子分泌的影响。结果显示，异补骨脂色烯查耳酮可抑制脂肪细胞炎症因子TNF-α、IL-6(图4D和E)及趋化因子MCP-1、MCP-1α(图4A和B)分泌及MCP-1αmRNA表达(图4C)的影响，具有改善脂肪细胞炎症的作用。

图5给出Western blotting法检测异补骨脂色烯查耳酮对RAW264.7巨噬细胞内NF-κB和MAPK信号通路的影响。结果显示，与空白对照组相比，LPS诱导后RAW264.7细胞中P38、ERK和JNK蛋白磷酸化水平显著升高，并且RAW264.7细胞核内磷酸化p65表达水平也得到了上调，促进NF-κB由胞浆转至细胞核。25～100μmol/L浓度的异补骨脂色烯查耳酮处理可明显抑制P38和ERK蛋白的磷酸化水平(P<0.001)，但在50μmol/L、100μmol/L浓度时异补骨脂色烯查耳酮未显示抑制JNK磷酸化蛋白表达。此外，异补骨脂色烯查耳酮在25～100μmol/L浓度下均可抑制细胞核内p65磷酸化。据以上结果推测异补骨脂色烯查耳酮改善RAW264.7巨噬细胞炎症水平，可能与抑制NF-κB和MAPK信号通路有关。

图6给出了异补骨脂色烯查耳酮对p65核移位现象的影响。为了进一步探索异补骨脂色烯查耳酮对NF-κB信号通路的影响，本研究使用免疫荧光实验观察了p65核移位现象。结果表明，巨噬细胞经LPS处理后，其p65向核内转移增加。之后使用异补骨脂色烯查耳酮50μmol/L处理细胞，可发现p65核移位现象明显受到了抑制。这进一步表明异补骨脂色烯查耳酮抑制NF-κB信号通路是触发炎症产生的关键步骤，从而改善巨噬细胞炎症状态。

图7给出了异补骨脂色烯查耳酮对炎症信号通路NF-κB、JNK和SOCS-3相关蛋白表达的影响。为了对异补骨脂色烯查耳酮改善脂肪细胞炎症作用机制进行深入探索，对炎症相关通路进行检测。结果显示，异补骨脂色烯查耳酮在浓度为25、50和100μmol/L时，均可显著抑制脂肪细胞p65蛋白磷酸化(P<0.001)。与高浓度相比，异补骨脂色烯查耳酮在低浓度时更显著地抑制JNK蛋白磷酸化水平。同时，异补骨脂色烯查耳酮可在25、50和100μmol/L浓度水平下抑制SOCS-3蛋白的表达(P<0.001)。由此可得，异补骨脂色烯查耳酮可通过抑制NF-κB、JNK和SOCS-3信号通路改善脂肪细胞炎症。

综上可以看出：本发明所述化合物异补骨脂色烯查耳酮可改善脂肪细胞炎症，其改善机制可能是异补骨脂色烯查耳酮可通过抑制其自分泌趋化因子，从而减少巨噬细胞向脂肪细胞浸润。可通过抑制巨噬细胞炎症因子分泌，及抑制巨噬细胞内炎症信号通路NF-κB和MAPK，来减少巨噬细胞炎症反应。同时异补骨脂色烯查耳酮可通过抑制脂肪细胞NF-κB、JNK和SOCS-3炎症信号通路，来抑制脂肪细胞分泌促炎症因子，减少脂肪细胞炎症。由此充分说明：化合物异补骨脂色烯查耳酮可改善脂肪细胞炎症，可用作制备抗炎药物。

Claims (4)

1.异补骨脂色烯查耳酮在制备抗炎药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，异补骨脂色烯查耳酮通过抑制巨噬细胞浸润脂肪细胞，及减少脂肪细胞炎症因子释放来改善炎症。

3.异补骨脂色烯查耳酮与本领域常规辅料复配制成具有降血糖功效的复方制剂。

4.如权利要求3所述的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂的剂型为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂或注射剂。

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