CN113347965A - TGFβ抑制剂和前药 - Google Patents
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Abstract
公开了一种具有改善的TGFβ信号传导途径抑制活性、改善的治疗功效和改善的毒性特性的式(I)的化合物及其两种前药。还公开了包含所述TGFβ信号传导途径抑制剂及其前药的组合物。另外,本发明公开了所述式(I)的化合物及其前药,其用于治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病的方法。
Description
技术领域
本发明涉及具有改善的抑制活性、改善的治疗能力和改善的毒性特性的新型TGFβ信号传导途径抑制剂,以及其前药(包含香荚兰乙酮衍生的片段或者氨基甲酸酯片段),其圈闭(cage)TGFβ信号传导抑制活性,但是当所述前药发生水解时能够在体内递送活性更大的TGFβ信号传导途径抑制剂。还公开了包含所述TGFβ信号传导途径抑制剂及其前药的组合物。此外,本发明公开了所述TGFβ信号传导途径抑制剂及其前药,其用于治疗响应于TGFβ信号传导抑制的疾病的方法。
背景技术
转化生长因子β同工型TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3是小的分泌型同二聚体信号传导蛋白。它们仅存在于脊椎动物中,并且是多种器官和组织的正常发育以及体内平衡所需要的。调节细胞命运和TGFβ信号传导途径的功能的活性中的大部分(如果不是全部)由特异性受体复合物介导,所述特异性受体复合物在配体结合后组装并且包含TGFβII型受体和I型受体。
TGFβ受体(TGFβR)包括TGFβI型受体和TGFβII型受体。TGFβI型受体包括七种激活素(Activin)受体样激酶:ALK1(ACVRL1),ALK2(ACVR1),ALK3(BMPR1A),ALK4(ACVR1B),ALK5(TGFBR1),ALK6(BMPR1B)和ALK7(ACVR1C),并且TGFβII型受体包括TGFBR2,BMPR2,ACVR2A和ACVR2B。TGFβ配体使用ALK5/TGFBR1和TGFBR2以跨越细胞膜进行信号传导,并且因此是用于TGFβ途径的特异性抑制的靶标。尤其是ALK5已被用作使用小分子时的靶标,但是由于受体ALK4和ALK5是密切相关的,所以抑制剂特异性(对于它们中的任一种)是一个已知的问题。ALK4/ACVR1B介导来自TGFβ超家族的另外的分子(包括激活素A、GDF1、GDF11和Nodal)的信号传导。然而,与ALK5信号传导类似,ALK4活性已涉及组织纤维化(Jin.等人,Journal ofMecinal Chemistry 2014,57:4213-4238;Sugiyama M等人,Gastroentenology 1998,114(3):550-558;Matsuse T等人,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.1995,13(1):17-24;Pawlowski,J.E.等人,J.Clin.Invest.1997,100(3):639-648;Hübner,G.等人,Dev.Biol.1996,173(2):490-498;Munz,B.等人,EMBO J.1999,18(19):5205-5215;Wankell,M.等人,EMBO J.2001,20(19):5361-5372。因此,ALK4/ALK5的双重抑制可能会增强TGFβ途径抑制剂在纤维化疾病中的治疗功效。
TGFβ信号传导已涉及多种病理,包括遗传性病症(包括卡-恩二氏病(Camurati-Engelmann disease),马凡综合征(Marfan syndrome),肌营养不良(muscular dystrophy)和范可尼贫血(Fanconi Anemia)),肥胖,糖尿病,血液病(hematological disease),心血管疾病,皮肤病诸如牛皮癣(psoriasis)和纤维化疾病(fibrotic disease),并且在例如烧伤伤口的伤口愈合或瘢痕形成(scarring)中起到关键作用。
TGFβ信号传导在癌症进展中也起到关键作用。尽管TGFβ信号传导以复杂且迥然不同的方式潜在地影响肿瘤中的所有不同细胞类型,但是总体效果似乎强烈地促进肿瘤生长、侵袭和转移,特别是在疾病的晚期。因此,TGFβ信号传导途径的抑制在临床上是强烈相关的,并且人们正在积极进行靶向该途径的有效药剂的开发和测试。对于多种癌症类型正在进行临床试验,所述癌症类型包括血液癌症诸如多发性骨髓瘤(multiple myeloma)和骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome);脑癌诸如胶质母细胞瘤(glioblastoma);软癌诸如尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)和恶性胸膜间皮瘤(malignantpleural mesothelioma);以及实体瘤,包括乳腺癌(breast cancer)、胃和胃食管癌(gastric and gastroesophageal cancer)、结肠直肠癌症(colorectal cancer)、胰腺癌症(pancreatic cancer)、肝癌(liver cancer)、肺癌症(lung cancer)、卵巢癌症(ovariancancer)、前列腺癌症(prostate cancer)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)或黑素瘤(melanoma);以及与以上提及的癌症类型相关的转移。
文献Li等人(J.Med.Chem.2008,51(7):2302-2306)、WO02094833 A1和WO2014072517 A1描述了宽范围的用作TGFβ信号传导途径抑制剂的二氢吡咯并吡唑衍生物。
最近,已经证实,TGFβ信号传导抑制激活抗肿瘤免疫反应并且增强其他类型的免疫疗法,使得其在不久的将来有可能成为用于治疗不同类型的癌症的联合免疫疗法的组成部分(Batlle和Massagué.Immunity.2019,50(4):924-940)。已经证实,间质TGFβ信号传导的抑制释放了针对肿瘤细胞的免疫系统,并且这种治疗作用还可以治愈转移性疾病(即癌症患者死亡的主要原因)(Tauriello等人Nature.2018,554(7693):538-543.;Mariathasan等人Nature.2018,554(7693):544-548)。
尽管TGFβ途径已被广泛认为是潜在的治疗靶标,但是TGFβ途径的临床利用受到重要的毒性问题的阻碍。针对途径组分的多种小分子抑制剂和抗体的开发由于它们在临床前模型和患者中的广泛毒性而已被放弃(Garber,K.(2009).JNCI Journal of the NationalCancer Institute,101(24),1664–1667.)。小分子LY2157299(加尼西替尼(galunisertib))是一种已经在癌症患者中广泛测试的TGFβ途径抑制剂。加尼西替尼是TGFβ受体I(ALK5)的相对较弱的抑制剂(Herbertz S等人,Drug Design,Development andTherapy(药物设计、开发和疗法),2015,9:4479-4499),其已进入临床试验,最初用于脑癌,并且在过去的10年中已经在多种其他癌症类型中进行了测试(Herbertz S等人,DrugDesign,Development and Therapy(药物设计、开发和疗法),2015,9:4479-4499))。鉴于其在临床前模型中的相关毒性,包括口腔心血管、胃肠道、免疫、骨骼/软骨、生殖和肾脏毒性(Stauber等人,J Clin Pract 2014,4(3):1-10),加尼西替尼的施用剂量和频率二者在14天进行-14天停止的方案中均被限制为在人体中最大为300mg/天(Herbertz S等人,DrugDesign,Development and Therapy(药物设计、开发和疗法),2015,9:4479-4499)。然而,尽管在临床试验中进行了广泛测试,但是迄今为止使用这种剂量方案报道的加尼西替尼在癌症患者中的治疗作用是适度的或不存在的(Herbertz S等人;2015;Melisi等人,BritishJournal of Cancer,2018,119(10):1208–1214,;Kelley RK等人,Clin TranslGastroenterol.2019 Jul;10(7):e00056.;Brandes,A.等人,Neuro-Oncology,18(8):1146–1156.)。因此,在治疗剂量下表现出较低的毒性特性和增强的活性的TGFβ信号传导途径的抑制剂代表了重要的临床需要。
更一般而言,已知许多有效药物提供许多不良作用或者对健康的组织和细胞是有毒的。其他药物只能局部递送以避免药物的全身作用。前药是衍生自活性药剂或药物(母体化合物)的化合物,它们已被改性以调节性能诸如溶解性、吸收、分布、代谢、排泄和毒性。因此,前药是这样的化合物,其包括与降低或阻断活性的片段连接的母体化合物,而同时调节一种或多种性能诸如溶解性、吸收、分布、代谢、排泄和毒性。在这个意义上,Yoon等人(Molecular Cancer Therapeutics,2003,2(11):1171-1181)报道了使用酯连接的4-哌啶基哌啶基团作为活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱的前药。另外,Reiter等人(GreenChem.,2013,15(5):1373-1381)报道了利用LigF(β-醚酶)酶的木质素β-4芳基醚键的酶促裂解。
因此,本发明的一个目的是开发更有效的TGFβ信号传导途径抑制剂,其表现出改善的毒性特性和增强的治疗效果。
另外,本发明的目的还在于开发可以用于在靶组织或器官中更有效地递送药物的前药,从而避免不利或不希望的全身作用:产生高效的局部剂量,同时对身体的其余部分没有毒性。
发明内容
本发明涉及一种式(I)的化合物,或者其药用盐或药用溶剂化物:
本发明还涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含有效量的式I的化合物,或者其药用盐或药用溶剂化物,和/或至少一种药用赋形剂或载体,以及任选地,至少另一种活性成分。
另外,本发明涉及一种式I的化合物或者其药用盐或药用溶剂化物,或一种包含所述式I的化合物或者其药用盐或药用溶剂化物的药物组合物,其用作药物,特别是用于治疗响应于TGFβ途径抑制剂的疾病。
本发明还涉及一种式I的化合物的前药,其中所述前药是式(II)的前药或者其药用盐或药用溶剂化物:
其中
-R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,环烷基,卤代烷基,羟基烷基,氨基烷基,烷酰基氨基,烷氧基,芳基,烷基芳基,芳基烷基,氨基,N-烷基氨基和N,N-二烷基氨基;并且
-R2和R3各自独立地选自由H、烷基和卤代烷基组成的组。
本发明还涉及一种式I的化合物的前药,所述前药具有式(III),或者其药用盐或药用溶剂化物:
此外,本发明涉及一种式I的化合物的前药,所述前药具有式(IV),或者其药用盐或药用溶剂化物:
此外,本发明还涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含有效量的式I的化合物的前药,该前药选自式II的前药或式III的前药或式IV的前药,或者其药用盐或药用溶剂化物,以及至少一种药用赋形剂或载体。
本发明还涉及一种式I的化合物的前药,该前药选自式II的前药或式III的前药或式IV的前药,或者其药用盐或药用溶剂化物,或者一种包含所述前药或者药用盐或药用溶剂化物的药物组合物,其用作药物,特别是用于治疗响应于TGFβ途径抑制剂的疾病。特别地,用于响应于TGFβ信号传导途径的抑制的疾病,该疾病选自由以下各项组成的组:癌症(cancer),硬皮病(scleroderma),牛皮癣(psoriasis),贫血(anemia),少肌症(sarcopenia),阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease),马凡综合征(Marfan syndrome),动脉瘤(aneurysm),肺动脉高压(pulmonary hypertension),成骨不全(osteogenesisimperfecta),特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis),肝纤维化(liverfibrosis),肝硬化(cirrhosis),肝脂肪变性(hepatic steatosis),肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy),骨髓纤维化(myelofibrosis),I型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type I),纤维化肾病(fibrotic kidney disease),局灶性节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis),辐射诱发性纤维化(radiation-induced fibrosis),系统性硬化中的皮肤纤维化(skin fibrosis in systemicsclerosis),弥漫系统性硬化(diffuse systemic sclerosis),瘢痕形成(scarring),角膜原发性翼状胬肉(corneal primary pterygium),纤维化(fibrosis),子宫平滑肌瘤(uterine leiomyoma),肥胖(obesity),糖尿病(diabetes),糖尿病性视网膜病和肾病中的微血管病(microangiopathy in diabetic retinopathy and nephropathy),并且更特别地用于治疗癌症。
附图说明
图2:肝转移切片的照片,通过免疫组织化学法对磷酸化的SMAD2进行染色:箭头指向染色的细胞核,表明在对照(媒介物)中具有活性TGFβ信号传导,但是在用式I的化合物、式IV的化合物或加尼西替尼治疗的小鼠中没有这样的信号传导。在三天期间给予等摩尔剂量(5x)的加尼西替尼、式I的化合物和式IV的化合物。
图3:小鼠肝转移起始测定,作为对植入小鼠肿瘤类器官(Mouse Tumor Organoid,MTO)的具有免疫能力的小鼠的TGFβ抑制和相关抗癌功效的读数。相对于用空媒介物治疗的对照,在80mg/kg b.i.d.的加尼西替尼(其转换为2mg/小鼠,假定平均重量为25g)的标准小鼠剂量的0.3x、1x、3x和9x的摩尔当量下用式I的化合物或加尼西替尼治疗后,测量肝转移(LiM)的数量(y轴)。未测试0.3x加尼西替尼的剂量(0.6mg/小鼠b.i.d.)(n.t.)。
图4:作为用于TGFβ抑制和相关抗癌功效的读数的小鼠肝转移起始测定。由利用植入具有免疫能力的小鼠中的表达荧光素酶的MTO进行的活体成像定量的归一化生物发光信号显示出,在第3天和第14天之间,在用不同剂量(80mg/kg b.i.d.的标准小鼠加尼西替尼剂量的0.3x、1x和3x摩尔当量)的式I的化合物和加尼西替尼治疗后的肿瘤生长和排斥。
图5:式I的化合物(相对于加尼西替尼)在HEK293T细胞中的体外细胞毒性测定。DMSO用作对照。
图6:利用纯化的LigF进行4-甲基伞形酮香荚兰乙酮(式II的前药并且特别是式III的前药的模型化合物)的β-酮醚部分的酶促裂解的体外荧光测定。该图示出了相对于时间的荧光。
图7:利用稳定表达LigF(用于4-甲基伞形酮香荚兰乙酮(MUAV)(式II的前药并且特别是式III的前药的模型化合物)的β-酮醚部分的细胞酶促裂解)的HEK293T细胞的体外荧光测定。该图示出了相对于时间,暴露于LigF的不同浓度的MUAV的荧光。标示了三个浓度的MUAV底物:10μM(实心正方形)、30μM(三角形)和100μM(实心圆圈)。利用100μM MUAV但没有LigF的对照以空心圆圈示出。
图8:纯化的LigF裂解式VII的前药的β醚键得到4-OHT的HPLC-MS实验。(A)阴性对照。(B)时间=0。(C)时间=1小时。(D)时间=3小时。(E)时间=44小时。
图9:通过质谱法测量的式VII的前药(作为异构体E和Z显示)转化为4-OHT(示出了异构体Z和E二者)的定量;作为在不同时间点处(x轴)的以总体的百分比计的相对丰度(y轴)。
图10:利用对4-OHT敏感或不敏感(携带或不携带普遍存在的Cre-ERT2蛋白)的MEF的表达β-醚酶的小鼠肠肿瘤类器官的共培养测定,并且用式VII的化合物或4-OHT治疗剂进行治疗。示出了通过FACS分析测量的重组细胞的分数。
图11:在以1μM和10μM施用4-OHT、前药VII的细胞或者利用DMSO的对照中的TCF4-ERT2融合蛋白的归一化基因表达。
图12:对于小鼠肝脏切片的EGFP的免疫组织化学染色(所述小鼠肝脏表达Ub-Cre-ERT2和mTmG报告基因盒二者),用阴性对照(油,图12A)或用1μmol(图12B)或5μmol(图12C)的式VII的化合物进行处理。
图13:作为TGFβ信号传导抑制和相关抗癌功效的读数的小鼠肝转移形成测定。将MTO植入C57BL/6小鼠,并且在接种肿瘤细胞后两天开始用标示化合物进行治疗。标示化合物的治疗功效通过测量其抑制肝转移形成的能力来评估。以如下摩尔当量剂量用式I的化合物、式IV的化合物、化合物338或加尼西替尼治疗小鼠:9x,3x,1x,0.3x。对照小鼠用空媒介物进行治疗。在治疗后测量肝转移(LiM)的数量(y轴)。所有小鼠在接种肿瘤细胞后第2天至第14天接受治疗,并且在MTO接种后4周对转移进行计数。结果汇集自三个独立实验,通过数据点的形状(正方形、三角形或圆形)表示。相对于汇集的对照的P值表示为:*:<0.05;**:<0.001;***:<0.0001。它们的值为:Gal 1x:0.72;Gal 3x:0.0107;Gal 9x:0.0078;(IV)1x:0.075;(I)0.3x:0.026;(I)1x:0.0002;(I)3x:0.0004;(I)9x:0.035;338 1x:0.72;Mann-Whitney双尾检验。
图14:化合物在具有明显转移性疾病的小鼠中的治疗效果。将MTO植入具有免疫能力的小鼠,并且当转移性疾病明显时在接种后第16天对小鼠进行治疗。小鼠用ALK5抑制剂单独治疗或与抗检查点分子PD-1的抗体组合治疗。标示化合物的治疗功效通过测量其减少已确定的肝转移的数量的能力来评估。标示化合物以当量的1x摩尔剂量给予。对于抗体施用,每3天通过腹膜内注射200μg来治疗小鼠。对照小鼠用管饲媒介物和200μg IgG2a同种型对照抗体进行治疗。从第16天到第24天,小鼠接受治疗。在终点处测量肝转移的数量(LiM,y轴)。结果汇集自两个独立实验,通过数据点的形状(正方形或圆形)表示。相对于汇集的对照的P值表示为:*:<0.05;**:<0.001;***:<0.0001。它们的值为:Gal 1x:0.58;(I)1x:0.048;aPD-1:0.0068;Gal+aPD-1:0.18;(I)+aPD1:0.0001;Mann-Whitney双尾检验。
图15:化合物在具有明显转移性疾病的小鼠中的治疗效果。将MTO植入具有免疫能力的小鼠,并且当肝转移性疾病明显时在接种后第16天对小鼠进行治疗。治疗功效通过测量在用标示化合物治疗之后的小鼠存活百分比来评估,所述标示化合物以当量的1x摩尔剂量给予。对照小鼠用管饲媒介物进行治疗。从第16天到第24天,所有小鼠接受治疗。数据来自图14所示的相同实验。相对于汇集的对照的P值表示为:(I):0.0018;Gal:0.67;对数秩检验(Log-rank test)。
图16:将MTO植入具有免疫能力的小鼠,并且当转移性疾病明显时在接种后第16天对小鼠进行治疗。标示化合物的治疗功效通过测量存活百分比来评估,所述存活百分比是在以1x等摩尔剂量用抗-PD-1抗体(每3天200μg)或用使用抗-PD-1抗体加式I的化合物或加尼西替尼的联合免疫疗法进行治疗之后的存活百分比。对照小鼠用管饲媒介物和200μgIgG2a同种型对照抗体进行治疗。从第16天到第24天,小鼠接受治疗。数据来自图14所示的相同实验。相对于汇集的对照的P值表示为:(I)+aPD-1:<0.0001;aPD-1:0.0048;Gal+aPD1:0.43;对数秩检验。
图17:将MTO植入C57BL/6小鼠,并且在接种肿瘤细胞之后两天开始用标示化合物进行治疗。标示化合物的治疗功效通过测量其抑制肝转移形成的能力来评估。以1x使用式I的化合物、化合物338或化合物337对小鼠进行治疗。对照小鼠用空媒介物进行治疗。在治疗之后测量肝转移(LiM)的数量(y轴)。从接种肿瘤细胞后第2天到第18天,所有小鼠接受治疗。在MTO接种后21天对肝转移的数量进行计数。Ns是非显著性的,*表示通过Mann-Whitney双尾检验<0.05。
发明描述
本发明涉及一种式(I)的化合物,或药用盐,或它们的药用溶剂化物或多晶型物或共晶:
特别地,本发明涉及一种式I的化合物,或者其药用盐或药用溶剂化物。
本发明还涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含有效量的式I的化合物,或者其药用盐,或药用溶剂化物或多晶型物或共晶,以及至少一种药用赋形剂。
本发明涉及一种式I的化合物,或者包含所述化合物的药物组合物,其用作药物,特别是用于治疗响应于TGFβ途径的抑制或TGFβ信号传导的抑制的疾病。出于本发明的目的,术语“TGFβ途径的抑制剂”等同于术语“TGFβ信号传导途径的抑制剂”以及术语“TGFβ抑制剂”,并且这三个术语在整个说明书中无区别地使用。为此,出于本发明的目的,因此术语“响应于TGFβ途径的抑制的疾病”等同于术语“响应于TGFβ信号传导途径的抑制的疾病”。
式I的化合物是TGFβ途径的抑制剂。TGFβ信号传导途径的抑制剂可以抑制一种或多种选自由以下各项组成的组的TGFβ信号传导途径受体:ALK1,ALK2,ALK3,ALK4,ALK5,ALK6,ALK7,TGFBR2,BMPR2,ACVR2A和ACVR2B。因此,本发明还涉及一种式I的化合物,其用于治疗响应于一种或多种TGFβ信号传导途径受体的抑制的疾病,其中TGFβ信号传导途径受体是TGFβ信号传导途径I型受体或TGFβ信号传导途径II型受体,并且选自由以下各项组成的组:ALK1,ALK2,ALK3,ALK4,ALK5,ALK6,ALK7,TGFBR2,BMPR2,ACVR2A和ACVR2B。因此,本发明涉及一种式I的化合物,其用作一种或多种选自由以下各项组成的组的TGFβ信号传导途径受体的抑制剂:ALK1,ALK2,ALK3,ALK4,ALK5,ALK6,ALK7,TGFBR2,BMPR2,ACVR2A和ACVR2B。
实施例2的表1中包含的结果显示,相较于加尼西替尼,式I的化合物对ALK5具有令人惊讶的更高(8.6倍)的结合亲和力。这种比较已考虑到使用相同技术(KINOMEscanTM)的公开数据(Jonathan M等人,Oncotarget,2018,9(6):6659-6677)来进行。此外,式I的化合物在培养细胞中的ALK5激酶酶促活性抑制以及TGFβ信号传导抑制能力为加尼西替尼的约2.5倍,如在实施例2的表2以及图1中看到的。此外,选择性测定(KINOMEscanTM技术)显示,式I的化合物的特征在于,对ALK5的选择性相对于ALK1、ALK2和ALK3为三百多倍,相对于TGFBR2为100倍,并且相对于ACVR2B和ALK6分别为5倍和8倍,如实施例2(表1)中所描述的。此外,与加尼西替尼相比,式I的化合物对于所有测试蛋白质都具有更大的选择性。
因此,式I的化合物与现有技术化合物的结构差异令人惊讶地导致强烈改善的TGFβ信号传导抑制能力,其与更好的ALK5抑制相关。与现有技术化合物相比,比较对于ALK5的结合亲和力,式I的化合物也具有更大的选择性。另一方面,式I的化合物已经通过毒性筛选,包括对于遗传毒性的筛选、与不良药物反应强烈相关的蛋白质摄动(SafetyScreen44TM,如实施例2中所述)以及体内(小鼠)毒性(实施例4),从而表明与加尼西替尼相比,式I的化合物提供了改善的毒性特性,潜在地避免了对于间歇治疗的需要。
式I的化合物可以由在对位具有被掩蔽或保护的酚的对苯胺合成。在这个意义上,式I的化合物的合成可以使用不同的路线,如在方案1的逆合成分析中所看到的:
方案I
实施例1包括与根据优选合成路线(a)和(d)的式I的化合物的制备相对应的所有合成细节,但是合成路线(b)和(c)也是获得根据本发明的式I的化合物的合适路线。
方案II:路线(a)
路线(a)包括从被保护的对羟基苯胺开始的式I的化合物的合成,其中所述被保护的酚仅在结束时脱保护。在第一步骤中,在路易斯酸催化剂的存在下经由多布纳-米勒(Doebner-Miller)反应来获得6-甲氧基-4-甲基喹啉。多布纳-米勒反应在本领域中是熟知的(F.W.Chem.Rev.1944,35,153)。
在第二步骤中,在强碱(共轭酸的pKa高于17)和合适条件的存在下加入6-甲基吡啶甲酸甲酯来进行6-甲氧基-4-甲基喹啉的酰化。
最后,酮中间体到甲基保护的式I的化合物的转化通过以下方式进行:首先使用1-氨基吡咯烷-2-酮和碱(诸如二甲基吡啶)在迪安-斯塔克(Dean-Stark)条件下获得腙中间体,随后使用合适的条件进行环化,其在迪安-斯塔克条件下脱水后得到甲基保护的式I的化合物。
甲基可以通过使在AcOH中的HBr回流来移除,但是也可以使用其他常用脱保护条件,诸如BBr3、BCl3、TMSCl/NaI或BF3/RSH。
方案III:路线(b)
路线(b)包括与路线(a)等同的第一步骤,其中进行改良的对硝基苯胺的多布纳-米勒反应。第二步骤也包括在碱的存在下加入6-甲基吡啶甲酸甲酯对6-硝基-4-甲基喹啉进行酰化。以与路线(a)等同的方式来进行完成腙的形成以及环化的后续步骤。通过任一已知方法(H2/Pd/C;Sn/HCl等)进行硝基衍生物的还原,并且通过重氮盐的水解将氨基转化为酚。
方案IV:路线(c)
路线(c)包括与路线(a)等同的第一步骤,其中使用对氟苯胺和氧化剂(诸如氯醌)来进行改良的多布纳-米勒反应。第二步骤也包括在强碱的存在下加入6-甲基吡啶甲酸甲酯来进行6-氟-4-甲基喹啉的酰化。以与路线(a)等同的方式来进行完成腙的形成以及环化的后续步骤。氟衍生物到酚的转化可以以多种方式进行,所述方式包括过渡金属催化,或使用乙酰氧基氧肟酸,如Fier和Maloney(Org.Lett.2016,18,2244)所述。
方案V:路线(d)
方案V(续):路线(d)
路线(d)包括与路线(a)等同的第一步骤,其中使用空气作为氧化剂来进行改良的对溴苯胺的多布纳-米勒反应。第二步骤也包括在强碱的存在下通过添加6-甲基吡啶甲酸甲酯来进行6-溴-4-甲基喹啉的酰化。以与路线(a)等同的方式来进行完成腙的形成以及环化的后续步骤。随后,式I的化合物可以利用宫浦硼基化(Miyaura borylation)来获得(T.Ishiyama,M.Murata,N.Miyaura,J.Org.Chem.1995,60:7508–7510),其中芳基溴经由与二硼酯(diboronyl ester)诸如双(频哪醇合)二硼(B2Pin2)的Pd催化的交叉偶联反应而转化为对应的硼酸酯。偶联经由Pd(0)/Pd(II)机制进行,因此任何Pd(0)源都可以进行该反应。在一个优选的实施方案中,[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(Pd(DPPF)Cl2)是适当的试剂。在不进行任何进一步纯化的情况下,可以将硼酸酯用过氧化氢氧化,并且在随后的在碱性介质中的水解之后,获得式I的化合物。
本发明还涉及前药。前药是衍生自活性药剂或药物(母体化合物)的化合物,其已被改性以调节性能诸如溶解性、吸收、分布、代谢、排泄和毒性。因此,前药是这样的化合物,其包括与降低或阻断活性的片段连接的母体化合物,而同时调节一种或多种性能诸如溶解性、吸收、分布、代谢、排泄和毒性。
特别地,本发明涉及式I的化合物的前药。
本发明的一个实施方案涉及一种式I的化合物的前药,其中所述前药具有式II,或者其药用盐,或药用溶剂化物或多晶型物或共晶:
其中
-R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,环烷基,卤代烷基,羟基烷基,氨基烷基,烷酰基氨基,烷氧基,芳基,烷基芳基,芳基烷基,氨基,N-烷基氨基和N,N-二烷基氨基;并且
-R2和R3各自独立地选自由H、烷基和卤代烷基组成的组。
一个实施方案涉及一种式I的化合物的前药,其中所述前药具有式II,或者其药用盐或药用溶剂化物,其中R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,环烷基,卤代烷基,羟基烷基,氨基烷基,烷酰基氨基,烷氧基,芳基,烷基芳基,芳基烷基,氨基,N-烷基氨基和N,N-二烷基氨基;R2是甲基并且R3是H。在另一个实施方案中,R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,卤代烷基,氨基烷基和羟基烷基;R2是甲基并且R3是H。
在本发明的一个优选实施方案中,R1是H,R2是甲基并且R3是H,并且式I的化合物的前药是式(III)的前药,或者其药用盐,或药用溶剂化物或多晶型物或共晶:
优选地,式I的化合物的前药是式(III)的前药,或者其药用盐或药用溶剂化物。如实施例1中例示的,式III的前药通过以下方式获得:将式I的化合物的酚基用具有被保护的香荚兰乙酮酚基的香荚兰乙酮卤代衍生物进行烷基化反应,随后对香荚兰乙酮部分进行脱保护。
在另一个优选的实施方案中,式I的化合物的前药是式(IV)的前药,或者其药用盐,或药用溶剂化物或多晶型物或共晶:
优选地,式I的化合物的前药是式(IV)的前药,或者其药用盐或药用溶剂化物。如实施例1中例示的,通过式I的化合物与4-哌啶基哌啶-1-羰基氯的反应来获得式IV的前药。
术语“包括”应被理解为包括一组特征(A,B,C),然而其不排除其中还包括其他特征的实施方案,只要它们不会使得所述实施方案不可行即可。另外,出于本发明的目的,所述术语“包括”还涵盖其中仅包括所述特征(A,B,C)的实施方案,在这种情况下可以由术语“由……组成”代替。
术语“药用盐”是指任何药用盐,其在施用至患者后能够(直接或间接地)提供如本文所述的化合物。
这样的盐优选地是酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐的实例包括无机酸加成盐,诸如例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐,以及有机酸加成盐,诸如例如乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐的实例包括无机盐,诸如例如钠盐、钾盐、钙盐和铵盐,以及有机碱盐,诸如例如乙二胺盐、乙醇胺盐,N,N-二亚烷基乙醇胺盐(N,N-dialkylenethanolamine)、三乙醇胺盐和碱性氨基酸盐。然而,应当理解,非药用盐也落入本发明的范围内,因为它们可用于制备药用盐。用于盐形成的程序在本领域中是常规的。
在本发明的一个实施方案中,式I的化合物的药用盐是碱加成盐或酸加成盐。在一个优选的实施方案中,所述式I的化合物的药用盐选自由以下各项组成的组:钠盐,钾盐,钙盐,铵盐,烷基铵盐,二烷基铵盐,三烷基铵盐,乙醇胺盐,N,N-二亚烷基乙醇胺盐和氨基酸盐。
在另一个优选的实施方案中,所述式I的化合物的药用盐选自由以下各项组成的组:盐酸盐,氢溴酸盐,氢碘酸盐,硫酸盐,硫酸氢盐,硝酸盐,磷酸盐,磷酸氢盐,乙酸盐,三氟乙酸盐,马来酸盐,富马酸盐,柠檬酸盐,乳酸盐,草酸盐,琥珀酸盐,葡糖酸盐,酒石酸盐,马来酸盐,扁桃酸盐,甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。
在本发明的一个实施方案中,式II的前药并且特别是式III的前药的药用盐是酸加成盐。在一个优选的实施方案中,所述式II的化合物并且特别是式III的前药的药用盐选自由以下各项组成的组:盐酸盐,氢溴酸盐,氢碘酸盐,硫酸盐,硫酸氢盐,硝酸盐,磷酸盐,磷酸氢盐,乙酸盐,三氟乙酸盐,马来酸盐,富马酸盐,柠檬酸盐,乳酸盐,草酸盐,琥珀酸盐,葡糖酸盐,酒石酸盐,马来酸盐,扁桃酸盐,甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。
在本发明的一个实施方案中,式IV的化合物的药用盐是碱加成盐或酸加成盐。在一个优选的实施方案中,所述式IV的化合物的药用盐选自由以下各项组成的组:盐酸盐,氢溴酸盐,氢碘酸盐,硫酸盐,磷酸盐,乙酸盐,三氟乙酸盐,马来酸盐,富马酸盐,柠檬酸盐,草酸盐,琥珀酸盐,酒石酸盐,苹果酸盐,扁桃酸盐,甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。最优选地,式IV的化合物的药用盐是盐酸盐。
在另一个优选的实施方案中,所述式IV的化合物的药用盐选自由以下各项组成的组:钠盐,钾盐,钙盐,铵盐,烷基铵盐,二烷基铵盐,三烷基铵盐,乙醇胺盐,N,N-二亚烷基乙醇胺盐和氨基酸盐。
根据本发明的术语“溶剂化物”应理解为意指根据本发明的活性化合物的任何形式,其中所述化合物通过非共价键结合至另一个分子(通常为极性溶剂),这尤其包括水合物和醇化物。在本发明的一个实施方案中,药用溶剂化物是醇化物。在本发明的一个实施方案中,药用溶剂化物是水合物。在本发明的一个实施方案中,式I的化合物、式II的前药、式III的前药或式IV的前药是一水合物。
术语“多晶型物”是指这样的晶型,其具有相同的化学组成但是具有形成晶体的分子、原子和/或离子的不同空间排布。因此,相同的式I的化合物或者其药用盐或药用溶剂化物可以包括不同的晶体多晶型物,这取决于形成所述晶型的原子或离子的空间排布。
式I的化合物是具有改善的抑制能力和低的毒性特性的TGFβ信号传导途径抑制剂,如在实施例2至4以及实施例8至10中所显示的。
因此,一个实施方案涉及一种式I的化合物,或者其药用盐,或药用溶剂化物或多晶型物或共晶,其用于治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病。优选地涉及一种式I的化合物,或者其药用盐或药用溶剂化物,其用于治疗响应于TGFβ途径抑制的疾病。
在与所述药剂或药物连接的片段裂解后,前药转化为母体化合物。这可以通过多种酶来进行。
在代谢时,式I的化合物的前药释放式I的化合物,并且因此局部地施用至肿瘤,从而以这种方式防止全身途径抑制,所述全身途径抑制在进行TGFβ信号传导途径的连续抑制时会产生不良影响。因此,式I的化合物的前药也可用于预防和/或治疗响应于TGFβ途径的抑制的疾病。
如在图1和表2中看到的,式I的化合物的前药,即式II、式III和式IV的前药,在体外具有降低的TGFβ信号传导抑制能力,但是在体内递送式I的化合物,即式II、式III和式IV的前药是在体内代谢从而释放式I的活性化合物的前药。
实际上,式IV的前药的4-哌啶基哌啶基团提供水溶性并且经由通过例如在肝细胞和肠细胞中表达的体内羧基酯酶的水解而裂解。
因此,当施用式IV的前药时,在通过肝细胞和肠细胞中的羧基酯酶的水解后释放式I的化合物。主要优点在于,其在降低的全身毒性的情况下允许施用高局部剂量以及TGFβ信号传导抑制。
另一方面,式II的前药并且特别是式III的前药的香荚兰乙酮衍生的片段可以通过酶诸如细胞色素P450酶家族(主要存在于肝脏中)而被氧化和裂解,所述酶水解酯键,从而递送式I的化合物。另一方面,式I的化合物也可以使用来自非哺乳动物来源的特定β-醚酶而由其式II的前药获得,所述酶诸如细菌鞘脂菌属物种(Sphingobium sp.)菌株SYK-6酶LigE和LigF,或真菌污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)Ds-GST1,其可以与式Ⅱ的前药联合施用,并且优选地与式III的前药联合施用。
因此,一个实施方案涉及式II的前药,其用于治疗响应于TGFβ途径的抑制的疾病,其中β-醚酶与式II的化合物一起、在其之后或在其之前施用。一个优选的实施方案涉及式III的前药,其用于治疗响应于TGFβ途径的抑制的疾病,其中β-醚酶与式III的化合物一起施用或在其之后施用。实施例6显示在利用4-甲基伞形酮的香荚兰乙酮醚以及利用4-羟基他莫昔芬的香荚兰乙酮醚进行的模型实验中,LigF(一种β-醚酶)如何能够水解醚键,从而使香荚兰乙酮片段裂解。
在一个特别的实施方案中,在表达β-醚酶的细胞中施用所述β-醚酶作为细胞疗法,例如过继性T细胞转移或树突细胞疫苗接种。备选地,在另一个特别的实施方案中,任选地在具有谷胱甘肽的情况下,将β-醚酶与肿瘤或基质特异性的抗体偶联施用。某些组织诸如肺衬壁包含高细胞外水平的谷胱甘肽,并且因此不需要施用谷胱甘肽。
式II、式III和式IV的前药或者其药用盐或溶剂化物作为TGFβ信号传导途径抑制剂具有大幅降低的活性,使得它们可以在对TGFβ途径具有很少影响或没有影响的情况下施用,除非β醚键被裂解。
当施用式II或式III的前药或者其药用盐或溶剂化物时,在目标肿瘤间质中,在局部施用β-醚酶后释放式I的化合物。主要优点在于,其允许在降低的全身毒性的情况下施用高局部剂量以及TGFβ信号传导途径抑制。
另一方面,式I的化合物的前药(具有式IV),或其药用盐,还在体外提供降低的TGFβ信号传导抑制活性,并且当在体内施用时,通过在不同身体组织细胞诸如肝细胞和肠细胞中表达的羧基酯酶的酶促作用而在体内发生水解并且产生式I的化合物。
然后发现在体内实验中,相较于有效的加尼西替尼剂量,式I的化合物在低得多的剂量下(实际上低至十分之一)是有效的。此外,在有效剂量下,式I的化合物不具有毒性(体内总体的或在组织切片上病理学的),而在鼠相关剂量下的加尼西替尼确实有毒性(参见实施例2至4)。如在图1和表2中看到的,式I的化合物的前药,诸如式III的前药和式IV的前药,在体外具有低至多达十分之一的TGFβ信号传导抑制能力,这表明式I的化合物的TGFβ信号传导抑制能力被成功圈闭或阻断。
图2示出了式I的化合物的高TGFβ信号传导抑制活性,而在体外并未显示显著的TGFβ信号传导抑制活性的式IV的前药在体内提供高TGFβ信号传导途径抑制活性,这是由于所述前药在体内水解,从而递送式I的活性化合物。
因此,本发明的一个实施方案涉及一种式I的化合物的前药,其中所述前药是式II的前药,或者其药用盐,或药用溶剂化物或多晶型物或共晶,其用作药物,特别是用于治疗响应于TGFβ信号传导的疾病。优选地,所述前药是式III的前药。一个优选的实施方案涉及一种式III的化合物,或者其药用盐或药用溶剂化物,其用作药物,特别是用于治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病。
另一个实施方案涉及式I的化合物,或者其药用盐,或药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,或包含所述式I的化合物的组合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病。
一个另外的实施方案涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含式I的化合物,或者其药用盐,或药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,以及至少一种药用赋形剂,和任选的一种另外的活性成分或治疗剂。
出于本发明的目的,术语“活性成分”或“治疗剂”是指改善或增强本发明的化合物或其前药的治疗效果的另一种化合物或疗法。
本发明的另一个实施方案涉及一种式I的化合物的前药,其中所述前药是式IV的前药,或者其药用盐,或药用溶剂化物或多晶型物或共晶,其用作药物,特别是用于治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病。优选地,式IV的化合物,或者其药用盐或药用溶剂化物,其用作药物,特别是用于治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病。
本发明的一个备选实施方案涉及单独或配制为组合物(特别是药物组合物)的所述式I的化合物或其前药(即式II、式III和式IV的前药)或者其药用盐或溶剂化物作为药物的用途,所述组合物至少包含与至少一种具有加合或协同生物活性的其他活性化合物或治疗剂组合的所述式I的化合物或其前药(即式II、式III和式IV的前药)。
在这个意义上,本发明的一个实施方案涉及式I的化合物或其前药(即式II、式III和式IV的前药)或者其药用盐或溶剂化物,或者包含所述化合物中的至少一种的药物组合物,其用于与其他癌症靶向疗法或与化学疗法组合预防和/或治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病。
出于本发明的目的,术语“化学疗法”是指通过杀死细胞或通过使它们停止分裂来起到使癌细胞的生长停止的作用的任何治疗。
因此,本发明的一个实施方案涉及式I的化合物或其前药(即式II、式III和式IV的前药)或者其药用盐或溶剂化物,或者包含所述化合物中的至少一种的药物组合物,其用于与化学疗法或与化疗剂组合使用。特别地,与选自由以下各项组成的组的一种化疗剂组合:铂基抗肿瘤剂,抗有丝分裂的化疗剂,聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂,I型拓扑异构酶抑制剂,II型拓扑异构酶抑制剂,埃博霉素(epothilone),环骨架破坏素(cycloskeletal disruptor),烷基化剂,埃博霉素,组蛋白脱乙酰酶抑制剂,激酶抑制剂,抗叶酸剂,激酶抑制剂,肽类抗生素,类视黄醇(retinoids),长春花生物碱,以及胸苷酸合酶抑制剂。优选地,该化疗剂选自由以下各项组成的组:环磷酰胺(cyclophosphamide),异环磷酰胺(ifosfamide),白消安(busulfan),替莫唑胺(temozolomide),氮芥(mechlorethamine),苯丁酸氮芥(chlorambucil),美法仑(melphalan),达卡巴嗪(dacarbazine),柔红霉素(daunorubicin),阿霉素(doxorubicin),柔红霉素(daunorubicin),表柔比星(epirubicin),伊达比星(idarubicin),米托蒽醌(mitoxantrone),戊柔比星(valrubicin),紫杉醇(paclitaxel),多西他赛(docetaxel),abraxane,泰索帝(taxotere),埃博霉素(epothilone),伏立诺他(vorinostat),罗米地辛(romidepsin),伊立替康(irinotecan),托泊替康(topotecan),喜树碱(camptothecin),依沙替康(exatecan),勒托替康(lurtotecan),依托泊苷(etoposide),替尼泊苷(teniposide),他氟泊苷(tafluposide),硼替佐米(bortezomib),厄洛替尼(erlotinib),吉非替尼(gefitinib),伊马替尼(imatinib),维莫非尼(vemurafenib),维莫德吉(vismodegib),阿扎胞苷(azacitadine),硫唑嘌呤(azathioprine),卡培他滨(capecitabine),阿糖胞苷(cytarabine),克拉屈滨(cladribine),氟达拉滨(fludarabine),去氧氟尿苷(doxifluridine),氟尿嘧啶(fluorouracil),吉西他滨(gemcitabine),羟基脲(hydroxyurea),巯基嘌呤(mercaptopurine),甲氨蝶呤(methotrexate),培美曲塞(pemetrexed),硫鸟嘌呤(tioguanine),博来霉素(bleomycin),放线菌素(actinomycin),卡铂(carboplatin),顺铂(cisplatin),奥沙利铂(oxaliplatin),维甲酸(tretinoin),阿利维A酸(alitretinoin),贝沙罗汀(bexarotene),长春碱(vinblastine),长春新碱(vincristine),长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)。
出于本发明的目的,术语“癌症靶向疗法”是指靶向癌症的特定基因、蛋白质或有助于癌症生长和存活的组织环境的任何类型的疗法。因此,本发明的一个实施方案涉及一种式I的化合物或其前药(即式II、式III和式IV的前药)或者其药用盐或溶剂化物,或者包含所述化合物中的至少一种的组合物,其用于与癌症靶向疗法组合预防和/或治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病,优选地,所述癌症靶向疗法选自由以下各项组成的组:激素疗法,信号转导抑制剂,基因表达调节剂,细胞凋亡诱导剂,血管生成抑制剂,免疫治疗剂,递送毒性分子的单克隆抗体,癌症疗法和基因疗法。
因此,本发明的一个实施方案涉及一种式I的化合物或其前药(即式II、式III和式IV的前药)或者其药用盐或溶剂化物,或者包含所述化合物中的至少一种的组合物,其用于与免疫疗法组合预防和/或治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病。
出于本发明的目的,术语“免疫疗法”是指激活免疫系统以杀死癌细胞的免疫治疗剂、化合物或成分。更优选地,免疫疗法或免疫治疗剂是免疫检查点抑制剂并且甚至更优选地是抗PD-1或PDL1抑制剂。
在这个意义上,本发明的另一个实施方案涉及一种式I的化合物或其前药(即式II、式III和式IV的前药)或者其药用盐或溶剂化物,或者包含所述化合物中的至少一种的药物组合物,其用于与免疫治疗剂(优选地,免疫检查点抑制剂;更优选地,抗-PD1或PDL1抑制剂;还更优选地,抗-PD1抗体)组合预防和/或治疗响应于TGFβ信号传导途径抑制的疾病。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是在T细胞上表达的跨膜蛋白,其充当负调节T细胞激活并且引起免疫系统下调的免疫检查点。在施用后,抗-PD-1单克隆抗体结合并抑制PD-1及其下游信号传导途径,从而通过激活T细胞和针对肿瘤细胞的细胞介导的免疫反应来恢复免疫功能。
在一个优选的实施方案中,所述至少一种其他活性化合物或治疗剂选自由以下各项组成的组:抑制PD1的溶瘤病毒,和抗PD-1或PDL1的抗体,抑制PD-1或PDL1的双特异性单克隆抗体,抑制PD-1或PDL-1的小分子,拮抗PD-1的蛋白质和靶向PD-1的疫苗。
在一个优选的实施方案中,所述至少一种其他活性化合物或治疗剂选自由以下各项组成的组:纳武单抗(nivolumab),派姆单抗(pembrolizumab),西米普利单抗(cemiplimab),卡瑞利珠单抗(camrelizumab),信迪利单抗(sintilimab),特瑞普利单抗(toripalimab),替雷利珠单抗(tislelizumab),阿特珠单抗(atezolimumab),阿维单抗(avelumab),德瓦鲁单抗(durvalumab),KN-035,CK-301,AUNP12,CA-170,BMS-986189,MDX-1105,MEDI0680,LY3300054,LY-3434172,APL-502,bintrafusp alfa,CS-1001,SHR-1316,BGBA-333,CX-072,GEN-1046,GS-4224,IO-103,KD-005,KLA-167,KN-046,拉泽替尼(lazertinib),STIA-1014,WP-1066,ADG-104,BCD-135,BCD-135,FAZ-053,FPT-155,FS-118,HLX-20,IBI-318,INBRX-105,INCB-86550,JS-003,洛达利单抗(lodapolimab),LP-002,MCLA-145,MSB-2311,RG-6084,SHR-1701,SL-279252,STIA-1015,LYN-00102,ACE-05,AP-201,AP-505,AVA-004,AVA-021,BBI-801,BH-2996h,BH-29XX,CA-327,CDX-527,CTX-8371,DPDL-1E,DSP-105,DSP-106,Gensci-047,HS-636,IBI-322,IBI-323,IKT-201,IMM-2505,JBI-426,KD-033,KY-1043,ND-021,PH-790,PMC-122,PRS-344,SNA-02,STT-01,TJL-14B,TJL-1C4,TJL-1D5,TJL-1H3,TJL-1I7,Toca-521,VXM-10,Y-111,ABM-101,ABP-160,AVA-027,AVA-040,DB-002,DB-003,IMC-2101,IMC-2102,IMM-2510,TE-7212,TXB-4BC3,YBL-007,YBL-008,ALN-PDL,BH-2941,BMS-936559,CBA-0710,GXP-2,HTI-1316,IGEM-P,IMM-25,IMM-2502,IMM-2503,IMM-2504,IO-104,KD-036,KY-1003,KY-1055,MSB-002,PMC-305,STIA-100X,STIA-1010,STIA-1011,STIA-1012,STIB-010X,LY-3415244,AK-103,AK-104,AK-105,AK-106,多斯塔利单抗(dostarlimab),HLX-10,prolgolimab,斯巴达珠单抗(spartalizumab),APL-501,巴替利单抗(balstilimab),BAT-1306,BI-754091,西利单抗(cetrelimab),GLS-010,MGA-012,匹地利珠单抗(pidilizumab),SCTI-10A,AMG-404,BCD-217,布格利单抗(budigalimab),CC-90006,CS-1003,F-520,HAB-21,HX-009,IBI-318,JTX-4014,LY-3434172,LZM-009,MEDI-5752,MGD-013,MGD-019,ONO-4685,RO-7121661,萨善利单抗(sasanlimab),sulituzumab,Sym-021,XmAb-20717,XmAb-23104,AK-112,PSB-205,AK-123,ALPN-202,AM-0001,ANB-030,BH-2922,BH-2950,BH-2954,BH-2996h,CB-201,CB-213,CBT-103,CBT-107,CTX-8371,GNR-051,HEISCOIII-003,IBI-319,KEY-Vaxx,LD-01,LD-10,MD-402,mDX-400,OT-2,PC-101,PEGMP-7,PH-762,PRS-332,PT-001,RO-7247669,SG-001,TSR-075,AT-16201,DB-004,IKT-202,IMT-200,KF-082,LBL-006,SSI-361,YBL-006,JY-034,TRS-007,AMP-224,AUR-012,BGB-108,BH-2941,BLSM-101,CX-188,ENUM-244C8,ENUM-388D4,IMM-1802,MEDI-0680,SNA-01,STIA-1110和Sym-016。
备选地,所述组合物可以用至少一种惰性成分作为载体或赋形剂(诸如:共溶剂,表面活性剂,油,湿润剂,润滑剂,防腐剂,稳定剂和抗氧化剂)配制。可以使用任何药理学上可接受的缓冲剂,例如TRIS或磷酸盐缓冲剂。
另一个实施方案涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含式I的化合物的前药(所述前药具有式II或式III),或者其药用盐,或药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,以及至少一种药用赋形剂,和任选的一种另外的活性成分。又一个实施方案涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含式I的化合物的前药(所述前药具有式IV),或者其药用盐,或药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,以及至少一种药用赋形剂,和任选的一种另外的活性成分。
另一个实施方案涉及式I的化合物的前药,或者其药用盐,或药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,或者包含所述式I的化合物的前药的组合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗响应于TGFβ信号传导抑制的疾病。一个优选的实施方案涉及式II的前药,更优选地式III的前药,或式IV的前药在制备药物中的用途,所述药物用于治疗响应于TGFβ信号传导抑制的疾病。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于治疗响应于TGFβ信号传导抑制的疾病的方法,所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的式I的化合物,或者其药用盐,或药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,或者包含所述式I的化合物的组合物。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于治疗响应于TGFβ信号传导抑制的疾病的方法,所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的式I的化合物的前药,或者其药用盐,或药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,或者包含所述式I的化合物的前药的组合物。优选地,式I的化合物的前药是式II或式III或式IV的前药。一个优选的实施方案涉及一种用于治疗响应于TGFβ信号传导抑制的疾病的方法,所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的式II或式III或式IV的前药,或者其药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,或者包含所述前药的组合物。
在本发明的一个实施方案中,响应于TGFβ信号传导途径的抑制的疾病选自由以下各项组成的组:癌症,硬皮病,牛皮癣,贫血,少肌症,阿尔茨海默病,马凡综合征,动脉瘤,肺动脉高压,成骨不全,特发性肺纤维化,肝纤维化,肝硬化,肝脂肪变性,肥厚型心肌病,骨髓纤维化,I型神经纤维瘤病,纤维化肾病,局灶性节段性肾小球硬化,辐射诱发性纤维化,系统性硬化中的皮肤纤维化,弥漫系统性硬化,瘢痕形成,角膜原发性翼状胬肉,纤维化,子宫平滑肌瘤,肥胖,糖尿病,糖尿病性视网膜病和肾病中的微血管病。在一个特别的实施方案中,瘢痕形成是病理性皮肤(skin)瘢痕形成、皮肤(cutaneous)瘢痕形成或角膜瘢痕形成。
在一个特别的实施方案中,响应于TGFβ信号传导途径的抑制的疾病还包括动脉再狭窄(arterial restenosis)。
在癌症进展中,TGFβ信号传导已涉及细胞增殖、血管生成、上皮细胞到间充质细胞转化、免疫浸润和调节、转移性传播以及耐药性。如之前所提及的,TGFβ信号传导途径的总体作用似乎强烈地促进肿瘤生长、侵袭和转移。
在一个优选的实施方案中,响应于TGFβ信号传导途径的抑制的疾病是癌症。在一个优选的实施方案中,癌症是实体瘤。在另一个优选的实施方案中,癌症不是实体癌。在一个另外的优选实施方案中,癌症是小儿癌症。
如在图3中看到的,与参考化合物加尼西替尼相比,即使在加尼西替尼的等摩尔剂量的三分之一下,式I的化合物也提供改善的阻断肝转移形成的能力。
图13示出了,与加尼西替尼相比,并且出乎意料地还与现有技术所公开的参考化合物4-[2-(甲基-吡啶-2-基)5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-喹啉-7-醇(参考化合物338)相比,式I的化合物如何表现出治疗活性的巨大改善并且以大得多的程度阻断肝转移形成:
如所看到的,图13中示出的结果是高度出乎意料的,因为参考化合物338是式I的化合物的结构异构体,其具有在喹啉部分的7位处的酚羟基,而式I的化合物的特征在于所述酚羟基在喹啉部分的6-位处。
在这个意义上,式I的化合物对于ALK5的酶活性抑制(作为IC50测量)也确认了与现有技术化合物337、338和加尼西替尼相比,本发明的化合物具有出乎意料地高的效力。
4-(2-吡啶-2-基-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)-喹啉-7-醇(参考化合物337)的结构与式I的化合物的结构的不同之处在于,参考化合物337不包括在吡啶部分的2-位处的甲基,并且特征在于酚羟基在喹啉部分的7位而不是如式I的化合物那样在喹啉部分的6-位。
如出现在实施例2中的表2中所看到的,结果显示出,出乎意料地,式(I)的化合物的效力是参考化合物338的2.1倍,并且是参考化合物337的1.8倍,要知道的是,在结构上所述化合物的不同之处仅在于酚羟基的位置以及在吡啶部分中存在或不存在甲基。
另外的体内测定将式I化合物与化合物337和338的治疗效果进行了比较。图17显示出,与化合物338相比,式I的化合物表现出治疗活性的巨大改善并且以大得多的程度阻断肝转移形成,这确认了图13中所显示的结果。该实验还证实,在这些体内转移测定中,与化合物337相比,式(I)的化合物表现出增强的治疗活性。因此,本发明表明,取代的类型及其在母核结构中的位置令人惊讶地提供了由式(I)的化合物所显示的出乎意料的改善的效力。此外,Li等人(J.Med.Chem.2008,51(7):2302-2306)公开了在6-位上可以容忍缺电子和相对较小的基团,这教导与在式(I)的化合物中引入作为在6-位处的特征的给电子基团诸如羟基相反,而当与替代地以7-位处的所述羟基为特征的现有技术结构异构体338相比时,该式(I)的化合物反而导致令人惊讶地强的效力。
另一方面,图13还显示出,与式I的化合物相比,式IV的前药在体外具有低至高达十分之一的TGFβ信号传导途径抑制能力,但在体内转移测定中提供相似的治疗活性。因此,尽管与式I的化合物相比,式III的前药和式IV的前药在体外测定中具有低至高达十分之一的TGFβ信号传导抑制能力,但是它们在体内表现出相似的治疗活性。该结果支持了式III和式IV的前药的TGFβ信号传导抑制能力在体外被圈闭或阻断,但是在体内被释放。
在另一个优选的实施方案中,癌症是转移性癌症。优选地,转移性癌症是明显的转移或明显的转移性疾病。
在这个意义上,图14显示出,当以等摩尔剂量施用时,与现有技术化合物加尼西替尼相比,在明显的转移性疾病的动物模型中,式I的化合物如何发挥非常实质性的改善的活性。此外,图15确认了在所述明显的转移性疾病的动物模型中施用式I的化合物还导致更高的存活率。
另一方面,式I的化合物可以与其他疗法组合施用。如之前提及的,在一个实施方案中,式I的化合物,或其具有式II或式III、式IV的前药,或者其药用盐,或药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,可以与免疫疗法一起使用,例如与针对免疫检查点的免疫疗法一起使用。
因此,一个优选的实施方案涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含式I的化合物,或其具有式II或式III、式IV的前药,或者其药用盐,或药用溶剂化物,或多晶型物或共晶,以及免疫检查点抑制剂,更优选地,抗-PD1或PDL1抗体。为此,图14和16显示出利用式I的化合物和抗-PD-1抗体的组合疗法在明显的转移性疾病的动物模型中如何提供存活率的显著增加并且减少肝转移的数量。
在一个优选的实施方案中,响应于TGFβ信号传导途径的抑制的疾病是选自由以下各项组成的组的癌症:血液癌症(hematologic cancer);B-细胞或T-细胞白血病(B-cellor T-cell leukemia),非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma),B-细胞或T-细胞型非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma B-cell or T-cell types),伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma),霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma),白血病(leukemias),B-细胞或T-细胞型淋巴瘤(lymphoma B-cell or T-cell types),多发性骨髓瘤(multiple myeloma),脑癌(brain cancer),中枢神经系统的神经胶质谱系的癌症(cancer of glial lineage ofthe central nervous system)(神经胶质瘤(glioma)),胶质母细胞瘤(gliobastoma),肉瘤(sarcomas),纤维肉瘤(fibrosarcoma),恶性纤维组织细胞瘤(malignant fibroushistiocytoma),尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma),骨肉瘤(osteosarcoma),恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma),乳腺癌(breast cancer),抗HER2疗法的乳腺癌(breast cancer resistant to anti-HER2 therapy),乳癌(breast carcinoma),乳腺腺癌(breast adenocarcinoma),转移性乳腺癌(metastatic breast cancer),胃和胃食管癌(gastric and gastroesophageal cancer),胃癌(gastric carcinoma),胃腺癌(gastricadenocarcinoma),结肠直肠癌症(colorectal cancer),结肠癌(colon carcinoma),结肠腺癌(colon adenocarcinoma),直肠癌(rectum cancer),结肠直肠癌(colorectalcarcinoma),转移性结肠癌(metastatic colon cancer),胰腺癌症(pancreatic cancer),胰腺癌(pancreas carcinoma),胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma),肾细胞癌(renalcell carcinoma),透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma),肝癌(livercancer),肝转移癌(liver metastatic cancer),转移性疾病(metastatic disease),肺癌症(lung cancer),肺癌(lung carcinoma),肺腺癌(lung adenocarcinoma),非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer),小细胞肺癌(small-cell lung cancer),卵巢癌症(ovarian cancer),卵巢癌(ovarian carcinoma),卵巢腺癌(ovarian adenocarcinoma),卵巢癌(ovarian carcinoma),子宫内膜癌(endometrial carcinoma),子宫内膜间质肉瘤(endometrial stromal sarcoma),宫颈癌(carcinoma of the uterine cervix),甲状腺癌(thyroid carcinoma),转移性乳头状甲状腺癌(metastasizing papillary thyroidcarcinoma),滤泡状甲状腺癌(follicular thyroid carcinoma),膀胱癌(bladdercarcinoma),尿膀胱癌(urine bladder carcinoma),尿膀胱移行细胞癌(transitionalcell carcinoma of the urinary bladder),前列腺癌症(prostate cancer),前列腺癌(prostate carcinoma),神经内分泌癌(neuroendocrine cancers),鳞状细胞癌(squamouscell carcinoma),骨肉瘤(osteosarcoma),横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma),胚胎癌(embryonal cancers),神经母细胞瘤(neuroblastoma),髓母细胞瘤(medulloblastoma),视网膜母细胞瘤(retinoblastoma),肾母细胞瘤(nephroblastoma),肝母细胞瘤(hepatoblastoma),黑素瘤(melanoma)和皮肤癌(skin cancer)。
在一个优选的实施方案中,响应于TGFβ信号传导途径的抑制的疾病是转移性疾病。
优选地,血液癌症是白血病、多发性骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。优选地,脑癌是胶质母细胞瘤。
在一个优选的实施方案中,实体瘤选自由以下各项组成的组:乳腺癌,胃和胃食管癌,结肠直肠癌症,胰腺癌症,肝癌,肝转移癌,转移性疾病,肺癌症,卵巢癌症,前列腺癌症,神经内分泌癌。优选地,皮肤癌是黑素瘤。
在一个优选的实施方案中,响应于TGFβ信号传导途径的抑制的疾病是选自由以下各项组成的组的癌症:白血病,多发性骨髓瘤,骨髓增生异常综合征,胶质母细胞瘤,尤因肉瘤,骨肉瘤,恶性胸膜间皮瘤,乳腺癌,胃和胃食管癌,结肠直肠癌症,胰腺癌症,肝癌,肝转移癌,转移性疾病,肺癌症,卵巢癌症,前列腺癌症,神经内分泌癌和黑素瘤。
另外,对于含有香荚兰乙酮衍生的片段的式II的前药,本发明还公开了其他香荚兰乙酮衍生的前药。因此,式II的前药的香荚兰乙酮衍生的片段(AcV):
也可以用于获得与式I的化合物不同的其他药物的前药,其中所述药物必须包含一个羟基。在这个意义上,具有结构R-OH的包含一个羟基的所述药物可以与包含香荚兰乙酮片段的化合物AcV-X反应,从而形成式V的前药AcV-OR的醚键,如在方案VI中看到的:
方案VI
当β-酮醚键在β-醚酶的存在下或通过肝酶诸如细胞色素P450水解时,释放包含一个羟基的药物R-OH。具有式R-OH的包含一个羟基的药物的实例是,但不限于,4-羟基他莫昔芬或7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38,CAS No:86639-52-3,伊立替康的活性代谢物)。
实施例6显示出,在利用4-甲基伞形酮的香荚兰乙酮醚和利用4-羟基他莫昔芬的香荚兰乙酮醚进行的模型实验中,LigF(一种β-醚酶)如何能够水解醚键,从而使香荚兰乙酮片段裂解。
在这个意义上,本发明通常还涉及具有式R-OH的包含一个羟基的药物的式V的前药,其中所述前药包含香荚兰乙酮衍生的片段:
其中
-R-OH是包含一个羟基的药物;
-R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,环烷基,卤代烷基,羟基烷基,氨基烷基,烷酰基氨基,烷氧基,芳基,烷基芳基,芳基烷基,氨基,N-烷基氨基和N,N-二烷基氨基;并且
-R2和R3各自独立地选自由H、烷基和卤代烷基组成的组。
在一个实施方案中,R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,环烷基,卤代烷基,羟基烷基,氨基烷基,烷酰基氨基,烷氧基,芳基,烷基芳基,芳基烷基,氨基,N-烷基氨基和N,N-二烷基氨基;R2是甲基并且R3是H。在另一个实施方案中,R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,卤代烷基,氨基烷基和羟基烷基;R2是甲基并且R3是H。
一个实施方案涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含有效量的式V的前药,以及至少一种药用赋形剂。
本发明的一个实施方案涉及一种式VI的4-羟基他莫昔芬的前药:
其中
-R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,环烷基,卤代烷基,羟基烷基,氨基烷基,烷酰基氨基,烷氧基,芳基,烷基芳基,芳基烷基,氨基,N-烷基氨基和N,N-二烷基氨基;并且
-R2和R3各自独立地选自由H、烷基和卤代烷基组成的组。
一个实施方案涉及一种式VI的4-羟基他莫昔芬的前药,其中R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,环烷基,卤代烷基,羟基烷基,氨基烷基,烷酰基氨基,烷氧基,芳基,烷基芳基,芳基烷基,氨基,N-烷基氨基和N,N-二烷基氨基;R2是甲基并且R3是H。在另一个实施方案中,R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,卤代烷基,氨基烷基和羟基烷基;R2是甲基并且R3是H。
尽管描绘了一种异构体,但是异构体Z和E二者及其混合物都包括在式VI的前药中。在一个实施方案中,式VI的前药是Z-异构体。在另一个实施方案中,式VI的前药是E-异构体。在另一个实施方案中,式VI的前药是Z-异构体和E-异构体的混合物。特别地,该混合物包括两种异构体以50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、99:1比率或任何其他比率的混合物。
在一个优选的实施方案中,R1是H,R2是甲基并且R3是H,并且式VI的4-羟基他莫昔芬的前药是式VII的前药:
尽管描绘了一种异构体,但是异构体Z和E二者及其混合物都包括在式VII的前药中。在一个实施方案中,式VII的前药是Z-异构体。在另一个实施方案中,式VII的前药是E-异构体。在另一个实施方案中,式VII的前药是Z-异构体和E-异构体的混合物。特别地,该混合物包括两种异构体以50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、99:1比率或任何其他比率的混合物。
一个实施方案涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含有效量的式VI或式VII的前药,以及至少一种药用赋形剂。
与4-羟基他莫昔芬(4-OHT)相比,式VI或式VII的前药的活性低得多。
4-羟基他莫昔芬是用于治疗癌症(优选地但不排他地用于预防和/或治疗乳腺癌)的雌激素受体(ER)拮抗剂。另外,它是ER突变型(尤其是ERT2变体)的强激动剂,其可以用于触发融合蛋白诸如Cre-ERT和Cre-ERT2(T=可由他莫昔芬诱导)的激活,如专利EP1692936B1中所述的,所述融合蛋白的主要活性在细胞核中。
特别地,Cre-ERT融合蛋白包含具有配体结合活性的核雌激素受体的至少一部分。核受体或其片段之一的配体结合活性具有至少一种选自以下各项的突变:(1)在人核雌激素受体序列或该序列的天然变体的第521位上的甘氨酸到精氨酸的突变(G521 R);(2)在人核雌激素受体序列或该序列的天然变体的第400位上的甘氨酸到缬氨酸的突变(G400V);和(3)位于人核雌激素受体序列或该序列的天然变体的第543-544位上的(蛋氨酸-亮氨酸)到(丙氨酸-丙氨酸)的突变(M543A/L544A突变)。
如专利EP1692936B1中所述的,Cre-ERT2是三重突变蛋白G400V/M543A/L544A和Cre-ERT融合蛋白,其带有G521 R突变。
在不存在4-OHT的情况下,融合蛋白被隔离在细胞质中,并且由此不具有活性;而在4-OHT与ERT2结合后,这使融合蛋白移至核中。当ERT2与Cre(能够重组(Can Recombine))蛋白融合时,并且当利用侧翼为Cre识别位点(loxP位点)的特定遗传区域时,这允许使用4-OHT在特定位置处激活或缺失细胞中的基因。在这个意义上,可以仅在编码特定酶的细胞周围局部地裂解前药,从而释放4-羟基他莫昔芬(4-OHT),如在实施例6中看到的。
如实施例5中所述的,式VII的前药从已知的化合物4,4'-(1-苯基丁-1-烯-1,2-二基)二酚(化合物5-43)和香荚兰乙酮开始进行合成。在这个意义上,方案VII描述了所使用的合成路径:
方案VII
在这个意义上,合成从来自4,4'-二羟基二苯甲酮和丙苯酮的化合物5-43(CASNo.91221-46-4)(他莫昔芬的二羟基前体)开始。首先,将对应于4-羟基他莫昔芬的以N.N-二甲基氨基乙基醚基团为特征的位置的羟基用缩水甘油转化为醚。二醇随后用2,2-二甲氧基丙烷保护,以通过在第二羟基中的烷基化来偶联香荚兰乙酮衍生的片段。其他步骤包括使二醇基团脱保护,然后将其氧化为醛,并且随后经由还原性胺化转化为胺。
式VII的前药是无活性的,但是在β-醚酶的存在下可以释放4-OHT。其能够在特定位置处激活或缺失细胞中的基因(如其中使用Cre-ERT2酶的实施例6所显示的),或者充当抗癌药,从而拮抗野生型雌激素受体。
以这种方式,仅在编码β-醚酶诸如LigF(其编码于肿瘤细胞的DNA中,如实施例6中所述)的细胞中释放4-羟基他莫昔芬。LigF的酶活性将使4-羟基他莫昔芬从式VI的前药或式VII的前药中释放。
备选地,式VI的前药或式VII的前药可以通过酶诸如细胞色素P450酶家族(主要存在于肝脏中)裂解(可能以比LigF更低的效率)。实施例7描述了一种小鼠治疗,其中发现肝脏能够主动裂解前药并且以剂量依赖性方式经过基因重组,这表明该前药策略可以用于利用任何式V的化合物(包括香荚兰乙酮β-醚并且特别是式VI的前药)特异性地靶向肝脏。当与肝脏相比时,外周组织中的基因重组是更低的,这表明有靶向肝脏的可能性。
在这个意义上,式VI的前药或式VII的前药可以用作生物医学、遗传学、发育生物学、细胞生物学、干细胞生物学或相关领域中的研究工具。
因此,本文描述了一种用于在4-羟基他莫昔芬的存在下在一组表达Cre-ERT2融合蛋白的小鼠的细胞中进行所述小鼠中的一个或多个基因或者一个或多个目标序列的重组的方法,其中所述一个或多个基因或序列属于所述小鼠天然基因组,所述方法包括:
a)提供小鼠,所述小鼠包含Cre重组酶蛋白的一个或多个识别位点,所述识别位点被插入位于小鼠基因组的一个或多个染色体中的所述目标DNA序列中;以及在不具有4-羟基他莫昔芬的情况下或在天然雌激素的存在下基本上不具有重组酶活性的Cre-ERT2融合蛋白,所述重组酶活性由少量的4-羟基他莫昔芬诱导;
b)使所述小鼠与式VI的前药接触;
c)当需要重组时,使小鼠的细胞的至少一部分与β-醚酶接触,以与式VI的化合物反应,从而释放4-羟基他莫昔芬,并且诱导所述Cre-ERT2融合蛋白的重组酶活性,并且在存在β-醚酶的局部特定区域中(其是释放的4-羟基他莫昔芬的来源)获得所述一个或多个基因或目标序列的重组;并且
然而在不具有4-羟基他莫昔芬的情况下或在天然雌激素的存在下,在表达Cre-ERT2融合蛋白的所述细胞中基本上不发生所述重组。
在一个实施方案中,β-醚酶是LigF并且式VI的前药具有式VII。出于本发明的目的,在不具有4-羟基他莫昔芬的情况下或在天然雌激素的存在下基本上不具有重组酶活性的Cre-ERT2融合蛋白表示所述融合蛋白的重组酶活性小于10%,或小于5%,或甚至小于1%。以类似的方式,在不具有4-羟基他莫昔芬的情况下或在天然雌激素的存在下,在表达Cre-ERT2融合蛋白的细胞中基本上不发生重组,这也表示重组以在不具有4-羟基他莫昔芬的情况下或在天然雌激素的存在下的情形的小于10%、5%或甚至1%发生。
本发明的另一个实施方案涉及式VI或式VII的前药,或其药物组合物,其用作药物。另一个实施方案涉及式VI的前药,优选地式VII的前药,其用于治疗癌症。优选地,选自由以下各项组成的组的癌症:血液癌症;B-细胞或T-细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤,B-细胞或T-细胞型非霍奇金淋巴瘤,伯基特淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,白血病,B-细胞或T-细胞型淋巴瘤,多发性骨髓瘤,脑癌,中枢神经系统的神经胶质谱系的癌症(神经胶质瘤),肉瘤,纤维肉瘤,恶性纤维组织细胞瘤,尤因肉瘤,骨肉瘤,恶性胸膜间皮瘤,乳腺癌,抗HER2疗法的乳腺癌,乳癌,乳腺腺癌,胃和胃食管癌,胃癌,胃腺癌,结肠直肠癌症,结肠癌,结肠腺癌,直肠癌,结肠直肠癌,转移性结肠癌,胰腺癌症,胰腺癌,胰腺腺癌,肾细胞癌,透明细胞肾细胞癌,肝癌,肺癌症,肺癌,肺腺癌,非小细胞肺癌,小细胞肺癌,卵巢癌症,卵巢癌,卵巢腺癌,卵巢癌,子宫内膜癌,子宫内膜间质肉瘤,宫颈癌,甲状腺癌,转移性乳头状甲状腺癌,滤泡状甲状腺癌,膀胱癌,尿膀胱癌,尿膀胱移行细胞癌,前列腺癌症,前列腺癌,神经内分泌癌,鳞状细胞癌,骨肉瘤,横纹肌肉瘤,胚胎癌,神经母细胞瘤,髓母细胞瘤,视网膜母细胞瘤,肾母细胞瘤,肝母细胞瘤,黑素瘤和皮肤癌。
优选地,血液癌症是白血病、多发性骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。优选地,脑癌是胶质母细胞瘤。
在一个优选的实施方案中,实体瘤选自由以下各项组成的组:乳腺癌,胃和胃食管癌,结肠直肠癌症,胰腺癌症,肝癌,肺癌症,卵巢癌症,前列腺癌症,神经内分泌癌。
优选地,皮肤癌是黑素瘤。
本发明的另一个实施方案涉及式VIII的7-乙基-10-羟基-喜树碱的前药:
其中
-R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,环烷基,卤代烷基,羟基烷基,氨基烷基,烷酰基氨基,烷氧基,芳基,烷基芳基,芳基烷基,氨基,N-烷基氨基和N,N-二烷基氨基;并且
-R2和R3各自独立地选自由H、烷基和卤代烷基组成的组。
一个实施方案涉及式VIII的7-乙基-10-羟基-喜树碱的前药,其中R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,环烷基,卤代烷基,羟基烷基,氨基烷基,烷酰基氨基,烷氧基,芳基,烷基芳基,芳基烷基,氨基,N-烷基氨基和N,N-二烷基氨基;R2是甲基并且R3是H。在另一个实施方案中,R1选自由以下各项组成的组:H,烷基,卤代烷基,氨基烷基和羟基烷基;R2是甲基并且R3是H。
在式VIII的前药的一个优选的实施方案中,R1是H,R2是甲基并且R3是H,并且7-乙基-10-羟基-喜树碱的前药是式IX的前药:
一个实施方案涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含有效量的式VIII的前药或式IX的前药,以及至少一种药用赋形剂。
所描述的一个实施方案涉及式VIII或式IX的7-乙基-10-羟基-喜树碱的前药,或其药物组合物,其用作药物,特别是用于治疗癌症。优选地,选自由以下各项组成的组的癌症:血液癌症;B-细胞或T-细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤,B-细胞或T-细胞型非霍奇金淋巴瘤,伯基特淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,白血病,B-细胞或T-细胞型淋巴瘤,多发性骨髓瘤,脑癌,中枢神经系统的神经胶质谱系的癌症(神经胶质瘤),肉瘤,纤维肉瘤,恶性纤维组织细胞瘤,尤因肉瘤,骨肉瘤,恶性胸膜间皮瘤,乳腺癌,抗HER2疗法的乳腺癌,乳癌,乳腺腺癌,胃和胃食管癌,胃癌,胃腺癌,结肠直肠癌症,结肠癌,结肠腺癌,直肠癌,结肠直肠癌,转移性结肠癌,胰腺癌症,胰腺癌,胰腺腺癌,肾细胞癌,透明细胞肾细胞癌,肝癌,肺癌症,肺癌,肺腺癌,非小细胞肺癌,小细胞肺癌,卵巢癌症,卵巢癌,卵巢腺癌,卵巢癌,子宫内膜癌,子宫内膜间质肉瘤,宫颈癌,甲状腺癌,转移性乳头状甲状腺癌,滤泡状甲状腺癌,膀胱癌,尿膀胱癌,尿膀胱移行细胞癌,前列腺癌症,前列腺癌,神经内分泌癌,鳞状细胞癌,骨肉瘤,横纹肌肉瘤,胚胎癌,神经母细胞瘤,髓母细胞瘤,视网膜母细胞瘤,肾母细胞瘤,肝母细胞瘤,黑素瘤和皮肤癌。
优选地,血液癌症是白血病、多发性骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。优选地,脑癌是胶质母细胞瘤。
在一个优选的实施方案中,实体瘤选自由以下各项组成的组:乳腺癌,胃和胃食管癌,结肠直肠癌症,胰腺癌症,肝癌,肺癌症,卵巢癌症,前列腺癌症,神经内分泌癌。
优选地,皮肤癌是黑素瘤。
式V的前药并且特别是式VI、VII、VIII和IX的前药的香荚兰乙酮衍生的片段可以通过肝酶诸如细胞色素P450酶而被氧化和裂解,所述肝酶水解酯键,从而递送包含一个羟基的药物R-OH,该药物在式VI和VII的前药的情况下是4-羟基他莫昔芬,并且在式VIII和IX的前药的情况下是7-乙基-10-羟基-喜树碱。另一方面,醚键也可以通过来自非哺乳动物来源的特定β-醚酶水解,所述酶诸如细菌鞘脂菌属物种(Sphingobium sp.)菌株SYK-6酶LigE和LigF,或真菌污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)Ds-GST1,其可以与式V的前药联合施用,并且优选地与式VI、VII、VIII或IX的前药联合施用。
在一个特别的实施方案中,在表达β-醚酶的细胞中施用所述β-醚酶作为细胞疗法,例如过继性T细胞转移或树突细胞疫苗接种。备选地,在另一个特别的实施方案中,任选地在具有谷胱甘肽的情况下,将β-醚酶与肿瘤或基质特异性的抗体偶联施用。某些组织诸如肺衬壁包含高细胞外水平的谷胱甘肽,并且因此不需要施用谷胱甘肽。
出于本发明的目的,术语“活性化合物”是指当施用于人或动物时发挥治疗作用的化学实体或活性成分。
典型的组合物包含本发明的所述化合物连同至少一种药用赋形剂,例如,所述赋形剂可以是载体或稀释剂。这样的组合物可以为胶囊、囊袋(sachet)、纸或其他容器的形式。在制备组合物中,可以使用用于制备药物组合物的常规技术。例如,目标化合物将通常与载体混合,或由载体稀释,或封闭在可以为安瓿、胶囊、囊袋、纸或其他容器的形式的载体中。当载体用作稀释剂时,它可以是固体、半固体或液体材料,其充当活性化合物的媒介物、赋形剂或介质。目标化合物可以吸附在颗粒状固体容器上,例如在囊袋中。合适的载体的一些实例是水、盐溶液、醇、聚乙二醇、多羟基乙氧基化蓖麻油、花生油、橄榄油、乳糖、白土(terra alba)、蔗糖、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸、或纤维素的低级烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸单甘油酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。类似地,载体或稀释剂可以包括本领域已知的任何缓释材料,诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯,单独地或与蜡混合。制剂还可以包括润湿剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。通过采用本领域众所周知的程序,可以配制本发明的制剂以在向患者施用之后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
可以将药物组合物进行灭菌,并且如果需要,与不会与活性化合物进行有害反应的辅助剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂和/或着色物质等混合。
本发明的一个优选实施方案涉及施用途径,其可以是将目标化合物有效地运送至适当或期望的作用部位的任何途径,诸如经口、经颊、经鼻、局部、经肺、经皮或肠胃外,例如直肠、皮下、静脉内、尿道内、肌内、鼻内、滴眼液或软膏剂。
对于经鼻施用,制剂可以含有溶解或悬浮在液体载体(特别是水性载体)中的目标化合物,以用于气雾剂应用。载体可以含有添加剂,诸如增溶剂例如丙二醇,表面活性剂,吸收促进剂诸如卵磷脂(磷脂酰胆碱)或环糊精,或防腐剂诸如对羟基苯甲酸酯。
为了制备局部制剂,将目标化合物置于如本领域已知的皮肤科媒介物中。局部制剂中要施用的目标化合物的量以及该化合物的浓度取决于所选择的媒介物、递送体系或装置、患者的临床状况、制剂中化合物的副作用和稳定性。因此,根据所讨论的患者或类似患者的临床经验,医生采用含有适当浓度的目标化合物的适当制剂,并且选择施用的制剂的量。
对于眼科应用,将目标化合物配制成适合用于眼睛的溶液、混悬剂和软膏剂。浓度通常如以上关于局部制剂所讨论的。
对于经口施用,可以制备固体或流体单位剂型。为了制备固体组合物诸如片剂,将目标化合物与常规成分诸如滑石、硬脂酸镁、磷酸二钙、硅酸铝镁、硫酸钙、淀粉、乳糖、阿拉伯胶、甲基纤维素以及在功能上与药物稀释剂或载体类似的材料一起混合到制剂中。
胶囊通过将目标化合物与惰性药物稀释剂混合并将混合物填充到适当尺寸的硬明胶胶囊中来制备。软明胶胶囊通过将目标化合物的浆料与可接受的植物油、轻质液状石蜡或其他惰性油进行机械囊封来制备。可以制备用于经口施用的流体单位剂型诸如糖浆剂、酏剂和混悬剂。水溶性形式可以与糖、芳族调味剂和防腐剂一起溶解在水性媒介物中以形成糖浆剂。酏剂通过使用水醇(例如乙醇)媒介物与合适的甜味剂诸如糖和糖精连同芳族调味剂一起来制备。混悬剂可以借助悬浮剂诸如阿拉伯胶、黄蓍胶、甲基纤维素等利用水性媒介物来制备。
肠胃外使用的合适制剂对于普通技术人员是明显的,诸如使用合适的可注射溶液或混悬剂。无菌的制剂适合多种局部或肠胃外途径,包括皮内、肌内、血管内和皮下。
除了目标化合物以外,根据所需的制剂和递送模式,组合物还可以包含药用的无毒载体或稀释剂,其包括通常用于形成用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。对稀释剂进行选择以免不适当地影响组合的生物活性。
尤其可用于可注射制剂的这样的稀释剂的实例是水、各种盐水、有机或无机盐溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和汉克氏溶液(Hank's solution)。另外,药物组合物或制剂可以包括添加剂诸如其他载体;佐剂;或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。
此外,制剂中可以包含赋形剂。实例包括共溶剂、表面活性剂、油、湿润剂、润滑剂、防腐剂、稳定剂和抗氧化剂。可以使用任何药理学上可接受的缓冲剂,例如tris或磷酸盐缓冲剂。稀释剂、添加剂和赋形剂的有效量是在溶解度或生物活性方面有效获得药用制剂的那些量。
目标化合物可以掺入微球中。可以将目标化合物加载到白蛋白微球中,从中可以将这样的微球以干粉形式重新获得以用于经鼻施用。适用于制备微球的其他材料包括琼脂、海藻酸盐、壳聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、白蛋白、琼脂糖、葡聚糖、透明质酸、明胶、胶原蛋白和酪蛋白。微球可以通过本领域技术人员已知的各种方法诸如喷雾干燥法或乳化法来生产。
例如,白蛋白微球可以通过以下方式制备:在搅拌下将磷酸盐缓冲剂中的兔血清白蛋白添加到橄榄油中以产生油包水乳液。然后将戊二醛溶液添加到乳液中,并且搅拌乳液以使白蛋白交联。然后微球可以通过离心进行分离,除去油,并且洗涤球,例如用石油醚洗涤,接着用乙醇洗涤。最后,可以将微球过筛并且收集,并且通过过滤进行干燥。
淀粉微球可以通过以下方式制备:在搅拌下将温热的淀粉水溶液例如马铃薯淀粉水溶液添加到聚乙二醇在水中的加热溶液中以形成乳液。当已经形成两相体系(其中淀粉溶液作为内相)时,则在连续搅拌下将混合物冷却至室温,随后内相转化成凝胶颗粒。然后将这些颗粒在室温下滤出并且在溶剂诸如乙醇中制成浆料,然后再次将颗粒滤出并且置于空气中干燥。可以通过众所周知的交联程序诸如热处理或通过使用化学交联剂来使微球硬化。合适的试剂包括二醛(包括乙二醛、丙二醛、琥珀醛(succinicaldehyde)、己二醛、戊二醛和苯二醛),二酮诸如丁二酮,表氯醇,多磷酸盐和硼酸盐。使用二醛以通过与氨基的相互作用来交联蛋白质(诸如白蛋白),并且二酮与氨基形成席夫碱(Schiff base)。表氯醇利用亲核基团诸如氨基或羟基以将化合物活化为环氧化物衍生物。
本发明的另一个优选的实施方案是剂量方案。术语“单位剂型”是指适合作为用于受试者例如哺乳动物受试者(例如人、狗、猫和啮齿动物)的单一剂量的物理上离散的单位,每个单位都含有经计算与所需药物稀释剂、载体或媒介物结合而产生所需药物作用的预定量的活性物质。用于本发明的单位剂型的规格由以下各项决定并且取决于以下各项:(a)活性材料的独特特性和要实现的特定效果以及(b)将这样的活性材料配制成用于在人和动物中使用的领域中固有的限制。单位剂型的实例是片剂、胶囊、丸剂、粉剂袋(powderpacket)、薄片剂(wafer)、栓剂、颗粒剂、扁囊剂、茶匙(teaspoonful)、汤匙(tablespoonful)、滴剂(dropperful)、安瓿、小瓶、带计量排放量的气雾剂、任何前述的分离倍数以及如本文所述的其他形式。组合物可以包含在试剂盒中,所述试剂盒可以含有组合物的一个或多个单位剂型以及用于治疗一种或多种本文所述的病症的使用说明书。
缓慢或延长释放的递送体系,包括各种生物聚合物(基于生物的体系),采用脂质体、胶体、树脂的体系以及其他聚合物递送体系或分隔式储库中的任一种,可以与本文所述的组合物一起使用,以提供治疗化合物的连续或长期来源。这样的缓慢释放体系适用于经由局部、眼内、经口和肠胃外途径进行递送的制剂。
在治疗中采用有效量的目标化合物。根据本发明使用的化合物的剂量根据化合物和所治疗的病况例如接受患者的年龄、体重和临床状况而变化。其他因素包括:施用途径,患者,患者的医学病史,疾病过程的严重程度以及特定化合物的效力。剂量应足以缓解所治疗的疾病的症状或病征,同时不会对患者产生不可接受的毒性。通常,化合物的有效量是提供症状的主观缓解或由临床医生或其他有资格的观察者注意到的客观可识别的改善。
实施例
以下描述的本发明的实施例旨在举例说明所公开的实施方案中的一些,而不限制其保护范围。另外,包括了参考实施例,其涉及本说明书中公开的实施方案但是不包括在权利要求的范围内。利用小鼠模型的所有实验均得到巴塞罗那科学园动物保护和使用委员会(Animal Care and Use Committee of Barcelona Science Park,CEEA-PCB)和加泰罗尼亚政府的批准。小鼠被保持在无特定病原体(SPF)的具有12小时亮-暗周期的设施中,并且饲喂标准饮食和水(没有限制地)。对所有小鼠的动物福利都进行了密切监测。
关于小鼠实验中的化合物给药的一般信息:加尼西替尼(LY2157299一水合物)、式I和式IV的化合物以及化合物338和337的分子量分别为:387.4;342.4;536.7;342.4;328.4。因此,相应的分子量比率为:1:0.88:1.39:0.88:0.85。计算在以下附图中和在实施例中所描述的所有小鼠治疗,使用对于加尼西替尼的1x剂量作为参考,这对应于分成2个口服施用(早上和傍晚)的160mg/kg/天,即80mg/kg b.i.d。因此,式I的化合物的1x摩尔当量剂量为70.8mg/kg b.i.d.,式IV的化合物的1x摩尔当量剂量为111.2mg/kg b.i.d,化合物338的1x摩尔当量剂量为70.8mg/kg b.i.d.并且化合物337的1x摩尔当量剂量为68,0mg/kgb.i.d.。
现有技术化合物337(CAS No.476474-11-0)和338(CAS No.476477-67-5)根据专利WO2005094833(338和337二者)和J.Med Chem.2008,51,2302(仅描述了337)制备。
实施例1:式I、III和IV的化合物的合成:
除非另有说明,所有反应均在惰性气氛(N2)下进行。无水THF、DCM和乙醚从Innovative Technology Inc.Puresolv Solvent Purification System(SPS)获得。购买其他无水溶剂,并且在不进行任何进一步纯化或干燥的情况下使用。
所有实验均通过分析薄层色谱(TLC)使用硅胶TLC-铝板(Merck 60 F254)进行监测。结果在UV灯(254或365nm)下被可视化,并且在必要时使用KMnO4染色来显示。
除非另外说明,否则急骤柱色谱在(Teledyne Isco)或在Puriflash 430(Interchim)上进行。流动相是己烷/乙酸乙酯的梯度或二氯甲烷/甲醇的梯度。在其中在要纯化的分子上存在碱性氮的一些情况下,利用在己烷中的2.5%三乙胺溶液对柱进行预调节。
将用于NMR的样品溶解在CDCl3、CD3OD、DMSO或D2O中。
1H和13C光谱参考残留溶剂峰和/或四甲基硅烷。偶合常数以赫兹(Hz)为单位测量。所有IR光谱均在NaCl盘上使用薄膜法进行,并且在Thermo Nicolet Nexus Ft-IR傅里叶变换光谱仪上记录。
1.1.由对溴苯胺合成式I的化合物-路线(d):
式I的化合物由对溴苯胺合成,包括其中将溴转化为酚的最后步骤:
6-溴-4-甲基喹啉
在五分钟内,在室温下向4-溴苯胺(20g,117mmol)和氯醌(34.7g,141mmol,1.2当量)在乙醇(200mL,10体积)中的搅拌溶液中加入37%HCl(29.3mL,351mmol,3当量)。在室温下搅拌五分钟后,将反应混合物加热至75℃,其中在三十分钟内向反应混合物中加入在乙醇(15mL,1体积)中稀释的甲基乙烯基酮(15.45mL,190.5mmol,1.5当量)。四小时后,通过TLC并未观察到起始材料。将反应冷却至60℃,其中将其用THF(165mL,11体积)稀释,在60℃下搅拌一小时,然后使其冷却至室温过夜。将悬浮液通过烧结的布氏漏斗过滤。将剩余物用THF(2x45mL,总计6体积)漂洗,然后在真空烘箱中在50℃下干燥过夜,得到标题化合物(21.1g,81%),为褐色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.78(d,J=4.4Hz,1H),8.16–8.14(m,1H),7.97(d,J=9.0Hz,1H),7.77(dd,J=9.0,2.2Hz,1H),7.25(dd,J=4.4,0.9Hz,1H),2.68(d,J=0.9Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,DMSO)δ145.76,138.20,135.96,133.04,129.21,127.79,125.12,123.25,122.18,19.24。
6-溴-4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉
在-78℃下向6-溴-4-甲基喹啉(3.70g,14.31mmol)在THF(60mL)中的搅拌溶液中加入1M NaHMDS(57mL,57mmol,4当量)。将反应混合物搅拌3小时,接着在30分钟内逐滴加入在THF(7.4mL,2体积)中稀释的6-甲基吡啶甲酸甲酯(2.60g,17.17mmol,1.2当量)。使反应温热至室温过夜,然后冷却至0℃,并且利用3M HCl使其达到pH 1。使其在一小时内温热至室温,然后利用固体NaHCO3使其达到pH 8。将混合物用水(50mL)稀释并且用EtOAc(1x100mL)萃取,接着用CHCl3(1×100mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4),蒸发,并且将剩余物从MeOH(30mL,8体积)中重结晶,得到2-(6-溴喹啉-4-基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)乙-1-酮(2.57g,53%),为灰白色固体。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ8.84(d,J=4.4Hz,1H),8.36(d,J=2.1Hz,1H),7.97(d,J=9.0Hz,1H),7.86(d,J=7.7Hz,0H),7.75(dd,J=9.0,2.2Hz,1H),7.73(t,J=7.7Hz,1H),7.43(d,J=4.4Hz,1H),7.38(d,J=8.6Hz,1H),4.96(s,1H),2.70(s,2H)。
13C NMR(101MHz,cdcl3)δ197.87,158.43,152.01,150.47,147.24,141.30,137.39,132.77,131.95,129.36,127.58,127.09,124.09,120.89,119.76,40.53,24.60.
6-溴-4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉
在室温下向2-(6-溴喹啉-4-基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)乙-1-酮(2.57g,7.53mmol)在DMF(15.5mL,6体积)、甲苯(26mL,10体积)和2,6-二甲基吡啶(2.6mL,1体积)中的搅拌溶液中加入1-氨基吡咯烷-2-酮甲苯磺酸盐(2.05g,7.53mmol,1当量),并且在室温下搅拌5分钟。将反应在迪安-斯塔克条件下加热至回流,直到大多数起始材料已被消耗(通过TLC)。将反应混合物冷却至室温,向其中装入Cs2CO3(4.17g,12.8mmol,1.7当量)并且加热回到回流。监测反应的中间体的消失,并且一旦全部消耗,就蒸馏甲苯直至反应混合物达到145℃,然后冷却至室温,在水(30mL)和EtOAc(30mL)之间分配,并且分离各相。将水相用EtOAc(2x20mL)萃取,合并的有机萃取物用5%LiCl水溶液(2x20mL)洗涤并且将有机层干燥(MgSO4),蒸发,并且将剩余物进行色谱分析(0-10%MeOH,在DCM中),得到标题化合物(2.05g,67%),为褐色固体。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ8.85(d,J=4.4Hz,1H),7.98(d,J=8.9Hz,1H),7.92(d,J=2.2Hz,1H),7.71(dd,J=8.9,2.2Hz,1H),7.35(t,J=7.7Hz,1H),7.31(d,J=4.4Hz,1H),7.11(d,J=7.8Hz,1H),6.92(d,J=7.6Hz,1H),4.37(t,J=7.2Hz,2H),2.90–2.84(m,2H),2.75–2.66(m,2H),2.24(s,3H)。
13C NMR(101MHz,cdcl3)δ158.22,153.60,153.24,151.25,150.22,147.11,146.66,140.88,136.29,132.50,131.34,128.72,128.66,123.03,121.77,120.20,118.86,48.33,25.98,24.19,23.15.
UPLC-MS:407m/z[M+H]
式I的化合物:4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-6-醇
在N2下向火焰干燥的烧瓶中加入6-溴-4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉(200mg,0.493mmol)、Pd(dppf)Cl2(36mgs,0.050mmol,0.1当量)、KOAc(145mgs,1.48mmol,3当量)和双(频哪醇合)二硼(137mgs,0.542mmol,1.1eq)。然后向反应烧瓶中加入脱气的二噁烷(5mL),并且加热至100℃达2小时,此时将反应冷却至室温,并且用1M NaOH(4.93mL,4.93mmol,10当量)稀释并且逐滴加入30%H2O2(46.6μL,0.542mmol,1.1当量)。在室温下另外2小时后,将反应用1.6M亚硫酸钠(1mM,625μL)猝灭。在搅拌30分钟后,检查反应混合物中的过氧化物的存在,通过硅藻土垫过滤并且利用37%HCl使其达到pH 8。将混合物用水(5mL)稀释,并且用EtOAc(3×5mL)和氯仿(1x5mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4),蒸发,并且将剩余物进行色谱分析(0-100%EtOAc,在己烷中),得到标题化合物I(130mgs,77%)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.66(s,1H),8.58(d,J=4.4Hz,1H),7.86(d,J=9.0Hz,1H),7.56(t,J=7.7Hz,1H),7.48(d,J=7.8Hz,1H),7.29–7.16(m,2H),6.96(d,J=7.5Hz,1H),6.91(d,J=2.7Hz,1H),4.27(t,J=7.2Hz,2H),2.79(t,J=6.5Hz,2H),2.69–2.55(m,2H),1.89(s,3H)。
13C NMR(101MHz,DMSO)δ156.49,155.08,152.01,151.70,146.55,146.24,143.18,139.37,136.48,130.60,128.71,122.47,121.16,117.73,109.89,106.98,47.86,25.53,23.41,22.50。
IR(薄膜):3412,2949,2833,1650,1618,1508,1236,1010cm-1
1.2.由对甲氧基苯胺合成式I的化合物-路线(a):
6-甲氧基-4-甲基喹啉
在30分钟内,在室温下向对茴香胺(5g,40.6mmol)和ZnCl2(719mg,5.3mmol,0.13当量)在乙醇(20mL)中的搅拌溶液中分批加入FeCl3(17.45g,107.6mmol,2.65当量)。当加入甲基乙烯基酮(3.38mL,40.6mmol,1当量)时,将反应混合物搅拌30分钟,并且加热至75℃达两小时。然后将其冷却至室温并且倒入在0℃下的NaOH(1M,220mL)中。将混合物用EtOAc(3×40mL)萃取,并且将合并的有机萃取物干燥(MgSO4),蒸发,并且将剩余物进行色谱分析(0-100%EtOAc,在己烷中),得到标题化合物(2.88g,41%),为褐色油状物。
1H NMR(400MHz;CDCl3)δ8.65(d,J=4.4Hz,1H),8.02(d,J=9.2Hz,1H),7.37(dd,J=9.2,2.8Hz,1H),7.21(d,J=4.4Hz,1H),7.19(d,J=2.8Hz,1H),3.96(s,3H),2.67(s,3H)。
2-(6-甲氧基喹啉-4-基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)乙-1-酮
在-78℃下向6-甲氧基-4-甲基喹啉(2.5g,14.4mmol)在THF(80mL)中的搅拌溶液中加入LDA(33.19mmol,2.3当量)。当在30分钟内向反应混合物中逐滴加入6-甲基吡啶甲酸甲酯(3.27g,21.6mmol,1.5当量)时,将反应混合物搅拌30分钟。将反应置于-78℃下并且使其温热至室温过夜。然后用饱和NH4Cl(20mL)猝灭,用EtOAc(40mL)稀释,并且分离各相。将水相用氯仿(2x50mL)萃取,将合并的有机萃取物干燥(MgSO4),蒸发,并且将剩余物进行色谱分析(0-100%EtOAc,在己烷中),得到标题化合物(1.91g,51%),为褐色油状物;
6-甲氧基-4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉
在室温下向2-(6-甲氧基喹啉-4-基)-1-(6-甲基吡啶-2-基)乙-1-酮(1.60g,5.47mmol)在DMF(9.6mL,6体积)、甲苯(16mL,10体积)和2,6-二甲基吡啶(1.6mL,1体积)中的搅拌溶液中加入1-氨基吡咯烷-2-酮甲苯磺酸盐(1.49g,5.47mmol,1当量),并且在室温下搅拌5分钟。将反应在迪安-斯塔克条件下加热至回流,直到大多数起始材料已被消耗(通过TLC)。将反应混合物冷却至室温,向其中装入Cs2CO3(3.029g,9.299mmol,1.7当量),静置5分钟,然后加热回到回流。监测反应的中间体的消失,并且一旦全部消耗,就将反应冷却至室温,并且在水(50mL)和EtOAc(50mL)之间分配。对水相进行萃取(2x25mL),将合并的有机萃取物用5%LiCl水溶液(2x50mL)洗涤,并且将有机层干燥(MgSO4),蒸发,并且将剩余物进行色谱分析(0-10%MeOH,在DCM中)。将含有产物的级分溶解在少量的CHCl3中,并且用己烷缓慢地稀释,直至混合物呈现为轻微浑浊。将烧瓶在冰箱中放置48小时,形成晶体(1.28g,67%),为白色固体;
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ8.74(d,J=4.4Hz,1H),7.98(d,J=9.2Hz,1H),7.35–7.20(m,4H),6.96–6.85(m,3H),4.37(t,J=7.2Hz,2H),3.54(s,3H),2.91(br s,2H),2.75–2.65(m,2H),2.38(s,3H)。
13C NMR(101MHz,cdcl3)δ158.62,157.67,153.65,151.83,147.66,146.69,144.89,139.90,136.43,131.17,128.25,122.41,122.22,121.93,119.50,110.50,104.00,55.52,48.46,26.19,24.58,23.32。
HRMS(ESI):m/z[M+H]+对于C22H20N4O的计算值:356.1637;实验值:356.1639。
式I的化合物:4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-6-醇
在室温下向6-甲氧基-4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉(432mg,1.21mmol)在乙酸(5mL)中的搅拌溶液中加入HBr(5mL,44.45mmol,36.7当量)。将反应混合物在120℃下搅拌48小时,然后冷却至室温,并且在真空中除去溶剂。将剩余物在水(5mL)和EtOAc(10mL)之间分配,并且利用40%NaOH使其达到pH 8,分离各相,并且将水相用EtOAc(3x10mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4),蒸发,并且将剩余物悬浮在回流甲苯中达一小时,然后在一小时内冷却至室温。将固体过滤并且在真空中干燥,得到标题化合物(328mg,79%),为灰白色固体;
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.66(s,1H),8.58(d,J=4.4Hz,1H),7.86(d,J=9.0Hz,1H),7.56(t,J=7.7Hz,1H),7.48(d,J=7.8Hz,1H),7.29–7.16(m,2H),6.96(d,J=7.5Hz,1H),6.91(d,J=2.7Hz,1H),4.27(t,J=7.2Hz,2H),2.79(t,J=6.5Hz,2H),2.69–2.55(m,2H),1.89(s,3H)。
13C NMR(101MHz,DMSO)δ156.49,155.08,152.01,151.70,146.55,146.24,143.18,139.37,136.48,130.60,128.71,122.47,121.16,117.73,109.89,106.98,47.86,25.53,23.41,22.50。
IR(薄膜):3412,2949,2833,1650,1618,1508,1236,1010cm-1
HRMS(ESI):m/z[M+H]+对于C21H18N4O的计算值:342.1481;实验值:342.1480。
1.3.式III的前药的合成:
1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-((4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-6-基)氧基)乙-1-酮
将式I的化合物即4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-6-醇(42mg,0.12mmol)和Cs2CO3(134mg,0.41mmol)溶解在1.5mL的无水DMF中,并且在N2气氛下在60℃加热1.5小时。然后经由插管将新戊酸4-(2-溴乙酰基)-2-甲氧基苯酯在0.5mL的无水DMF中的溶液加入到亮绿色悬浮液中。将所得混合物在60℃搅拌2小时。然后将反应冷却至室温,用水(15mL)稀释并且用0.5mL的HCl的1M溶液猝灭。将所得水层用EtOAc(3x20 mL)萃取,有机层用无水MgSO4干燥,并且将溶剂在真空中除去。粗产物经由柱色谱(0至20%的MeOH,在DCM中)纯化,得到褐色油状物,将其用在1.5mL的MeOH中的LiOH.H2O(13mg,0.31mmol)处理1小时。将反应用1M HCl(0.3mL)猝灭,用水稀释并且用EtOAc(3x20mL)萃取。有机层用无水MgSO4干燥,将溶剂在真空中除去,并且将粗制物进行色谱分析(0至20%的MeOH,在EtOAc中),得到51.9mg(82%)的标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.73(d,J=4.6Hz,1H),8.11(d,J=9.2Hz,1H),7.50(d,J=1.9Hz,1H),7.47–7.43(m,2H),7.32–7.26(m,2H),7.06–6.95(m,3H),6.89(d,J=7.6Hz,1H),4.94(bs,2H),4.27(t,J=7.3Hz,2H),3.93(s,3H),2.82(bs,2H),2.61(bs,2H),2.24(s,3H)ppm。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ192.3,158.5,156.3,153.4,152.0,151.6,147.5,147.2,146.9,144.2,141.1,136.5,130.7,128.3,127.1,123.5,122.7,122.6,122.0,119.2,114.5,110.2,110.1,105.7,70.4,56.2,48.4,26.0,24.3,23.2ppm。
IR(薄膜):3074,2958,2925,1686,1620,1589,1509,1428,1274,1225,1198,1088cm-1。
HRMS(ESI):m/z[M+H]+对于C30H27N4O4的计算值:507.2027;实验值:507.2016。
Mp:162-163℃。
1.4.式IV的前药的合成:
[1,4'-联哌啶]-1'-甲酸4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-6-基酯
制备在1.1.中合成的式I的化合物(47mg,0.14mmol)在3mL的CHCl3中的溶液,并且在N2下转移至含有活化分子筛的Schlenk烧瓶。将溶液在室温下搅拌1小时。然后逐滴加入[1,4'-联哌啶]-1'-羰基氯(32mg,0.14mmol,1当量)、Et3N(23μL,0.17mmol,1.2当量)和4-二甲基氨基吡啶晶体在1mL的CHCl3中的溶液。将所得混合物搅拌过夜。在第二天通过TLC检测某种起始材料,并且因此向反应混合物中加入[1,4'-联哌啶]-1'-羰基氯(16mg,0.07mmol,0.5当量)、Et3N(12μL,0.08mmol,0.6当量)和4-二甲基氨基吡啶晶体在0.5mL的CHCl3中的另一个溶液,并且将其搅拌过夜。通过加入20mL的H2O来猝灭反应。将所得水层用EtOAc(3x20mL)萃取,用MgSO4干燥并且浓缩,得到粗产物,将其通过柱色谱(利用在DCM中的10-20%MeOH的梯度洗脱)纯化,获得64mg(87%)的所需产物,为橙色油状物。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.80(d,J=4.4Hz,1H),8.01(d,J=9.1Hz,1H),7.56(dd,J=24.0,7.5Hz,2H),7.47(dd,J=9.1,2.6Hz,1H),7.38(d,J=4.4Hz,1H),7.28(d,J=2.6Hz,1H),6.95(d,J=7.8Hz,1H),4.27(t,J=7.2Hz,2H),4.01(dd,J=37.1,14.3Hz,2H),3.65–3.14(m,1H),2.81(d,J=16.6Hz,4H),2.61(m,3H),1.82(s,3H),1.74(d,J=10.6Hz,3H),1.44(m,10H)。
13C NMR(101MHz,DMSO)δ156.59,152.55,151.92,151.57,149.18,148.60,147.08,145.62,141.10,136.57,130.20,127.54,124.70,122.63,121.25,117.67,116.92,109.27,61.31,49.59,47.95,25.53,23.29,22.41。
UPLC-MS:537.8(M+H)
1.5.式IV的前药的盐酸盐的合成:
1-(1-(((4-(2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-6-基)氧基)羰基)哌啶-4-基)哌啶-1-鎓氯化物
将式IV的化合物(65mg,0.12mmol)溶解在DCM(1.5mL)中并且用0.3mL(1.21mmol)的HCl在二噁烷中的2M溶液处理2小时。然后除去溶剂,得到淡橙色固体(70mg,100%)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.18(d,J=5.6Hz,1H),8.35(d,J=9.2Hz,1H),8.12(d,J=5.6Hz,1H),8.06(t,J=7.9Hz,1H),8.02–7.93(m,2H),7.74(d,J=7.9Hz,1H),7.28(d,J=7.9Hz,1H),4.56–4.39(m,3H),4.31–4.28(m,1H),3.59–3.56(m,2H),3.52–3.45(m,2H),3.19–2.95(m,6H),2.88(s,3H),2.85–2.81(m,1H),2.25–2.20(m,2H),2.01–1.85(m,7H),1.60–1.50(m,1H)ppm。
13C NMR(101MHz,甲醇-d4)δ157.0,153.3,153.2,152.2,151.0,147.2,146.1,145.5,144.9,137.62,131.4,129.3,128.0,124.6,124.5,124.1,119.5,111.0,66.9,64.6,51.4,50.4,44.3,44.0,27.5,27.2,27.1,24.5,24.2,22.9,20.1,15.5ppm。
IR(薄膜):3411,3048,2933,2857,1716,1589,1420,1195,1020,804cm-1。
HRMS(ESI):m/z[M+H]+对于C32H37N6O2的计算值:537.2973;实验值:537.2968。
Mp:214-215℃。
实施例2:体外TGFβ抑制剂活性
2.1分子亲和力和选择性测定
通过使用来自Eurofins的KINOMEscanTM技术来测定式I的化合物对ALK家族的亲和力,该亲和力作为Kd(解离常数)测得。测定了面对ALK1(ACVRL1)、ALK2(ACVR1)、ALK3(BMPR1A)、ALK4(ACVR1B)、ALK6(BMPR1B)、ACVR2B和TGFβR2的选择性。
KINOMEscan筛选平台采用活性位点定向竞争结合测定来定量地测量测试化合物和激酶之间的相互作用。KINOMEscan测定不需要ATP并且由此报告真正的热力学相互作用亲和力。
测定通过组合三种组分进行:DNA标记的激酶;固定化配体;和测试化合物。经由DNA标签的定量PCR来测量测试化合物与固定化配体竞争的能力。
结合反应通过在1x结合缓冲液(20%SeaBlock,0.17x PBS,0.05%Tween 20,6mMDTT)中组合激酶、配体亲和珠和测试化合物而进行组装。将测试化合物制备为在100%DMSO中的111X储液。使用11点的3倍化合物稀释系列来确定Kd,其中三个DMSO对照点为最高浓度30μM。用于Kd测量的所有化合物均通过在100%DMSO中的声传递(非接触式分配)进行分布。然后将化合物直接稀释到测定中,以使DMSO的最终浓度为0.9%。所有反应均在聚丙烯384-孔板上进行。每个的最终体积为0.02ml。将测定板在振荡下在室温温育1小时,并且用洗涤缓冲液(1x PBS,0.05%Tween 20)洗涤亲和珠。然后将这些珠重新悬浮在洗脱缓冲液(1xPBS,0.05%Tween 20,0.5μM非生物素化亲和配体)中,并且在振荡下在室温温育30分钟。通过qPCR测量洗脱液中的激酶浓度。
与激酶活性位点结合并直接(立体地)或间接(变构地)阻止激酶与固定化配体结合的化合物将减少在固体载体上捕获的激酶的量。相反,不结合激酶的测试分子对在固体载体上捕获的激酶的量没有影响。通过测量作为测试化合物浓度的函数的在固体载体上捕获的激酶的量,计算测试化合物-激酶相互作用的解离常数(Kd)。
如在下表1中看到的,式I的化合物在ALK5亲和力方面的效力是加尼西替尼的8.6倍。使用相同的技术,考虑了加尼西替尼发表数据(Jonathan M等人,Oncotarget,2018,9(6):6659-6677)来进行比较。
表1.KINOMEscanTM亲和力数据
还通过使用来自Eurofins的Kinase Profiler服务来测定本发明的式I的化合物、式II和IV的前药以及现有技术化合物337、338和加尼西替尼对于ALK5的酶活性抑制(作为IC50测得)。
简言之,将人ALK5与8mM MOPS pH 7.0、0.2mM EDTA、1mM MnCl2、2mg/mL酪蛋白、10mM乙酸Mg和[γ-33P-ATP](比活度大约500cpm/pmol,所需的浓度)进行温育。通过添加MgATP混合物来启动反应。在室温下温育40分钟后,通过添加3%磷酸溶液来终止反应。然后将10μL的反应物点到P30滤垫上,并且在75mM磷酸中洗涤3次,持续5分钟,并且在甲醇中洗涤一次,然后进行干燥和闪烁计数。
使用半对数系列稀释液的9点曲线来测试化合物。测试的最高浓度为10μM。测试化合物在100%DMSO中制备。
表2中示出的结果表明,式I的化合物的效力是加尼西替尼的2.5倍。本发明的式III和IV的前药以及现有技术化合物337、338的结果也显示在以下同一个表中:
表2.KinaseProfilerTM酶活性数据
如在表2中看到的,结果显示,出乎意料地,式(I)的化合物的效力是参考化合物338的2.1倍,而在结构上这些化合物的不同之处仅在于酚羟基的位置。另外,与参考化合物337相比,显示出类似的结果,即式(I)的化合物的效力是所述化合物的1.8倍,而已知在结构上这些化合物的不同之处仅在于酚羟基的位置以及在吡啶部分中存在或不存在甲基。
如所看到的,现有技术鉴定了提供作为TGFβ途径抑制剂的活性的化合物家族,然而,令人惊讶地,本发明表明取代的类型及其在母核结构中的位置在提供由式(I)的化合物所显示的出乎意料的改善的效力方面是关键的。
此外,Li等人(J.Med.Chem.2008,51(7):2302-2306)公开了在6位上可以容忍缺电子和相对较小的基团,这教导与在式(I)的化合物中引入作为在6-位处的特征的给电子基团诸如羟基相反。
就前药而言,式I的化合物的效力分别是具有式(III)和(IV)的式(I)化合物的前药的4.7倍和12.9倍,突显了TGFβ抑制活性在体外被阻断。
使用scanEDGE(KINOMEscan,Eurofins)测定,还测量了式I的化合物对于一组97种蛋白质的选择性。该式的化合物的选择性特性是良好的。
另外,通过使用来自Eurofins的SafetyScreen44TM服务来进行安全性评估。其中的靶标均与体内不良药物反应强烈相关,如在出版物Reducing safety-related drugattrition:the use of in vitro pharmacological profiling(减少安全性相关的药物消耗:体外药理学分析的使用)(Bowes J等人,Nature Review Drug Discovery 2012,11(12):909-922)中所提及的。该组代表了在初步安全性评估中的合理的第一步,因为它们提供潜在的脱靶相互作用的早期识别以优化安全限度。该安全组包括酶测定和结合测定二者。对于所有测试的蛋白质,式I的化合物在10μM下的抑制百分比均低于50%。考虑到该化合物对于ALK5的结合亲和力(20nM),对于在SafetyScreen44组中的蛋白质的选择性比率大于500倍。
2.2.体外萤光素酶测定
从ATCC购得HEK293T细胞,并且在补充有L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的DMEM(LifeTechnologies)中于37℃和5%CO2下培养。将细胞接种在24-孔板中,并且使用聚乙烯亚胺(Polysciences)作为转染试剂,用编码12xCAGA-Firefly_Luc和Tk-Renilla_Luc的质粒转染(分别为每孔75ng和10ng)。7小时后,将培养基替换为饥饿培养基(DMEM+0.05%FBS)。第二天,用加尼西替尼、式I的化合物以及前药(式III的化合物和式IV的化合物)(来自在DMSO中的10mM储液,稀释103至108倍)(如所示)以及5ng/ml重组人TGFB1(Peprotech)进行处理。16小时后,使用双重萤光素酶测定试剂盒(Promega)来测量萤光素酶活性:吸出培养基,并且将细胞在200μl被动裂解缓冲液(试剂盒)中裂解20分钟。在Berthold Lumat LB6507光度计中测量生物发光(18μl试剂,10秒测量)。
当TGβ与受体结合时,发生TGFBR1的磷酸化,进而使SMAD2/3磷酸化,然后其与SMAD4形成复合物并且进入细胞核。然后,SMAD2/3-SMAD4复合物与启动子(或TGF-β反应元件)结合并且与各种辅因子结合,允许下游基因或荧光素酶报告基因的转录。
当将萤光素酶底物(萤光素)添加到细胞裂解物中时,由于产生pSMAD2/3–SMAD4,光的发射暗示了活跃的TGF-β途径,而没有或几乎没有观察到的光将暗示该途径被该抑制剂抑制。最后,可以通过添加Stop&来使结果归一化,该Stop&猝灭萤火虫萤光素酶/底物并且激活海肾转染对照,产生的光再次由光度计测量并且用于将数据归一化。
图1显示了式I的化合物的TGFβ信号传导抑制能力如何高至加尼西替尼的多于2倍,即,发现的加尼西替尼的IC50值为359nM并且式I的化合物的IC50值为165nM,而与式I的化合物相比,式I的化合物的前药(式III的化合物和式IV的化合物)具有低至多达八分之一的TGFβ信号传导抑制能力。这意味着,由于式I的化合物的特定结构特征,其TGFβ信号传导抑制能力强,并且另外地,为了获得前药(式III的化合物和式IV的化合物)所作出的修饰成功地圈闭或阻断了TGFβ信号传导抑制活性。
实施例3:TGFβ抑制剂体内研究
小鼠肿瘤类器官(MTO)来源于C57BL6/J品系的复合转基因小鼠(在Apc、Kras、Trp53和Tgfbr2中的条件突变,并且携带Lgr5-EGFP/CreERT2),并且进行培养,如在Tauriello等人2018Nature 554(7693):538-543.doi:10.1038/nature25492中描述的。类器官是在3D矩阵中生长的肿瘤上皮细胞,在该3D矩阵中它们采用器官型结构,典型地作为带有内腔的球状体。以这种方式,细胞保持相对正常的极性(这意味着外表面、内/内腔表面以及细胞-细胞接触是单独地特化的),这比常规的2D细胞培养更具生理性。此外,这些类器官能够重现概括人类癌症的复杂肿瘤结构,包括募集丰富且促肿瘤原性的(即富含TGFβ的)基质;用于移植人样肿瘤并研究肝转移的系统,以前并未进行过描述。
为了进行体内抗癌功效和TGFβ抑制剂研究,C57BL/6J小鼠在6周龄时从Janvier购得,并且在7-8周时进行注射。将MTO用胰蛋白酶消化(消化基质(matrix)并且将类器官分解成单个细胞),进行计数,并且将300,000个细胞以HBSS(汉克氏平衡盐溶液,Lonza)的形式注射到脾脏中,从而将细胞直接递送到连接肠与肝脏的门静脉中。在本发明描述的所有实验中均使用MTO129(Tauriello等人Nature.2018)。
通过管饲(管饲喂)在Milli-Q水中的1%羧甲基纤维素钠(Sigma)、0.4%十二烷基硫酸钠(Sigma)、0.085%聚乙烯吡咯烷酮、0.05%消泡剂A(Sigma)中的4至120mg/ml的悬浮液来进行利用化合物(式I的化合物和加尼西替尼)的治疗。每天两次地用150μl治疗小鼠,持续14天或直至终点。
在其中在MTO移植后两周开始治疗并在处死前持续三天的小鼠中,评估了处理对生物标记的影响。采用本领域众所周知的程序,通过免疫组织化学用对磷酸化SMAD2具有特异性的抗体(Cell Signaling,3108)对4μm的组织切片进行染色。图2显示出在对照处理的动物(媒介物)中对于磷酸-SMAD2阳性的细胞核(用箭头标记),但是在用加尼西替尼或者用式I的化合物或其前药(式IV的化合物)处理的小鼠中不存在。
图3显示了在不同剂量(80mg/kg b.i.d.的加尼西替尼的通常小鼠剂量的0.3x、1x、3x和9x的摩尔当量,当假定平均重量为25g时,其转换为2mg/小鼠)下的式I的化合物和加尼西替尼的肝肿瘤计数(LiM)。在小鼠中,特别是在小鼠转移性结肠直肠癌中,加尼西替尼在160mg/Kg/天的标准1x剂量下是无效的;在上述MTO论文(Tauriello等人Nature etal.2018)中,我们需要使用高达1600mg/kg/天(10x)的剂量以有效地治疗转移性癌症。然而,所述剂量可能导致毒性(心脏毒性、肌肉组织和软骨缺损、骨骼发育以及皮肤和肠道中的炎症反应改变)。在患者中,在14天用药-14天停药的方案中,治疗剂量降到80至150mgb.i.d。如图3中所示,当与加尼西替比相比时,式I的化合物导致肝肿瘤的量明显更低。
使用50μl 15mg/ml D-荧光素钾盐(Resem BV)的眶后注射,通过生物发光成像来测量表达荧光素酶报告基因的MTO。对每秒的来自跨胸部/腹部的区域的光子进行定量并且归一化为注射当天的测量值。图4显示了在12天的治疗期间(第3天直至第14天),在不同剂量(0.3x、1x、3x和9x的80mg/kg b.i.d.的小鼠剂量(即160mg/kg/天))下的式I的化合物和加尼西替尼的转移性肿瘤生长抑制能力。如可以在图4中看到的,1x剂量(160mg/Kg/天的小鼠剂量)对于加尼西替尼是无效的,并且必须增加到3x剂量(对应于480mg/Kg/天)以成为最有效的(1440mg/kg/天的9x剂量是高度有效的,如在图3中看到的),而式I的化合物在0.3x剂量的摩尔当量(对应于42.5mg/Kg/天;这在0.88:1的式I与加尼西替尼一水合物的分子量比率的校正之后,因为式I的化合物的分子量为342.4,而加尼西替尼的分子量为387.4)是有效的,显示出令人惊讶地且强烈地改善的体内抗肿瘤活性。
实施例4:毒性评估
对于有关经常与毒性相关的蛋白质的安全性评估,参见实施例2.1中的SafetyScreen44测定。
为了在体外评估式I的化合物的毒性,将HEK293T细胞接种在96-孔板中,并且用标示化合物处理24小时。DMSO用作对照。式I的化合物或加尼西替尼以在1至100μM范围内的不同浓度加入。根据制造商的说明,并且在测量前温育4小时,通过XTT测定(BiologicalIndustries)来评估细胞活力。在100μM下的细胞活力为64%,并且在30μM下的细胞活力为93%(图5),这表明在生理水平上具有极低的毒性,尤其是当考虑到式I的化合物对ALK5的抑制的IC50值在nM范围内时。
为了评估体内毒性,将小鼠接种MTO129,并且如图3中所述,在两周内用不同摩尔当量剂量的加尼西替尼和式I的化合物处理。对治愈的小鼠(即在实验终点时没有转移的小鼠)的数量进行评分。将这些小鼠的肠、皮肤样本、心脏、胸骨骼和四肢固定在磷酸盐缓冲的10%福尔马林(Sigma)中。将软组织包埋在石蜡块中,切片,并且用苏木精和曙红染色。首先将骨骼脱钙2周,然后再进行包埋、切片和染色。有经验的病理学家对组织进行了组织病理学异常的分析。发现肉眼可见地明显的漏斗胸表型(在胸骨内塌陷)与胸肋软骨区域(在胸骨和肋骨之间存在的软骨)的缺陷有关。此外,对于肥大区中的缺陷,分析在长骨末端处的软骨骨化区。在使用1x剂量的加尼西替尼或式I的化合物的皮肤和肠的分析中,未观察到病理学异常。
表3:加尼西替尼(Gal)与式I的化合物的功效和毒性比较。对每次测试小鼠数量的毒性进行评分,合并并且作为百分比得到;n.d:没有测定
表3
加尼西替尼从3x剂量当量(480mg/kg/天)开始有效(>50%功效),并且在9x(1440mg/kg/天)时是毒性的(毒性>50%)。式I的化合物在0.3x剂量当量(42.5mg/kg/天)时是有效的,并且在9x剂量当量(1272mg/kg/天)时也是毒性的(毒性>50%)。
基于此,可以计算式I的化合物相比于加尼西替尼的治疗指数(毒性剂量/有效剂量之间的比率)。
加尼西替尼治疗指数=9/3=3。式I化合物治疗指数=9/0.3=30。结果表明,与加尼西替尼相比,式I的化合物提供至少10倍的改善。
实施例5:式VII的前药的合成:
为了将香荚兰乙酮-片段偶联至4-羟基他莫昔芬,首先从商业香荚兰乙酮开始来合成卤代的香荚兰乙酮片段。
1-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)乙-1-酮
在室温下向香荚兰乙酮(6g,36.1mmol)在DMF(120mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(7.48g,54.15mmol,1.5当量),接着逐滴加入苄基溴(4.66mL,38.99mmol,1.08当量)。将反应混合物在40℃下搅拌14小时,然后冷却至室温,其中将其倒入1L的水/冰混合物中并且搅拌10分钟。然后在真空下使用Büchner漏斗对悬浮液进行过滤,将固体用在0℃的水(3x70mL)洗涤,然后在真空下将其在布氏漏斗中留置一小时。然后将固体转移到圆底烧瓶中并且在高真空线上干燥至恒重,得到8.99g(97%收率)的标题化合物(C.Miesch,T.Emrick,J.Colloid Interface Sci.2014,425,152–8)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.55(d,J=2.0Hz,1H),7.50(dd,J=8.4,2.0Hz,1H),7.43(dd,J=8.2,1.4Hz,2H),7.38(m,2H),7.34–7.29(m,1H),6.91–6.87(m,1H),5.23(s,2H),3.94(s,3H),2.55(s,3H)。
1-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-溴乙-1-酮(5-8a)
在60℃下向先前获得的1-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)乙-1-酮(7.86g,30.69mmol)在EtOH(150mL)中的搅拌溶液中加入溴(4.90g,30.69mmol,1当量)。将反应混合物搅拌6小时,然后使其缓慢冷却至室温过夜。在早上,将反应混合物冷却至0℃,其中将其保持搅拌一小时。然后将其通过玻璃布氏漏斗进行过滤,用冷EtOH(2x30mL)洗涤,然后使其在高真空线上进行干燥。这得到标题化合物(7.25g,71%),为白色固体(纯净,通过1HNMR)。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ7.58–7.49(m,2H),7.46–7.29(m,5H),6.92(d,J=8.4Hz,1H),5.25(s,2H),4.39(s,2H),3.95(s,3H)。
式VII的前药从4,4'-(2-苯基丁-1-烯-1,1-二基)二苯酚(CAS编号4120-45-0)开始的合成可以如方案VIII中所示:
方案VIII
3-(4-(1-(4-羟基苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基)苯氧基)丙-1,2-二醇,(5-46)
在密封烧瓶中向二醇5-43(1.6g,5.06mmol)的溶液中加入在EtOH(24mL)中的NEt3(0.706mL,5.06mmol,1当量)和缩水甘油(0.301mL,4.55mmol,0.9当量),并且加热直至80度过夜。在早上,将反应混合物冷却至室温并且将溶剂在真空中除去。将剩余物在EtOAc(40mL)和饱和氯化铵(40mL)之间分配,然后将有机层用MgSO4干燥并且在真空中浓缩至干燥。剩余物通过急骤柱色谱纯化,得到标题化合物,为粘稠的无色油状物(735mg,37.2%收率)。
1H NMR(400MHz,cd3od)δ7.19–7.06(m,1H),7.04(d,J=8.4Hz,1H),6.96(t,J=5.7Hz,1H),6.82–6.74(m,1H),6.67(d,J=8.5Hz,1H),6.62–6.55(m,1H),6.42(d,J=8.5Hz,1H),4.13–3.80(m,1H),3.79–3.53(m,1H),2.49(p,J=7.5Hz,1H),0.92(t,J=7.4Hz,1H)。
13C NMR(101MHz,cd3od)δ159.14,158.29,157.25,156.36,144.11,144.10,141.99,141.80,139.74,139.71,137.87,137.50,136.34,135.98,133.02,133.00,131.57,130.89,130.87,128.84,126.94,115.84,115.18,115.09,114.35,71.84,71.76,70.34,70.08,64.21,64.14,29.89,29.85,13.94。**由于双键是顺式和反式异构体的1:1混合物的事实,以及所用的缩水甘油是外消旋物的事实,所以碳比预期的多。这是由非对映异构体所引起的。**
4-(1-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基)苯酚,(5-49)
在N2下向烧瓶中加入5-46(106mg,0.271mmol)的溶液并且在室温下溶解在丙酮(3mL)中,其中在50度下加入p-TSA(7.7mg,0.040mmol,0.15当量)和2,2-二甲氧基丙烷(66μL,542mmol,2当量),并且使其反应5小时。在通过TLC所有起始材料都消失后,将反应混合物冷却至室温,其中将其用10%NaHCO3(2mL)和EtOAc(6mL)稀释,分离各相,并且将水层用EtOAc(2x6mL)萃取,将有机层合并并且用MgSO4干燥,然后在真空中浓缩。然后将剩余物通过二氧化硅纯化,得到标题化合物(102mgs,87%收率),为无色油状物。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ7.19–7.04(m,7H),6.92–6.83(m,1H),6.82–6.69(m,3H),6.56–6.52(m,1H),6.48–6.44(m,1H),4.96(s,0.5H),4.70(s,0.5H),4.54–3.77(m,5H),2.52–2.42(m,2H),1.49–1.34(m,6H),0.92(t,J=7.4Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,cdcl3)δ157.20,156.37,154.22,153.41,142.53,141.20,141.16,137.63,137.61,136.69,136.33,136.23,135.89,132.09,131.92,130.76,130.59,129.67,127.83,127.81,125.92,114.93,114.23,114.04,113.29,109.79,109.69,74.03,73.98,68.71,68.42,66.89,66.80,29.01,29.00,26.79,26.73,25.37,25.34,13.59。
**由于双键是顺式和反式异构体的1:1混合物的事实,以及所用的缩水甘油是外消旋物的事实,所以碳比预期的多。这是由非对映异构体所引起的。
IR(薄膜):3400,2920,2851,1722,1673,1598,1496,1273cm-1
HRMS(ESI):m/z(M+H)对于C28H30O4的计算值:430.2144;实验值:430.2143。
1-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-(4-(1-(4-((2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基)苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基)苯氧基)乙-1-酮,(5-50)
向5-49(500mg,1.16mmol,1当量)在丙酮(15mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(321mg,2.32mmol,2当量),接着加入α溴酮5-8a(582mg,1.74mmol,1.5当量),其中将其在室温下搅拌过夜。第二天早上,将溶剂在真空中除去,其中接着将其用EtOAc(50mL)和水(30mL)稀释。分离各相,并且将水层用EtOAc(2x20mL)萃取,将有机层合并并且用MgSO4干燥,然后在真空中浓缩。然后将剩余物通过二氧化硅纯化,得到标题化合物(737mg,92.7%收率),为无色油状物。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ7.61–7.27(m,7H),7.19–6.84(m,10H),6.78–6.71(m,2H),6.59–6.50(m,2H),5.30–5.05(m,4H),4.53–4.34(m,1H),4.22–4.02(m,1H),3.99–3.86(m,5jH),3.85–3.74(m,1H),2.46(q,J=7.5Hz,2H),1.49–1.34(m,6H),0.91(td,J=7.3,1.0Hz,3H)。
13C NMR(101MHz,cdcl3)δ193.25,193.20,157.39,156.98,156.55,156.15,153.18,153.05,149.91,149.82,142.62,142.58,141.53,141.48,137.66,137.23,136.76,136.73,136.26,136.23,132.10,132.07,130.78,130.75,129.80,128.86,128.84,128.32,128.30,128.13,128.12,127.98,127.31,127.30,126.09,122.75,122.68,114.53,114.20,113.79,113.45,112.38,112.32,110.94,110.91,109.88,109.78,74.17,74.12,70.98,70.95,70.91,70.78,68.89,68.60,67.06,66.97,56.27,56.23,29.19,29.14,26.98,26.89,25.52,25.50,13.74,13.73。
**由于双键是顺式和反式异构体的1:1混合物的事实,以及所用的缩水甘油是外消旋物的事实,所以碳比预期的多。这是由非对映异构体所引起的。**
UPLC-MS:685.9(M+H)
1-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-(4-(1-(4-(2,3-二羟基丙氧基)苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基)苯氧基)乙-1-酮,(5-51)
将上述的5-50(634mg,1.09mmol)的搅拌溶液溶解在6:1THF:水(20mL)中,其中在室温下加入2M HCl(2mL)。通过TLC跟踪反应,并且在所有的SM消耗后,用10%NaHCO3(10mL)猝灭。将反应混合物用EtOAc稀释并且分离各相,将水相用EtOAc(5mL)和氯仿(5mL)萃取。将合并的有机萃取物用MgSO4干燥,然后在真空中浓缩。然后将剩余物通过二氧化硅(MeOH/DCM)纯化,得到标题化合物(527mg,89%收率),为无色油状物。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ7.61–7.30(m,7H),7.19–7.05(m,7H),6.95–6.85(m,3H),6.79–6.72(m,2H),6.59–6.51(m,2H),5.26–5.02(m,4H),4.23–3.53(m,8H),2.50–2.40(m,2H),0.91(td,J=7.3,1.1Hz,3H)。
2-(4-(1-(4-(2-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基)苯氧基)乙醛,(5-52)
在室温下向上述的5-51(250mg,0.388mmol)在DCM(7mL)中的搅拌溶液中加入在水(2mL)中的NaIO4(249mgs,1.16mmol,3当量)。将反应剧烈搅拌3小时,其中大部分的起始材料已被消耗。将其用盐水(4mL)稀释,然后分离各相。将有机相干燥(MgSO4),并且将溶剂在真空中除去,然后通过急骤柱色谱纯化,得到标题化合物,为无色油状物(155mgs,63%收率)。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ9.88(br s,0.5H),9.77(br s,0.5H),7.62–7.28(m,7H),7.20–7.05(m,7H),6.94–6.84(m,3H),6.81–6.70(m,2H),6.60–6.49(m,2H),5.33–4.98(m,4H),3.93(d,J=14.5Hz,4H),2.51–2.38(m,2H),0.92(dt,J=8.5,4.2Hz,3H)。
1-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-(4-(1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基)苯氧基)乙-1-酮(5-54)
在室温下,在N2下,向5-52(143mg,0.233mmol,1当量)在THF(5mL)中的搅拌溶液中加入二甲胺在THF中的2M溶液(0.175mL,0.350mmol,1.5当量),接着分批加入Na(AcO)3BH(75mg,0.700mmol,3当量)。使反应反应5小时,此时通过TLC没有看到SM。然后将反应混合物用盐水(3mL)和EtOAc(10mL)稀释,并且在搅拌15分钟之后分离各相。将水相用EtOAc(2x10mL)和氯仿(1x10mL)萃取,将有机萃取物合并,干燥(MgSO4),并且将溶剂在真空中除去。将剩余物通过急骤柱色谱(DCM/MeOH–0-15%)纯化,得到标题化合物,为粘稠油状物(93mgs,62%收率)。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ7.62–7.55(m,1H),7.55–7.48(m,1H),7.46–7.28(m,5H),7.21–7.06(m,7H),6.94–6.81(m,3H),6.78–6.71(m,2H),6.59–6.45(m,2H),5.24(s,1H),5.22(s,2H),5.06(s,1H),4.26(t,J=5.1Hz,1H),4.11–4.07(m,1H),3.95(s,1.5H),3.91(s,1.5H),3.11(dt,J=36.9,4.3Hz,2H),2.63(s,3H),2.57(s,3H),2.46(q,J=6.7Hz,2H),0.91(td,J=7.4,1.8Hz,3H)。
2-(4-(1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)-2-苯基丁-1-烯-1-基)苯氧基)-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)乙-1-酮,(式VII的前药)
在室温下向5-54(94mg,0.146mmol)在脱气的10%MeOH/EtOAc(12mL)中的搅拌溶液中加入Pd/C(9mg)。在利用H2气球和真空的三个循环中,将N2气氛置换为H2气氛。通过TLC跟踪反应,并且当SM已被消耗时,将气氛置换为N2并且将其吹扫5分钟。将反应混合物通过硅藻土过滤并且将溶剂在真空中除去。将剩余物通过急骤柱色谱(DCM/MeOH–梯度)纯化,得到标题化合物,为粘稠油状物(74mg,92%收率)。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ7.65–7.58(m,1H),7.55–7.50(m,1H),7.17–7.05(m,7H),7.00–6.86(m,3H),6.79–6.71(m,2H),6.59–6.51(m,2H),5.23(s,1H),5.07(s,1H),4.14(t,J=5.6Hz,1H),4.01–3.93(m,4H),2.86(t,J=5.6Hz,1H),2.77(t,J=5.4Hz,1H),2.50–2.40(m,5H),2.38(s,3H),0.91(td,J=7.4,2.0Hz,3H)。
实施例6:LigF酶测定
6.1 4-甲基伞形酮香荚兰乙酮的合成
4-甲基伞形酮(4-MU)衍生物是已知的化合物。MUAV的合成可以例示如下:
7-(2-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-氧代乙氧基)-4-甲基-2H-色原烯-2-酮,(5-4b)
在25℃下向4-甲基伞形酮(400mg,2.27mmol)在丙酮(30mL)中的搅拌溶液中加入1-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-2-溴乙-1-酮(5-8a,在实施例5中合成)(967mg,2.72mmol,1.2当量)。将反应混合物搅拌16小时,然后过滤,并且将固体剩余物用丙酮(2x30mL)洗涤。然后将溶剂在减压下除去,然后悬浮在甲苯中并且加热直至形成溶液。然后使烧瓶在90分钟内冷却至室温,其中将其过滤,用冷甲苯(10mL)洗涤,并且使其在高真空线上干燥。这得到标题化合物,为白色固体(801mg,82%)。
1H NMR(400MHz,cdcl3)δ7.57–7.30(m,8H),6.94(d,J=4.5Hz,2H),6.78(d,J=2.5Hz,1H),6.14(d,J=1.2Hz,1H),5.31(s,2H),5.26(s,2H),3.95(s,3H)。
7-(2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-氧代乙氧基)-4-甲基-2H-色原烯-2-酮,(5-4a)
在室温下,向压力反应器中加入在脱气的10%MeOH/EtOAc(10mL)中的5-4b(500mg,1.16mmol)和10%Pd/C(25mg,相对于sm的质量为5%wrt)。向反应器中装入1巴(g)的氢气,并且通过使用适当的能够承受压力的针取样而通过TLC跟踪反应。4小时后,起始材料已被消耗。将氢气从反应器中释放,并且经由3个真空-氮气循环置换为氮气。将反应混合物用CHCl3(20mL)稀释并且通过硅藻土过滤。将滤液在减压下浓缩。将粗制物进行色谱分析(0-10%MeOH:DCM),得到标题化合物5-4a(307mg,78%),为白色固体。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.59–7.55(m,2H),7.51(d,J=8.8Hz,1H),7.00(d,J=8.1Hz,1H),6.94(dd,J=8.8,2.6Hz,1H),6.79(d,J=2.6Hz,1H),6.18(br s,1H),6.14(d,J=1.2Hz,1H),5.33(s,2H),3.97(s,3H),2.39(d,J=1.2Hz,3H)。
6.2体外酶促荧光测定
为了研究通常式II和式V的前药(包括式III的化合物,即式I的化合物的前药;式VII的化合物,即4-羟基他莫昔芬的前药;以及式IX的化合物,即SN-38的前药)中的醚键的断裂的动力学,并且为了弄清酶对于识别片段的选择性,将荧光化合物荧光4-甲基伞形酮用作模型化合物。
为了测试LigF的酶活性,通过将His标记的LigF DNA插入到pOPINF载体中,纯LigF蛋白通过在IRB(巴塞罗那)内的蛋白质表达核心设施表达,并且在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)Rosetta lysS细胞中表达。在表达和裂解后,通过使用镍柱以及随后的凝胶过滤来纯化蛋白质。值得注意的是,在纯化后并未将His标签从蛋白质上移除。
对于体外荧光测定,将纯化的LigF在20mM Tris-HCl(pH7.5)中稀释至15μg/ml,加入1mM谷胱甘肽和30μM 4-甲基伞形酮香荚兰乙酮(MUAV)模型化合物。
反应在96孔固体聚苯乙烯板(Corning)中进行,并且利用顶孔平板读数器(BioTekFL600荧光计)在360激发、485发射和灵敏度100下进行测量。
由于化合物MUAV的β-醚键断裂导致的4-甲基伞形酮(4-MU)的快速产生速率,通过降低LigF酶浓度,对Masai(E.Masai等人,J.Bacteriol.2003,185,1768–75)描述的方案进行改良。利用这种优化方案,将化合物MUAV在缓冲剂谷胱甘肽(GSH)和LigF的存在下在室温下温育,并且通过利用荧光观察4-MU的产生来跟踪裂解。适当的对照(包括不含GSH、不含LigF和不含MUAV的孔)表明,在测定条件下醚键并未分解,并且需要酶活性。酶LigF在大约30-40分钟内使产物MUAV裂解(图6)。
对于在细胞培养中的测定,通过利用pLenti PGK puro载体和包装质粒pCAG-RTR2、pCAG-VSVG和pCAG-KGP1R的慢病毒感染来稳定地转导细胞以表达LigF。在用1μg/ml嘌呤霉素(InvivoGen)进行选择之后,将感染的细胞接种到24孔板中,并且加入4-甲基伞形酮香荚兰乙酮(MUAV)。在添加各种浓度的MUAV(即10、30和100μM)后的时间点,取培养基进行4-MU荧光的测量。
图7显示,MUAV的醚键确实被细胞表达的LigF裂解,这由荧光的剂量依赖性增加表明。在以下对照实验中并未观察到裂解:用100μM处理的表达空载体(而非LigF)的HEK293T细胞。这些实验表明,LigF在哺乳动物细胞内具有活性,并且至少在所测试的细胞中不存在其他能够裂解β醚键的酶。
6.3.式VII的前药的体外LigF测定
为了在用LigF和香荚兰乙酮-衍生的前药的体外酶促测定中进行进一步测试,使用式VII的化合物—4-羟基他莫昔芬的前药。
与5.2.中的体外测定类似,将式VII的化合物从在DMSO中的30mM储液稀释至在20mM Tris-HCl(pH 7.5)中的50μM,加入1mM谷胱甘肽和15μg/ml LigF。然而,将反应混合物在37℃下温育,并且读出不同:使用HPLC-MS/MS。将反应样品以及没有酶的对照样品和作为标准品的Z-4-OHT(4-羟基他莫昔芬)在MeOH中以2:3稀释,并且将2μl注入使用水-MeOH梯度(在30分钟内为60-90%MeOH;在5分钟内为90-100%;100μl/min流速)的BioBasic C18柱(5μm,2.1x150 mm,Thermo;使用Thermo EC Finnigan Mod Micro AS自动进样器和Thermo ECQuarternary泵,Finnigan Mod.Surveyor MS色谱)上。利用Advion Triversa Nanomate(Advion BioSciences,Ithaca,NY,USA)作为通过芯片技术进行纳米电喷雾的纳米ESI源,进行LC-MS偶联。将Nanomate附接到LTQ-FT Ultra质谱仪上,并且以正模式在1.7kV的喷雾电压和0.5psi的递送压力下运行。在LTQ-FT Ultra(Thermo Scientif)质谱仪中,使用40V毛细管电压和120V套筒透镜电压进行分析。MS/MS以数据相关采集(DDA)模式和选定的反应监测(SRM)模式运行。在FT中获取检查MS扫描,其中分辨率(在400m/z下定义的)设置为100,000。每次扫描中最强离子中的最多六个被碎片化,并且在线性离子阱中被检测到。对于检查扫描的离子计数目标值为1,000,000,而对于MS/MS扫描的离子计数目标值为50,000。已经将为MS/MS选择的目标离子动态地排除30s。对于SRM,最大注入量设置为400ms和平均2次微扫描。
使用QuanBrowser(Xcalibur软件2.0SR2),将数据表示为平行反应监测(PRM)转换的XIC(提取离子色谱图)峰面积。
LigF能够裂解连接识别片段(香荚兰乙酮)和4-OHT母核的式VII的前药的β醚键,从而产生4-OHT。注意到,在对照实验中,当除LigF外的所有其他组分都存在时,该分子仍保持完整,表明在体温下的延长的稳定性。出乎意料地,式VII的前药的E-异构体以比Z异构体更快的速率裂解,导致异构体(Z)-4-OHT的特定释放。(式VII的前药的E-异构体裂解而得到(Z)-4-OHT的事实是由Cahn-Ingold-Prelog优先规则所导致的。)
图8显示了式VII的前药的β醚键通过LigF裂解而得到4-OHT的HPLC-MS/MS实验。(A)阴性对照。(B)时间=0。(C)时间=1小时。(D)时间=3小时。(E)时间=44小时。
式VII的前药的裂解在大约30小时后达到了50%的平稳期,并且在3小时后到达了平稳期的一半,我们设想这是足够的速率以成为可用的体内工具,如图9中所看到的。
6.4细胞共培养测定:
进行这些测定以评估这种对式VII的化合物的特异性LigF酶促反应是否可以在细胞环境中发生,包括这种前药是否可以通过细胞膜,以及在被LigF裂解后,4-OHT是否可以扩散到相邻细胞并且激活突变的ERT2融合蛋白,从而实现融合蛋白的核活性。在这个实施例中,那些融合蛋白是Cre-ERT2和转录因子的活性部分(NTCF4-ERT2)-。
对于第一个实验,其中证实了在与表达LigF的细胞相邻的细胞中的基因重组,使用了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。小鼠模型带有重组报告基因mTmG(JAX货号:007676)。这种系统表达膜结合的tdTomato(串联二聚体tomato;mT代表膜Tomato),其是一种红色荧光蛋白。在与活化的Cre酶重组后,在loxP位点之间的用于mT的编码序列以及终止密码子被切除。这反而导致膜结合的增强型绿色荧光蛋白(EGFP;mG)的表达。有效地,这意味着在Cre酶的存在下或在4-OHT激活的Cre-ERT2融合蛋白的存在下,细胞停止其tdTomato的产生并且继续表达EGFP;可以通过流式细胞术分析有效地定量这种遗传转换。然后将表达mTmG的小鼠品系与在所有细胞中携带Cre-ERT2融合蛋白的小鼠杂交(UbC-Cre-ERT2;Jax货号:008085)。从双转基因小鼠以及从不具有Cre-ERT2的报告品系中,从14日龄的胚胎中收获MEF。简言之,在塞形成后14天,将妊娠的雌性处死,取出子宫,并且解剖胚胎:丢弃头部和胎肝。将剩余物切碎并且用胰蛋白酶消化,并且在具有上述补充的DMEM的10-cm平皿中生长。
MEF重组:用pLenti PGK-LigF(puro)或用等效的空载体转导的MTO129进行胰蛋白酶消化,并且单个细胞加入UbC-Cre-ERT2上;在12-孔板中生长的mTmG(或对照仅mTmG)MEF。第二天,以在1000至1nM范围内的浓度添加Z-4-OHT或式VII的前药。两天后,细胞用胰蛋白酶消化,并且通过流式细胞术分析TdTomato/EGFP荧光(Gallios,Beckman Coulter)。在2个维度上分析了活细胞上的荧光,并且在4个象限中以百分比进行评分。EGFP阳性象限(Q2和Q4,具有或不具有TdTomato)被认为是重组的,并且计算了总体中的分数。数据是来自两个独立实验的平均值(+SD)。
图10显示了测定的结果,其中UVCre-mTmG下方的条图显示了用表达Cre-ERT2的MEF以及重组报告基因盒(mTmG)获得的结果,而Con-mTmG下方的柱图显示了缺少Cre-ERT2表达的MEF的结果,其用作对照。
如在图10中看到的,与Cre-ERT2表达无关,通过添加4-OHT都存在剂量依赖性基因重组。当添加式VII的前药时,这在MEF中实现了基因重组的模式,其与仅在表达LigF醚酶的MEF中的4-OHT非常类似。在缺乏UbC-ERT2的MEF中,在最高剂量下仅存在一些重组,这可能通过少量杂质或固有降低的活性进行解释。这表明式VII的前药大部分是无活性的,但是其在与MEF共培养的表达Lig-F的MTO129中被裂解,并且这种反应足以使释放的4-OHT扩散至MEF并且影响基因重组。
对于其中ERT2融合产物是转录因子的第二个实验,使用在与表达Lig-F的HEK293T细胞的共培养中的LS174T-NTCF4-ERT2(LS-NE)细胞(如在Whissell等人,2014,Nature CellBiology,16,695-707中所述的。原始LS174T细胞购自ATCC)。这些LS-NE细胞在补充有L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的DMEM(Life Technologies)中在37℃和5%CO2下进行培养。
NTCF4代表转录因子TCF4的N末端。这个构建体具有显性负性功能,关闭Wnt途径中的信号传导(Wnt-OFF),这在发育和(肠)干细胞调节中很重要。另外,大多数结肠直肠癌症(CRC)细胞都沉溺于Wnt信号传导,使得其抑制将会导致促致瘤干细胞基因(下降,抑制)和细胞分化基因(上升,激活)的基因表达中的强烈反应。与ERT2的融合使这个构建体保持在细胞核外,并且因此无活性。在用NTCF4-ERT2修饰的CRC细胞系LS174T中,添加4-OHT导致在内源基因表达方面的所述变化。
用pLenti PGK-LigF(puro)或用等效的空载体转导的HEK293T细胞与LS174T-NTCF4-ERT2(LS-NE)细胞以1/10的比率共铺板在6-孔板中。共培养物用DMSO、1μM Z-4-OHT或式VII的前药以1或10μM处理。16小时后,将细胞在trizol中裂解以进行RNA提取((PureLinkRNA Mini Kit,Life Technologies)和cDNA制备(High Capacity cDNA RT kit,AppliedBiosysytems)。在StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)上,使用Taqman探针(Applied Biosystems),通过RT-qPCR来分析干细胞基因ASCL2(被4-OHT-介导的Wnt-OFF抑制;Hs_00270888_S1)、分化基因KRT20(由4-OHT-介导的Wnt-OFF激活;Hs_00300643_m1)和管家基因PPIA(Hs_99999904_m1)。图11中的数据已针对管家基因和DMSO对照进行了归一化。数据是来自单个实验的技术重复的平均值(+SD)。而在对于LigF阴性的HEK293T的存在下,仅4-OHT能够诱导转录开关(激活基因KRT20向上,并且抑制基因ASCL2向下),在HEK293T-LigF的存在下,式VII的前药在10μM下实现了相同的反应。
实施例7:式VII的4-OHT前药体内研究
使用实施例6中所述的UbCre-ERT2;mTmG小鼠,我们用式VII的前药以1或5μmol(分别为大约0.6或3mg)或用媒介物对照(油)来治疗这些动物。在治疗后五天,处死小鼠,并且将肝脏在10%磷酸盐缓冲福尔马林(sigma)中固定过夜并且包埋在石蜡中,类似于实施例3中的描述(图1)。切出切片并且使用免疫组织化学对于EGFP进行染色。图12中显示的结果表明,在小鼠肝脏中(但不在我们的培养细胞中,参见实施例6)存在的酶能够裂解式VII的前药,导致基因重组和EGFP表达的剂量依赖性激活。
实施例8:使用癌症模型的体内TGFβ信号传导抑制的另外的研究。
进行了另外的体内研究以进一步评价本发明的式I的化合物及其式IV的前药相对于现有技术的参考化合物加尼西替尼和参考化合物338的功效。如实施例3中所示使小鼠肿瘤类器官(MTO129)发展。对于体内抗癌功效和TGFβ信号传导抑制研究,C57BL/6J小鼠在6周龄时从Janvier购得,并且在7-8周时进行注射。为了将MTO129移植到肝脏中,将细胞用胰蛋白酶消化(消化基质并且将类器官分解成单个细胞),进行计数,并且将300,000个细胞以HBSS(汉克氏平衡盐溶液,Lonza)的形式注射到脾脏中,从而将细胞直接递送到连接肠与肝脏的门静脉中。
将化合物(式I的化合物、式IV的化合物、加尼西替尼或化合物338)制备为在媒介物溶液中的悬浮液,所述媒介物溶液由在milli-Q水中的1%羧甲基纤维素钠(Sigma)、0.4%十二烷基硫酸钠(Sigma)、0.085%聚乙烯基吡咯烷酮、0.05%消泡剂A(Sigma)构成。通过管饲法(管饲喂)进行利用化合物的治疗,每天用150μl的化合物悬浮液治疗两次。对照小鼠用150μl的媒介物进行治疗。
在图13所示的实验中,评估了标示化合物抑制转移形成的效力。在MTO129移植后两天开始用标示化合物对小鼠进行治疗,并且持续两周。在移植后4周处死小鼠,并且通过肉眼在固定的肝脏上对肝转移(LiM)进行计数。图3显示了如在图例中所述的在不同摩尔当量剂量(9x、3x、1x、0.3x)下的式I的化合物和加尼西替尼的肝肿瘤计数(LiM)。当与相同摩尔剂量(70.8mg/Kg b.i.d)的参考化合物338(结构上与式I的化合物最接近的化合物)相比,在1x剂量(70.8mg/Kg b.i.d)下的式I的化合物在预防转移形成方面提供了显著改善的活性。
此外,图13显示出,式I的化合物在0.3x剂量(21.25mg/Kg b.i.d)下在预防肝转移方面仍然是有效的,并且这种治疗效果与3x的加尼西替尼剂量相当。另外,式I的化合物的活性显著优于参考化合物338的活性,这是高度出乎意料的,因为参考化合物338是式I的化合物的结构异构体。
与加尼西替尼相比,在该测定中式I的化合物的前药(式IV)更有力地减少肝转移的数量。
另外,图14和图15所示的实验评估了均在1x等摩尔剂量(式I的化合物为70.8mg/kg b.i.d并且加尼西替尼为80mg/Kg b.i.d)下,与现有技术化合物加尼西替尼相比,式I的化合物对明显的转移性疾病的治疗功效。为此目的,使用了针对图13描述的用MTO129进行小鼠接种的方案,但是此处用化合物进行的治疗在接种后第16天开始。在这个时间点,小鼠已经发展了大的转移。治疗在第24天结束。结果(图14)显示,当与等摩尔剂量的加尼西替尼相比时,在该实验设置下,式I的化合物在减少肝转移数量方面提供了改善的功效。另一方面,图15显示了用化合物治疗完成后具有明显的转移性疾病的小鼠的存活率。在这些实验中,绝大多数(>90%)的对照小鼠死于肝转移性疾病。用式I的化合物治疗的小鼠比用加尼西替尼治疗的小鼠具有更高的存活率。图13、图14和图15中所示的实验说明了与化学相关的化合物加尼西替尼和参考化合物338(其事实上为式(I)的化合物的构象异构体)相比,式I的化合物具有出乎意料的增强的治疗功效。
实施例9:利用PD1/PDL1检查点免疫疗法的体内组合疗法测定。
进行体内研究以评价式I的化合物相对于现有技术的参考化合物加尼西替尼(单独地或与PD1/PDL1免疫检查点抑制剂诸如抗-PD-1抗体治疗组合)对患有明显转移性疾病的小鼠的活性。
如实施例3中所示,发展了小鼠肿瘤类器官(MTO129)。C57BL/6J小鼠在6周龄时从Janvier购得,并且在7-8周时进行注射。为了将MTO129移植到肝脏中,将细胞进行胰蛋白酶消化(消化基质并且将类器官分解成单个细胞),进行计数,并且将300,000个细胞以HBSS(汉克氏平衡盐溶液,Lonza)的形式注射到脾脏中,从而将细胞直接递送到连接肠与肝脏的门静脉中。将化合物(式I的化合物或加尼西替尼)制备为在媒介物溶液中的悬浮液,所述媒介物溶液由在milli-Q水中的1%羧甲基纤维素钠(Sigma)、0.4%十二烷基硫酸钠(Sigma)、0.085%聚乙烯基吡咯烷酮、0.05%消泡剂A(Sigma)构成。通过管饲法(管饲喂)进行利用化合物的治疗,并且每天两次地用150μl的在媒介物中的化合物悬浮液对小鼠进行治疗。用1x等摩尔剂量的每种化合物治疗小鼠,其对应于80mg/k b.i.d的加尼西替尼或70.8mg/kgb.i.d的式I的化合物。通过腹膜内注射每3天给予200μg的抗-PD1一次(克隆RMPI-14;Leinco Technologies)。对照小鼠给予管饲媒介物和IgG2a同种型对照抗体。
在图14和图16所示的实验中,在接种MTO129后第16天开始用化合物和标示抗体进行治疗。在这个时间点,小鼠已经发展了大的肝转移。治疗在第24天结束。图14显示了与现有技术化合物加尼西替尼相比,单独用式I的化合物进行治疗后的肝肿瘤计数(LiM),二者均为1x等摩尔剂量(80mg/k b.i.d的加尼西替尼或70.8mg/kg b.i.d的式I的化合物),以及在用抗-PD-1抗体进行治疗后或者用抗-PD-1抗体加式I的化合物或加尼西替尼的组合治疗后的肝肿瘤计数(LiM)。同样,结果表明式I的化合物作为单一疗法在等摩尔剂量下提供了改善的活性。另外,与抗-PD-1抗体与加尼西替尼的组合相比,抗-PD-1抗体和式I的化合物的组合疗法提供了改善的活性。显著地,用式I的化合物与PD-1抗体疗法组合治疗的大多数小鼠在实验时间点保持无转移。图16显示了在治疗结束后具有明显转移性疾病的小鼠的存活率。在这些实验中,绝大多数(>90%)对照小鼠死于肝转移性疾病。相比之下,用式1的化合物与抗-PD1抗体组合治疗的小鼠中的80%在治疗后存活。用式I的化合物与抗-PD1抗体组合治疗的小鼠的存活率要比用加尼西替尼加抗-PD1抗体治疗的小鼠高得多(80%相对于20%)。
实施例10:式I的化合物以及参考化合物338和337的体内治疗功效
在另一个实验中(图17),我们比较了式I的化合物与相关化合物338和化合物337的体内治疗活性。如实施例3中所示,发展了小鼠肿瘤类器官(MTO129)。C57BL/6J小鼠在6周龄时从Janvier购得,并且在7-8周时进行注射。为了将MTO129移植到肝脏中,对细胞进行胰蛋白酶消化(消化基质并且将类器官分解成单个细胞),进行计数,并且将200,000个细胞以HBSS(汉克氏平衡盐溶液,Lonza)的形式注射到脾脏中,从而将细胞直接递送到连接肠与肝脏的门静脉中。用1x当量摩尔剂量的每种化合物(70.8mg/kg b.i.d.的式I的化合物,70.8mg/kg b.i.d.的化合物338或68.0mg/kg b.i.d.的化合物337)来治疗小鼠。从接种肿瘤细胞后第2天至第18天对所有小鼠进行治疗。在MTO接种后21天对肝转移的数量进行计数。该实验(图17)证实,与化合物338和化合物337相比,式I的化合物具有增强的阻断转移形成的效力。
Claims (28)
4.根据权利要求2或3中任一项所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的化合物,其中所述式(I)的化合物与化学疗法或癌症靶向疗法组合施用。
5.根据权利要求2或3中任一项所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的化合物,其中所述式(I)的化合物与免疫疗法组合施用。
6.根据权利要求2或3中任一项所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的化合物,其中所述式(I)的化合物与免疫检查点抑制剂组合施用。
7.根据权利要求3至6中任一项所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的化合物,其中所述响应于TGFβ途径抑制剂的疾病选自由以下各项组成的组:癌症,硬皮病,牛皮癣,贫血,少肌症,阿尔茨海默病,马凡综合征,动脉瘤,肺动脉高压,成骨不全,特发性肺纤维化,肝纤维化,肝硬化,肝脂肪变性,肥厚型心肌病,骨髓纤维化,I型神经纤维瘤病,纤维化肾病,局灶性节段性肾小球硬化,辐射诱发性纤维化,系统性硬化中的皮肤纤维化,弥漫系统性硬化,瘢痕形成,角膜原发性翼状胬肉,纤维化,子宫平滑肌瘤,肥胖,糖尿病,糖尿病性视网膜病和肾病中的微血管病。
8.根据权利要求3至6中任一项所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的化合物,其中所述响应于TGFβ途径抑制剂的疾病是选自由以下各项组成的组的癌症:血液癌症;B-细胞或T-细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤,B-细胞或T-细胞型非霍奇金淋巴瘤,伯基特淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,白血病,B-细胞或T-细胞型淋巴瘤,多发性骨髓瘤,脑癌,中枢神经系统的神经胶质谱系的癌症(神经胶质瘤),肉瘤,纤维肉瘤,恶性纤维组织细胞瘤,尤因肉瘤,骨肉瘤,恶性胸膜间皮瘤,乳腺癌,抗HER2疗法的乳腺癌,乳癌,乳腺腺癌,胃和胃食管癌,胃癌,胃腺癌,结肠直肠癌症,结肠癌,结肠腺癌,直肠癌,结肠直肠癌,转移性结肠癌,胰腺癌症,胰腺癌,胰腺腺癌,肾细胞癌,透明细胞肾细胞癌,肝癌,肝转移癌,转移性疾病,肺癌症,肺癌,肺腺癌,非小细胞肺癌,小细胞肺癌,卵巢癌症,卵巢癌,卵巢腺癌,卵巢癌,子宫内膜癌,子宫内膜间质肉瘤,宫颈癌,甲状腺癌,转移性乳头状甲状腺癌,滤泡状甲状腺癌,膀胱癌,尿膀胱癌,尿膀胱移行细胞癌,前列腺癌症,前列腺癌,神经内分泌癌,鳞状细胞癌,骨肉瘤,横纹肌肉瘤,胚胎癌,神经母细胞瘤,髓母细胞瘤,视网膜母细胞瘤,肾母细胞瘤,肝母细胞瘤,黑素瘤和皮肤癌。
9.根据权利要求8所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的化合物,其中所述癌症是转移性癌症。
12.根据权利要求11所述的药物组合物,所述药物组合物还包含至少另一种活性成分,其中所述至少另一种活性成分是免疫治疗剂。
13.根据权利要求11所述的药物组合物,所述药物组合物还包含至少另一种活性成分,其中所述至少另一种活性成分是化疗剂。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的式(I)的化合物的前药,其用作药物。
18.根据权利要求14至16中任一项所述的式(I)的化合物的前药,其用于预防和/或治疗响应于TGFβ途径抑制剂的疾病。
19.根据权利要求17至18中任一项所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的式(I)的化合物的前药,其中所述式(I)的化合物的前药与化学疗法或癌症靶向疗法组合施用。
20.根据权利要求17至18中任一项所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的式(I)的化合物的前药,其中所述式(I)的化合物的前药与免疫疗法组合施用。
21.根据权利要求17至20中任一项所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的式(I)的化合物的前药,其中所述式(I)的化合物的前药与免疫检查点抑制剂组合施用。
22.根据权利要求17至21中任一项所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的式(I)的化合物的前药,其中所述疾病选自由以下各项组成的组:癌症,硬皮病,牛皮癣,贫血,少肌症,阿尔茨海默病,马凡综合征,动脉瘤,肺动脉高压,成骨不全,特发性肺纤维化,肝纤维化,肝硬化,肝脂肪变性,肥厚型心肌病,骨髓纤维化,I型神经纤维瘤病,纤维化肾病,局灶性节段性肾小球硬化,辐射诱发性纤维化,子宫平滑肌瘤,肥胖,糖尿病,糖尿病性视网膜病和肾病中的微血管病。
23.根据权利要求22所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的式(I)的化合物的前药,其中所述疾病是选自由以下各项组成的组的癌症:血液癌症;B-细胞或T-细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤,B-细胞或T-细胞型非霍奇金淋巴瘤,伯基特淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,白血病,B-细胞或T-细胞型淋巴瘤,多发性骨髓瘤,脑癌,中枢神经系统的神经胶质谱系的癌症(神经胶质瘤),肉瘤,纤维肉瘤,恶性纤维组织细胞瘤,尤因肉瘤,骨肉瘤,恶性胸膜间皮瘤,乳腺癌,抗HER2疗法的乳腺癌,乳癌,乳腺腺癌,胃和胃食管癌,胃癌,胃腺癌,结肠直肠癌症,结肠癌,结肠腺癌,直肠癌,结肠直肠癌,转移性结肠癌,胰腺癌症,胰腺癌,胰腺腺癌,肾细胞癌,透明细胞肾细胞癌,肝癌,肝转移癌,转移性疾病,肺癌症,肺癌,肺腺癌,非小细胞肺癌,小细胞肺癌,卵巢癌症,卵巢癌,卵巢腺癌,卵巢癌,子宫内膜癌,子宫内膜间质肉瘤,宫颈癌,甲状腺癌,转移性乳头状甲状腺癌,滤泡状甲状腺癌,膀胱癌,尿膀胱癌,尿膀胱移行细胞癌,前列腺癌症,前列腺癌,神经内分泌癌,鳞状细胞癌,骨肉瘤,横纹肌肉瘤,胚胎癌,神经母细胞瘤,髓母细胞瘤,视网膜母细胞瘤,肾母细胞瘤,肝母细胞瘤,黑素瘤和皮肤癌。
24.根据权利要求23所述用作药物或用于预防和/或治疗疾病的式(I)的化合物的前药,其中所述癌症是转移性癌症。
25.根据权利要求14至16中任一项所述的式(I)的化合物的前药,其用于预防癌症转移。
26.一种药物组合物,所述药物组合物包含有效量的根据权利要求14至16中任一项所述的式(I)的化合物的前药或者其药用盐或溶剂化物,以及至少一种药用赋形剂或载体。
27.根据权利要求26所述的药物组合物,所述药物组合物还包含至少另一种活性成分,其中所述至少另一种活性成分是免疫治疗剂。
28.根据权利要求26所述的药物组合物,所述药物组合物还包含至少另一种活性成分,其中所述至少另一种活性成分是化疗剂。
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