JP2017537116A - 癌治療のための化合物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Mps−1キナーゼ阻害剤のプロドラッグ誘導体、および疾患の治療および/または予防のためのそれらの使用に関する。
Description
本発明は、Mps−1キナーゼ阻害剤のプロドラッグ誘導体、ならびに疾患の治療および/または予防のためのそれらの使用に関する。
Mps−1(単極紡錘体1)キナーゼ(チロシントレオニンキナーゼ、TTKとしても知られている)は、有糸分裂チェックポイント(紡錘体チェックポイント、紡錘体形成チェックポイントとしても知られている)の活性化において重要な役割を果たし、それによって有糸分裂中の適切な染色体分離を確保する二重特異性Ser/Thrキナーゼである[Abrieu A et al., Cell, 2001, 106, 83−93]。全ての分裂細胞が、確実に複製した染色体を二つの娘細胞に等しく分離しなければならない。有糸分裂に入ると、染色体はその動原体で紡錘体装置の微小管に結合する。有糸分裂チェックポイントは、未結合動原体が存在する限り活性であり、有糸分裂細胞が分裂後期に入り、それによって未結合染色体があるにもかかわらず細胞分裂を完了させることを阻止する監視機構である[Suijkerbuijk SJ and Kops GJ, Biochemica et Biophysica Acta, 2008, 1786, 24−31;Musacchio A and Salmon ED, Nat Rev Mol Cell Biol., 2007, 8, 379−93]。いったん全ての動原体が正しい両糸性(amphitelic)、すなわち、双極性様式で紡錘体と結合したら、チェックポイントが満たされ、細胞が分裂後期に入り、有糸分裂を進行する。有糸分裂チェックポイントは、MAD(有糸分裂停止欠損、MAD1−3)およびBub(ベンゾイミダゾールにより抑制されない発芽、Bub1−3)ファミリーのメンバー、モータータンパク質CENP−E、Mps−1キナーゼならびに他の構成要素を含むいくつかの必須タンパク質の複雑なネットワークからなり、これらの多くは増殖している細胞(例えば、癌細胞)および組織で過剰発現している[Yuan B et al., Clinical Cancer Research, 2006, 12, 405−10]。有糸分裂チェックポイントシグナル伝達におけるMps−1キナーゼ活性の必須の役割は、shRNAサイレンシング、遺伝生化学ならびにMps−1キナーゼの化学阻害剤によって示されている[Jelluma N et al., PLos ONE, 2008, 3, e2415;Jones MH et al., Current Biology, 2005, 15、160−65;Dorer RK et al., Current Biology, 2005, 15, 1070−76;Schmidt M et al., EMBO Reports, 2005, 6, 866−72]。
低下した不完全な有糸分裂チェックポイント機能と異数性および腫瘍形成を結びつける十分な証拠が存在する[Weaver BA and Cleveland DW, Cancer Research, 2007, 67, 10103−5;King RW, Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1786, 4−14]。対照的に、有糸分裂チェックポイントの完全な阻害は、腫瘍細胞における重度の染色体不分離(missegregation)およびアポトーシス誘発をもたらすと認識されている[Kops GJ et al., Nature Reviews Cancer, 2005, 5, 773−85;Schmidt M and Medema RH, Cell Cycle, 2006, 5, 159−63;Schmidt M and Bastians H, Drug Resistance Updates, 2007, 10, 162−81]。
そのため、Mps−1キナーゼまたは有糸分裂チェックポイントの他の構成要素の薬理的阻害による有糸分裂チェックポイントの抑止は、固形腫瘍、例えば、癌腫および肉腫および白血病およびリンパ系悪性腫瘍または制御されない細胞増殖を伴う他の障害を含む増殖性障害の治療のための新規な手法に相当する。
Mps−1キナーゼの阻害効果を示す種々の化合物が先行技術で開示されており、WO2009/024824A1には、増殖性障害を治療するためのMps−1の阻害剤として2−アニリノプリン−8−オンが開示されている。WO2010/124826A1には、Mps−1キナーゼの阻害剤として置換イミダゾキノキサリン化合物が開示されている。WO2011/026579A1には、Mps−1阻害剤として置換アミノキノキサリンが開示されている。WO2011/064328A1、WO2011/063907A1、WO2011/063908A1およびWO2012/143329A1は、[1,2,4]−トリアゾロ−[1,5−a]−ピリジンおよびMps−1キナーゼを阻害するためのその使用に関する。
[1,2,4]−トリアゾロ−[1,5−a]−ピリジンに関する上記特許出願は、化合物の半数阻害濃度(IC50)によって表される、化合物の、Mps−1キナーゼを阻害する有効性に主に注目している。
さらに、当業者であれば分かるように、化合物の薬らしさを決定するさらに多くの因子が存在する。前臨床試験の目的は、ヒト臨床試験の前に例えば、安全性、毒性、薬物動態および代謝パラメータを評価することである。化合物の薬らしさを評価するための一つの重要な因子は代謝安定性である。化合物の代謝安定性は、例えば、化合物を例えば、ラット、イヌおよび/またはヒトの肝ミクロソームの懸濁物と共にインキュベートすることによって決定することができる(詳細については、実験の部を参照する。)。
癌を治療するための化合物の薬らしさを評価するための別の重要な因子は、例えば、HeLa細胞増殖アッセイで決定することができる細胞増殖の阻害である(詳細については、実験の部を参照する。)。
医薬品の患者への送達成功も障害の治療において極めて重要である。既知の生理活性特性を有する多くの臨床薬の使用は、例えば、有効成分の静脈投与を困難にする薬物の極めて低い水溶性によって制限される。
静脈(i.v.)投薬は、医薬品を患者の静脈に直接与える方法を指す。静脈投薬法には、注射器を用いて急速な注射(プッシュ)によって医薬品を静脈内に与えること、静脈内セカンダリラインを用いて特定の時間にわたって間欠的に医薬品を与えること、または主静脈液に連続的に混合した医薬品を与えることなどがあり得る。
静脈投薬の主な目的は、医薬品に対する急速な全身反応を開始することである。これが医薬品を送達する最も速い方法の一つである。体が薬物を直ちに利用できる。静脈法を用いることによって、体に送達される薬物の実際の量を制御することがより容易になり、治療反応のための血中薬物レベルを維持することもより容易になる。
多くの薬物は、水溶性が低い結果として、しばしば共溶媒医薬媒体中で、またはプロドラッグとして製剤される。
プロドラッグは、作用部位に達する前または後に化学的または酵素的攻撃によって体内で親薬剤に変換される誘導体に化学的に変換された活性薬物である。活性薬物を不活性型に変換する工程は薬物潜伏化(drug latentiation)と呼ばれる。プロドラッグは、担体連結プロドラッグおよび生体前駆体(bioprecursor)であることができる。担体連結プロドラッグは、活性分子と輸送部分の一時的結合から生じる。このようなプロドラッグは、親活性薬物と比べてあまり活性でないまたは不活性である。輸送部分は、その無毒性および効率的動態での有効成分の放出を確保する能力で選択される。他方、生体前駆体は有効成分を代謝産物として放出する代謝酵素に対する基質になることができる新規な分子を産生することによってそれ自体が有効成分の分子修飾から生じる。
プロドラッグは、薬物の薬物動態を変化させ、薬物の安定性および溶解度を改善し、毒性を低下させ、特異性を増加させ、および/または薬理効果の持続時間を増加させるよう調製される。薬物動態を変化させることにより、薬物の吸収、分布、生体内変換および/または排出を増加させることによって薬物の生物学的利用能が増加する。
プロドラッグの設計においては、以下の因子を考慮することが重要である:a)担体と薬物との間の結合が通常は共有結合である、b)プロドラッグは不活性であるか、有効成分ほど活性でない、c)プロドラッグ合成は高価であってはならない、d)プロドラッグは薬物の可逆的または生体可逆的(bioreversible)誘導体でなければならない、およびe)担体部分は放出された時に非毒性および不活性でなければならない。
プロドラッグは通常、a)活性薬物のエステル、ヘミエステル、炭酸エステル、硝酸エステル、アミド、ヒドロキサム酸、カーバメート、イミン、マンニッヒ塩基およびエナミンの形成、b)アゾ、グリコシド、ペプチドおよびエーテル官能基による薬物の官能化、c)薬物のポリマー、塩、錯体、ホスホルアミド、アセタール、ヘミアセタールおよびケタール型の使用によって製造される(例えば、Andrejus Korolkovas’s, ″Essentials of Medicinal Chemistry″, pp.97−118参照)。
Abrieu A et al., Cell, 2001, 106, 83−93
Suijkerbuijk SJ and Kops GJ, Biochemica et Biophysica Acta, 2008, 1786, 24−31
Musacchio A and Salmon ED, Nat Rev Mol Cell Biol., 2007, 8, 379−93
Yuan B et al., Clinical Cancer Research, 2006, 12, 405−10
Jelluma N et al., PLos ONE, 2008, 3, e2415
Jones MH et al., Current Biology, 2005, 15、160−65
Dorer RK et al., Current Biology, 2005, 15, 1070−76
Schmidt M et al., EMBO Reports, 2005, 6, 866−72
Weaver BA and Cleveland DW, Cancer Research, 2007, 67, 10103−5
King RW, Biochimica et Biophysica Acta, 2008, 1786, 4−14
Kops GJ et al., Nature Reviews Cancer, 2005, 5, 773−85
Schmidt M and Medema RH, Cell Cycle, 2006, 5, 159−63
Schmidt M and Bastians H, Drug Resistance Updates, 2007, 10, 162−81
Andrejus Korolkovas’s, ″Essentials of Medicinal Chemistry″, pp.97−118
従って本発明の目的は、高い薬らしさを特徴とし、静脈投与することができるMps−1キナーゼ阻害化合物またはそのプロドラッグ誘導体を同定することであった。
から選択される基を表し、
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示し;
R3は、水素原子またはメチル−基を表し;
R4およびR5は互いから独立に、水素原子またはC1−C3−アルキル−基を表し;
R6は、水素原子またはC1−C6−アルキル−基を表す。
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示し;
R3は、水素原子またはメチル−基を表し;
R4およびR5は互いから独立に、水素原子またはC1−C3−アルキル−基を表し;
R6は、水素原子またはC1−C6−アルキル−基を表す。
本文で言及される用語は、以下の意味を有する。
「ハロゲン原子」または「ハロ−」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味するものと理解されるべきである。
「C1−C6−アルキル」という用語は、1、2、3、4、5または6個の炭素原子を有する直鎖または分岐の飽和一価炭化水素基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソ−プロピル、イソ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、イソ−ペンチル、2−メチルブチル、1−メチルブチル、1−エチルプロピル、1,2−ジメチルプロピル、ネオ−ペンチル、1,1−ジメチルプロピル、4−メチルペンチル、3−メチルペンチル、2−メチルペンチル、1−メチルペンチル、2−エチルブチル、1−エチルブチル、3,3−ジメチルブチル、2,2−ジメチルブチル、1,1−ジメチルブチル、2,3−ジメチルブチル、1,3−ジメチルブチルもしくは1,2−ジメチルブチル基、またはこれらの異性体を意味するものと理解されるべきである。特に、前記基は、1、2、3または4個の炭素原子を有する(「C1−C4−アルキル」)、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソ−プロピル、イソ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル基、さらに特に1、2または3個の炭素原子を有する(「C1−C3−アルキル」)、例えば、メチル、エチル、n−プロピル−またはイソ−プロピル基である。
本明細書で使用される場合、「脱離基」という用語は、結合電子を持って安定な種として化学反応で置換される原子または原子の群を指す。好ましくは、脱離基は、ハロ、特にクロロ、ブロモまたはヨード、メタンスルホニルオキシ−、p−トルエンスルホニルオキシ−、トリフルオロメタンスルホニルオキシ−、ノナフルオロブタンスルホニルオキシ−、(4−ブロモ−ベンゼン)スルホニルオキシ−、(4−ニトロ−ベンゼン)スルホニルオキシ−、(2−ニトロ−ベンゼン)−スルホニルオキシ−、(4−イソプロピル−ベンゼン)スルホニルオキシ−、(2,4,6−トリ−イソプロピル−ベンゼン)−スルホニルオキシ−、(2,4,6−トリメチル−ベンゼン)スルホニルオキシ−、(4−tertブチル−ベンゼン)スルホニルオキシ−、ベンゼンスルホニルオキシ−および(4−メトキシ−ベンゼン)スルホニルオキシ−を含む基から選択される。
本明細書で使用される場合、「PG1」という用語は、ヒドロキシ基のための保護基、例えば、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis、第3版、Wiley 1999に記載されているTMS基またはTBDPS基(TMS=トリメチルシリル)、TBDPS=tert−ブチルジフェニルシリル)を指す。
本明細書で使用される場合、「PG2」という用語は、アミノ基のための保護基、例えば、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis、第3版、Wiley 1999に記載されているBoc基(Boc=tert−ブチルオキシカルボニル)を指す。
から選択される基を表し、
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示し;
R3は、水素原子またはメチル−基を表し;
R4およびR5は互いから独立に、水素原子またはC1−C3−アルキル−基を表し、
R6は、水素原子またはC1−C6−アルキル−基を表す。
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示し;
R3は、水素原子またはメチル−基を表し;
R4およびR5は互いから独立に、水素原子またはC1−C3−アルキル−基を表し、
R6は、水素原子またはC1−C6−アルキル−基を表す。
RAは、R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−C(R4)(R5)−O−C(=O)−を表す。
好ましい実施形態において、RAは、
R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−CH2−O−C(=O)−、
R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−C(H)(CH3)−O−C(=O)−、
および
R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−C(H)(C(H)(CH3)2)−O−C(=O)−
から選択される基を表す。
R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−CH2−O−C(=O)−、
R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−C(H)(CH3)−O−C(=O)−、
および
R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−C(H)(C(H)(CH3)2)−O−C(=O)−
から選択される基を表す。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
R1は、メトキシ−および2,2,2−トリフルオロエトキシ−から選択される基を表す。
好ましい実施形態において、R1は2,2,2−トリフルオロエトキシ−基を表す。
別の好ましい実施形態において、R1はメトキシ−基を表す。
から選択される基を表し、
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す。
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す。
から選択される基を表し、
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す。
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す。
を表し、
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す。
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す。
を表し、
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す。
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す。
別の好ましい実施形態において、R2は−S(=O)2CH3基を表す。
R3は水素原子またはメチル−基を表す。
好ましい実施形態において、R3は水素原子を表す。
別の好ましい実施形態において、R3はメチル−基を表す。
R4およびR5は互いから独立に、水素原子またはC1−C3−アルキル−基を表す。
好ましい実施形態において、R4およびR5は互いから独立に、水素原子またはメチル−またはイソ−プロピル−基を表す。
別の好ましい実施形態において、R4は水素原子またはC1−C3−アルキル−基を表し、R5は水素原子を表す。
別の好ましい実施形態において、R4は水素原子またはメチル−またはイソ−プロピル−基を表し、R5は水素原子を表す。
別の好ましい実施形態において、R4およびR5はそれぞれ水素原子を表す。
別の好ましい実施形態において、R4はメチル−基を表し、R5は水素原子を表す。
別の好ましい実施形態において、R4はイソ−プロピル−基を表し、R5は水素原子を表す。
別の好ましい実施形態において、R4は水素原子またはC1−C3−アルキル−基を表す。
別の好ましい実施形態において、R4は水素原子またはメチル−基を表す。
別の好ましい実施形態において、R4はを水素原子表す。
別の好ましい実施形態において、R4はメチル−基を表す。
別の好ましい実施形態において、R5は水素原子を表す。
R6は水素原子またはC1−C6−アルキル−基を表す。
好ましい実施形態において、R6はC1−C6−アルキル−基を表す。
別の好ましい実施形態において、R6は水素原子またはC1−C4−アルキル−基を表す。
別の好ましい実施形態において、R6はC1−C4−アルキル−基を表す。
別の好ましい実施形態において、R6はイソ−プロピル、tert−ブチル、およびH3C−CH2−C(H)(CH3)−から選択される基を表す。
上記態様のさらなる実施形態では、本発明は、N−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、またはこれらの混合物の形態である上記実施形態のいずれかによる式(I)の化合物に関する。
理解すべき点として、本発明は、上記の好ましい実施形態の任意の組み合わせに関するものでもある。
組み合わせのいくつかの例を以下で示す。しかしながら、本発明はこれらの組み合わせに限定されない。
から選択される基を表し、
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す、上記の式(I)の化合物、またはそれのN−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、またはそれらの混合物に関する。
「*」は、R2が結合しているフェニル環への結合箇所を示す、上記の式(I)の化合物、またはそれのN−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、またはそれらの混合物に関する。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
から選択される基を表し、
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
「*」は、RAが結合している窒素原子への結合箇所を示す。
理解すべき点として、本発明は、上記の一般式(I)の化合物の本発明の任意の実施形態または態様内の任意の部分的組み合わせに関するものである。
さらに、本発明は、下記の本文の実施例セクションで開示される一般式(I)の化合物を網羅する。
本発明はまた、本発明の化合物の全ての適当な同位体変種も含む。本発明の化合物の同位体変種は、少なくとも1個の原子が同じ原子番号を有するが、自然状態で通常または支配的に見られる原子質量とは異なる原子質量を有する原子によって置き換えられているものとして定義される。本発明の化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素の同位体、例えば、それぞれ、2H(重水素)、3H(トリチウム)、11C、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129Iおよび131Iが挙げられる。本発明の化合物の特定の同位体変種、例えば、3Hまたは14Cなどの1種または複数の放射性同位体が組み込まれたものは、薬剤および/または基質組織分布研究に有用である。トリチウム標識、および炭素−14、すなわち14C同位体は、その製造の容易さおよび検出性のために特に好まれる。さらに、重水素などの同位体による置換は、大きな代謝安定性から生じる特定の治療上の利点、例えば、イン・ビボ半減期の増加または投与必要量の減少を与え得るので、状況によっては好まれ得る。本発明の化合物の同位体変種は一般的に、例示的方法などによって当業者により知られている従来手順によってまたは適当な試薬の適当な同位体変種を使用して以下の実施例に記載される製造によって製造することができる。
さらに、本発明の化合物は、本発明の化合物の少なくとも1個の窒素が酸化されているという点で定義されるN−オキサイドとして存在することができる。本発明は、全てのこのような可能なN−オキサイドを含む。
本発明はまた、本明細書に開示される化合物の有用な形態、例えば、水和物、溶媒和物、塩、特に医薬として許容される塩、および共沈物に関する。
本発明の化合物は水和物または溶媒和物として存在することができ、本発明の化合物は例えば、化合物の結晶格子の構造要素として極性溶媒、特に水、メタノールまたはエタノールを含む。極性溶媒、特に水の量は、化学量論比または非化学量論比で存在し得る。化学量論的溶媒和物の場合、例えば、水和物、半−、(セミ−)、モノ−、セスキ−、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ等の溶媒和物、または水和物がそれぞれ可能である。本発明は、全てのこのような水和物または溶媒和物を含む。
さらに、本発明の化合物は、遊離型で、例えば、遊離塩基もしくは遊離酸もしくは両性イオンとして存在することができる、または塩型で存在することができる。前記塩は任意の塩、有機または無機付加塩のいずれか、特に薬学で一般に使用される任意の医薬として許容される有機または無機付加塩であることができる。
「医薬として許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機または有機酸付加塩を指す。例えば、S. M. Berge, et al. ″Pharmaceutical Salts″, J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1−19を参照する。
本発明の化合物の適当な医薬として許容される塩は、例えば、十分に塩基性の、鎖中または環内に窒素原子を有する本発明の化合物の酸付加塩、例えば、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、重硫酸、リン酸または硝酸による酸付加塩、または有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、アセト酢酸、ピルビン酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ウンデカン酸、ラウリル酸、安息香酸、サリチル酸、2−(4−ヒドロキシベンゾイル)−安息香酸、ショウノウ酸、ケイヒ酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、ニコチン酸、パモ酸、ペクチニン酸、過硫酸、3−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバル酸、2−ヒドロキシエタンスルホネート、イタコン酸、スルファミン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、2−ナフタレンスルホン酸、ナフタリンジスルホン酸、カンファースルホン酸、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、アジピン酸、アルギン酸、マレイン酸、フマル酸、D−グルコン酸、マンデル酸、アスコルビン酸、グルコヘプタン酸、グリセロリン酸、アスパラギン酸、スルホサリチル酸、ヘミ硫酸またはチオシアン酸による酸付加塩であり得る。
さらに、十分に酸性の本発明の化合物の別の適当な医薬として許容される塩は、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウムもしくはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウムもしくはマグネシウム塩、アンモニウム塩または生理学的に許容されるカチオンを与える有機塩基による塩、例えば、N−メチル−グルカミン、ジメチル−グルカミン、エチル−グルカミン、リジン、ジシクロヘキシルアミン、1,6−ヘキサジアミン、エタノールアミン、グルコサミン、サルコシン、セリノール、トリス−ヒドロキシ−メチル−アミノメタン、アミノプロパンジオール、sovak塩基、1−アミノ−2,3,4−ブタントリオールによる塩である。さらに、本発明による化合物は、例えば、低級ハロゲン化アルキル(塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルならびにブチルなど);硫酸ジアルキル(硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルなど);長鎖ハロゲン化物(塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルならびにステアリルなど);ハロゲン化アラルキル(臭化ベンジルおよびフェネチルなど)などの剤による塩基性窒素含有基の四級化によって得ることができる四級アンモニウムイオンによる塩を形成し得る。適当な四級アンモニウムイオンの例には、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラ(n−プロピル)アンモニウム、テトラ(n−ブチル)アンモニウムまたはN−ベンジル−N,N,N−トリメチルアンモニウムがある。
当業者であれば、特許請求の化合物の酸付加塩が、いくつかの既知の方法のいずれかを介して化合物と適当な無機酸または有機酸の反応によって製造され得ることをさらに認識するだろう。あるいは、本発明の酸性化合物のアルカリおよびアルカリ土類金属塩は、種々の既知の方法を介して本発明の化合物を適当な塩基と反応させることによって製造される。
本発明は、単一の塩として、または任意の比の前記塩の任意の混合物として本発明の化合物の全ての可能な塩を含む。
さらに、本発明は、本発明の化合物の全ての可能な結晶型または多形を、単一多形としてまたは任意の比の複数の多形の混合物として含む。
別の態様によると、本発明は、本明細書の実験セクションで記載されるステップを含む、本発明の化合物を製造する方法を網羅する。
本発明はまた、本発明の1以上の化合物を含む医薬組成物に関する。これらの組成物を利用して、それを必要とする患者に投与することによって所望の薬理的効果を達成することができる。本発明の目的のために、患者は、特定の状態または疾患についての治療を必要とする、ヒトを含む哺乳動物である。そのため、本発明は、医薬として許容される担体と、医薬として有効な量の本発明の化合物またはその塩とで構成される医薬組成物を含む。医薬として許容される担体は、好ましくは担体に起因するいかなる副作用も有効成分の有益な効果を無効にしないように、有効成分の有効な活性と調和した濃度で、患者に比較的非毒性および無害である担体である。化合物の医薬として有効な量は、好ましくは、治療されている特定の状態に対して結果をもたらすまたは影響を及ぼす量である。
本発明の化合物はまた、非経口的に、すなわち、皮下に、静脈に、眼内に、関節滑液嚢内に、筋肉にまたは腹腔内に、医薬として許容される界面活性剤(石鹸もしくは洗剤など)、懸濁剤(ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロースなど)、または乳化剤および他の医薬補助剤を用いてまたは用いないで、好ましくは滅菌液体または液体の混合物、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖液および関連する糖液、アルコール(エタノール、イソプロパノールもしくはヘキサデシルアルコールなど)、グリコール(プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなど)、グリセロールケタノール(2,2−ジメチル−1,1−ジオキソラン−4−メタノールなど)、エーテル(ポリ(エチレングリコール)400など)、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステルまたは脂肪酸グリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドであり得る医薬担体を含む生理的に許容される希釈剤中の注射可能な投与量の化合物として投与することもできる。
本発明の非経口組成物は、代表的には溶液中に約0.5重量%から約25重量%の有効成分を含む。有利には保存剤および緩衝剤を使用してもよい。注射部位での刺激を最小化するまたは排除するために、このような組成物は、好ましくは約12から約17の親水性−親油性バランス(HLB)を有するノニオン系界面活性剤を含んでもよい。このような製剤中の界面活性剤の量は、好ましくは約5重量%から約15重量%に及ぶ。界面活性剤は上記HLBを有する単一成分であってもよいし、または所望のHLBを有する2種以上の成分の混合物であってもよい。
非経口製剤に使用される界面活性剤の例には、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、およびプロピレンオキサイドとプロピレングリコールの縮合により形成されるエチレンオキサイドと疎水性基剤の高分子量付加物がある。
医薬組成物は、滅菌注射水系懸濁剤の形態であってもよい。このような懸濁剤は、適当な分散または湿潤剤および懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガムおよびアラビアガム;天然ホスファチド、例えば、レシチン、アルキレンオキサイドと脂肪酸の縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、エチレンオキサイドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、ヘプタデカ−エチレンオキシセタノール、エチレンオキサイドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、またはエチレンオキサイドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである得る分散または湿展剤を用いて既知の方法により製剤することができる。
滅菌注射製剤はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であってもよい。使用され得る希釈剤および溶媒は、例えば、水、リンゲル液、等張食塩水および等張グルコース溶液である。
本発明による医薬組成物を以下の通り示すことができる:
滅菌静注溶液:本発明の所望の化合物の5mg/mL溶液を滅菌注射用水を用いて製造することができ、必要に応じてpHを調整する。この溶液を投与するために滅菌5%ブドウ糖を用いて1から2mg/mLに希釈し、約60分間にわたって静注輸液として投与する。
滅菌静注溶液:本発明の所望の化合物の5mg/mL溶液を滅菌注射用水を用いて製造することができ、必要に応じてpHを調整する。この溶液を投与するために滅菌5%ブドウ糖を用いて1から2mg/mLに希釈し、約60分間にわたって静注輸液として投与する。
上記のように、化合物AがMps−1を有効に阻害することが分かり、そのため、制御されない細胞成長、増殖および/または生存、不適当な細胞免疫応答、あるいは不適当な細胞炎症反応、あるいは制御されない細胞成長、増殖および/または生存、不適当な細胞免疫応答、あるいは不適当な細胞炎症反応を伴う疾患(特に、制御されない細胞成長、増殖および/または生存、不適当な細胞免疫応答、あるいは不適当な細胞炎症反応は、Mps−1によって媒介されている)、例えば、血液系腫瘍、固形腫瘍および/またはこれらの転移、例えば、白血病および骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、頭頸部腫瘍(脳腫瘍および脳転移を含む)、胸部腫瘍(非小細胞および小細胞肺腫瘍を含む)、胃腸腫瘍、内分泌腫瘍、乳房および他の婦人科腫瘍、泌尿器腫瘍(腎臓、膀胱および前立腺腫瘍を含む)、皮膚腫瘍、および肉腫、ならびに/あるいはこれらの転移の疾患の治療または予防のために使用され得る。
そのため、別の態様によると、本発明は、上記の疾患の治療または予防に使用するための、本明細書に記載および定義される一般式(I)の化合物、またはそれのN−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、特にその医薬として許容される塩、またはこれらの混合物を網羅する。
そのため、本発明の別の特定の態様は、疾患を予防または治療するための、上記の一般式(I)の化合物、またはそれのN−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、特にその医薬として許容される塩、またはこれらの混合物の使用である。
そのため、本発明の別の特定の態様は、疾患を治療または予防するための医薬組成物を製造するための、上記一般式(I)の化合物の使用である。
本発明の文脈、特に本明細書で使用される「不適当な細胞免疫応答または不適当な細胞炎症反応」の文脈内の「不適当な」という用語は、好ましくは正常より小さいまたは大きい、また前記疾患の病理に関連する、それの原因である、またはそれをもたらす応答を意味するものと理解されるべきである。
本発明は、哺乳動物の過剰増殖障害を治療するために、本発明の化合物およびその組成物を使用する方法に関する。化合物を利用して細胞増殖および/または細胞分裂を阻害する、遮断する、低減する、減少させる等、ならびに/あるいはアポトーシスをもたらすことができる。この方法は、障害を治療するのに有効な量の本発明の化合物、またはその医薬として許容される塩、異性体、多形、代謝産物、水和物、溶媒和物もしくはエステル等を、ヒトを含む、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む。過剰増殖障害には、それだけに限らないが、例えば、乾癬、ケロイドおよび皮膚に影響を及ぼす他の過形成、前立腺肥大症(BPH)、固形腫瘍(乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、目、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺の癌およびこれらの遠隔転移など)が含まれる。これらの障害にはリンパ腫、肉腫および白血病も含まれる。
乳癌の例には、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性乳管癌および非浸潤性小葉癌などがあるが、これらに限定されるものではない。
気道の癌の例には、小細胞および非小細胞肺癌、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫などがあるが、これらに限定されるものではない。
脳癌の例には、脳幹および視床下部(hypophtalmic)膠腫、小脳および大脳星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、ならびに神経外胚葉および松果体腫瘍などがあるが、これらに限定されるものではない。
男性生殖器の腫瘍には、前立腺および精巣癌などがあるが、これらに限定されるものではない。女性生殖器の腫瘍には、子宮内膜、子宮頸部、卵巣、膣および外陰癌、ならびに子宮の肉腫などがあるが、これらに限定されるものではない。
消化管の腫瘍には、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸および唾液腺癌などがあるが、これらに限定されるものではない。
尿路の腫瘍には、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管、尿道およびヒト乳頭状腎臓癌などがあるが、これらに限定されるものではない。
目の癌には、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫などがあるが、これらに限定されるものではない。
肝癌の例には、肝細胞癌(線維層板型の変形を伴うまたは伴わない肝臓細胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)および混合肝細胞性胆管癌などがあるが、これらに限定されるものではない。
皮膚癌には、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚癌および非黒色腫皮膚癌などがあるが、これらに限定されるものではない。
頭頸部癌には、喉頭、下咽頭、鼻咽頭、中咽頭癌、および口腔癌および扁平細胞などがあるが、これらに限定されるものではない。リンパ腫には、AIDS関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン病および中枢神経系のリンパ腫などがあるが、これらに限定されるものではない。
肉腫には、軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉種などがあるが、これらに限定されるものではない。
白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病および有毛細胞白血病などがあるが、これらに限定されるものではない。
これらの障害はヒトにおいてよく特徴付けられているが、他の哺乳動物でも類似の病因で存在し、本発明の医薬組成物を投与することによって治療することができる。
本文書の全体で述べられている「治療すること」または「治療」という用語は、慣習的に使用され、例えば、癌などの疾患または障害の状態等と戦う、これを緩和する、低減する、軽減する、改善する目的での対象の管理またはケアである。
本発明はまた、脳卒中、心不全、肝腫大、心拡大、糖尿病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、異種移植片拒絶症状、敗血症ショックまたは喘息など(これらに限定されるものではない)の異常なマイトジェン細胞外キナーゼ活性に関連する障害を治療する方法も提供する。
有効量の本発明の化合物を使用して、上記背景セクションで言及された疾患(例えば、癌)を含むこのような障害を治療することができる。それにもかかわらず、このような癌および他の疾患は、作用機序および/またはキナーゼと障害との間の関係とは無関係に、本発明の化合物により治療することができる。
「異常なキナーゼ活性」または「異常なセリントレオニンキナーゼ活性」という句は、キナーゼをコードする遺伝子または遺伝子がコードするポリペプチドの任意の異常な発現または活性を含む。このような異常な活性の例としては、遺伝子またはポリペプチドの過剰発現;遺伝子増幅;恒常的活性型または機能亢進性キナーゼ活性をもたらす突然変異;遺伝子突然変異、欠失、置換、付加などがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明はまた、有効量の、その塩、多形、代謝産物、水和物、溶媒和物、プロドラッグ(例えば、エステル)およびそのジアステレオマー型を含む本発明の化合物を投与する段階を含む、特にマイトジェン細胞外キナーゼのキナーゼ活性を阻害する方法も提供する。細胞(例えば、イン・ビトロ)、または哺乳動物対象、特に治療を必要とするヒト患者の細胞においてキナーゼ活性を阻害することができる。
式(I)のプロドラッグ化合物の一般的合成
以下の段落は、下記の図式に示した式(I)の化合物を製造するのに好適な合成手法を説明するものである。
以下の段落は、下記の図式に示した式(I)の化合物を製造するのに好適な合成手法を説明するものである。
下記の経路に加えて、有機合成の技術分野の当業者の一般的知識に従って、他の経路を使用して標的化合物を合成してもよい。そのため、以下の図式で例示される変換の順序は限定的であることを意図しておらず、種々の図式からの適当な合成ステップを組み合わせて追加の合成順序を形成することができる。さらに、例示の変形の前および/または後で、示される置換基のいずれかの相互変換を行うことができる。これらの修飾は、例えば、官能基の還元もしくは酸化、ハロゲン化、金属化、金属触媒カップリング反応、置換または当業者に知られている他の反応などであり得る。これらの変換には、置換基のさらなる相互変換を可能にする官能基を導入するものが含まれる。特に、以下の合成経路は、保護基の導入および切断を包含する。適当な保護基ならびにその導入および切断は当業者に周知であり(例えば、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 4th edition, Wiley 2006参照)、より具体的には保護基にはPG1(上に定義されるヒドロキシのための保護基)およびPG2(上に定義されるアミノのための保護基)などの基が含まれる。
具体的な例を後の段落で記載する。さらに、当業者に周知であるように、2以上の連続段階を、前記段階間で後処理を行うことなく、例えば、「ワンポット」反応で行ってもよい。
図式1は、式(V)(式中、R1およびR2は一般式(I)の化合物について定義される通りである)の中間体からの一般式(I)の化合物の合成を概説している。中間体(V)の製造は、実験節に記載されるように行うことができる。中間体(V)を、エーテル、例えば、テトラヒドロフランなどの適当な溶媒中で水素化ナトリウムなどの適当な塩基によって脱プロトン化し、その後、式(VI)(式中、R4およびR5は一般式(I)の化合物について定義される通りであり、LGは上に定義される脱離基、好ましくはクロロを表す)のクロロホルメートと反応させるとカーバメート(VII)が得られる。式(VI)のクロロホルメートは当業者に周知であり、いくつかの場合、市販されている。前記カーバメート(VII)を、N,N−ジメチルホルムアミドなどの適当な溶媒中、式(VIII)(式中、PG2は上記で定義のアミノ基のための保護基、例えばtert−ブトキシカルボニル(Boc)、ベンジルオキシカルボニル(Z)またはp−メトキシベンジル(PMB)を表し、M+はアルカリ陽イオンまたはアンモニウム塩、好ましくはセシウムなどの一価陽イオンを表す。)のカルボキシレート塩と反応させて式(IX)の中間体を得る。この置換を、触媒量のヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムなどのヨウ化物塩の存在下で行って、それによって脱離基LGを原位置でヨウ化物に変換することもできる。あるいは、脱離基LGを置換反応の前にヨウ化物に変換することができる。次いで、中間体(IX)を、ボロン酸誘導体(X)(式中、REは水素または互いに独立に、C1−C6−アルキル−を表す、あるいは一緒になってC2−C6−アルキレン−基、例えば−C(CH3)2−C(CH3)2−を形成する)を伴うスズキカップリングに供する。スズキカップリングは当業者に周知であり、好ましくは、カップリングは、配位子/触媒としてジシクロヘキシル(2′,6′−ジメトキシビフェニル−2−イル)ホスフィンおよび酢酸パラジウム、またはPd2dba3を用い、塩基としてリン酸カリウム一水和物またはリン酸カリウムを用い、そして溶媒としてトルエンもしくはN−メチルピロリジンまたはトルエンとN−メチルピロリジンの混合物用いて行う。その後、カップリング生成物(XI)を(必要に応じて)例えば、塩酸で処理することによって脱保護してBoc基を除去して、一般式(I)の化合物を得る。一般式(I)の化合物は、代表的には塩、好ましくはHCl塩またはTFA塩として単離される。
図式1:中間体(V)からの式(I)のプロドラッグ化合物の合成
実験の部
以下の表は、この段落および実施例セクションで使用される略語を列挙するものである。NMRピーク形態はスペクトラムで見られる通りに記述しており、可能なより高次の効果は考慮していない。
実験の部
以下の表は、この段落および実施例セクションで使用される略語を列挙するものである。NMRピーク形態はスペクトラムで見られる通りに記述しており、可能なより高次の効果は考慮していない。
本発明の方法により製造された化合物および中間体は精製を必要とし得る。有機化合物の精製は当業者に周知であり、同化合物を精製するいくつかの方法が存在し得る。場合により、精製は必要でない場合もある。場合により、結晶化によって化合物を精製することができる。場合により、適当な溶媒を用いて不純物を攪拌することができる。場合により、例えば、Separtis製の予備充填シリカゲルカートリッジ、例えば、Isolute(登録商標)Flashシリカゲル(シリカゲルクロマトグラフィー)またはIsolute(登録商標)Flash NH2シリカゲル(アミノ相−シリカゲルクロマトグラフィー)を適当なクロマトグラフィーシステム、例えば、Flashmaster II(Separtis)またはIsoleraシステム(Biotage)および溶離液、例えば、ヘキサン/酢酸エチルまたはDCM/メタノールの勾配と組み合わせて使用して、クロマトグラフィー、特にフラッシュクロマトグラフィーによって化合物を精製することができる。場合により、例えば、ダイオードアレイ検出器および/またはオンラインエレクトロスプレーイオン化質量分析計を搭載したWaters自動精製装置を適当な予備充填逆相カラムおよび溶離液、例えば、トリフルオロ酢酸、ギ酸またはアンモニア水などの添加剤を含み得る水およびアセトニトリルの勾配と組み合わせて使用して、分取HPLCによって化合物を精製することができる。
光学異性体は、従来法によるラセミ混合物の分割、例えば、光学活性酸もしくは塩基を用いたジアステレオマー塩の形成または共有結合性ジアステレオマーの形成によって得ることができる。適当な酸の例には、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジトルオイル酒石酸およびカンファースルホン酸がある。ジアステレオマーの混合物は、当技術分野で知られている方法、例えば、クロマトグラフィーまたは分別結晶によって、その物理的および/または化学的違いに基づいて個々のジアステレオマーに分離することができる。その後、光学活性塩基または酸を分離したジアステレオマー塩から遊離させる。光学異性体の別の分離法は、エナンチオマーの分離を最大化するために選択してもよい、従来の誘導体化を用いるまたは用いない、キラルクロマトグラフィー(例えば、キラルHPLCカラム)の使用を含む。適当なキラルHPLCカラムは、Diacelによって製造されており、例えば、数ある中でも全て日常的に選択可能なChiracel ODおよびChiracel OJがある。誘導体化を用いるまたは用いない酵素分離も有用である。本発明の光学活性化合物はさらに、光学活性出発物質を利用したキラル合成によっても得ることができる。
本文中、特に実験セクションにおいて、本発明の中間体および実施例の合成について、化合物を対応する塩基または酸による塩型として言及する場合、それぞれの製造および/または精製工程によって得られる前記塩型の正確な化学量論的組成は、ほとんどの場合、未知である。
特に指定しない限り、例えば、「塩酸塩」、「トリフルオロアセテート」、「ナトリウム塩」または「xHCl」、「xCF3COOH」、「xNa+」などの化学名または構造式の接尾辞は、化学量論的指定としてではなく、単なる塩型として理解されるべきである。
分析UPLC−MSを以下の通り行った。
LC−MS方法:
方法1:
装置:Waters Acquity UPLCMS ZQ4000;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.05体積%ギ酸、溶離液B:アセトニトリル+0.05体積%ギ酸勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
方法1:
装置:Waters Acquity UPLCMS ZQ4000;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.05体積%ギ酸、溶離液B:アセトニトリル+0.05体積%ギ酸勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
方法2:
装置:Waters Acquity UPLC−MS SQD 3001;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.1体積%ギ酸(95%)、溶離液B:アセトニトリル、勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
装置:Waters Acquity UPLC−MS SQD 3001;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.1体積%ギ酸(95%)、溶離液B:アセトニトリル、勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
方法3:
装置:Waters Acquity UPLCMS SQD;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.05体積%ギ酸(95%)、溶離液B:アセトニトリル+0.05体積%ギ酸(95%)、勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
装置:Waters Acquity UPLCMS SQD;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.05体積%ギ酸(95%)、溶離液B:アセトニトリル+0.05体積%ギ酸(95%)、勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
方法4:
装置:Waters Acquity UPLC−MS SQD;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.750×2.1mm;溶離液A:水+0.1体積%ギ酸(99%)、溶離液B:アセトニトリル;勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
装置:Waters Acquity UPLC−MS SQD;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.750×2.1mm;溶離液A:水+0.1体積%ギ酸(99%)、溶離液B:アセトニトリル;勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
方法5:
装置:Waters Acquity UPLCMS SQD3001;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.2体積%アンモニア(32%)、溶離液B:アセトニトリル、勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
装置:Waters Acquity UPLCMS SQD3001;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.2体積%アンモニア(32%)、溶離液B:アセトニトリル、勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
方法6
装置:Waters Acquity UPLC−MS SQD;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7 50×2.1mm;溶離液A:水+0.2体積%アンモニア(32%)、溶離液B:アセトニトリル;勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
装置:Waters Acquity UPLC−MS SQD;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7 50×2.1mm;溶離液A:水+0.2体積%アンモニア(32%)、溶離液B:アセトニトリル;勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
方法7
装置:Waters Acquity UPLC−MS ZQ;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7 50×2.1mm;溶離液A:水+0.1体積%ギ酸(99%)、溶離液B:アセトニトリル;勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
装置:Waters Acquity UPLC−MS ZQ;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7 50×2.1mm;溶離液A:水+0.1体積%ギ酸(99%)、溶離液B:アセトニトリル;勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
方法8:
装置:Waters Acquity UPLCMS SQD;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.2体積%アンモニア(32%)、溶離液B:アセトニトリル;勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
装置:Waters Acquity UPLCMS SQD;カラム:Acquity UPLC BEH C18 1.7μm、50×2.1mm;溶離液A:水+0.2体積%アンモニア(32%)、溶離液B:アセトニトリル;勾配:0−1.6分1−99%B、1.6−2.0分99%B;流量0.8mL/分;温度:60℃;注入:2μL;DAD走査:210−400nm;ELSD。
2−アミノ−4−クロロピリジン(10.1g)のジオキサン(100mL)中溶液を撹拌しながら、それにエトキシカルボニルイソチオシアネート(11.1g)を加えた。混合物を室温で2時間撹拌した。白色固体が沈殿した。ヘキサン(25mL)を加え、白色固体を濾取して、標題化合物8.0gを得た。溶液を減圧下に濃縮し、残留物を酢酸エチルから再結晶して、追加の標題化合物8.5gを得た。
ヒドロキシル塩化アンモニウム(13.9g)をメタノール(70mL)に懸濁させ、エタノール(65mL)およびヒューニッヒ塩基(21.1mL)を室温で加えた。混合物を加熱して60℃とし、エチル[(4−クロロピリジン−2−イル)カルバモチオイル]カーバメート(9.0g)を少量ずつ加え、混合物を60℃で2時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、水(150mL)を加えた。固体を濾取し、エタノールで洗浄し、真空乾燥した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、標題化合物4.2gを得た。
1H−NMR(300MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=6.14(2H)、6.92(1H)、7.50(1H)、8.55(1H)。
7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−アミン(190mg)のトルエン(7mL)およびNMP(0.7mL)中懸濁液を撹拌しながら、それに(4−ブロモ−3−メトキシフェニル)(3−フルオロアゼチジン−1−イル)メタノン(373mg)、クロロ(2−ジシクロヘキシルホスフィノ−2′,4′,6′−トリ−イソ−プロピル−1,1′−ビフェニル)[2−(2−アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)メチル−tert−ブチルエーテル付加物(28mg)、X−Phos(16mg)および粉末リン酸カリウム・1水和物(0.60g)を加え、フラスコを2回脱気し、アルゴンを充填し戻した。混合物を16時間加熱還流した。炭酸カリウムの半飽和溶液を加え、混合物をジクロロメタンおよびメタノールの混合物で抽出した。有機相を脱水し(硫酸ナトリウム)、溶媒を減圧下に除去した。混合物を濾過し、減圧下に濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、標題化合物120mgを得た。
1H−NMR(300MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=3.91(3H)、3.94−4.80(4H)、5.26−5.59(1H)、7.15(1H)、7.23−7.33(2H)、7.82(1H)、8.21−8.36(1H)、8.46(1H)、8.85(1H)。
7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−アミン(300mg)および1−ブロモ−2−メトキシ−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(543mg)を原料として、中間体実施例01.03.の製造手順と同様にして中間体実施例01.04.を製造した。収量:標題化合物236mg。
1H−NMR(300MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=3.18(3H)、3.97(3H)、7.17(1H)、7.44(1H)、7.53(1H)、7.86(1H)、8.43(1H)、8.75(1H)、8.87(1H)。
7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−アミン(100mg)および1−ブロモ−4−(メチルスルホニル)−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)ベンゼン(227mg)を原料として、中間体実施例01.03.の製造手順と同様にして中間体実施例01.05.を製造した。収量:標題化合物50mg。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=3.19(3H)、5.00(2H)、7.18(1H)、7.58−7.71(2H)、7.86(1H)、8.44(1H)、8.70(1H)、8.81−8.92(1H)。
中間体実施例01.06.
{4−[(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル)アミノ]−3−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}(3−フルオロアゼチジン−1−イル)メタノン
{4−[(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル)アミノ]−3−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}(3−フルオロアゼチジン−1−イル)メタノン
7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−アミン(250mg)および[4−ブロモ−3−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル](3−フルオロアゼチジン−1−イル)メタノン(607mg)を原料として、中間体実施例01.03.の製造手順と同様にして中間体実施例01.06.を製造した。収量:標題化合物198mg。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=3.93−4.72(4H)、4.93(2H)、5.32−5.55(1H)、7.16(1H)、7.36−7.43(2H)、7.83(1H)、8.27−8.33(1H)、8.41(1H)、8.81−8.90(1H)。
7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−アミン(190mg)およびアゼチジン−1−イル(4−ブロモ−3−メトキシフェニル)メタノン(350mg)を原料として、中間体実施例01.03.の製造手順と同様にして中間体実施例01.07.を製造した。収量:標題化合物130mg。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=2.27(2H)、3.88−3.94(3H)、3.97−4.47(4H)、7.15(1H)、7.23−7.31(2H)、7.83(1H)、8.28(1H)、8.42(1H)、8.79−8.93(1H)。
ジイソプロピルアミン(13.0g)のテトラヒドロフラン(160mL)中溶液を撹拌しながら、それにn−ブチルリチウムのヘキサン中溶液(51.4mL;c=2.5M)を−78℃で加えた。溶液を0℃で15分間撹拌した。溶液を冷却して−78℃とし、テトラヒドロフラン(40mL)に溶かした(4−フルオロフェニル)酢酸メチル(18.0g)の溶液を加えた。溶液を−78℃で30分間撹拌した。ヨウ化メチル(10.0mL)を−78℃で加え、溶液を1時間以内で昇温させて0℃とした。水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を脱水し(硫酸ナトリウム)、溶媒を減圧下に除去した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、標題化合物18.9gを得た。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6):δ[ppm]=1.34(d、3H)、3.55(s、3H)、3.79(q、1H)、7.08−7.15(m、2H)、7.25−7.32(m、2H)。
中間体実施例02.01.(18.9g)のエタノール(200mL)中溶液を撹拌しながら、それに水(200mL)に溶かした水酸化カリウム(35g)の溶液を加えた。混合物を0℃で4時間撹拌した。pH5に達するまで塩酸(c=4.0M)を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を分離し、溶媒を減圧下に除去して、標題生成物15.64gを得た。粗生成物を、それ以上精製せずに用いた。
1H−NMR(300MHz、DMSO−d6):δ[ppm]=1.31(d、3H)、3.66(q、1H)、7.05−7.15(m、2H)、7.24−7.33(m、2H)、12.30(s、1H)。
中間体実施例02.02.(23.6g)の還流酢酸エチル(250mL)中溶液を撹拌しながら、それに(1S)−1−フェニルエタンアミン(17.35g)の酢酸エチル中溶液を加えた。混合物を1時間以内で放冷して室温とした。白色固体を濾取し、酢酸エチルで洗浄し、真空乾燥して固体27.5gを得た。固体を還流酢酸エチル400mLから再結晶した。混合物を放冷して室温とした。白色固体を濾取し、酢酸エチルで洗浄し、真空乾燥して、固体18.3gを得た。その固体を還流酢酸エチルから2回再結晶化した(350mL;300mL)。白色固体を濾取し、酢酸エチルで洗浄し、真空乾燥して、固体10.51gを得た。その固体を水に溶かし、pH5に達するまで塩酸(c=2.0M)を加え、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。有機相を脱水し(硫酸ナトリウム)、溶媒を減圧下に除去して、標題生成物5.6gを得た。粗生成物を、それ以上精製せずに用いた。
1H−NMR(300MHz、DMSO−d6):δ[ppm]=1.31(d、3H)、3.66(q、1H)、7.05−7.16(m、2H)、7.24−7.33(m、2H)、12.28(brs、1H)。
[α]D 20:−79.3°(DMSO中)。
分析キラルHPLCによるエナンチオマー純度の測定:
カラム:Chiralcel OJ−H 150×4.6;流量:1.00mL/分;溶媒:A:ヘキサン、B:2−プロパノール(0.1%ギ酸含有);溶媒混合物:80%A+20%B。操作時間:30分。保持時間:3.41分;UV254nm;エナンチオマー比:99.8%:0.2%。
カラム:Chiralcel OJ−H 150×4.6;流量:1.00mL/分;溶媒:A:ヘキサン、B:2−プロパノール(0.1%ギ酸含有);溶媒混合物:80%A+20%B。操作時間:30分。保持時間:3.41分;UV254nm;エナンチオマー比:99.8%:0.2%。
4−(4,4,5,5−テトラメチル−1,3,2−ジオキサボロラン−2−イル)アニリン(1.0g)のDMF(45mL)およびジクロロメタン(90mL)中溶液を撹拌しながら、それに重炭酸ナトリウム(766mg)、(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパン酸(844mg)およびHATU(2.6g)を加えた。混合物を室温で4時間撹拌した。水を加え、混合物を30分間撹拌した。重炭酸ナトリウムの半飽和溶液を加え、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、脱水し(硫酸ナトリウム)、溶媒を減圧下に除去した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、標題化合物1.53gを得た。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=1.23(12H)、1.37(3H)、3.74−3.87(1H)、7.06−7.16(2H)、7.31−7.42(2H)、7.51−7.61(4H)、10.12(1H)。
(4−アミノフェニル)ボロン酸塩酸塩(2.00g)のDMF(42mL)中溶液を撹拌しながら、それに重炭酸ナトリウム(2.9g)、(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパン酸(2.04g)およびHATU(6.58g)を加えた。混合物を室温で72時間撹拌した。水(140mL)を加え、混合物を2時間撹拌した。白色沈殿を濾取し、水で洗浄し、真空乾燥して、標題化合物2.86gを得た。
1H−NMR(300MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=1.39(3H)、3.84(1H)、7.08−7.21(2H)、7.35−7.44(2H)、7.52(2H)、7.69(2H)、7.88(2H)、10.07(1H)。
7−ブロモ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−アミン(100mg;CAS−RN[882521−63−3];Allichem LLC, USA;Baltimore, MDから市販;製造はWO2010/020363A1に記載)の1−プロパノール(3mL)中溶液を撹拌しながら、それに炭酸カリウム溶液(0.7mL、c=2M)、(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)ボロン酸(202mg)、トリフェニルホスフィン(12mg)およびPdCl2(PPh3)2(33mg)を加えた。混合物を16時間加熱還流した。追加のトリフェニルホスフィン(12mg)およびPdCl2(PPh3)2(33mg)を加え、混合物をさらに4時間加熱還流した。反応混合物をアミノ相−シリカゲルカラムで濾過し、溶媒を減圧下に除去した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、標題化合物150mgを得た。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=1.42(3H)、3.86(1H)、5.97(2H)、7.08−7.25(3H)、7.35−7.49(2H)、7.58(1H)、7.63−7.83(4H)、8.53(1H)、10.21(1H)。
参考実施例01.01.
(2R)−2−(4−フルオロフェニル)−N−[4−(2−{[2−メトキシ−4−(メチルスルホニル)フェニル]アミノ}[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル)フェニル]プロパンアミド
(2R)−2−(4−フルオロフェニル)−N−[4−(2−{[2−メトキシ−4−(メチルスルホニル)フェニル]アミノ}[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル)フェニル]プロパンアミド
(2R)−N−[4−(2−アミノ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル)フェニル]−2−(4−フルオロフェニル)プロパンアミド(100mg)のトルエン(4mL)およびNMP(0.2mL)中懸濁液を撹拌しながら、それに1−ブロモ−2−メトキシ−4−(メチルスルホニル)ベンゼン(106mg)、クロロ(2−ジシクロヘキシルホスフィノ−2′,4′,6′−トリ−イソ−プロピル−1,1′−ビフェニル)[2−(2−アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)メチル−tert−ブチルエーテル付加物(22mg)、X−Phos(13mg)および粉末リン酸カリウム・1水和物(283mg)を加え、フラスコを2回脱気し、アルゴンを充填し戻した。混合物を16時間加熱還流した。混合物を濾過し、減圧下に濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーと次に分取逆相HPLCによって、標題化合物10mgを得た。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=1.44(3H)、3.20(3H)、3.88(1H)、4.00(3H)、7.12−7.24(2H)、7.40−7.50(4H)、7.56(1H)、7.75(2H)、7.86(2H)、7.92(1H)、8.52(1H)、8.63(1H)、8.86(1H)、10.28(1H)。
参考実施例01.02.
(2R)−N−{4−[2−({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−メトキシフェニル}アミノ)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル]フェニル}−2−(4−フルオロフェニル)プロパンアミド
(2R)−N−{4−[2−({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−メトキシフェニル}アミノ)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル]フェニル}−2−(4−フルオロフェニル)プロパンアミド
{4−[(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル)アミノ]−3−メトキシフェニル}(3−フルオロアゼチジン−1−イル)メタノン(110mg)のトルエン(4.0mL)およびNMP(0.4mL)中懸濁液を撹拌しながら、それに(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)ボロン酸(126mg)、粉末リン酸カリウム・1水和物(248mg)、ジシクロヘキシル(2′,6′−ジメトキシビフェニル−2−イル)ホスフィン(24mg)およびPd(OAc)2(6.6mg)を加え、フラスコを2回脱気し、アルゴンを充填し戻した。混合物を2時間加熱還流した。反応混合物を濾過し、溶媒を減圧下に除去した。アミノ相シリカゲルクロマトグラフィーによって固体を得て、それをエーテルで磨砕して、標題化合物150mgを得た。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=1.44(3H)、3.82−3.98(4H)、3.98−4.77(4H)、5.31−5.59(1H)、7.18(2H)、7.24−7.35(2H)、7.37−7.50(3H)、7.75(2H)、7.80−7.95(3H)、8.29−8.48(2H)、8.83(1H)、10.27(1H)。
参考実施例01.03.
(2R)−N−{4−[2−({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}アミノ)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル]フェニル}−2−(4−フルオロフェニル)プロパンアミド
(2R)−N−{4−[2−({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}アミノ)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル]フェニル}−2−(4−フルオロフェニル)プロパンアミド
{4−[(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル)アミノ]−3−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}(3−フルオロアゼチジン−1−イル)メタノン(70mg)および(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)ボロン酸(61mg)を原料として、参考実施例01.02の製造手順と同様にして参考実施例01.03.を製造した。収量:標題化合物73mg。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=1.44(3H)、3.89(1H)、3.96−4.76(4H)、4.96(2H)、5.34−5.59(1H)、7.13−7.22(2H)、7.39−7.48(5H)、7.75(2H)、7.81−7.87(2H)、7.89(1H)、8.28(1H)、8.38−8.44(1H)、8.84(1H)、10.28(1H)。
参考実施例01.04.
(2R)−2−(4−フルオロフェニル)−N−(4−{2−[(6−メトキシ−1,1−ジオキシド−2,3−ジヒドロ−1−ベンゾチオフェン−5−イル)アミノ][1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル}フェニル)プロパンアミド
(2R)−2−(4−フルオロフェニル)−N−(4−{2−[(6−メトキシ−1,1−ジオキシド−2,3−ジヒドロ−1−ベンゾチオフェン−5−イル)アミノ][1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル}フェニル)プロパンアミド
参考実施例01.04.の化合物は、本明細書に記載の方法と同様にして製造することができる。
参考実施例01.05.
(2R)−2−(4−フルオロフェニル)−N−[4−(2−{[4−(メチルスルホニル)−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル]アミノ}[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル)フェニル]プロパンアミド
(2R)−2−(4−フルオロフェニル)−N−[4−(2−{[4−(メチルスルホニル)−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル]アミノ}[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル)フェニル]プロパンアミド
7−クロロ−N−[4−(メチルスルホニル)−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル][1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−アミン(50mg)および(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)ボロン酸(51mg)を原料として、参考実施例01.02の製造手順と同様にして参考実施例01.05.を製造した。収量:標題化合物20mg。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=1.42(3H)、3.19(3H)、3.87(1H)、5.02(2H)、7.12−7.20(2H)、7.39−7.46(3H)、7.62−7.67(2H)、7.74(2H)、7.81−7.88(2H)、7.91(1H)、8.53(1H)、8.60(1H)、8.85(1H)、10.27(1H)。
参考実施例01.06.
(2R)−N−[4−(2−{[4−(アゼチジン−1−イルカルボニル)−2−メトキシフェニル]アミノ}[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル)フェニル]−2−(4−フルオロフェニル)プロパンアミド
(2R)−N−[4−(2−{[4−(アゼチジン−1−イルカルボニル)−2−メトキシフェニル]アミノ}[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−7−イル)フェニル]−2−(4−フルオロフェニル)プロパンアミド
アゼチジン−1−イル{4−[(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル)アミノ]−3−メトキシフェニル}メタノン(120mg)および(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)ボロン酸(144mg)を原料として、参考実施例01.02の製造手順と同様にして参考実施例01.06.を製造した。収量:標題化合物30mg。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6)、δ[ppm]=1.42(3H)、2.25(2H)、3.82−3.94(4H)、4.03(2H)、4.36(2H)、7.12−7.20(2H)、7.22−7.29(2H)、7.35−7.46(3H)、7.73(2H)、7.80−7.89(3H)、8.29(1H)、8.33(1H)、8.81(1H)、10.26(1H)。
中間体実施例IntP01.01
クロロメチル(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル){4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}カーバメート
クロロメチル(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル){4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}カーバメート
{4−[(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル)アミノ]−3−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}(3−フルオロアゼチジン−1−イル)メタノン(120mg)のTHF(6mL)およびNMP(2.8mL)中溶液を撹拌しながら、それに室温で水素化ナトリウム(オイル中55重量%;59mg)を加え、混合物を15分間撹拌した。クロルギ酸クロロメチル(61μL)を0℃で加え、混合物を室温で1時間撹拌した。塩化アンモニウムの半飽和溶液を加え、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を脱水し(硫酸ナトリウム)、溶媒を減圧下に除去した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、標題化合物75mgを得た。
N−(tert−ブトキシカルボニル)−3−メチル−L−バリン(4.08g)のメタノール(36mL)中溶液を撹拌しながら、それにpH7に達するまで炭酸セシウム水溶液を加え(炭酸セシウム約2.85gの水(36mL)中溶液)、溶液を30分間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、トルエンを加え、溶媒を減圧下に再度除去して、標題化合物6.34gを得た。
中間体実施例IntP01.03
{[(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル){4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}カルバモイル]オキシ}メチルN−(tert−ブトキシカルボニル)−3−メチル−L−バリネート
{[(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル){4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}カルバモイル]オキシ}メチルN−(tert−ブトキシカルボニル)−3−メチル−L−バリネート
クロロメチル(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル){4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}カーバメート(70mg)のDMF(3.0mL)中溶液を撹拌しながら、それに(2S)−2−[(tert−ブトキシカルボニル)アミノ]−3,3−ジメチルブタン酸セシウム(109mg)を加え、混合物を室温で72時間撹拌した。塩化アンモニウムの半飽和溶液を加え、混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、脱水し(硫酸ナトリウム)、溶媒を減圧下に除去した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、標題化合物68mgを得た。
中間体実施例IntP01.04
[({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}[7−(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル]カルバモイル)オキシ]メチルN−(tert−ブトキシカルボニル)−3−メチル−L−バリネート
[({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}[7−(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル]カルバモイル)オキシ]メチルN−(tert−ブトキシカルボニル)−3−メチル−L−バリネート
{[(7−クロロ[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル){4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}カルバモイル]オキシ}メチルN−(tert−ブトキシカルボニル)−3−メチル−L−バリネート(65mg)のトルエン(1.6mL)およびNMP(0.16mL)中溶液を撹拌しながら、それに(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)ボロン酸(34.5mg)、粉末リン酸カリウム・1水和物(68mg)、ジシクロヘキシル(2′,6′−ジメトキシビフェニル−2−イル)ホスフィン(6.6mg)および酢酸パラジウム(3.6mg)を加え、フラスコを2回脱気し、アルゴンを充填し戻した。混合物を加熱して100℃として20分間経過させた。反応混合物をシリカゲルカラムで濾過し、溶媒を減圧下に除去して固体を得て、それをヘキサンおよびジクロロメタンの混合物で磨砕して、標題化合物47mgを得た。
本発明の化合物
実施例1.1.
[({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}[7−(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル]カルバモイル)オキシ]メチル3−メチル−L−バリネート塩酸塩
実施例1.1.
[({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}[7−(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル]カルバモイル)オキシ]メチル3−メチル−L−バリネート塩酸塩
[({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}[7−(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル]カルバモイル)オキシ]メチルN−(tert−ブトキシカルボニル)−3−メチル−L−バリネート(44mg)のジクロロメタン(1mL)およびメタノール(0.3mL)中溶液を撹拌しながら、それに塩酸のジオキサン中溶液(0.24mL;c=4.0M)を加えた。混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去した。固体残留物をジクロロメタンおよびヘキサンの混合物で3回磨砕し、各回において溶媒を除去し、固体を真空乾燥して、標題化合物32mgを得た。
1H−NMR(400MHz、DMSO−d6):δ[ppm]=0.94−1.01(m、9H)、1.41(d、3H)、3.82−3.96(m、2H)、3.99−4.19(m、1H)、4.31−4.69(m、3H)、4.83(q、2H)、5.33−5.56(m、1H)、5.85(d、1H)、5.95(d、1H)、7.11−7.19(m、2H)、7.33−7.47(m、5H)、7.52(dd、1H)、7.71−7.85(m、4H)、7.97(d、1H)、8.44(d、3H)、8.86(d、1H)、10.38(s、1H)。
LC−MS(方法2):Rt=1.15分;MS(ESIポジティブ)m/z=838[M+H]+。
生物アッセイ:増殖アッセイ
培養腫瘍細胞(MCF7、ホルモン依存性ヒト乳癌細胞、ATCC HTB22;NCI−H460、ヒト非小細胞肺癌細胞、ATCC HTB−177;DU145、ホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞、ATCC HTB−81;HeLa−MaTu、ヒト子宮頸癌細胞、EPO−GmbH、ベルリン;HeLa−MaTu−ADR、多剤耐性ヒト子宮頸癌細胞、EPO−GmbH、ベルリン;HeLaヒト頸部腫瘍細胞、ATCC CCL−2;B16F10マウスメラノーマ細胞、ATCC CRL−6475)を10%ウシ胎児血清を補充したそれぞれの増殖培地200μLに96ウェルマルチタイタープレート中5000個細胞/ウェル(MCF7、DU145、HeLa−MaTu−ADR)、3000個細胞/ウェル(NCI−H460、HeLa−MaTu、HeLa)または1000個細胞/ウェル(B16F10)の密度で蒔いた。24時間後、1プレート(0ポイントプレート)の細胞をクリスタルバイオレットで染色し(以下参照)、他のプレートの培地を、試験物質を種々の濃度(0μM、ならびに0.01から30μMの範囲;溶媒ジメチルスルホキシドの最終濃度は0.5%とした)で添加した新鮮な培養培地(200μL)に取り替えた。細胞を試験物質の存在下で4日間インキュベートした。細胞をクリスタルバイオレットで染色することによって細胞増殖を測定した:室温で15分間、20μL/測定点の11%グルタルアルデヒド溶液を添加することによって細胞を固定した。固定細胞の水による3回洗浄サイクル後、プレートを室温で乾燥させた。100μL/測定点の0.1%クリスタルバイオレット溶液(pH3.0)を添加することによって細胞を染色した。染色細胞の水による3回洗浄サイクル後、プレートを室温で乾燥させた。100μL/測定点の10%酢酸溶液を添加することによって染料を溶解した。595nmの波長での測光によって吸光度を測定した。測定値を0ポイントプレート(=0%)の吸光度および未処理(0μm)細胞(=100%)の吸光度値に正規化することによって、細胞数の変化(%)を計算した。4パラメータ適合によってIC50値を測定した。
培養腫瘍細胞(MCF7、ホルモン依存性ヒト乳癌細胞、ATCC HTB22;NCI−H460、ヒト非小細胞肺癌細胞、ATCC HTB−177;DU145、ホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞、ATCC HTB−81;HeLa−MaTu、ヒト子宮頸癌細胞、EPO−GmbH、ベルリン;HeLa−MaTu−ADR、多剤耐性ヒト子宮頸癌細胞、EPO−GmbH、ベルリン;HeLaヒト頸部腫瘍細胞、ATCC CCL−2;B16F10マウスメラノーマ細胞、ATCC CRL−6475)を10%ウシ胎児血清を補充したそれぞれの増殖培地200μLに96ウェルマルチタイタープレート中5000個細胞/ウェル(MCF7、DU145、HeLa−MaTu−ADR)、3000個細胞/ウェル(NCI−H460、HeLa−MaTu、HeLa)または1000個細胞/ウェル(B16F10)の密度で蒔いた。24時間後、1プレート(0ポイントプレート)の細胞をクリスタルバイオレットで染色し(以下参照)、他のプレートの培地を、試験物質を種々の濃度(0μM、ならびに0.01から30μMの範囲;溶媒ジメチルスルホキシドの最終濃度は0.5%とした)で添加した新鮮な培養培地(200μL)に取り替えた。細胞を試験物質の存在下で4日間インキュベートした。細胞をクリスタルバイオレットで染色することによって細胞増殖を測定した:室温で15分間、20μL/測定点の11%グルタルアルデヒド溶液を添加することによって細胞を固定した。固定細胞の水による3回洗浄サイクル後、プレートを室温で乾燥させた。100μL/測定点の0.1%クリスタルバイオレット溶液(pH3.0)を添加することによって細胞を染色した。染色細胞の水による3回洗浄サイクル後、プレートを室温で乾燥させた。100μL/測定点の10%酢酸溶液を添加することによって染料を溶解した。595nmの波長での測光によって吸光度を測定した。測定値を0ポイントプレート(=0%)の吸光度および未処理(0μm)細胞(=100%)の吸光度値に正規化することによって、細胞数の変化(%)を計算した。4パラメータ適合によってIC50値を測定した。
Mps−1キナーゼアッセイ
ヒトキナーゼMps−1はビオチン化基質ペプチドをリン酸化する。リン酸化産物の検出は、供与体としてのユーロピウム標識抗ホスホセリン/トレオニン抗体から受容体としての架橋アロフィコシアニン(SA−XLent)で標識したストレプトアビジンへの時間分解蛍光共鳴エネルギー転移(TR−FRET)によって行う。化合物をキナーゼ活性の阻害について試験する。
ヒトキナーゼMps−1はビオチン化基質ペプチドをリン酸化する。リン酸化産物の検出は、供与体としてのユーロピウム標識抗ホスホセリン/トレオニン抗体から受容体としての架橋アロフィコシアニン(SA−XLent)で標識したストレプトアビジンへの時間分解蛍光共鳴エネルギー転移(TR−FRET)によって行う。化合物をキナーゼ活性の阻害について試験する。
N末端GST標識ヒト全長組換えMps−1キナーゼ(Invitrogen、Karslruhe、ドイツから購入、カタログ番号PV4071)を使用した。キナーゼ反応の基質として、アミノ酸配列PWDPDDADITEILG(アミド型のC末端、Biosynthan GmbH、ベルリンから購入)のビオチン化ペプチドを使用した。
アッセイのために、試験化合物のDMSO中100倍濃縮溶液50nLを黒色低容積384ウェルマイクロタイタープレート(Greiner Bio−One、Frickenhausen、ドイツ)にピペットで入れて、Mps−1のアッセイ緩衝液[0.1mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mM MgCl2、2mM DTT、25mM Hepes pH7.7、0.05%BSA、0.001%Pluronic F−127]中溶液2μLを添加し、混合物を22℃で15分間インキュベートして、キナーゼ反応の開始前に試験化合物とMps−1の予備結合を可能にした。次いで、16.7アデノシン三リン酸(ATP、16.7μM⇒5μLアッセイ体積中最終濃度は10μMである)およびペプチド基質(1.67μM⇒5μLアッセイ体積中最終濃度は1μMである)のアッセイ緩衝液中溶液3μLを添加することによってキナーゼ反応を開始し、得られた混合物を22℃で60分の反応時間インキュベートした。アッセイにおけるMps−1の濃度は酵素のロットの活性に応じて調整し、線形範囲のアッセイを有するよう適当に選択し、代表的な濃度は約1nM(5μLのアッセイ体積中最終濃度)の範囲にあった。HTRF検出試薬の溶液(100mM Hepes pH7.4、0.1%BSA、40mM EDTA、140nMストレプトアビジン−XLent[#61GSTXLB、Fa. Cis Biointernational、Marcoule、フランス]、1.5nM抗ホスホ(Ser/Thr)−ユーロピウム抗体[#AD0180、PerkinElmer LAS、Rodgau−Jugesheim、ドイツ]3μLを添加することによって反応を停止した。
得られた混合物を22℃で1時間インキュベートしてリン酸化ペプチドと抗ホスホ(Ser/Thr)−ユーロピウム抗体を結合させた。その後、ユーロピウム標識抗ホスホ(Ser/Thr)抗体からストレプトアビジン−XLentへの共鳴エネルギーを測定することによって、リン酸化基質の量を評価した。そのため、350nmでの励起後の620nmおよび665nmでの蛍光発光をViewlux TR−FRETリーダー(PerkinElmer LAS、Rodgau−Jugesheim、ドイツ)で測定した。「ブランク補正正規化比」(Viewlux固有の読み取り値、665nmおよび622nmでの発光の従来の比と類似のもの、ここでは比を計算する前にブランクおよびEu供与体のクロストークを、665nmシグナルから減じる)をリン酸化基質の量の尺度とみなした。データを正規化した(阻害剤を用いない酵素反応=0%阻害、酵素を用いない全ての他のアッセイ成分=100%阻害)。試験化合物を、20μMから1nMの範囲の10の異なる濃度で(20μM、6.7μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM、82nM、27nM、9.2nM、3.1nMおよび1nM、希釈系列は、連続1:3希釈により100倍濃縮原液のレベルでアッセイの前に調製)、各濃度につき二連の値で同じマイクロタイタープレートで試験し、4パラメータ適合によりIC50値を計算した。
紡錘体形成チェックポイントアッセイ
紡錘体形成チェックポイントにより、有糸分裂中の適切な染色体分離が確保される。有糸分裂に入ると、染色体が凝縮し始め、これはセリン10上のヒストンH3のリン酸化によって達成される。セリン10上のヒストンH3の脱リン酸化は分裂後期に始まり、分裂終期の初期に終了する。したがって、セリン10上のヒストンH3のリン酸化を有糸分裂中の細胞のマーカーとして利用することができる。ノコダゾールは、微小管不安定化物質である。例えば、ノコダゾールは微小管動態に干渉し、紡錘体形成チェックポイントを起動する。細胞はG2/M移行で有糸分裂に停止し、セリン10上のリン酸化ヒストンH3を示す。Mps−1阻害剤による紡錘体形成チェックポイントの阻害は、ノコダゾールの存在下で有糸分裂妨害を無効化し、細胞が有糸分裂を早期に完了する。この変化は、セリン10上のヒストンH3のリン酸化を有する細胞の減少によって検出される。この減少を、本発明の化合物が有糸分裂急進を誘発する能力を決定するためのマーカーとして使用する。
紡錘体形成チェックポイントにより、有糸分裂中の適切な染色体分離が確保される。有糸分裂に入ると、染色体が凝縮し始め、これはセリン10上のヒストンH3のリン酸化によって達成される。セリン10上のヒストンH3の脱リン酸化は分裂後期に始まり、分裂終期の初期に終了する。したがって、セリン10上のヒストンH3のリン酸化を有糸分裂中の細胞のマーカーとして利用することができる。ノコダゾールは、微小管不安定化物質である。例えば、ノコダゾールは微小管動態に干渉し、紡錘体形成チェックポイントを起動する。細胞はG2/M移行で有糸分裂に停止し、セリン10上のリン酸化ヒストンH3を示す。Mps−1阻害剤による紡錘体形成チェックポイントの阻害は、ノコダゾールの存在下で有糸分裂妨害を無効化し、細胞が有糸分裂を早期に完了する。この変化は、セリン10上のヒストンH3のリン酸化を有する細胞の減少によって検出される。この減少を、本発明の化合物が有糸分裂急進を誘発する能力を決定するためのマーカーとして使用する。
ヒト頸部腫瘍細胞系HeLa(ATCC CCL−2)の培養細胞を1%(体積基準)グルタミン、1%(体積基準)ペニシリン、1%(体積基準)ストレプトマイシンおよび10%(体積基準)ウシ胎児血清を補充した2μLダルベッコ培地(w/oフェノールレッド、w/oピルビン酸ナトリウム、w 1000mg/mLグルコース、w ピリドキシン)に384ウェルマイクロタイタープレート中2500個細胞/ウェルの密度で蒔いた。37℃で一晩のインキュベーション後、0.1μg/mLの最終濃度の10μL/ウェルノコダゾールを細胞に添加した。24時間のインキュベーション後、細胞を細胞周期進行のG2/M期で停止した。ジメチルスルホキシド(DMSO)に可溶化した試験化合物を種々の濃度(0μM、ならびに0.005μMから10μMの範囲;溶媒DMSOの最終濃度は0.5%(体積基準)でとした)で添加した。細胞を試験化合物の存在下37℃で4時間インキュベートした。その後、細胞を4℃で一晩リン酸緩衝食塩水(PBS)中4%(体積基準)パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、室温で20分間PBS中0.1%(体積基準)Triton X(商標)100で透過処理し、室温で15分間PBS中0.5%(体積基準)ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックした。PBSで洗浄した後、20μL/ウェルの抗体溶液(抗ホスホヒストンH3クローン3H10、FITC;Upstate、カタログ番号16−222;1:200希釈)を細胞に添加し、これを室温で2時間インキュベートした。その後、細胞をPBSで洗浄し、20μL/ウェルのHOECHST33342染料溶液(5μg/mL)を細胞に添加し、細胞を暗所中室温で12分間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、次いで、PBSで覆い、分析まで4℃で保管した。Perkin Elmer OPERA(商標名)High−Content Analysisリーダーを用いて画像を取得した。Cell Cycleアプリケーションモジュールを利用してMolecular devices製の画像解析ソフトウェアMetaXpress(商標名)を用いて画像を解析した。このアッセイでは、HOECHST33342とセリン10上のリン酸化ヒストンH3の両標識を測定した。HOECHST33342はDNAを標識するので、細胞数を計数するために使用する。セリン10上のリン酸化ヒストンH3の染色により、有糸分裂細胞の数を測定する。Mps−1の阻害により、不適切な有糸分裂進行を示すノコダゾールの存在下での有糸分裂数が減少する。4パラメータロジスティック回帰分析によって各試験化合物についてのIC50値を決定することにより、アッセイの生データをさらに分析した。
pH7.4の緩衝液中での安定性
試験化合物0.3mgをジメチルスルホキシド0.1mLおよびアセトニトリル0.4mLに溶解する。完全に溶解するために、試料溶液を含むHPLCバイアルを約20秒間超音波処理する(sonified)。次いで、緩衝液1.0mLを添加し、試料を再度超音波浴で処理する。
試験化合物0.3mgをジメチルスルホキシド0.1mLおよびアセトニトリル0.4mLに溶解する。完全に溶解するために、試料溶液を含むHPLCバイアルを約20秒間超音波処理する(sonified)。次いで、緩衝液1.0mLを添加し、試料を再度超音波浴で処理する。
緩衝液の調製
塩化ナトリウム90g、リン酸二水素カリウム13.61gおよび1M水酸化ナトリウム溶液83.35gをMillipore水を用いて1リットルにし、次いで、1:10希釈する。
塩化ナトリウム90g、リン酸二水素カリウム13.61gおよび1M水酸化ナトリウム溶液83.35gをMillipore水を用いて1リットルにし、次いで、1:10希釈する。
試料溶液の10μL分をHPLCによって分析して37℃で24時間の期間にわたって試験化合物の量を測定する。ピーク面積(%)を定量に使用する。
HPLC法:
DAD(G1315B)、バイナリポンプ(G1312A)、オートサンプラ(G1329A)、カラムオーブン(G1316A)、サーモスタット(G1330B)を備えるAgilent 1100;カラム:Kromasil 100 C18、250mm×4mm、5μm;カラム温度:37℃;溶離液A:水+過塩素酸5mL/リットル、溶離液B:アセトニトリル。
DAD(G1315B)、バイナリポンプ(G1312A)、オートサンプラ(G1329A)、カラムオーブン(G1316A)、サーモスタット(G1330B)を備えるAgilent 1100;カラム:Kromasil 100 C18、250mm×4mm、5μm;カラム温度:37℃;溶離液A:水+過塩素酸5mL/リットル、溶離液B:アセトニトリル。
勾配:
0分98%A、2%B→0から3.0分85%A、15%B→3.0から8.0分50%A、50%B→8.0から16.0分50%A、50%B→16.0から20.0分10%A、90%B→20.0から21.0 10%A、90%B→21.0から24.0分98%A、2%B→24.0から25.0分98%A、2%B;流量:1.5mL/分;UV検出:210nm。
0分98%A、2%B→0から3.0分85%A、15%B→3.0から8.0分50%A、50%B→8.0から16.0分50%A、50%B→16.0から20.0分10%A、90%B→20.0から21.0 10%A、90%B→21.0から24.0分98%A、2%B→24.0から25.0分98%A、2%B;流量:1.5mL/分;UV検出:210nm。
開始時のピーク面積に対する異なる時点でのピーク面積(F)の比を代表的な実施例について表1に示す。
ラットおよびヒト血漿中のイン・ビトロ安定性(HPLC検出)
試験化合物1mgをジメチルスルホキシド1.25mLに溶解する。次いで、水1.25mLを添加する。この試料溶液0.5mLをヘパリン化した37℃の温血漿0.5mL(wistarラット血漿またはヒト血漿)と混合する。直ちに最初の試料(10μL)をHPLC分析用に採取する。インキュベーション開始最大4時間後の期間に、10μL小分けサンプルを30、60、90、120および240分後に採取し、試験化合物の量を測定する。
試験化合物1mgをジメチルスルホキシド1.25mLに溶解する。次いで、水1.25mLを添加する。この試料溶液0.5mLをヘパリン化した37℃の温血漿0.5mL(wistarラット血漿またはヒト血漿)と混合する。直ちに最初の試料(10μL)をHPLC分析用に採取する。インキュベーション開始最大4時間後の期間に、10μL小分けサンプルを30、60、90、120および240分後に採取し、試験化合物の量を測定する。
HPLC法:
DAD(G1315A)、バイナリポンプ(G1312A)、オートサンプラ(G1329A)、カラムオーブン(G1316A)、サーモスタット(G1330B)を備えるAgilent 1100;カラム:Kromasil 100 C18、250mm×4mm、5μm;カラム温度:45℃;溶離液A:水+過塩素酸5mL/リットル、溶離液B:アセトニトリル。
DAD(G1315A)、バイナリポンプ(G1312A)、オートサンプラ(G1329A)、カラムオーブン(G1316A)、サーモスタット(G1330B)を備えるAgilent 1100;カラム:Kromasil 100 C18、250mm×4mm、5μm;カラム温度:45℃;溶離液A:水+過塩素酸5mL/リットル、溶離液B:アセトニトリル。
勾配:
0分98%A、2%B→0から3.0分85%A、15%B→3.0から8.0分55%A、45%B→8.0から16.0分55%A、45%B→16.0から20.0分10%A、90%B→20.0から21.0 10%A、90%B→21.0から24.0分98%A、2%B→24.0から25.0分98%A、2%B;流量:1.5mL/分;UV検出:222nm。
0分98%A、2%B→0から3.0分85%A、15%B→3.0から8.0分55%A、45%B→8.0から16.0分55%A、45%B→16.0から20.0分10%A、90%B→20.0から21.0 10%A、90%B→21.0から24.0分98%A、2%B→24.0から25.0分98%A、2%B;流量:1.5mL/分;UV検出:222nm。
開始時のピーク面積に対するそれぞれの時点でのピーク面積(F)の比は残りの親化合物を示すので、記載される実験条件下での安定性を示している。
イン・ビトロでの代謝安定性の測定
(肝臓インビボ血液クリアランス(CL)および最大経口バイオアベイラビリティ(Fmax)の計算を含む)
イン・ビトロでの試験化合物の代謝安定性を、0.5mg/mLのタンパク質濃度および37℃において、1μMの試験化合物を100mMリン酸緩衝液、pH7.4(NaH2PO4×H2O+Na2HPO4×2H2O)中で懸濁肝ミクロソームと共にインキュベートすることによって測定した。リン酸緩衝液、pH7.4中に1.2mg NADP、3IUグルコース−6−リン酸脱水素酵素、14.6mgグルコース−6−リン酸および4.9mg MgCl2を含有する補因子混合物を添加することによって反応を活性化した。
(肝臓インビボ血液クリアランス(CL)および最大経口バイオアベイラビリティ(Fmax)の計算を含む)
イン・ビトロでの試験化合物の代謝安定性を、0.5mg/mLのタンパク質濃度および37℃において、1μMの試験化合物を100mMリン酸緩衝液、pH7.4(NaH2PO4×H2O+Na2HPO4×2H2O)中で懸濁肝ミクロソームと共にインキュベートすることによって測定した。リン酸緩衝液、pH7.4中に1.2mg NADP、3IUグルコース−6−リン酸脱水素酵素、14.6mgグルコース−6−リン酸および4.9mg MgCl2を含有する補因子混合物を添加することによって反応を活性化した。
インキュベーション中の有機溶媒を0.2%未満のジメチルスルホキシド(DMSO)および1%未満のメタノールに限定した。インキュベーション中、ミクロソーム懸濁物を連続的に振盪し、一定分量を2、8、16、30、45および60分にとり、これに等体積の冷メタノールを直ちに添加した。試料を−20℃で一晩凍結し、その後3000rpmで15分間遠心分離し、上清をLCMS/MS検出を有するAgilent 1200 HPLCシステムによって分析した。
試験化合物の半減期を濃度−時間プロットから決定した。半減期から、固有クリアランスを計算した。追加のパラメータである肝血流、特定の肝臓重量およびミクロソームタンパク質含量と一緒に、肝臓インビボ血液クリアランス(CL)および最大経口生物学的利用能(Fmax)を異なる種について計算した。以下のパラメータ値を使用した:肝血流−1.3リットル/時間/kg(ヒト)、2.1リットル/時間/kg(イヌ)、4.2リットル/時間/kg(ラット);特定の肝臓重量−21g/kg(ヒト)、39g/kg(イヌ)、32g/kg(ラット);ミクロソームタンパク質含量−40mg/g。
記載のアッセイでは、ミクロソームの第I相代謝のみ、例えば、代表的にはチトクロムP450酵素およびフラビンモノオキシゲナーゼ(FMO)による酸化還元反応ならびにエステラーゼによる加水分解反応(エステルおよびアミド)が反映される。
Claims (11)
- RAが、
R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−CH2−O−C(=O)−、
R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−C(H)(CH3)−O−C(=O)−、
および
R6−C(R3)(NH2)−C(=O)−O−C(H)(C(H)(CH3)2)−O−C(=O)−
から選択される基を表す請求項1に記載の化合物。 - [({4−[(3−フルオロアゼチジン−1−イル)カルボニル]−2−(2,2,2−トリフルオロエトキシ)フェニル}[7−(4−{[(2R)−2−(4−フルオロフェニル)プロパノイル]アミノ}フェニル)[1,2,4]トリアゾロ[1,5−a]ピリジン−2−イル]カルバモイル)オキシ]メチル3−メチル−L−バリネート;
または該化合物のN−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、またはそれらの混合物である、請求項1に記載の化合物。 - 疾患の治療または予防に使用するための、請求項1から6のいずれか1項に記載の化合物または該化合物のN−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、特にはそれの医薬として許容される塩、またはそれらの混合物。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載の化合物または該化合物のN−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、特にはそれの医薬として許容される塩、またはそれらの混合物、ならびに医薬として許容される希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物。
- 疾患の予防または治療のための、請求項1から6のいずれか1項に記載の化合物または該化合物のN−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、特にはそれの医薬として許容される塩、またはそれらの混合物の使用。
- 疾患の予防または治療のための医薬を製造するための、請求項1から6のいずれか1項に記載の化合物または該化合物のN−オキサイド、水和物、溶媒和物もしくは塩、特にはそれの医薬として許容される塩、またはそれらの混合物の使用。
- 前記疾患が、制御されない細胞成長、増殖および/または生存、不適当な細胞免疫応答、または不適当な細胞炎症応答の疾患、特には制御されない細胞成長、増殖および/または生存、不適当な細胞免疫応答、または不適当な細胞炎症反応にMps−1が介在している疾患、さらに特に、制御されない細胞成長、増殖および/または生存、不適当な細胞免疫応答、または不適当な細胞炎症応答の疾患が血液腫瘍、固形腫瘍および/またはそれらの転移である疾患、例えば、血液系腫瘍、固形腫瘍および/またはこれらの転移、例えば、白血病および骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、頭頸部腫瘍(脳腫瘍および脳転移を含む)、胸部腫瘍(非小細胞および小細胞肺腫瘍を含む)、胃腸腫瘍、内分泌腫瘍、乳房および他の婦人科腫瘍、泌尿器腫瘍(腎臓、膀胱および前立腺腫瘍を含む)、皮膚腫瘍、および肉腫、および/またはこれらの転移である請求項7、9または10に記載の使用。
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