TW201625565A

TW201625565A - 用於治療癌症之化合物

Info

Publication number: TW201625565A
Application number: TW104141347A
Authority: TW
Inventors: 渥克史古茲; 漢斯喬治勒奇; 尤利奇盧津; 安特杰瑪格利特文格納; 傑爾哈德希梅斯特; 飛利普立爾諾; 俄索拉克蘭茲
Original assignee: 拜耳製藥公司
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2016-07-16
Also published as: CN107001376A; AU2015359593A1; ZA201704589B; EA201791264A1; PE20170927A1; ECSP17036251A; SG11201704684PA; US20170342064A1; CU20170078A7; TN2017000241A1; PH12017501063A1; MA41136A; BR112017012317A2; JP2017537116A; KR20170088872A; NI201700072A; DOP2017000136A; WO2016091825A1; CA2969902A1; CR20170243A

Abstract

本發明係關於Mps-1激酶抑制劑之前藥衍生物及其用於治療及/或預防疾病之用途。

Description

用於治療癌症之化合物

Mps-1(單極紡錘體1)激酶(亦稱為酪胺酸蘇胺酸激酶，TTK)係在有絲分裂檢查點(亦稱為紡錘體檢查點、紡錘體組裝檢查點)之活化中起關鍵作用、由此確保在有絲分裂期間適當染色體分離之雙特異性Ser/Thr激酶[Abrieu A等人，Cell，2001,106,83-93]。每一分裂細胞均必須確保經複製之染色體均等分離至兩個子細胞中。在進入有絲分裂時，染色體於其著絲點處附接至紡錘體之微管。有絲分裂檢查點係只要存在未附接著絲點即有效並防止有絲分裂細胞進入後期且由此在未附接染色體之情形下完成細胞分裂之監督機制[Suijkerbuijk SJ及Kops GJ,Biochemica et Biophysica Acta,2008,1786,24-31；Musacchio A及Salmon ED,Nat Rev Mol Cell Biol.,2007,8,379-93]。一旦所有著絲點均以正確雙向(即雙極)方式與有絲分裂紡錘體附接後，檢查點即被滿足且細胞進入後期並繼續行進通過有絲分裂。有絲分裂檢查點由多種必需蛋白質之複雜網絡組成，其包括MAD(有絲分裂阻滯缺陷，MAD 1-3)及Bub(不受苯并咪唑抑制之出芽，Bub 1-3)家族之成員、動力蛋白CENP-E、Mps-1激酶以及其他組份，該等中之多者在增殖細胞(例如癌細胞)及組織中過度表現[Yuan B等人，Clinical Cancer Research,2006,12,405-10]。已藉由shRNA-沉默、化學遺傳學以及Mps-1激酶之化學抑制劑顯示在有絲分裂檢查點信號傳導中Mps-1激酶活性之基本作用[Jelluma N等人，PLos ONE,2008,3,e2415；Jones MH等人，Current Biology,2005,15,160-65；Dorer RK等人，Current Biology,2005,15,1070-76；Schmidt M等人，EMBO Reports,2005,6,866-72]。

有充足證據將降低但不完全之有絲分裂檢查點功能與非整倍性及腫瘤形成相關聯[Weaver BA及Cleveland DW,Cancer Research,2007,67,10103-5；King RW,Biochimica et Biophysica Acta,2008,1786,4-14]。與此相比，已認識到，有絲分裂檢查點之完全抑制導致腫瘤細胞中嚴重染色體錯分離及凋亡之誘導[Kops GJ等人，Nature Reviews Cancer,2005,5,773-85；Schmidt M及Medema RH,Cell Cycle,2006,5,159-63；Schmidt M及Bastians H,Drug Resistance Updates,2007,10,162-81]。

因此，經由Mps-1激酶或有絲分裂檢查點之其他組份之藥理學抑制之有絲分裂檢查點廢除代表治療增殖性病症(包括諸如癌瘤及肉瘤等實體腫瘤及白血病以及淋巴樣惡性腫瘤或與不受控制之細胞增殖有關之其他病症)之新方法。

顯示針對Mps-1激酶之抑制效應之不同化合物已揭示於先前技術中：WO 2009/024824 A1揭示2-苯胺基嘌呤-8-酮作為Mps-1之抑制劑用於治療增殖病症。WO 2010/124826 A1揭示經取代咪唑并喹喔啉化合物作為Mps-1激酶抑制劑。WO 2011/026579 A1揭示經取代之胺基喹喔啉作為Mps-1抑制劑。WO 2011/064328 A1、WO 2011/063907 A1、WO 2011/063908 A1及WO 2012/143329 A1係關於[1,2,4]-三唑并-[1,5-a]-吡啶及其用於抑制Mps-1激酶之用途。

涉及[1,2,4]-三唑并-[1,5-a]-吡啶之上述專利申請案主要著重於藉由化合物之半數最大抑制濃度(IC₅₀)表示之化合物在抑制Mps-1激酶方面之效力。

另外，如熟習此項技術者已知，有許多決定化合物之適藥性(druglikeness)之因子。臨床前開發之目的係在人類臨床試驗之前評價(例如)安全性、毒性、藥代動力學及代謝參數。用於評價化合物之適藥性之一重要因子係代謝穩定性。化合物之代謝穩定性可藉由(例如)將化合物與來自(例如)大鼠、狗及/或人類之肝微粒體之懸浮液一起培育來測定(詳細參見實驗部分)。

用於評價用於治療癌症之化合物之適藥性之另一重要因子係細胞增殖之抑制，其可(例如)於HeLa細胞增殖分析中測定(詳細參見實驗部分)。

藥物至患者之成功遞送在病症治療中同樣係至關重要的。具有已知生物活性性質之許多臨床藥物之使用受限於藥物之極低水溶解性，使得(例如)難以靜脈內投與活性成份。

靜脈內(i.v.)醫藥投與係指直接將醫藥給與至患者靜脈中之過程。投與i.v.醫藥之方法可包括藉由使用注射器迅速注射(推入)至靜脈中來給與醫藥、使用i.v.副線經特定時間量間歇地給與醫藥或連續給與混合於主要i.v.溶液中之醫藥。

給與i.v.醫藥之主要目的係起始對醫藥之迅速全身反應。此係遞送醫藥之最快速方法中之一者。藥物立即可用於身體。藉由使用i.v.方法更易於控制遞送至身體之藥物之實際量且亦更易於維持血液中用以產生治療反應之藥物含量。

由於低水溶解性，許多藥物通常調配於共溶劑醫藥媒劑中或作為前藥。

前藥係化學轉化為衍生物之活性藥物，該衍生物在體內在達到作用位點之前或之後借助化學或酶擊轉化為母體藥物。將活性藥物轉化為無活性形式之製程稱為藥物潛伏化。前藥可係載劑連接前藥及生物前體。載劑連接前藥係自活性分子與輸送部分之暫時連接產生。與母體活性藥物相比，此等前藥活性較低或無活性。輸送部分將針對其無毒性及其確保以有效動力學釋放活性成份之能力來選擇。然而，生物前體係自活性成份本身之分子修飾藉由生成新分子而產生，該新分子能夠作為釋放活性成份作為代謝物之代謝酶之受質。

前藥經製備以改變藥物藥代動力學，改良穩定性及溶解性，減小毒性，增加特異性及/或增加藥物之藥理效應之持續時間。藉由改變藥代動力學，藥物生物利用度藉由增加藥物之吸收、分佈、生物轉化及/或排泄而增加。

在設計前藥中，重要的係考慮以下因子：a)載劑與藥物之間之連接通常係共價鍵，b)前藥無活性或活性低於活性成份，c)前藥合成應不昂貴，d)前藥必須係藥物之可逆或生物可逆衍生物，及e)在釋放時載劑部分必須無毒且無活性。

前藥通常係藉由以下來製備：a)形成活性藥物之酯、半酯、碳酸酯、硝酸酯、醯胺、羥肟酸、胺基甲酸酯、亞胺、曼尼希鹼(Mannich base)及烯胺，b)用偶氮化合物、糖苷、肽及醚官能基將藥物官能化，c)使用藥物之聚合物、鹽、複合物、磷醯胺、縮醛、半縮醛及縮酮形式(例如，參見Andrejus Korolkovas之「Essentials of Medicinal Chemistry」，第97頁至第118頁)。

因此，本發明之目標係鑑別Mps-1激酶抑制化合物或其前藥衍生物，其特徵在於高適藥性且其可靜脈內投與。

本發明係關於通式(I)之化合物：

其中：R^A 表示-C(=O)-O-C(R⁴)(R⁵)-O-C(=O)-C(R³)(NH₂)-R⁶；R¹ 表示選自甲氧基-及2,2,2-三氟乙氧基-之基團；R² 表示選自以下之基團：其中「*」指示R²附接至苯環之附接點；R³ 表示氫原子或甲基-；R⁴及R⁵彼此獨立地表示氫原子或C₁-C₃-烷基-；R⁶ 表示氫原子或C₁-C₆-烷基-；或其N-氧化物、水合物、溶劑合物、或鹽或其混合物。

如本文中所提及之術語具有以下含義：術語「鹵素原子」或「鹵基-」應理解為意指氟、氯、溴或碘原子。

術語「C₁-C₆-烷基-」應理解為意指具有1個、2個、3個、4個、5個或6個碳原子之直鏈或具支鏈飽和烴基，例如甲基-、乙基-、丙基- 、丁基-、戊基-、己基-、異丙基-、異丁基-、第二丁基-、第三丁基-、異戊基-、2-甲基丁基-、1-甲基丁基-、1-乙基丙基-、1,2-二甲基丙基-、新戊基-、1,1-二甲基丙基-、4-甲基戊基-、3-甲基戊基-、2-甲基戊基-、1-甲基戊基-、2-乙基丁基-、1-乙基丁基-、3,3-二甲基丁基-、2,2-二甲基丁基-、1,1-二甲基丁基-、2,3-二甲基丁基-、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基-或其同分異構物。具體而言，該基團具有1個、2個、3個或4個碳原子(「C₁-C₄-烷基-」)，例如甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、異丙基-、異丁基-、第二丁基-、第三丁基-，更具體而言1個、2個或3個碳原子(「C₁-C₃-烷基-」)，例如甲基-、乙基-、正丙基-或異丙基-。

如本文所用，術語「離去基團」係指在化學反應中作為穩定物質攜帶鍵結電子被置換之原子或原子之群。較佳地，離去基團選自包含以下之群：鹵基(具體而言氯、溴或碘)、甲烷磺醯基氧基-、對甲苯磺醯基氧基-、三氟甲烷磺醯基氧基-、九氟丁烷磺醯基氧基-、(4-溴-苯)磺醯基氧基-、(4-硝基-苯)磺醯基氧基-、(2-硝基-苯)-磺醯基氧基-、(4-異丙基-苯)磺醯基氧基-、(2,4,6-三-異丙基-苯)-磺醯基氧基-、(2,4,6-三甲基-苯)磺醯基氧基-、(4-第三丁基-苯)磺醯基氧基-、苯磺醯基氧基-及(4-甲氧基-苯)磺醯基氧基-。

如本文所用，術語「PG¹」係指羥基之保護基團，例如，如(例如)T.W.Greene及P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley 1999中所述之TMS基團或TBDPS基團(TMS=三甲基矽烷基，TBDPS=第三丁基二苯基矽烷基)。

如本文所用，術語「PG²」係指胺基之保護基團，例如，如闡述於(例如)T.W.Greene及P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley 1999中之Boc基團(Boc=第三丁基氧基羰基)。

本發明係關於通式(I)之化合物：

其中：R^A 表示-C(=O)-O-C(R⁴)(R⁵)-O-C(=O)-C(R³)(NH₂)-R⁶；R¹ 表示選自甲氧基-及2,2,2-三氟乙氧基-之基團；R² 表示選自以下之基團：其中「*」指示R²附接至苯環之附接點；R³ 表示氫原子或甲基-；R⁴及R⁵彼此獨立地表示氫原子或C₁-C₃-烷基-，R⁶ 表示氫原子或C₁-C₆-烷基-；或其N-氧化物、水合物、溶劑合物、或鹽或其混合物。

R^A表示R⁶-C(R³)(NH₂)-C(=O)-O-C(R⁴)(R⁵)-O-C(=O)-。

在較佳實施例中，R^A表示選自以下之基團：R⁶-C(R³)(NH₂)-C(=O)-O-CH₂-O-C(=O)-、R6-C(R³)(NH₂)-C(=O)-O-C(H)(CH₃)-O-C(=O)-及R⁶-C(R³)(NH₂)-C(=O)-O-C(H)(C(H)(CH₃)₂)-O-C(=O)-。

在另一較佳實施例中，R^A表示選自以下之基團：其中「*」指示R^A附接至氮原子之附接點。

R¹表示選自甲氧基-及2,2,2-三氟乙氧基-之基團。

在較佳實施例中，R¹表示2,2,2-三氟乙氧基-。

在另一較佳實施例中，R¹表示甲氧基-。

R²表示選自以下之基團：其中「*」指示R²附接至苯環之附接點。

在較佳實施例中，R²表示選自以下之基團：其中「*」指示R²附接至苯環之附接點。

在另一較佳實施例中，R²表示其中「*」指示R²附接至苯環之附接點。

在另一較佳實施例中，R²表示-S(=O)₂CH₃基團。

R³表示氫原子或甲基-。

在較佳實施例中，R³表示氫原子。

在另一較佳實施例中，R³表示甲基-。

R⁴及R⁵彼此獨立地表示氫原子或C₁-C₃-烷基-。

在較佳實施例中，R⁴及R⁵彼此獨立地表示氫原子或甲基-或異丙基-。

在另一較佳實施例中，R⁴表示氫原子或C₁-C₃-烷基-且R⁵表示氫原子。

在另一較佳實施例中，R⁴表示氫原子或甲基-或異丙基-且R⁵表示氫原子。

在另一較佳實施例中，R⁴及R⁵各自表示氫原子。

在另一較佳實施例中，R⁴表示甲基-且R⁵表示氫原子。

在另一較佳實施例中，R⁴表示異丙基-且R⁵表示氫原子。

在另一較佳實施例中，R⁴表示氫原子或C₁-C₃-烷基-。

在另一較佳實施例中，R⁴表示氫原子或甲基-。

在另一較佳實施例中，R⁴表示氫原子。

在另一較佳實施例中，R⁴表示甲基-。

在另一較佳實施例中，R⁵表示氫原子。

R⁶表示氫原子或C₁-C₆-烷基-。

在較佳實施例中，R⁶表示C₁-C₆-烷基-。

在另一較佳實施例中，R⁶表示氫原子或C₁-C₄-烷基-。

在另一較佳實施例中，R⁶表示C₁-C₄-烷基-。

在另一較佳實施例中，R⁶表示選自以下之基團：異丙基、第三丁基及H₃C-CH₂-C(H)(CH₃)-。

在上述態樣之另一實施例中，本發明係關於根據上述實施例之任一者之式(I)化合物，其呈其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽或其混合物之形式。

應理解，本發明亦係關於上述較佳實施例之任何組合。

以下給出組合之一些實例。然而，本發明並不限於該等組合。

在較佳實施例中，本發明係關於上文式(I)化合物，其中：R^A 表示選自以下之基團：其中「*」指示R^A附接至氮原子之附接點；R¹ 表示選自甲氧基-及2,2,2-三氟乙氧基-之基團；且R² 表示選自以下之基團：其中「*」指示R²附接至苯環之附接點；或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽或其混合物。

在另一較佳實施例中，本發明係關於式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)之化合物：

其中：R^A表示選自以下之基團：其中「*」指示R^A附接至氮原子之附接點；或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽或其混合物。

在另一較佳實施例中，本發明係關於式(Ia)化合物：

在另一較佳實施例中，本發明係關於式(Ib)化合物：

在另一較佳實施例中，本發明係關於式(Ic)化合物：

在另一較佳實施例中，本發明係關於式(Id)化合物：

在另一較佳實施例中，本發明係關於式(Ie)化合物：

其中： R^A表示選自以下之基團：其中「*」指示R^A附接至氮原子之附接點；或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽或其混合物。

在另一較佳實施例中，本發明係關於式(If)化合物：

應瞭解，本發明係關於在上文通式(I)化合物之本發明任何實施例或態樣內之任何子組合。

再更具體而言，本發明涵蓋下文揭示於本文實例部分中之通式(I)化合物。

本發明亦包括本發明化合物之所有適宜同位素變化形式。本發明化合物之同位素變化形式定義為至少一個原子經具有相同原子序數但原子質量不同於通常或主要在自然界中發現之原子質量之原子替代者。可納入本發明化合物中之同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴及碘之同位素，分別為例如²H(氘)、³H(氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²P、³³P、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、¹⁸F、³⁶Cl、⁸²Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁹I及¹³¹I。本發明化合物之某些同位素變化形式、例如彼等納入一或多種放射性同位素(例如³H或¹⁴C)者可用於藥物及/或受質組織分佈研究中。氚化及碳-14(即，¹⁴C)同位素因其易於製備及可檢測性而尤佳。此外，使用諸如氘等同位素之取代可因更強代謝穩定性而提供某些治療優點，例如增加活體內半衰期或減少劑量需求，且因此可在一些情況中較佳。本發明化合物之同位素變化形式通常可藉由熟習此項技術者已知之習用程序(例如藉由說明性方法或藉由下文實例中所述之製備)使用適宜試劑之適當同位素變化形式來製備。

此外，本發明化合物可作為N-氧化物存在，其經定義在於本發明化合物之至少一個氮經氧化。本發明包括所有此等可能的N-氧化物。

本發明亦係關於本文所揭示化合物之有用形式，例如水合物、溶劑合物、鹽(具體而言醫藥上可接受之鹽)及共沈澱物。

本發明化合物可作為水合物或作為溶劑合物存在，其中本發明化合物含有極性溶劑、具體而言水、甲醇或乙醇(例如)作為化合物晶格之結構要素。極性溶劑、具體而言水之量可以化學計量或非化學計量比率存在。在化學計量溶劑合物(例如水合物)之情形下，半-(hemi-)(半-(semi-))、單-、倍半-、二-、三-、四-、五-等溶劑合物或水合物分別係可能的。本發明包括所有此等水合物或溶劑合物。

此外，本發明化合物可以游離形式存在，例如作為游離鹼或作為游離酸或作為兩性離子，或可以鹽形式存在。該鹽可係藥劑學中常用之任何鹽，即有機或無機加成鹽，具體而言任何醫藥上可接受之有機或無機加成鹽。

術語「醫藥上可接受之鹽」係指本發明化合物之相對無毒之無機或有機酸加成鹽。例如，參見S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts」,J.Pharm.Sci.1977,66,1-19。

本發明化合物之適宜醫藥上可接受之鹽可係(例如)鏈或環中具有氮原子之(例如)具有足夠鹼性之本發明化合物之酸加成鹽，例如與諸如以下等無機酸之酸加成鹽：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、焦硫酸(bisulfuric acid)、磷酸或硝酸；或與諸如以下等有機酸之酸加成鹽：甲酸、乙酸、乙醯乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水楊酸、2-(4-羥基苯甲醯基)-苯甲酸、樟腦酸、肉桂酸、環戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羥基-2-萘甲酸、菸鹼酸、撲酸、果膠酯酸、過硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羥基乙磺酸、衣康酸、胺磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟腦磺酸、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、己二酸、海藻酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、D-葡萄糖酸、扁桃酸、抗壞血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水楊酸、半硫酸或硫氰酸。

此外，具有足夠酸性之本發明化合物之另一適宜醫藥上可接受之鹽係鹼金屬鹽(例如鈉或鉀鹽)、鹼土金屬鹽(例如鈣或鎂鹽)、銨鹽或具有提供生理學上可接受之陽離子之有機鹼之鹽，例如具有以下之鹽：N-甲基-葡糖胺、二甲基-葡糖胺、乙基-葡糖胺、離胺酸、二環己基胺、1,6-己二胺、乙醇胺、葡糖胺、肌胺酸、絲胺醇、叁-羥基-甲基-胺基甲烷、胺基丙二醇、蘇維克鹼(sovak-base)、1-胺基-2,3,4-丁三醇。此外，本發明化合物可形成具有四級銨離子之鹽，其可(例如)藉由含鹼性氮之基團與以下試劑四級銨化獲得：如較低碳數烷基鹵化物，例如甲基、乙基、丙基及丁基氯化物、溴化物及碘化物；二烷基硫酸，如二甲基、二乙基、二丁基及二戊基硫酸；長鏈鹵化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基及硬脂醯氯化物、溴化物及碘化物；芳烷基鹵化物，如苄基及苯乙基溴化物等。適宜四級銨離子之實例係四甲基銨、四乙基銨、四(正丙基)銨、四(正丁基)銨或N-苄基-N,N,N-三甲基銨。

熟習此項技術者將進一步認識到，所主張化合物之酸加成鹽可藉由使化合物與適當無機或有機酸經由多種已知方法中之任一者反應來製備。另一選擇為，本發明酸性化合物之鹼金屬鹽及鹼土金屬鹽藉由使本發明化合物與適當鹼經由多種已知方法反應來製備。

本發明包括本發明化合物之所有可能鹽，其呈單一鹽或呈該等鹽以任何比率之任何混合物形式。

此外，本發明包括本發明化合物之所有可能結晶形式或多晶形物，其呈單一多晶形物或呈以任何比率之一種以上多晶形物之混合物。

根據另一態樣，本發明涵蓋製備本發明化合物之方法，該等方法包含如本文實驗部分中所述之步驟。

本發明亦係關於含有一或多種本發明化合物之醫藥組合物。該等組合物可用於藉由投與需要其之患者來達成期望藥理學效應。出於本發明之目的，患者係需要治療具體病況或疾病之包括人類之哺乳動物。因此，本發明包括包含醫藥上可接受之載劑及醫藥有效量之本發明化合物或其鹽之醫藥組合物。醫藥上可接受之載劑較佳係在與活性成份之有效活性一致之濃度下對患者相對無毒且無害、由此可歸因於載劑之任何副作用不會損害活性成份之有益效應之載劑。化合物之醫藥有效量較佳係對所治療之具體病況產生效果或施加影響之量。

本發明化合物亦可非經腸地(即經皮下、經靜脈內、經眼內、經滑膜內、經肌內或經腹膜內)作為化合物較佳於生理學上可接受之稀釋劑與醫藥載劑中之可注射劑型投與，該醫藥載劑可係無菌液體或液體混合物，例如水、鹽水、右旋糖水溶液及相關糖溶液；醇，例如乙醇、異丙醇或十六烷醇；二醇，例如丙二醇或聚乙二醇；甘油縮酮，例如2,2-二甲基-1,1-二氧雜環戊烷-4-甲醇；醚，例如聚(乙二醇)400；油；脂肪酸；脂肪酸酯或脂肪酸甘油酯；或乙醯化脂肪酸甘油酯，其中添加或不添加醫藥上可接受之表面活性劑，例如肥皂或清潔劑；懸浮劑，例如果膠、卡波姆(carbomer)、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素；或乳化劑及其他醫藥佐劑。

本發明非經腸組合物之溶液中通常含有約0.5重量%至約25重量%之活性成份。亦可有利地使用防腐劑及緩衝劑。為最小化或消除對注射部位處之刺激，此等組合物可含有親水親油平衡值(HLB)較佳為約12至約17之非離子型表面活性劑。此調配物中表面活性劑之量較佳在約5重量%至約15重量%範圍內。表面活性劑可為具有以上HLB之單一組份或可為具有期望HLB之兩種或更多種組份之混合物。

用於非經腸調配物中之說明性表面活性劑係聚乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類(例如，山梨糖醇酐單油酸酯)及環氧乙烷與藉由使環氧丙烷與丙二醇縮合而形成之疏水性基質之高分子量加合物。

該等醫藥組合物可呈無菌可注射水性懸浮液形式。該等懸浮液可根據已知方法使用適宜分散劑或潤濕劑及懸浮劑來調配，該等懸浮劑係例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃著膠及阿拉伯膠；分散劑或潤濕劑，其可為天然存在之磷脂(例如卵磷脂)、環氧烷與脂肪酸之縮合產物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、環氧乙烷與長鏈脂肪族醇之縮合產物(例如，十七伸乙氧基十六烷醇)、環氧乙烷與自脂肪酸及己糖醇衍生之部分酯之縮合產物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)或環氧乙烷與自脂肪酸與己糖醇酐衍生之部分酯之縮合產物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。

無菌可注射製劑亦可為於無毒性非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液。可採用之稀釋劑及溶劑係例如水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、等滲氯化鈉溶液及等滲葡萄糖溶液。

本發明醫藥組合物可說明如以下：無菌i.v.溶液：5mg/mL本發明期望化合物之溶液可使用無菌可注射用水來製得且若需要調節pH。將溶液用無菌5%右旋糖稀釋至1mg/mL至2mg/mL以用於投與且經約60分鐘作為i.v.輸注液來投與。

如上文所提及，已發現化合物A有效抑制Mps-1且因此可用於治療或預防不受控制之細胞生長、增殖及/或存活、不適當細胞免疫反應或不適當細胞炎性反應之疾病或伴隨不受控制之細胞生長、增殖及/或存活、不適當細胞免疫反應或不適當細胞炎性反應之疾病，具體而言其中不受控制之細胞生長、增殖及/或存活、不適當細胞免疫反應或不適當細胞炎性反應係由Mps-1激酶介導，例如，血液腫瘤、實體瘤及/或其轉移，例如白血病及骨髓增生異常症候群、惡性淋巴瘤、頭頸部腫瘤(包括腦瘤及腦轉移)、胸部腫瘤(包括非小細胞及小細胞肺腫瘤)、胃腸道腫瘤、內分泌腫瘤、乳房及其他婦科腫瘤、泌尿系統腫瘤(包括腎、膀胱及前列腺腫瘤)、皮膚腫瘤及肉瘤及/或其轉移。

因此，根據另一態樣，本發明涵蓋如本文所述及定義之通式(I)化合物或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽(具體而言其醫藥上可接受之鹽)或其混合物，其用於治療或預防如上文所提及之疾病。

因此，本發明之另一具體態樣係上述通式(I)化合物或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽(具體而言其醫藥上可接受之鹽)或其混合物用於預防或治療疾病之用途。

因此，本發明之另一具體態樣係上述通式(I)化合物用於製造用於治療或預防疾病之醫藥組合物之用途。

如本文所用，術語「不適當」在本發明上下文內、具體而言在「不適當細胞免疫反應或不適當細胞炎性反應」之上下文中應理解為較佳意指小於或大於正常且與該等疾病之病理學有關、造成或導致該等疾病之病理學之反應。

本發明係關於使用本發明化合物及其組合物以治療哺乳動物過度增殖性病症之方法。可利用化合物來抑制、阻斷、減少、降低等細胞增殖及/或細胞分裂及/或產生細胞凋亡。該方法包含向需要其之哺乳動物(包括人類)投與有效治療該病症之量之本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽、同分異構物、多晶形物、代謝物、水合物、溶劑合物或酯等。過度增殖性病症包括(但不限於)(例如)牛皮癬、瘢痕瘤及影響皮膚之其他增生、良性前列腺增生(BPH)、實體腫瘤(例如乳癌、呼吸道癌、腦癌、生殖器癌、消化道癌、尿路癌、眼癌、肝癌、皮膚癌、頭頸癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌)及其遠端轉移。該等病症亦包括淋巴瘤、肉瘤及白血病。

乳癌之實例包括(但不限於)浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌、原位導管癌及原位小葉癌。

呼吸道癌之實例包括(但不限於)小細胞及非小細胞肺癌以及支氣管腺瘤及胸膜肺胚細胞瘤。

腦癌之實例包括(但不限於)腦幹及下丘腦神經膠質瘤、小腦及大腦星形細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤以及神經外胚層及松果體瘤。

雄性生殖器之腫瘤包括(但不限於)前列腺癌及睪丸癌。雌性生殖器之腫瘤包括(但不限於)子宮內膜癌、子宮頸癌、卵巢癌、陰道癌及外陰癌以及子宮肉瘤。

消化道之腫瘤包括(但不限於)肛門癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、膽囊癌、胃癌、胰臟癌、直腸癌、小腸癌及唾腺癌。

尿路之腫瘤包括(但不限於)膀胱癌、陰莖癌、腎癌、腎盂癌、輸尿管癌、尿道癌及人類乳頭狀腎癌。

眼癌包括(但不限於)眼內黑素瘤及視網膜母細胞瘤。

肝癌之實例包括(但不限於)肝細胞癌(具有或不具有纖維板層變體之肝細胞癌)、膽管癌(肝內膽管癌)及混合型肝細胞膽管癌。

皮膚癌包括(但不限於)鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、惡性黑色素瘤、默克爾細胞皮膚癌(Merkel cell skin cancer)及非黑色素瘤皮膚癌。

頭頸癌包括(但不限於)喉癌、下嚥癌、鼻咽癌、口咽癌、唇及口腔癌及鱗狀細胞癌。淋巴瘤包括(但不限於)AIDS相關性淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、皮膚T-細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、何傑金氏病及中樞神經系統淋巴瘤。

肉瘤包括(但不限於)軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤及橫紋肌肉瘤。

白血病包括(但不限於)急性骨髓性白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病及毛細胞白血病。

該等病症已在人類中經充分描述，而且亦以類似病因存在於其他哺乳動物中，且其可藉由投與本發明醫藥組合物來治療。

如本文件通篇所述之術語「治療(treating或treatment)」係照慣例使用，例如，出於防治、緩解、減弱、減輕、改良疾病或病症(例如，癌)之病況等目的來管理或護理個體。

本發明亦提供治療與異常促分裂原細胞外激酶活性有關之病症的方法，該等病症包括(但不限於)中風、心臟衰竭、肝腫大、心臟肥大、糖尿病、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、囊性纖維化、異種移植排斥之症狀、敗血性休克或氣喘。

本發明化合物之有效量可用於治療此等病症，包括上文背景部分中所提及之彼等疾病(例如，癌症)。然而，不管作用機制及/或激酶與病症之間之關係如何，此等癌症及其他疾病均可使用本發明化合物來治療。

片語「異常激酶活性」或「異常絲胺酸-蘇胺酸激酶活性」包括編碼激酶之基因或其編碼之多肽之任何異常表現或活性。此異常活性之實例包括(但不限於)基因或多肽之過表現；基因擴增；產生組成型活性或過度活性激酶活性之突變；基因突變、缺失、取代、添加等。

本發明亦提供抑制激酶活性、尤其絲裂原細胞外激酶之方法，其包含投與有效量之本發明化合物，其包括其鹽、多晶形物、代謝物、水合物、溶劑合物、前藥(例如：酯)及其非對映異構形式。可抑制細胞中(例如，活體外)或需要治療之哺乳動物個體、尤其人類患者之細胞中之激酶活性。

式(I)前藥化合物之一般合成

以下段落概述適於製備式(I)化合物之合成途徑，如以下方案中所示。

除下文所述路線之外，根據熟習有機合成技術者之一般常識亦可使用其他路線來合成目標化合物。因此，並不意欲限制例示於以下方案中之轉化順序，且可結合自各種方案之適宜合成步驟以形成其他合成序列。另外，任何所示取代基之相互轉換可在例示性轉化之前及/或之後達成。該等修飾可係例如官能基之還原或氧化、鹵化、金屬化、金屬催化偶合反應、取代或熟習此項技術者已知之其他反應。該等轉化包括彼等引入允許取代基之進一步相互轉換之官能性者。具體而言，以下合成路線涵蓋保護基團之引入及裂解。適當保護基團及其引入及裂解為熟習此項技術者所熟知(例如，參見T.W.Greene及P.G.M.Wuts in Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，Wiley 2006)；更特定而言，保護基團包括諸如PG¹(如上文定義羥基之保護基團)及PG²(如上文定義胺基之保護基團)之基團。

特定實例闡述於隨後段落中。另外，可實施兩個或更多個連續步驟而在該等步驟之間未實施後處理(例如「一鍋式」反應)，如熟習此項技術者所熟知。

方案1概述自式(V)中間體合成通式(I)化合物，其中R¹及R²係如針對通式(I)化合物所定義。中間體(V)之製備可如實驗部分中所述來實施。中間體(V)係藉由適宜鹼(例如氫化鈉)於適宜溶劑(例如醚，例如四氫呋喃)中去質子化，且隨後與式(VI)之氯甲酸酯(其中R⁴及R⁵係如針對通式(I)化合物所定義，且LG代表如上文所定義之離去基團，較佳氯)反應以獲得胺基甲酸酯(VII)。式(VI)之氯甲酸酯為熟習此項技術者所熟知且在若干情形下市面有售。該等胺基甲酸酯(VII)與式(VIII)之羧酸鹽於適宜溶劑(例如N,N-二甲基甲醯胺)中反應以獲得式(IX)中間體，其中PG²表示如上文定義之胺基保護基團，例如第三丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Z)或對甲氧基苄基(PMB)且其中M⁺代表單價陽離子，例如鹼金屬陽離子或銨鹽、較佳銫。此取代亦可在催化量之碘化物鹽(如碘化鈉或碘化鉀)之存在下實施，藉此離去基團LG原位轉化為碘化物。另一選擇為，離去基團LG可在取代反應之前轉化為碘化物。然後，中間體(IX)經受涉及硼酸衍生物(X)之鈴木偶合 (Suzuki coupling)，其中R^E代表氫或彼此獨立地代表C₁-C₆-烷基-或一起形成-C₂-C₆-烯基-，例如-C(CH₃)₂-C(CH₃)₂-。鈴木偶合為熟習此項技術者所熟知；較佳地，該偶合係使用二環己基(2',6'-二甲氧基聯苯-2-基)膦及乙酸鈀或Pd₂dba₃作為配位體/觸媒、單水合磷酸鉀或磷酸鉀作為鹼並甲苯或N-甲基吡咯啶或甲苯及N-甲基吡咯啶之混合物作為溶劑來實施。隨後，將偶合產物(XI)(例如)藉由使用鹽酸處理以移除Boc基團來去保護(若需要)，以獲得通式(I)化合物。通式(I)化合物通常作為鹽、較佳作為HCl鹽或作為TFA-鹽來分離。

方案1：自中間體(V)合成式(I)之前藥化合物 實驗部分

下表列示本段落及實例部分中所使用之縮寫。NMR峰形式係如其在光譜中之顯現來陳述，未考慮可能更高階效應。

根據本發明方法產生之化合物及中間體可需要純化。有機化合物之純化為熟習此項技術者所熟知且可存在若干種純化相同化合物之方法。在一些情形下，可能無需純化。在一些情形下，可藉由結晶來純化化合物。在一些情形下，可使用適宜溶劑攪拌出雜質。在一些情形下，化合物可藉由層析、具體而言急驟層析、使用(例如)來自(例如)Separtis之預填充矽膠柱(例如Isolute®急驟矽膠(矽膠層析)或Isolute®急驟NH2矽膠(胺基相矽膠層析))與適宜層析系統(例如Flashmaster II(Separtis)或Isolera系統(Biotage))及溶析劑(例如己烷/乙酸乙基酯或DCM/甲醇之梯度)之組合來純化。在一些情形下，化合物可藉由製備型HPLC、使用(例如)配備有二極體陣列檢測器及/或在線電噴霧電離質譜儀之Waters自動純化器與適宜預填充反相管柱及溶析劑(例如，可含有諸如三氟乙酸、甲酸或氨水溶液等添加劑之水及乙腈梯度)之組合來純化。

光學異構物可根據習用方法藉由拆分外消旋混合物來獲得，例如藉由使用光學活性酸或鹼形成非鏡像異構鹽或形成共價非鏡像異構物。適當酸之實例係酒石酸、二乙醯基酒石酸、二甲苯醯基酒石酸及樟腦磺酸。非鏡像異構物之混合物可基於其物理及/或化學差異藉由業內已知之方法(例如，藉由層析或分級結晶)分離成其個別非鏡像異構物。然後，自所分離非鏡像異構鹽釋放光學活性鹼或酸。用於分離光學異構物之不同製程涉及使用利用或不利用習用衍生化之對掌性層析(例如，對掌性HPLC管柱)，其經最佳化選擇以使鏡像異構物之分離最大化。適宜對掌性HPLC管柱(尤其例如Chiracel OD及Chiracel OJ)係由Diacel製造，所有皆可按慣例選擇。亦可使用利用或不利用衍生化之酶分離。本發明之光學活性化合物同樣可利用光學活性起始材料藉由對掌性合成來獲得。

在本文中、尤其在合成本發明之中間體及實例之實驗部分中，當化合物作為與相應鹼或酸形成之鹽形式提及時，在大多數情形下如藉由各別製備及/或純化製程獲得之該鹽形式之確切化學計量組成係未知的。

除非另外指定，否則化學名稱或結構式之後綴(例如「鹽酸鹽」、「三氟乙酸鹽」、「鈉鹽」或「x HCl」、「x CF₃COOH」、「x Na⁺」)應理解為非化學計量規格，而係僅作為鹽形式。

此同樣適用於以下情形：其中藉由所闡述之製備及/或純化製程作為溶劑合物(例如具有(若定義)未知化學計量組成之水合物)來獲得合成中間體或實例化合物或其鹽。

實例及中間體之IUPAC名稱係使用自ACD LABS之程式'ACD/Name batch 12.01版'產生且若需要可改變。

如以下實施分析型UPLC-MS：

LC-MS方法： 方法1：

儀器：Waters Acquity UPLCMS ZQ4000；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；溶析劑A：水+0.05vol%甲酸，溶析劑B：乙腈+0.05vol%甲酸，梯度：0min至1.6min 1%至99%B，1.6min至2.0min 99%B；流速0.8mL/min；溫度：60℃；注射：2μL；DAD掃描：210nm至400nm；ELSD。

方法2：

儀器：Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；溶析劑A：水+0.1vol%甲酸(95%)，溶析劑B：乙腈；梯度：0min至1.6min 1%至99%B，1.6min至2.0min 99%B；流速0.8mL/min；溫度：60℃；注射：2μL；DAD掃描：210nm至400nm；ELSD。

方法3：儀器：Waters Acquity UPLCMS SQD；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；溶析劑A：水+0.05vol%甲酸(95%)，溶析劑B：乙腈+0.05vol%甲酸(95%)，梯度：0min至1.6min 1%至99%B，1.6min至2.0min 99%B；流速0.8mL/min；溫度：60℃；注射：2μL；DAD掃描：210nm至400nm；ELSD。

方法4：

儀器：Waters Acquity UPLC-MS SQD；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；溶析劑A：水+0.1vol%甲酸(99%)，溶析劑B：乙腈；梯度：0min至1.6min 1%至99%B，1.6min至2.0min 99%B；流速0.8mL/min；溫度：60℃；注射：2μL；DAD掃描：210nm至400nm；ELSD。

方法5：儀器：Waters Acquity UPLCMS SQD 3001；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；溶析劑A：水+0.2vol.%氨(32%)，溶析劑B：乙腈；梯度：0min至1.6min 1%至99%B，1.6min至2.0min 99%B；流速0.8mL/min；溫度：60℃；注射：2μL；DAD掃描：210nm至400nm；ELSD。

方法6

儀器：Waters Acquity UPLC-MS SQD；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；溶析劑A：水+0.2vol.%氨(32%)，溶析劑B：乙腈；梯度：0min至1.6min 1%至99%B，1.6min至2.0min 99%B；流速0.8mL/min；溫度：60℃；注射：2μl；DAD掃描：210nm至400nm；ELSD。

方法7

儀器：Waters Acquity UPLC-MS ZQ；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；溶析劑A：水+0.1vol.%甲酸(99%)，溶析劑B：乙腈；梯度：0min至1.6min 1%至99%B，1.6min至2.0min 99%B；流速0.8mL/min；溫度：60℃；注射：2μl；DAD掃描：210nm至400nm；ELSD。

方法8：

儀器：Waters Acquity UPLCMS SQD；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；溶析劑A：水+0.2vol%氨(32%)，溶析劑B：乙腈；梯度：0min至1.6min 1%至99%B，1.6min至2.0min 99%B；流速0.8mL/min；溫度：60℃；注射：2μl；DAD掃描：210nm至400nm；ELSD。

中間體實例01.01. [(4-氯吡啶-2-基)硫代胺基甲醯基]胺基甲酸乙基酯

將乙氧基羰基異硫氰酸酯(11.1g)添加至2-胺基-4-氯吡啶(10.1g)於二噁烷(100mL)中之攪拌溶液中。在室溫下將混合物攪拌2h。白色固體沈澱。添加己烷(25mL)且藉由過濾收集白色固體，以獲得8.0g標題化合物。在真空中濃縮溶液且自乙酸乙基酯重結晶殘餘物，以進一步獲得8.5g標題化合物。

中間體實例01.02. 7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺

將羥基氯化銨(13.9g)懸浮於甲醇(70mL)中，且在室溫下添加乙醇(65mL)及Hünig鹼(21.1mL)。將混合物加熱至60℃，逐份添加[(4-氯吡啶-2-基)硫代胺基甲醯基]胺基甲酸乙基酯(9.0g)，且在60℃下將混合物攪拌2h。在真空中移除溶劑並添加水(150mL)。藉由過濾收集固體並用乙醇洗滌且在真空中乾燥。藉由矽膠層析獲得4.2g標題化合物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=6.14(2H),6.92(1H),7.50(1H),8.55(1H)。

中間體實例01.03. {4-[(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)胺基]-3-甲氧基苯基}(3-氟氮雜環丁-1-基)甲酮

向7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(190mg)於甲苯(7mL)及NMP(0.7mL)中之攪拌懸浮液中添加(4-溴-3-甲氧基苯基)(3-氟氮雜環丁-1-基)甲酮(373mg)、氯(2-二環己基膦基-2',4',6'-三-異丙基-1,1'-聯苯)[2-(2-胺基乙基)苯基]鈀(H)甲基-第三丁基醚加合物(28mg)、X-Phos(16mg)及粉末狀單水合磷酸鉀(0.60g)，並將燒瓶脫氣兩次且用氬回填。將混合物加熱至回流並保持16h。添加半飽和碳酸鉀溶液並使用二氯甲烷及甲醇之混合物來萃取混合物。乾燥(硫酸鈉)有機相並在真空中移除溶劑。過濾混合物並在真空中濃縮。矽膠層析獲得120mg標題化合物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=3.91(3H),3.94-4.80(4H),5.26-5.59(1H),7.15(1H),7.23-7.33(2H),7.82(1H),8.21-8.36(1H),8.46(1H),8.85(1H)。

中間體實例01.04. 7-氯-N-[2-甲氧基-4-(甲基磺醯基)苯基][1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺

自7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(300mg)及1-溴-2-甲氧基-4-(甲基磺醯基)苯(543mg)開始，以類似於製備中間體實例01.03.之程序製備中間體實例01.04.。產量：236mg標題化合物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=3.18(3H),3.97(3H),7.17(1H),7.44(1H),7.53(1H),7.86(1H),8.43(1H),8.75(1H),8.87(1H)。

中間體實例01.05. 7-氯-N-[4-(甲基磺醯基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基][1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺

自7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(100mg)及1-溴-4-(甲基磺醯基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯(227mg)開始，以類似於製備中間體實例01.03.之程序製備中間體實例01.05.。產量：50mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=3.19(3H),5.00(2H),7.18(1H),7.58-7.71(2H),7.86(1H),8.44(1H),8.70(1H),8.81-8.92(1H)。

中間體實例01.06. {4-[(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)胺基]-3-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}(3-氟氮雜環丁-1-基)甲酮

自7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(250mg)及[4-溴-3-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基](3-氟氮雜環丁-1-基)甲酮(607mg)，以類似於製備中間體實例01.03.之程序來製備中間體實例01.06.。產量：198mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=3.93-4.72(4H),4.93(2H),5.32-5.55(1H),7.16(1H),7.36-7.43(2H),7.83(1H),8.27-8.33 (1H),8.41(1H),8.81-8.90(1H)。

中間體實例01.07. 氮雜環丁-1-基{4-[(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)胺基]-3-甲氧基苯基}甲酮

自7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(190mg)及氮雜環丁-1-基(4-溴-3-甲氧基苯基)甲酮(350mg)開始，以類似於製備中間體實例01.03.之程序製備中間體實例01.07.。產量：130mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=2.27(2H),3.88-3.94(3H),3.97-4.47(4H),7.15(1H),7.23-7.31(2H),7.83(1H),8.28(1H),8.42(1H),8.79-8.93(1H)。

中間體實例02.01. 外消旋-2-(4-氟苯基)丙酸甲基酯

在-78℃下，向二異丙胺(13.0g)於四氫呋喃(160mL)中之攪拌溶液中添加正丁基鋰於己烷中之溶液(51.4mL；c=2.5M)。在0℃下將溶液攪拌15分鐘。將溶液冷卻至-78℃，且添加(4-氟苯基)乙酸甲基酯(18.0g)溶於四氫呋喃(40mL)中之溶液。將溶液在-78℃下攪拌30分鐘。在-78℃下添加碘甲烷(10.0mL)，且在1h內將溶液升溫至0℃。添加水並用乙酸乙基酯萃取反應混合物。乾燥(硫酸鈉)有機相並在真空中移除溶劑。矽膠層析獲得18.9g標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.34(d,3H),3.55(s,3H),3.79(q,1H),7.08-7.15(m,2H),7.25-7.32(m,2H)。

中間體實例02.02. 外消旋-2-(4-氟苯基)丙酸

向中間體實例02.01.(18.9g)於乙醇(200mL)中之攪拌溶液中添加氫氧化鉀(35g)溶於水(200mL)中之溶液。在0℃下將混合物攪拌4h。添加鹽酸(c=4.0M)直至達到pH 5，並用乙酸乙基酯萃取反應混合物。分離有機相，且在真空中移除溶劑，以獲得15.64g標題產物。粗製產物未經進一步純化即使用。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.31(d,3H),3.66(q,1H),7.05-7.15(m,2H),7.24-7.33(m,2H),12.30(s,1H)。

中間體實例02.03. (2R)-2-(4-氟苯基)丙酸

向中間體實例02.02.(23.6g)於回流乙酸乙基酯(250mL)中之攪拌溶液中添加(1S)-1-苯基乙胺(17.35g)於乙酸乙基酯中之溶液。在1h內將混合物冷卻至室溫。藉由過濾收集白色固體，用乙酸乙基酯洗滌並在真空中乾燥，以獲得27.5g固體。自400mL回流乙酸乙基酯重結晶固體。將混合物冷卻至室溫。藉由過濾收集白色固體，用乙酸乙基酯洗滌並在真空中乾燥以獲得18.3g固體。自回流乙酸乙基酯(350mL； 300mL)將固體重結晶兩次。藉由過濾收集白色固體，用乙酸乙基酯洗滌並在真空中乾燥以獲得10.51g固體。將固體溶解於水中，添加鹽酸(c=2.0M)直至達到pH 5，且用二氯甲烷萃取反應混合物。乾燥(硫酸鈉)有機相，且在真空中移除溶劑，以獲得5.6g標題產物。粗製產物未經進一步純化即使用。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.31(d,3H),3.66(q,1H),7.05-7.16(m,2H),7.24-7.33(m,2H),12.28(br.s.,1H)。

[α]_D ²⁰：-79.3°(於DMSO中)

藉由分析型對掌性HPLC測定鏡像異構物純度：管柱：Chiralcel OJ-H 150×4.6；流速：1.00mL/min；溶劑：A：己烷，B：含有0.1%甲酸之2-丙醇；溶劑混合物：80%A+20%B。運行時間：30min。滯留時間：3.41min；UV 254nm；鏡像異構物比率：99.8%：0.2%。

中間體實例02.04. (2R)-2-(4-氟苯基)-N-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯基]丙醯胺

向4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼烷-2-基)苯胺(1.0g)於DMF(45mL)及二氯甲烷(90mL)中之攪拌溶液中添加碳酸氫鈉(766mg)、(2R)-2-(4-氟苯基)丙酸(844mg)及HATU(2.6g)。在室溫下將混合物攪拌4h。添加水，並將混合物攪拌30分鐘。添加半飽和碳酸氫鈉溶液並用乙酸乙基酯萃取混合物。用飽和氯化鈉溶液洗滌有機相，乾燥(硫酸鈉)並在真空中移除溶劑。矽膠層析獲得1.53g標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=1.23(12H),1.37(3H),3.74-3.87(1H),7.06-7.16(2H),7.31-7.42(2H),7.51-7.61(4H),10.12(1H)。

中間體實例02.05. (4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)硼酸

向(4-胺基苯基)硼酸鹽酸鹽(2.00g)於DMF(42mL)中之攪拌溶液添加碳酸氫鈉(2.9g)、(2R)-2-(4-氟苯基)丙酸(2.04g)及HATU(6.58g)。在室溫下將混合物攪拌72h。添加水(140mL)，且將混合物攪拌2h。藉由過濾收集白色沈澱並用水洗滌且在真空中乾燥，以獲得2.86g標題化合物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=1.39(3H),3.84(1H),7.08-7.21(2H),7.35-7.44(2H),7.52(2H),7.69(2H),7.88(2H),10.07(1H)。

中間體實例02.06. (2R)-N-[4-(2-胺基[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)苯基]-2-(4-氟苯基)丙醯胺

向7-溴[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(100mg；CAS-RN[882521-63-3]；可自Allichem LLC,USA；Baltimore,MD購得；如WO2010/020363A1所述製備)於1-丙醇(3mL)中之攪拌溶液添加碳酸鉀溶液(0.7mL,c=2M)、(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)硼酸(202mg)、三苯基膦(12mg)及PdCl₂(PPh₃)₂(33mg)。將混合物加熱至回流並保持16h。再添加三苯基膦(12mg)及PdCl₂(PPh₃)₂(33mg)且再將混合物加熱至回流並保持4h。經由胺基相-矽膠管柱過濾反應混合物且在真空中移除溶劑。矽膠層析獲得150mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=1.42(3H),3.86(1H),5.97(2H),7.08-7.25(3H),7.35-7.49(2H),7.58(1H),7.63-7.83(4H),8.53(1H),10.21(1H)。

參考實例01.01. (2R)-2-(4-氟苯基)-N-[4-(2-{[2-甲氧基-4-(甲基磺醯基)苯基]胺基}[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)苯基]丙醯胺

向(2R)-N-[4-(2-胺基[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)苯基]-2-(4-氟苯基)丙醯胺(100mg)於甲苯(4mL)及NMP(0.2mL)中之攪拌懸浮液中添加1-溴-2-甲氧基-4-(甲基磺醯基)苯(106mg)、氯(2-二環己基膦基-2',4',6'-三-異丙基-1,1'-聯苯)[2-(2-胺基乙基)苯基]鈀(II)甲基-第三丁基醚加合物(22mg)、X-Phos(13mg)及粉末狀單水合磷酸鉀(283mg)，且將燒瓶脫氣兩次並用氬回填。將混合物加熱至回流並保持16h。將混合物過濾且在真空中濃縮。矽膠層析、然後製備型反相HPLC獲得10mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=1.44(3H),3.20(3H),3.88(1H),4.00(3H),7.12-7.24(2H),7.40-7.50(4H),7.56(1H),7.75 (2H),7.86(2H),7.92(1H),8.52(1H),8.63(1H),8.86(1H),10.28(1H)。

參考實例01.02. (2R)-N-{4-[2-({4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-甲氧基苯基}胺基)[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基]苯基}-2-(4-氟苯基)丙醯胺

向{4-[(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)胺基]-3-甲氧基苯基}(3-氟氮雜環丁-1-基)甲酮(110mg)於甲苯(4.0mL)及NMP(0.4mL)中之攪拌懸浮液中添加(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)硼酸(126mg)、粉末狀單水合磷酸鉀(248mg)、二環己基(2',6'-二甲氧基聯苯-2-基)膦(24mg)及Pd(OAc)₂(6.6mg)，且將燒瓶脫氣兩次並用氬回填。將混合物加熱至回流並保持2h。過濾反應混合物並在真空中移除溶劑。胺基相矽膠層析獲得固體，將其與醚一起研磨以獲得150mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=1.44(3H),3.82-3.98(4H),3.98-4.77(4H),5.31-5.59(1H),7.18(2H),7.24-7.35(2H),7.37-7.50(3H),7.75(2H),7.80-7.95(3H),8.29-8.48(2H),8.83(1H),10.27(1H)。

參考實例01.03. (2R)-N-{4-[2-({4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}胺基)[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基]苯基}-2-(4-氟苯基)丙醯胺

自{4-[(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)胺基]-3-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}(3-氟氮雜環丁-1-基)甲酮(70mg)及(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)硼酸(61mg)開始，以類似於製備參考實例01.02.之程序製備參考實例01.03.。產量：73mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=1.44(3H),3.89(1H),3.96-4.76(4H),4.96(2H),5.34-5.59(1H),7.13-7.22(2H),7.39-7.48(5H),7.75(2H),7.81-7.87(2H),7.89(1H),8.28(1H),8.38-8.44(1H),8.84(1H),10.28(1H)。

參考實例01.04. (2R)-2-(4-氟苯基)-N-(4-{2-[(6-甲氧基-1,1-二氧離子基-2,3-二氫-1-苯并噻吩-5-基)胺基][1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基}苯基)丙醯胺

參考實例01.04.之化合物可以類似於本文所闡述之方法來製備。

參考實例01.05. (2R)-2-(4-氟苯基)-N-[4-(2-{[4-(甲基磺醯基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基]胺基}[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)苯基]丙醯胺

自7-氯-N-[4-(甲基磺醯基)-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基][1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(50mg)及(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)硼酸(51mg)開始，以類似於製備參考實例01.02.之程序製備參考實例01.05.。產量：20mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=1.42(3H),3.19(3H),3.87(1H),5.02(2H),7.12-7.20(2H),7.39-7.46(3H),7.62-7.67(2H),7.74(2H),7.81-7.88(2H),7.91(1H),8.53(1H),8.60(1H),8.85(1H),10.27(1H)。

參考實例01.06. (2R)-N-[4-(2-{[4-(氮雜環丁-1-基羰基)-2-甲氧基苯基]胺基}[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基)苯基]-2-(4-氟苯基)丙醯胺

自氮雜環丁-1-基{4-[(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)胺基]-3-甲氧基苯基}甲酮(120mg)及(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)硼酸(144mg)開始，以類似於製備參考實例01.02.之程序製備參考實例01.06.。產量：30mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ[ppm]=1.42(3H),2.25(2H), 3.82-3.94(4H),4.03(2H),4.36(2H),7.12-7.20(2H),7.22-7.29(2H),7.35-7.46(3H),7.73(2H),7.80-7.89(3H),8.29(1H),8.33(1H),8.81(1H),10.26(1H)。

中間體實例IntP01.01 (7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基){4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}胺基甲酸氯甲基酯

在室溫下向{4-[(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)胺基]-3-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}(3-氟氮雜環丁-1-基)甲酮(120mg)於THF(6mL)及NMP(2.8mL)中之攪拌溶液添加氫化鈉(55%w/w於油中；59mg)並將混合物攪拌15分鐘。在0℃下添加氯甲酸氯甲基酯(61μL)並在室溫下將混合物攪拌1小時。添加半飽和氯化銨溶液並用乙酸乙基酯萃取混合物。乾燥(硫酸鈉)有機相並在真空中移除溶劑。矽膠層析獲得75mg標題化合物。

中間體實例IntP01.02 (2S)-2-[(第三-丁氧基羰基)胺基]-3,3-二甲基丁酸銫

向N-(第三-丁氧基羰基)-3-甲基-L-纈胺酸(4.08g)於甲醇(36mL)中之攪拌溶液添加碳酸銫於水中之溶液直至達到pH7(約2.85g碳酸銫於36mL水中)並將溶液攪拌30分鐘。在真空中移除溶劑，添加甲苯并再次在真空中移除溶劑以獲得6.34g標題化合物。

中間體實例IntP01.03 N-(第三-丁氧基羰基)-3-甲基-L-纈胺酸{[(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基){4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}胺基甲醯基]氧基}甲基酯

向(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基){4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}胺基甲酸氯甲基酯(70mg)於DMF(3.0mL)中之攪拌溶液添加(2S)-2-[(第三-丁氧基羰基)胺基]-3,3-二甲基丁酸銫(109mg)並在室溫下將混合物攪拌72h。添加半飽和氯化銨溶液並使用乙酸乙基酯萃取混合物。用飽和氯化鈉溶液洗滌有機相，乾燥(硫酸鈉)並在真空中移除溶劑。矽膠層析獲得68mg標題化合物。

中間體實例IntP01.04 N-(第三-丁氧基羰基)-3-甲基-L-纈胺酸[({4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}[7-(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]胺基甲醯基)氧基]甲基酯

向N-(第三-丁氧基羰基)-3-甲基-L-纈胺酸{[(7-氯[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基){4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}胺基甲醯基]氧基}甲基酯(65mg)於甲苯(1.6mL)及NMP(0.16mL)中之攪拌溶液添加(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)硼酸(34.5mg)、粉末狀單水合磷酸鉀(68mg)、二環己基(2',6'-二甲氧基聯苯-2-基)膦(6.6mg)及乙酸鈀(3.6mg)並將燒瓶脫氣兩次並用氬回填。將混合物加熱至100℃達20分鐘。經由矽膠管柱過濾反應混合物並在真空中移除溶劑以獲得固體，其與己烷及二氯甲烷之混合物一起研磨以獲得47mg之標題化合物。

本發明化合物 實例1.1. 3-甲基-L-纈胺酸[({4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}[7-(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]胺基甲醯基)氧基]甲基酯鹽酸鹽

向N-(第三-丁氧基羰基)-3-甲基-L-纈胺酸[({4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}[7-(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]胺基甲醯基)氧基]甲基酯(44mg)於二氯甲烷(1mL)及甲醇(0.3mL)中之攪拌溶液添加氯化氫於二噁烷中之溶液(0.24mL；c=4.0M)。在室溫下將混合物攪拌2h。在真空中移除溶劑。將固體殘餘物與二氯甲烷及己烷之混合物一起研磨三次，每次將溶劑移除且在真空中乾燥固體以獲得32mg標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=0.94-1.01(m,9H),1.41(d,3H),3.82-3.96(m,2H),3.99-4.19(m,1H),4.31-4.69(m,3H),4.83(q,2H),5.33-5.56(m,1H),5.85(d,1H),5.95(d,1H),7.11-7.19(m,2H),7.33-7.47(m,5H),7.52(dd,1H),7.71-7.85(m,4H),7.97(d,1H),8.44(d,3H),8.86(d,1H),10.38(s,1H)。

LC-MS(方法2)：R_t=1.15min；MS(ESIpos)m/z=838[M+H]⁺。

生物學分析：增殖分析

將經培育之腫瘤細胞(MCF7，激素依賴性人類乳癌細胞ATCC HTB22；NCI-H460，人類非小細胞肺癌細胞ATCC HTB-177；DU 145，激素非依賴性人類前列腺癌細胞ATCC HTB-81；HeLa-MaTu，人類宮頸癌細胞EPO-GmbH，Berlin；HeLa-MaTu-ADR，多重耐藥性人類宮頸癌細胞EPO-GmbH，Berlin；HeLa人類宮頸瘤細胞ATCC CCL-2；B16F10小鼠黑色素瘤細胞ATCC CRL-6475)以5000個細胞/孔(MCF7、DU145、HeLa-MaTu-ADR)、3000個細胞/孔(NCI-H460、HeLa-MaTu、HeLa)或1000個細胞/孔(B16F10)之密度於200μl補充有10%胎牛血清之其各別生長培養基中平鋪於96孔多滴定板中。在24小時後，用結晶紫將一個板(0點板)之細胞染色(參見下文)，同時用新鮮培養基(200μl)更換其他板之培養基，向新鮮培養基中添加不同濃度(0μM，以及在0.01-30μM範圍內；溶劑二甲基亞碸之最終濃度為0.5%)之測試物質。在測試物質之存在下將細胞培育4天。藉由用結晶紫將細胞染色來測定細胞增殖：藉由在室溫下添加20μl/量測點之11%戊二醛溶液並保持15分鐘來將細胞固定。在用水將經固定細胞洗滌三個循環後，將板於室溫下乾燥。藉由添加100μl/量測點之0.1%結晶紫溶液(pH 3.0)來將細胞染色。在用水將經染色細胞洗滌三個循環後，將板於室溫下乾燥。藉由添加100μl/量測點之10%乙酸溶液來溶解染料。在595nm波長下藉由光度測定法來測定消光。藉由將量測值正規化至0點板之消光值(=0%)及未處理(0μm)細胞之消光值(=100%)來計算細胞數目變化(%)。藉助4參數擬合來測定IC₅₀值。

上述參考實例係由以下於HeLa細胞增殖分析(如上文闡述)中所測定之IC₅₀值來表徵：

Mps-1激酶分析

人類激酶Mps-1使生物素化受質肽磷酸化。磷酸化產物之檢測係藉由自作為供體之經銪標記之抗磷酸-絲胺酸/蘇胺酸抗體至作為受體之經交聯別藻藍蛋白(SA-XLent)標記之鏈黴親和素之時間解析螢光共振能量轉移(TR-FRET)來達成。測試化合物對激酶活性之抑制。

使用N端帶GST標籤之人類全長重組Mps-1激酶(購自Invitrogen,Karslruhe,Germany，目錄號PV4071)。作為激酶反應之受質，使用胺基酸序列PWDPDDADITEILG之生物素化肽(C端呈醯胺形式，購自Biosynthan GmbH,Berlin)。

對於分析，將50nl測試化合物於DMSO中之100倍濃縮溶液移液至黑色低容量384孔微量滴定板(Greiner Bio-One,Frickenhausen,Germany)中，添加2μl Mps-1存於分析緩衝液[0.1mM正釩酸鈉，10mM MgCl₂，2mM DTT，25mM Hepes pH 7.7，0.05%BSA，0.001% 普流尼克(Pluronic)F-127]中之溶液並在22℃下將該混合物培育15min，以使得在開始激酶反應前使測試化合物預結合至Mps-1。然後，藉由添加3μl 16.7腺苷三磷酸(ATP，16.7μM=>5μl分析體積中之終濃度為10μM)及肽受質(1.67μM=>5μl分析體積中之終濃度為1μM)於分析緩衝液中之溶液來開始激酶反應，並在22℃下將所得混合物培育60min之反應時間。分析中Mps-1之濃度係根據酶批次之活性來調節且經適當選擇以使分析在線性範圍內，典型酶濃度在約1nM(5μl分析體積中之終濃度)範圍內。藉由添加3μl HTRF檢測試劑溶液(100mM Hepes pH 7.4，0.1%BSA，40mM EDTA，140nM鏈黴親和素-XLent[編號61GSTXLB，Fa.Cis Biointernational，Marcoule，France]，1.5nM抗-磷酸(Ser/Thr)-銪抗體[編號AD0180，PerkinElmer LAS，Rodgau-Jügesheim，Germany])使反應停止。

在22℃下將所得混合物培育1h，以使得磷酸化肽結合至抗磷酸(Ser/Thr)-銪抗體。隨後，藉由量測自經銪標記之抗磷酸(Ser/Thr)抗體至鏈黴親和素-XLent之共振能量轉移來評估磷酸化受質之量。因此，於Viewlux TR-FRET讀取器(PerkinElmer LAS,Rodgau-Jügesheim,Germany)中量測在350nm激發後在620nm及665nm下之螢光發射。將「經空白校正之正規化比率」(Viewlux特定讀出值，此與在665nm及622nm下之發射之傳統比率相似，其中自665nm信號減去空白及Eu供體串擾，然後計算比率)視為磷酸化受質之量之量度。將數據正規化(無抑制劑之酶反應=0%抑制，不存在酶之所有其他分析組份=100%抑制)。測試化合物係於相同微量滴定板上以在20μM至1nM之範圍內之10個不同濃度(20μM、6.7μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、82nM、27nM、9.2nM、3.1nM及1nM，在分析前以100倍濃縮儲積液之量藉由連續1：3稀釋來準備一系列稀釋液)下一式兩份來測試每一濃度之值，且藉由4參數擬合來計算IC₅₀值。

上述參考實例係由以下於Mps-1激酶分析(如上文所述)中所測定之IC₅₀值來表徵：

紡錘體組裝檢查點分析

紡錘體組裝檢查點確保染色體在有絲分裂期間之恰當分離。一旦進入有絲分裂，染色體即開始濃縮，此伴隨組蛋白H3絲胺酸10上之磷酸化。組蛋白H3絲胺酸10上之去磷酸化始於後期且在早末期結束。因此，可將組蛋白H3絲胺酸10上之磷酸化用作細胞於有絲分裂中之標記物。諾考達唑(Nocodazole)係使微管不穩定之物質。因此，諾考達唑幹擾微管動力學並調動紡錘體組裝檢查點。細胞於有絲分裂中在G2/M過渡期停止並展現組蛋白H3絲胺酸10上之磷酸化。在諾考達唑存在下，Mps-1抑制劑對紡錘體組裝檢查點之抑制會克服有絲分裂阻礙，且細胞過早地完成有絲分裂。藉由於組蛋白H3絲胺酸10上磷酸化之細胞之減少來檢測此改變。將此下降用作測定本發明化合物誘導有絲分裂突破能力之標記物。

將人類宮頸瘤細胞系HeLa(ATCC CCL-2)之經培養細胞以2500個細胞/孔之密度於20μl補充有1%(v/v)麩醯胺酸、1%(v/v)青黴素(penicillin)、1%(v/v)鏈黴素(streptomycin)及10%(v/v)胎牛血清之杜貝克氏培養基(Dulbeco's Medium)(w/o苯酚紅、w/o丙酮酸鈉、w 1000 mg/mL葡萄糖、w吡多醇(pyridoxine))平鋪於384孔微量滴定板中。在37℃下培育過夜後，將諾考達唑以0.1μg/mL之終濃度以10μl/孔添加至細胞中。在24h培育後，細胞停止於細胞周斯進展之G2/M期。以不同濃度(0μM、以及在0.005μM-10μM範圍內；溶劑DMSO之終濃度為0.5%(v/v))添加溶於二甲基亞碸(DMSO)中之測試化合物。將細胞在測試化合物存在下在37℃下培育4h。此後，在4℃下在於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之4%(v/v)多聚甲醛中將細胞固定過夜，然後在室溫下在於PBS中之0.1%(v/v)Triton X^TM 100中滲透化處理20min且在室溫下在於PBS中之0.5%(v/v)牛血清白蛋白(BSA)中封阻15min。在用PBS洗滌後，將20μL/孔抗體溶液(抗磷酸-組蛋白H3純系3H10，FITC；Upstate，目錄號16-222；1：200稀釋)添加至細胞中，在室溫下將該等細胞培育2h。此後，用PBS洗滌細胞且將20μl/孔HOECHST 33342染料溶液(5μg/mL)添加至細胞中並在室溫下在黑暗中將細胞培育12min。用PBS將細胞洗滌兩次，然後用PBS覆蓋並於4℃下儲存直至分析。利用Perkin Elmer OPERA^TM High-Content分析讀取器獲取影像。使用來自Molecular devices之影像分析軟體MetaXpress^TM利用細胞週期應用模組來分析影像。在此分析中，量測標籤HOECHST 33342及組蛋白H3絲胺酸10上之磷酸化二者。HOECHST 33342標記DNA且用於細胞數目計數。組蛋白H3絲胺酸10上之磷酸化之染色確定有絲分裂細胞之數目。在諾考達唑存在下，Mps-1之抑制降低有絲分裂細胞之數目，從而指示不適當有絲分裂進展。藉由4參數邏輯斯諦回歸分析(logistic regression analysis)進一步分析原始分析數據，以測定每一測試化合物之IC₅₀值。

於pH 7.4之緩衝液中之穩定性

將0.3mg測試化合物溶解於0.1ml二甲基亞碸及0.4ml乙腈中。為完全溶解，將具有試樣溶液之HPLC小瓶音波處理約20秒。然後，添加1.0ml之緩衝溶液，且將試樣再次於超音波浴中處理。

緩衝溶液之製備：

將90g氯化鈉、13.61g磷酸二氫鉀及83.35g 1M氫氧化鈉溶液用Millipore水補足至1升且然後1：10稀釋。

藉由HPLC分析10μl份之試樣溶液以測定在37℃下經24小時之時期測試化合物之量。使用峰面積(%)用於量化。

HPLC方法：

Agilent 1100，具有DAD(G1315B)、二元幫浦(G1312A)、自動進樣器(G1329A)、管柱烘箱(G1316A)、恆溫器(G1330B)；管柱：Kromasil 100 C18，250mm×4mm，5μm；管柱溫度：37℃；溶析劑A：水+5ml過氯酸/升，溶析劑B：乙腈。

梯度：

0min 98%A，2%B→0min至3.0min 85%A，15%B→3.0min至8.0min 50%A，50%B→8.0min至16.0min 50%A，50%B→16.0min至20.0min 10%A，90%B→20.0-21.0 10%A，90%B→21.0min至24.0min 98%A，2%B→24.0min至25.0min 98%A，2%B；流速：1.5ml/min；UV檢測：210nm。

代表性實例之在不同時間點之峰面積(F)相對於在起始時間之峰面積之比率顯示於表1中：

大鼠及人類血漿中之活體外穩定性(HPLC檢測)

將1mg測試化合物溶解於1.25ml二甲基亞碸中。然後，添加1.25ml水。將0.5ml此試樣溶液與0.5ml肝素化及37℃溫熱血漿(威斯塔大鼠(wistar rat)血漿或人類血漿)混合。立即獲取第一試樣(10μl)用於HPLC分析。在培育開始後長達4h之時期中，在30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘及240分鐘後再獲取10μl等分試樣並測定測試化合物之量。

HPLC方法：

Agilent 1100，具有DAD(G1315A)、二元幫浦(G1312A)、自動進樣器(G1329A)、管柱烘箱(G1316A)、恆溫器(G1330B)；管柱：Kromasil 100 C18，250mm×4mm，5μm；管柱溫度：45℃；溶析劑A：水+5ml過氯酸/升，溶析劑B：乙腈。

梯度：

0min 98%A，2%B→0min至3.0min 85%A，15%B→3.0min至8.0min 55%A，45%B→8.0min至16.0min 55%A，45%B→16.0min至20.0min 10%A，90%B→20.0-21.0 10%A，90%B→21.0min至24.0min 98%A，2%B→24.0min至25.0min 98%A，2%B；流速：1.5ml/min；UV檢測：222nm。

各別時間點處之峰面積(F)相對於起始時間之峰面積之比率指示剩餘母體化合物，因此指示在所述實驗條件下之穩定性。

活體外代謝穩定性之測定

(包括計算肝活體內血液清除率(CL)及最大經口生物利用度(F_max))

測試化合物之活體外代謝穩定性係藉由將1μM測試化合物與懸浮肝微粒體於100mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)(NaH₂PO₄×H₂O+Na₂HPO₄×2H₂O)中在0.5mg/mL蛋白質濃度下且在37℃下培育來測定。藉由添加含有存於磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中之1.2mg NADP、3 IU葡萄糖-6-磷酸去氫酶、14.6mg葡萄糖-6-磷酸及4.9mg MgCl₂之輔因子混合物來激活反應。

培育中之有機溶劑限於<0.2%二甲基亞碸(DMSO)及<1%甲醇。在培育期間，持續搖動微粒體懸浮液並於2min、8min、16min、30min、45min及60min獲得等分試樣，立即向其中添加等體積之冷甲醇。在-20℃下將試樣冷凍過夜，隨後在3000rpm下離心15分鐘並使用具有LCMS/MS檢測之Agilent 1200 HPLC系統來分析上清液。

自濃度-時間圖測定測試化合物之半衰期。自半衰期計算內在清除率。連同其他參數肝血液流量、特定肝重量及微粒體蛋白質含量，計算不同物種之肝活體內血液清除率(CL)及最大經口生物利用度(F_max)。使用以下參數值：肝血液流量-1.3L/h/kg(人類)、2.1L/h/kg(狗)、4.2L/h/kg(大鼠)；特定肝重量-21g/kg(人類)、39g/kg(狗)、32g/kg(大鼠)；微粒體蛋白質含量-40mg/g。

利用所述分析，僅反映微粒體之I相代謝，例如藉由細胞色素P450酶及黃素單加氧酶(FMO)之典型氧化還原反應及藉由酯酶(酯及醯胺)之水解反應。

Claims

一種通式(I)之化合物，其中：R^A表示-C(=O)-O-C(R⁴)(R⁵)-O-C(=O)-C(R³)(NH₂)-R⁶；R¹ 表示選自甲氧基-及2,2,2-三氟乙氧基-之基團；R² 表示選自以下之基團：其中「*」指示R²附接至苯環之附接點；R³ 表示氫原子或甲基-；R⁴及R⁵彼此獨立地表示氫原子或C₁-C₃-烷基-；R⁶ 表示氫原子或C₁-C₆-烷基-；或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽或其混合物。
如請求項1之化合物，其中：R^A表示選自以下之基團：R⁶-C(R³)(NH₂)-C(=O)-O-CH₂-O-C(=O)-，R⁶-C(R³)(NH₂)-C(=O)-O-C(H)(CH₃)-O-C(=O)-，及R⁶-C(R³)(NH₂)-C(=O)-O-C(H)(C(H)(CH₃)₂)-O-C(=O)-。
如請求項1之化合物，其中： R^A表示選自以下之基團：其中「*」指示R^A附接至氮原子之附接點。
如請求項1之化合物，其中：R^A表示選自以下之基團：其中「*」指示R^A附接至氮原子之附接點。
如請求項1至4中任一項之化合物，其中該化合物之特徵為通式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)：
如請求項1之化合物，其係： 3-甲基-L-纈胺酸[({4-[(3-氟氮雜環丁-1-基)羰基]-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基}[7-(4-{[(2R)-2-(4-氟苯基)丙醯基]胺基}苯基)[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]胺基甲醯基)氧基]甲基酯；或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽或其混合物。
如請求項1至6中任一項之化合物或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽、具體而言其醫藥上可接受之鹽或其混合物，其用於治療或預防疾病。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之化合物或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽、具體而言其醫藥上可接受之鹽或其混合物，及醫藥上可接受之稀釋劑或載劑。
一種如請求項1至6中任一項之化合物或其N-氧化物、水合物、溶劑合物或鹽、具體而言其醫藥上可接受之鹽或其混合物之用途，其用於製備用以預防或治療疾病之藥劑。
如請求項7或9之用途，其中該疾病係不受控制之細胞生長、增殖及/或存活、不適當細胞免疫反應或不適當細胞炎性反應之疾病，具體而言其中該不受控制之細胞生長、增殖及/或存活、不適當細胞免疫反應或不適當細胞炎性反應係藉由Mps-1介導，更具體而言其中該不受控制之細胞生長、增殖及/或存活、不適當細胞免疫反應或不適當細胞炎性反應之疾病係血液腫瘤、實體腫瘤及/或其轉移，例如白血病及骨髓增生異常症候群、惡性淋巴瘤、包括腦腫瘤及腦轉移之頭頸部腫瘤、包括非小細胞及小細胞肺腫瘤之胸部腫瘤、胃腸道腫瘤、內分泌腫瘤、乳房及其他婦科腫瘤、包括腎腫瘤、膀胱腫瘤及前列腺腫瘤之泌尿系統腫瘤、皮膚腫瘤及肉瘤及/或其轉移。