CN110314184A - 华佗再造丸在制备防治高血脂症的药物中的应用 - Google Patents

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张春波
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Abstract

本发明涉及华佗再造丸在制备防治高血脂症的药物中的应用。本发明通过大量的体内外药效和机制试验发现，华佗再造丸对高脂血症的疗效确切，具有良好的治疗高脂血症的作用。其中，华佗再造丸可降低C57BL/6小鼠体内总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL‑C)、丙二醛(MDA)水平，提高高密度脂蛋白(HDL‑C水平)，降低体重，减小脂肪细胞大小，减少肝脏脂肪沉积，提高糖耐量和胰岛素敏感性。

Description

华佗再造丸在制备防治高血脂症的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种华佗再造丸在制备防治高血脂症的药物中的应用。
背景技术
高脂血症是指各种原因导致的血浆中总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)和(或)低密度脂蛋白(LDL)过高和(或)高密度脂蛋白(HDL)过低的一种代谢性疾病，其本质是人体内脂质代谢、转运的紊乱，是导致脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病的重要因素之一。
高脂血症使动脉壁细胞内自由基活性增强，而机体的脂质过氧化也产生许多对机体具有毒性的代谢产物，其中毒性最大的是丙二醛(MDA)，MDA是氧自由基与生物膜上多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的产物，其产生的量与氧自由基的量及脂质过氧化的程度呈正相关，故检测MDA可反映氧自由基的水平及脂质过氧化的程度。MDA在肝组织脂肪变和肝损伤方面起了十分重要的作用，可使致炎因子基因表达释放增强，影响酶活性等，从而干扰脂肪酸的氧化，导致脂肪在肝内蓄积。超氧化物歧化酶(SOD)是重要的抗氧化活性酶，能清除自由基，保护机体组织。所以高脂血症常导致机体MDA活性增强而SOD活性降低。而药物对MAD及SOD活性的影响可反应其对高脂血症及心脑血管疾病的治疗作用。
随着社会的进步和生活水平的提高，人们的生活方式和饮食习惯发生了变化，我国高血脂症患病率也明显升高，2016年中国成人高血脂症总患病率高达40.40％。在高脂血症治疗方面，目前应用较多的贝特类、他汀类调脂药物均存在一定的副作用：长期服用贝特类调脂药物容易引起肝肾损伤，他汀类则会导致肝脏发生组织细胞的生物学变化；另外大剂量使用他汀类药物有可能导致横纹肌溶解，尤其是心脏横纹肌，与贝特类联合使用时横纹肌溶解几率增加
中医药在防治高脂血症方面较西药有明显优势，毒副作用较低。华佗再造丸处方选用川芎、吴茱萸、冰片等中药，主要用于治疗中风后遗症，但是未有关于治疗高脂血症的报道。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种华佗再造丸在制备防治高血脂症的药物中的应用。
本发明的另一目的是华佗再造丸在制备防治动脉粥样硬化的药物中的应用。
本发明的另一目的是提供华佗再造丸在制备防治脂肪肝的药物中的应用。
本发明的再一目的是提供华佗再造丸在制备防治糖尿病合并高血脂症的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于中医理论的痰瘀脾肾虚论治，结合对高血脂症的系统认识和现代药理学对中药防治高血脂症的科学研究，进行了大量的体内外药效和机制试验，采用高脂饮食诱导建立小鼠高脂血症模型，通过灌胃给药方式，动态监控给药后小鼠生长状况及血脂水平变化等指标，并采用生化检测及病理组织形态学方法，进而发现华佗再造丸对小鼠高脂血症的治疗作用。为中医药临床治疗高脂血症提供更多有效、低副作用的治疗手段。
华佗再造丸在治疗高脂血症药物中的应用具体表现在：华佗再造丸可降低C57BL/6小鼠体内总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙二醛(MDA)水平，提高高密度脂蛋白(HDL-C水平)，降低体重，减小脂肪细胞大小，减少肝脏脂肪沉积，提高糖耐量和胰岛素敏感性，以达到治疗高脂血症的作用。
附图说明
图1：造模第8周正常组(NCD)与高脂血症模型组(HFD)的体重统计图(A)和血脂水平统计图(B)；
图2：各组药物对小鼠的葡萄糖：葡萄糖耐量试验的血糖值曲线图(A)、胰岛素耐量试验的血糖值曲线图(B)、葡萄糖耐量试验的AUC统计图(C)、胰岛素耐量试验的AUC统计图(D)、小鼠空腹血糖值统计图(E)；
图3：各组药物对小鼠肝脏中各生化指标的影响：小鼠肝脏中TC水平统计图(A)、小鼠肝脏中TG水平统计图(B)、小鼠肝脏中MDA水平统计图(C)、小鼠肝脏中SOD活力统计图(D)；
图4：给药后各组小鼠肝脏及附睾脂肪组织重量变化：小鼠的肝指数(A)、小鼠的附睾脂肪指数(B)；
图5：各组小鼠的附睾脂肪细胞图；
图6：各组药物对附睾脂肪细胞大小的影响；
图7：各组小鼠的肝脏组织及脂肪细胞图；
图8：各组药物对肝脏组织及脂肪细胞大小的影响。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供一种华佗再造丸在制备防治高血脂症的药物中的应用。
在一些实施例中，所述高血脂症为血浆总胆固醇浓度升高引起的高血脂症
在一些实施例中，所述高血脂症为血浆甘油三脂浓度升高引起的高血脂症
在一些实施例中，所述高血脂症为血浆低密度脂蛋白胆固醇浓度升高引起的高血脂症。
本发明的另一目的是提供一种华佗再造丸在制备防治动脉粥样硬化的药物中的应用；进一步地，是华佗再造丸在制备防治高血脂症引起的动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种华佗再造丸在制备脂肪肝的药物中的应用；进一步地，是华佗再造丸在制备防治高血脂症引起的脂肪肝疾病药物中的应用。
本发明的另一目的是提供华佗再造丸在制备降低血糖同时防治高血脂症的药物中的应用。
本发明的另一目的是提供华佗再造丸在制备防治糖尿病合并高血脂症药物中的应用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例所使用材料：
1.实验材料
1.1药物：
华佗再造丸(批号:17022，广州白云山奇星药业有限公司)；
辛伐他汀片(批号：20171124，杭州默沙东制药有限公司)；
1.2实验动物
C57小鼠，雄性，8周龄，SPF级，华中科技大学同济医学院动物中心SPF级动物实验室饲养。
1.3试剂及耗材
正常饲料(批号：1710210103，北京华阜康生物科技股份有限公司)；高脂饲料(Research Diet D12492，脂肪含量60％)；总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等生化指标检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、多聚甲醛、EP管、冻存管；50％葡萄糖，人胰岛素(Novolin R)，生理盐水，血糖仪及血糖试纸(三诺生物)，15mL离心管，5mL注射器，1mL注射器，定时器，刀片，纱布，小鼠固定器，记录纸及其它常用试剂及耗材等。
1.4仪器
酶标仪(型号：RT-6100，深圳雷杜生命科学股份有限公司)、台式低速离心机(型号：TGL-60G，上海安亭科学仪器)、-80℃超低温冰箱(DW-86L388L，青岛海尔生物医疗股份有限公司)、显微镜及拍照系统(OLYMPUS CX31)、恒温箱(型号：SPX-250C，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、AUW 220D型双量程分析天平(日本岛津公司，感量为0.1mg/0.01mg)、移液枪(eppendorf)及其它常用仪器等。
2.小鼠高脂血症模型建立
8周龄雄性C57BL/6小鼠，共120只，适应性饲养3天后，随机分成2组。正常组15只，正常饲料饲养；模型组105只，高脂饲料饲养。造模周期持续8周，每4周1次进行眼眶静脉取血(禁食12h)，检测血脂水平(TC、TG、LDL-C、HDL-C)，模型组与正常组比较以判断造模是否成功。
3.动物分组及给药
在小鼠高脂血症模型造模成功后，对上述模型组实验动物进行再次分组处理(每组15只，确保给药前各组TC水平基本一致)，并开始每日1次分组灌胃给药。具体分组安排如下:
(1)正常组(Normal chow diet，NCD)：正常饲料饲养，0.5％(m/v)CMC-Na水溶液灌胃。
(2)高脂模型组(High fat diet，HFD)：高脂饲料饲养，0.5％CMC-Na溶液灌胃。
(3)华佗再造丸低剂量组(Low dose group of HTZZ，LH)：高脂饲料饲养，低剂量华佗再造丸丸(1g/kg/d混悬于0.5％(m/v)CMC-Na水溶液)灌胃。
(4)华佗再造丸中剂量组(Middle dose group of HTZZ，MH)：高脂饲料饲养，中剂量华佗再造丸(2g/kg/d混悬于0.5％(m/v)CMC-Na水溶液)灌胃。
(5)华佗再造丸高剂量组(High dose group of HTZZ，HH)：高脂饲料饲养，高剂量华佗再造丸(4g/kg/d混悬于0.5％(m/v)CMC-Na水溶液)灌胃。
(6)药物联用组(Combination group of HTZZ，CH)：高脂饲料饲养，中剂量华佗再造丸(2g/kg/d，混悬于0.5％(m/v)CMC-Na水溶液)与半剂量辛伐他汀(3mg/kg/d，混悬于0.5％CMC-Na溶液)联用灌胃。
(7)辛伐他汀组(Simvastatin group，Sim)：高脂饲料饲养，辛伐他汀(6mg/kg/d，溶于0.5％(m/v)CMC-Na水溶液)灌胃。
4.体重记录及血脂监测
给药开始后，每周1次记录各组实验动物体重及进食量变化，同时每4周1次进行眼眶静脉取血(禁食12h)并检测血脂水平(TC、TG、LDL-C、HDL-C)。比较给药组与模型组血脂水平变化情况，动态判断药效是否显著。
5.腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)和腹腔注射胰岛素耐量试验(IPITT)
5.1 IPGTT
注射液的配制：根据注射剂量1.5g/kg，配制成15％的葡萄糖溶液(50％葡萄糖3ml与7ml生理盐水混溶)。
小鼠准备：实验前一天下午5点将小鼠换入干净笼子禁食16小时，至次日上午9点，禁食期间，小鼠保持正常饮水。次日开始葡萄糖耐量实验。称取每只小鼠体重，并用标记笔在小鼠尾根部标记序号。
空腹血糖测定：将小鼠放于固定器中，用刀片割去小鼠尾巴末端约1-2mm，轻轻挤压小鼠尾巴，让血液富集成一滴，用血糖仪搭配血糖试纸测定空腹血糖，测定值认定为0min的血糖值，即空腹血糖值。
IPGTT：按照标准的腹腔注射操作给小鼠注射葡萄糖溶液(10mL/kg)后，在第15min、30min、60min、90min、120min测定每只小鼠各个时间点的血糖值。
5.2 IPITT
注射液的配制：根据注射剂量0.75μ/kg，配制成0.1μ/mL胰岛素溶液，4℃保存。
小鼠准备：于实验当天上午9点将小鼠换入干净笼子禁食6小时。禁食期间，小鼠保持正常的饮水；下午开始胰岛素耐量实验。称取每只小鼠体重，并用标记笔在小鼠尾根部标记序号。
0min血糖值的测定：将小鼠放于固定器中，用刀片割去小鼠尾巴末端约1-2mm，轻轻挤压小鼠尾巴，让血液富集成一滴，用血糖仪搭配血糖试纸测定血糖，测定值认定为0min的血糖值。
IPITT：按照标准的腹腔注射操作用1mL注射器给小鼠注射胰岛素溶液(7.5uL/g)后,在第15min、30min、60min、90min、120min测定每只小鼠各个时间点的血糖值。
6.动物处理及样本采集
给药结束后，集中处理各组实验动物(禁食12h)，一次性完成摘眼球取血、肝脏及附睾脂肪组织取材。全血样本室温静置1小时，待血液凝固后，4000rpm离心10min，收集血清样本，-80℃冻存(用作生化指标检测、冻存留样以备后续新增的检测分析)。肝脏、附睾脂肪组织取材后，生理盐水(置于冰上)漂洗，在纱布上翻动擦拭，称重，切成约50mg的方块，其中一小块附睾脂肪组织浸入多聚甲醛，用于石蜡切片HE染色。剩余组织样本-80℃冻存，用于生化指标检测、冰冻切片及油红O染色、冻存留样以备后续新增的检测分析。
7.生化指标检测
检测方法按试剂盒说明书所述步骤分别进行：①血清TC、TG、LDL-C、HDL-C，②肝脏TC、TG、SOD、MDA检测。
8.病理形态分析
8.1.附睾脂肪组织石蜡切片、HE染色
附睾脂肪组织浸入4％多聚甲醛中避光固定；在有盖的玻璃瓶中按50％→70％→80％→95％→100％→100％乙醇的顺序脱水，每个步骤0.5h；按顺序1/2二甲苯+1/2无水乙醇(20min)→纯二甲苯Ⅰ(15min)→纯二甲苯Ⅱ(25min)透明组织；将处理的材料置于1/2石蜡+1/2二甲苯中，56℃水浴40min，再放入石蜡Ⅰ90min、石蜡Ⅱ90-120min，以除去组织中的透明剂，恒温箱中保持0.5h，并保持箱内温度在55-60℃左右；提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用包埋盒至于60℃的烫板上，倒入材料，补足石蜡全部凝固后可取出晾干；石蜡块切片，厚度4-10μm；切片浮值粘片剂上，展开烫平，用滤纸吸去多余水分，放入温箱中烘干，温度为30-40℃过夜；进行脱蜡和染色，纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5—10min)→1/2二甲苯+1/2无水乙醇→100％无水乙醇→95％乙醇→85％乙醇→70％乙醇→50％乙醇→自来水冲洗10s→切片放入苏木精中染色约10-30min→用自来水流水冲洗约15min使片变蓝；分化和漂洗，将切片放入1％盐酸乙醇液中褪色，约2s，见切片变红，颜色较浅即可。切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色；脱水和复染，切片如50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇中各3-5min。用0.5％一红乙醇液对比染色1-3min，将切片放入95％乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5min。最后滤纸吸干多余的乙醇，将切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各3-5min；中性树胶封存。
8.2.肝脏组织冰冻切片、油红O染色
肝脏组织从-80℃取出后置于液氮罐中，然后包埋切片，自然风干；蒸馏水浸洗，60％异丙醇浸洗2min；油红O染色10min(37℃温箱)；60％异丙醇调色25s。蒸馏水洗；苏木素复染1.5min；自来水冲洗返蓝；明胶甘油封片。
8.3.病理拍照及染色结果判读分析
采用显微镜及拍照系统(OLYMPUS CX31)进行组织切片拍照，每张切片选取3-5个代表性区域，采用Image J图像分析软件进行病理形态学定量统计分析。
9.数据统计分析
实验数据以Mean±SD表示，采用Graphpad Prism 6软件进行数据统计分析及实验结果作图，两组间数据显著性差异分析采用student’s t-test，多组间数据显著性差异分析采用One-way ANOVA post hoc Tukey’s multiple comparisons t-test，显著性差异判断标准为p＜0.05(表示差异有统计学意义)。
二、实验结果
1.C57小鼠高脂血症模型造模情况
造模周期8周，每周1次记录各组实验动物体重，同时每4周1次进行眼眶静脉取血(禁食12h)并检测血脂水平(TC、TG、LDL-C、HDL-C)，结果见图1。结论：高脂模型造模成功，与正常组比较，模型组体重明显增加(p<0.05)；血脂水平TC(p<0.01)、TG(p<0.01)、LDL-C(p<0.05)均明显增高。
2.华佗再造丸对小鼠体重的影响
结果如表1所示。给药周期8周，同一周内比较高脂模型组与正常组的体重水平变化情况，结果表明高脂模型组的体重有明显增加(p<0.01)。同一周内比较给药组与高脂模型组的体重水平变化情况，结果表明华佗再造丸低剂量组、高剂量组、联用组对均能明显减轻小鼠体重(p<0.05)，效果最好的是联用组。
比较同组小鼠给药0-8周内的体重变化，计算每周体重差ΔW(ΔW＝W-W0周)，结果表明华佗再造丸低剂量组(ΔWmax＝-2.990±1.425、p>0.05)、中剂量组(ΔWmax＝-0.391±5.468、p>0.05)、高剂量组(ΔWmax＝-5.734±2.459、p<0.01)、联用组(ΔWmax＝-4.713±2.425、p<0.01)在给药期间对小鼠体重均有不同程度的降低作用，其中高剂量组和联用组的体重变化有统计学意义。
表1给药8周内小鼠体重变化(n＝9)
##p<0.01、#p<0.05表示同一周内与正常组比较有显著差异，*p<0.05表示同一周内与模型组组比较有明显差异，ΔΔp<0.01表示该组小鼠在给药期间的最低体重与0周时的初始体重比较有显著差异。
3.华佗再造丸对小鼠血脂水平的影响
结果如表2所示，比较给药组与模型组血脂水平变化情况：与正常组相比，高脂模型组血脂水平显著性改变(p<0.01)。与高脂模型组比较，联用组可显著降低TC及TG水平(p<0.01)、降低LDL-C水平(p<0.05)、显著升高HDL-C水平(p<0.01)，低剂量组明显降低小鼠血清中的TG(p<0.01)和LDL-C水平(p<0.05)、显著升高HDL-C水平(p<0.01)，中剂量组明显降低小鼠血清中的TG(p<0.05)和LDL-C水平(p<0.01)、显著升高HDL-C水平(p<0.01)，高剂量组可明显降低小鼠血清中的TC和TG(p<0.01)及LDL-C(p<0.05)水平、显著升高HDL-C水平(p<0.01)。
表2给药8周小鼠血清内TC，TG，LDL-C和HDL-C水平(n＝9)
##p<0.01表示同一周内与正常组比较有显著差异，*p<0.05、**p<0.01表示同一周内与模型组组比较有显著差异。
4.葡萄糖耐量及胰岛素耐量试验
结果见图2，与正常组相比，根据血糖时间趋势和曲线下面积(AUC)来看，给予高脂饲料的各组空腹血糖均上升，糖耐量降低，对胰岛素敏感性降低。与高脂模型组比较，高剂量组和联用组空腹血糖有明显降低(p<0.05)；高剂量组和联用组对糖耐量升高有作用，高剂量组有明显差异(p<0.05)；各给药组的胰岛素敏感性均升高，其中联用组对胰岛素敏感性升高效果有明显差异(p<0.05)。
5.华佗再造丸对小鼠肝脏生化指标的影响
检测肝脏中TC、TG、MDA的含量以及SOD活性。结果如图3所示，与正常组比较，模型组和各给药组SOD含量均升高但无显著性差异。高脂模型组的TC、TG、MDA含量均增加，TC、MDA有明显差异(p<0.05)。与模型组比较，低剂量组小鼠肝脏中的TC、TG、MDA含量明显降低(p<0.05)；中剂量组TC含量明显降低(p<0.05)，MDA降低但无显著差异；高剂量组TC、TG、MDA含量降低，其中TC显著性降低(p<0.01)，MDA明显降低(p<0.05)；联用组TG、MDA明显降低(p<0.05)。
6.华佗再造丸对小鼠肝指数和附睾脂肪指数的影响
结果如图4所示(肝指数(Liver index)＝肝脏重量/体重*100％；附睾脂肪指数(Epididymal index)＝附睾脂肪重量/体重*100％)，与正常组相比，高脂模型组肝指数明显降低(p<0.05)，附睾指数显著升高(p<0.01)。与高脂模型组比较，各组肝指数都有升高，但无显著性差异；低剂量组、高剂量组、联用组降低附睾指数，高剂量组和联用组附睾指数明显降低(p<0.05)。
7.华佗再造丸对小鼠附睾脂肪组织的影响
结果如图5、图6所示。与正常组相比，高脂模型组附睾脂肪细胞大小(Epididymaladipocyte size)显著性增加(p<0.01)。与高脂模型组相比，高剂量组降低脂肪细胞大小的效果最好，低剂量组、辛伐他丁组和联用组的脂肪细胞也有明显变小，有显著性差异(p<0.01)。
8.华佗再造丸对小鼠肝脏组织的影响
以油红O染色技术来估计该高脂模型小鼠肝脏的脂肪沉积以及进行细胞组织分析，结果如图7、图8所示。正常组小鼠肝细胞内未见红色脂滴，无脂肪变性，细胞结构正常大小均匀，肝组织光镜下结构完整，肝窦清晰可见，肝细胞索排列整齐；高脂模型组小鼠肝细胞内可见弥漫性大面积红色圆形脂滴，肝细胞肿胀，肝组织出现了大面积的脂肪变性，与正常组相比脂滴面积显著性增加(p<0.01)；与高脂模型组相比各个给药组的脂滴明显变小，肝组织较为完整，其中中剂量组有明显差异(p<0.05)，联用组有显著差异(p<0.01)。
以上实验表明，华佗再造丸给药干预后可不同程度改善高脂血症各方面表型，包括：①降低小鼠体重增长值。②降低小鼠血脂水平。③降低空腹血糖。④提高葡萄糖耐量。⑤提高胰岛素敏感性。⑥降低肝脏中TC、TG、MDA含量。⑦降低附睾脂肪指数。⑧降低附睾脂肪脂滴面积。⑨降低肝脂肪脂滴面积，保护小鼠肝细胞结构。持续给药干预具有预防和治疗高脂血症及高脂血症诱发的肥胖、脂肪肝及胰岛素抵抗等疾病。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.华佗再造丸在制备防治高血脂症的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高血脂症为血浆总胆固醇浓度升高引起的高血脂症。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高血脂症为血浆甘油三脂浓度升高引起的高血脂症。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高血脂症为血浆低密度脂蛋白胆固醇浓度升高引起的高血脂症。
5.华佗再造丸在制备防治动脉粥样硬化的药物中的应用。
6.华佗再造丸在制备防治脂肪肝的药物中的应用。
7.华佗再造丸在制备防治糖尿病合并高血脂症的药物中的应用。
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