CN113337645A - 鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重pcr检测试剂盒 - Google Patents

鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂盒，其中试剂组合包括针对鸭坦布苏病毒的引物、针对新型鸭呼肠孤病毒的引物、针对新型鹅细小病毒的引物、DreamTaq Green PCR预混液、谷氨酰胺和扩增促进剂，各类引物的序列如下：针对DTMUV的引物：上游：5’‑GCAGGGTTTGAAGCTGAAAG‑3’；下游：5’‑CCCACTTCTATGCCACTGGT‑3’；针对NDRV的引物：上游：5’‑TCGTCACTACTGTCAAGCTC‑3’；下游：5’‑TATGTATGAGAGGAGCCACA‑3’；针对NGPV的引物：上游：5’‑GGCTCACTGAGAACCGAGAC‑3’；下游：5’‑AGACCCTCCCAAAATTGCTT‑3’。本发明通过建立新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒和鸭坦布苏病毒的同步快速检测技术，对鸭群进行新型呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒的检疫净化，能提高核心鸭群的生产能力，减少疫病的发生，促进我国养鸭业健康发展。

Description

鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重 PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂盒。
背景技术
水禽产业是近年来我国畜禽行业中增长速度最快的产业之一，我国目前已经是世界上最大的水禽养殖国家，饲养量占据世界总量的75%以上，同时也是水禽消费的最大国家，养鸭业作为水禽产业的一部分，发展迅猛，已成为家禽产业中最具生命力的产业。随着我省养鸭业的迅速发展，制约水禽发展的传染病已成为其发展的大敌。病毒性传染病特别是新发病毒病严重制约了我国养鸭业的健康稳定发展。近年来，在我国养鸭业出现的新型番鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒、新型黄病毒感染，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，开展鸭新发病毒病的探索研究己日趋重要。新型鸭呼肠孤病毒病(New-type duckreovirus disease, NDRVD)是由新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck reovirus, NDRV)引起的一种以以肝脏出血坏死、脾脏肿大坏死为特征的新疫病，各个品种鸭均可发生，临床主要表现为雏鸭出雏率降低，免疫抑制和生长障碍等，新型鸭呼肠孤病毒感染自陈少莺等首次报道以来，现已在我国分布非常广泛，并已成为近几年养鸭业的一种危害严重的传染病。鸭短喙-侏儒综合征(Duck beak atrophy and dwarfism syndrome，BADS)是由新型鹅细小病毒(Novel GPV-related virus，NGPV)引起的一种新发传染病，其典型的临床症状为软脚、短嘴和生长障碍。该病自2015年在福建部分地区的半番鸭爆发，随后陆续在山东省、河南省、安徽省和江西省的半番鸭和樱桃谷鸭中出现，僵鸭淘汰率高达80%，给养鸭业造成巨大的经济损失。鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu virus disease, DTMUVD)是由新型黄病毒--鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)引起的一种以蛋鸭产蛋骤降、肉鸭或育成鸭出现神经症状为主要特征的急性传染病。该病自2010年在我国江苏、福建、浙江等省份陆续发生，并迅速蔓延至我国各个主要养鸭省市，现我省鸭坦布苏病毒感染严重，黄瑜等对江西省26养殖场进行了鸭坦布苏病毒感染，其中有21个场检测出DTMUV阳性，该病给养鸭业造成了严重的经济损失。
新型鸭呼肠孤病毒病、鸭短喙-侏儒综合征、鸭坦布苏病毒病等新发传染病疾病已成为危害水禽发展的重要传染病，这三种鸭病均是极大危害养鸭业经济效益的常发鸭病毒性传染病，而且这三种新发病毒性传染病混合感染严重，多种病原共感染对养鸭业的危害严重，鸭群一旦发病，发病率高、死亡率高，因此，及时准确地诊断对控制这些疾病具有非常重要的意义。目前的方法一次试验只能检测一种病毒，如需检测多种病毒要做多次检测，不仅费时费力，还可能造成误诊。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明建立了一种可准确检测鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒单一或混合感染的多重PCR检测试剂盒和检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒中的检测试剂组合包括针对鸭坦布苏病毒的引物、针对新型鸭呼肠孤病毒的引物、针对新型鹅细小病毒的引物、DreamTaq Green PCR 预混液、谷氨酰胺和扩增促进剂，各类引物的序列如下：
针对鸭坦布苏病毒(DTMUV)的引物：
上游：5’-GCAGGGTTTGAAGCTGAAAG-3’；
下游：5’-CCCACTTCTATGCCACTGGT-3’；
针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的引物：
上游：5’-TCGTCACTACTGTCAAGCTC-3’；
下游：5’-TATGTATGAGAGGAGCCACA-3’；
针对新型鹅细小病毒(NGPV)的引物：
上游：5’-GGCTCACTGAGAACCGAGAC-3’；
下游：5’-AGACCCTCCCAAAATTGCTT-3’。
进一步地，所述扩增促进剂的制备方法为：硝酸铈加入去离子水中配成硝酸铈的水溶液，将所述硝酸铈的水溶液水浴恒温至90±5℃的温度范围内，然后加入甘氨酸和蛋氨酸，加料完成后搅拌溶液3h以上，然后在90±5℃的温度范围内蒸干液相，所得固相为所述扩增促进剂。
进一步地，所述硝酸铈的水溶液中，硝酸铈的浓度为0.1～0.2mol/L，其余为水；所述甘氨酸和蛋氨酸的加入量与所述硝酸铈的水溶液的比例为甘氨酸：蛋氨酸：硝酸铈的水溶液=2～4g:1～5g:100mL。
本发明还公开了上述多重PCR检测试剂组合的使用方法，向所述DreamTaq GreenPCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入DTMUV cDNA、NDRV cDNA、NGPV DNA，再用灭菌水调节至反应所需总体积，使得其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；然后再加入谷氨酰胺和扩增促进剂，进行扩增反应。
本发明还公开了利用上述多重PCR检测试剂组合进行的不以疾病诊断治疗为目的的病毒检测方法，步骤包括：
1) 按照TIANamp Virus DNA/RNA Kit方法提取NDRV及DTMUV的RNA，NGPV的 DNA；
2) 将NDRV、DTMUV的RNA反转录成cDNA；
3) 利用所述多重PCR检测试剂组合对所述病毒DNA和cDNA进行扩增；
4) 判断临床样品是否为NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染。
进一步地，所述步骤2)的反转录反应条件为：用HiScript Ⅱ ReverseTranscriptase试剂盒对所述RNA进行反转录：采用50 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板5μL、5×HiScript Ⅱ Buffer 10μL，随机引物2μL、dNTP Mix(2.5mM each)4μL、HiScript ⅡReverse Transcriptase(200U/μL)1μL, RNase inhibitor(40U//μL)2μL，补充RNase-freeddH2O至总体积共50μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 2min、4℃ 5min的程序进行一个循环。
进一步地，所述步骤3)的扩增反应条件为：反应总体积为20μL：向5μL DreamTaqGreen PCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入上述所得DTMUV cDNA、NDRV cDNA、NGPV DNA各0.2μL，再加灭菌水至总体积为20 μL，其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；再加入0.8μg谷氨酰胺和0.6μg的扩增促进剂，扩增程序为95℃2min，95℃30s，54℃30 s，72℃30s，40个循环；然后72℃5min，再降温到4℃结束反应。
进一步地，测试扩增产物的电泳图，通过观察扩增产物电泳图是否包含相应病毒对应的预期条带，来判断临床样品是否为DTMUV、NDRV、NGPV的单一感染或混合感染，其中鸭坦布苏病毒对应的预期条带为328bp，新型鸭呼肠孤病毒对应的预期条带为594bp，新型鹅细小病毒对应的预期条带为467bp。
从以上技术方案可以看出，本发明有益效果在于：新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒感染都会给养鸭业带来严重的经济损失，并且这三种新发病原都属于垂直传播性疾病，本发明通过建立新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒和鸭坦布苏病毒的同步快速检测技术，对种鸭群进行新型呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏的检疫净化，能提高核心鸭群的生产能力，减少疫病的发生，促进我国养鸭业健康发展。且通过优化试剂组合，使得对新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒的检验速度更快，精度更高，通过检测鸭病料，4个小时内即可检测出新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒的单独或混合感染。
附图说明
图1为采用本发明PCR检测试剂组合在本发明所述检测反应条件下检测的电泳图，
其中：M：DNA分子量标准；1：新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒混合物；2：新型鸭呼肠孤病毒；3：新型鹅细小病毒；4：鸭坦布苏病毒；
图2为各对比例所述情况下各扩增产物检测的电泳图；
其中：M：DNA分子量标准；1：采用本发明所述PCR检测试剂组合所得扩增产物测得的电泳图；2：对比例1所得扩增产物测得的电泳图；3：对比例2所得扩增产物测得的电泳图；4：对比例3所得扩增产物测得的电泳图；5：对比例4所得扩增产物测得的电泳图。
具体实施方式
实施例
1 材料与方法
1.1 病毒株 鸭坦布苏病毒毒株(DTMUV)、新型鸭呼肠孤病毒毒株(NDRV)、新型鹅细小病毒毒株(NGPV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室提供。
1.2 主要试剂 离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker购自英特生物有限公司；DreamTaq Green PCR 预混液 (2X)的详细说明书见网址https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/K1081#/K1081；PCR薄壁管、枪头等耗材购置NEST公司。
1.3 试验方法
1.3.1 引物设计与合成 设计3对能同时扩增3种鸭病原的特异性引物，置-20℃保存备用。3对引物序列如表1所示：
表1
Figure 490623DEST_PATH_IMAGE001
1.3.2 病毒核酸提取和cDNA合成 按照TIANamp Virus DNA/RNA Kit方法提取NDRV及DTMUV的RNA，NGPV的 DNA。用HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒对NDRVRNA和DTMUV RNA进行反转录：采用50 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板5μL、5×HiScriptⅡ Buffer 10μL，随机引物2μL、dNTP Mix(2.5mM each)4μL、HiScript ⅡReverseTranscriptase(200U/μL)1μL，RNase inhibitor(40U/μL)2μL，补充RNase-free ddH2O至总体积共50μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 2 min、4℃ 5min的程序进行一个循环，cDNA合成后-20℃保存备用。
1.3.3 利用多重PCR检测试剂组合对所述病毒DNA和cDNA进行扩增 多重PCR反应在20μL反应体系中进行：向5μL DreamTaq Green PCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入上述所得DTMUV cDNA、NDRV cDNA、NGPV DNA各0.2μL，再加灭菌水至总体积为20 μL，其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；再加入0.8μg谷氨酰胺和0.6μg的扩增促进剂。其中扩增促进剂的制备方法为：硝酸铈加入去离子水中配成硝酸铈的水溶液，所述硝酸铈的水溶液中，硝酸铈的浓度为0.1mol/L，其余为水；将所述硝酸铈的水溶液水浴恒温至90±5℃的温度范围内，然后加入甘氨酸和蛋氨酸，甘氨酸和蛋氨酸的加入量与所述硝酸铈的水溶液的比例为甘氨酸：蛋氨酸：硝酸铈的水溶液=3g:2g:100mL。加料完成后搅拌溶液3h，然后在90±5℃的温度范围内蒸干液相，所得固相即为所述扩增促进剂。扩增程序为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，40个循环；72℃5min，4℃结束反应。如图1所示， DTMUV、NDRV、NGPV的目标条带与预期相符，且清晰度高，扩增效果好。
1.3.4 多重PCR的敏感性试验 用Thermofisher Qubit3荧光光度计测得DTMUV，NDRV，NGPV的浓度分别为2.15×104 copy/μL DTMUV copy/μL，8.80×103 copy/μL，4.03×104 copy/μL，应用上述多重PCR方法对10倍稀释的混合DNA/cDNA进行检测，结果表明，该多重PCR对DTMUV，NDRV，NGPV的检测极限分别为2.15×104 copy/μL DTMUV copy/μL，8.80×103 copy/μL copy/μL，4.03×104 copy/μL，表明本试验建立的多重PCR方法具有较好的敏感性。
为了验证本发明扩增促进剂在多重PCR检测试剂组合中对新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒的DNA或反转录cDNA扩增反应的促进作用，设计以下对比试验：
对比例1
步骤一、病毒核酸提取和cDNA合成：按照TIANamp Virus DNA/RNA Kit方法提取NDRV及DTMUV的RNA，NGPV的 DNA。用HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒对NDRVRNA和DTMUV RNA进行反转录：采用50 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板5μL、5×HiScriptⅡ Buffer 10μL，随机引物2μL、dNTP Mix(2.5mM each)4μL、HiScript ⅡReverseTranscriptase(200U/μL)1μL，RNase inhibitor(40U/μL)2μL，补充RNase-free ddH2O至总体积共50μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 2 min、4℃ 5min的程序进行一个循环，cDNA合成后-20℃保存备用；
步骤二、利用多重PCR检测试剂组合对所述病毒DNA和cDNA进行扩增：多重PCR反应在20μL反应体系中进行：向5μL DreamTaq Green PCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入上述所得DTMUV cDNA、NDRV cDNA、NGPV DNA各0.2μL，再加灭菌水至总体积为20 μL，其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；扩增程序为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，40个循环；72℃5min，4℃结束反应。如图2所示，由图可知，DTMUV、NDRV、NGPV的目标条带较模糊。
对比例2
步骤一、病毒核酸提取和cDNA合成：按照TIANamp Virus DNA/RNA Kit方法提取NDRV及DTMUV的RNA，NGPV的 DNA。用HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒对NDRVRNA和DTMUV RNA进行反转录：采用50 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板5μL、5×HiScriptⅡ Buffer 10μL，随机引物2μL、dNTP Mix(2.5mM each)4μL、HiScript ⅡReverseTranscriptase(200U/μL)1μL，RNase inhibitor(40U/μL)2μL，补充RNase-free ddH2O至总体积共50μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 2 min、4℃ 5min的程序进行一个循环，cDNA合成后-20℃保存备用；
步骤二、利用多重PCR检测试剂组合对所述病毒DNA和cDNA进行扩增：多重PCR反应在20μL反应体系中进行。向5μL DreamTaq Green PCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入上述所得DTMUV cDNA、NDRV cDNA、NGPV DNA各0.2μL，再加灭菌水至总体积为20 μL，其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；再加入0.6μg的扩增促进剂。其中扩增促进剂的制备方法为：硝酸铈加入去离子水中配成硝酸铈的水溶液，所述硝酸铈的水溶液中，硝酸铈的浓度为0.1mol/L，其余为水；将所述硝酸铈的水溶液水浴恒温至90±5℃的温度范围内，然后加入甘氨酸和蛋氨酸，甘氨酸和蛋氨酸的加入量与所述硝酸铈的水溶液的比例为甘氨酸：蛋氨酸：硝酸铈的水溶液=3g:2g:100mL。加料完成后搅拌溶液3h，然后在90±5℃的温度范围内蒸干液相，所得固相即为本对比例所述扩增促进剂。扩增程序为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，40个循环；72℃5min，4℃结束反应。如图2所示，由图可见，DTMUV、NDRV、NGPV的目标条带相比于对比例1更清晰，扩增效果更好，但目标条带与预期对应关系较差。
对比例3
步骤一、病毒核酸提取和cDNA合成：按照TIANamp Virus DNA/RNA Kit方法提取NDRV及DTMUV的RNA，NGPV的 DNA。用HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒对NDRVRNA和DTMUV RNA进行反转录：采用50 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板5μL、5×HiScriptⅡ Buffer 10μL，随机引物2μL、dNTP Mix(2.5mM each)4μL、HiScript ⅡReverseTranscriptase(200U/μL)1μL，RNase inhibitor(40U/μL)2μL，补充RNase-free ddH2O至总体积共50μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 2 min、4℃ 5min的程序进行一个循环，cDNA合成后-20℃保存备用；
步骤二、利用多重PCR检测试剂组合对所述病毒DNA和cDNA进行扩增：多重PCR反应在20μL反应体系中进行。向5μL DreamTaq Green PCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入上述所得DTMUV cDNA、NDRV cDNA、NGPV DNA各0.2μL，再加灭菌水至总体积为20 μL，其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；再加入0.8μg谷氨酰胺。扩增程序为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，40个循环；72℃5min，4℃结束反应。如图2所示，DTMUV、NDRV、NGPV的目标条带与预期相符，但清晰度显然不够，扩增效果一般。
对比例4
步骤一、病毒核酸提取和cDNA合成：按照TIANamp Virus DNA/RNA Kit方法提取NDRV及DTMUV的RNA，NGPV的 DNA。用HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒对NDRVRNA和DTMUV RNA进行反转录：采用50 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板5μL、5×HiScriptⅡ Buffer 10μL，随机引物2μL、dNTP Mix(2.5mM each)4μL、HiScript ⅡReverseTranscriptase(200U/μL)1μL，RNase inhibitor(40U/μL)2μL，补充RNase-free ddH2O至总体积共50μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 2 min、4℃ 5min的程序进行一个循环，cDNA合成后-20℃保存备用；
步骤二、利用多重PCR检测试剂组合对所述病毒DNA和cDNA进行扩增：多重PCR反应在20μL反应体系中进行。向5μL DreamTaq Green PCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入上述所得DTMUV cDNA、NDRV cDNA、NGPV DNA各0.2μL，再加灭菌水至总体积为20 μL，其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；再加入0.8μg谷氨酰胺和0.6μg的本对比例的扩增促进剂。其中本对比例的扩增促进剂的制备方法为：硝酸铈加入去离子水中配成硝酸铈的水溶液，所述硝酸铈的水溶液中，硝酸铈的浓度为0.1mol/L，其余为水；将所述硝酸铈的水溶液水浴恒温至90±5℃的温度范围内，然后加入甘氨酸，甘氨酸的加入量与所述硝酸铈的水溶液的比例为甘氨酸：硝酸铈的水溶液=5g:100mL。加料完成后搅拌溶液3h，然后在90±5℃的温度范围内蒸干液相，所得固相即为本对比例所述扩增促进剂。扩增程序为95℃2min，95℃30s，53℃30 s，72℃45s，40个循环；72℃5min，4℃结束反应。如图1所示，DTMUV、NDRV、NGPV的目标条带情况与对比例3相似。
以上对本发明所提供的技术方案进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 江西省农业科学院畜牧兽医研究所
福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂盒
<130> SIPOSequenceListing 1 .0
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gcagggtttg aagctgaaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
cccacttcta tgccactggt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tcgtcactac tgtcaagctc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tatgtatgag aggagccaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ggctcactga gaaccgagac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
agaccctccc aaaattgctt 20

Claims (8)

1.一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂组合，其特征在于，包括针对鸭坦布苏病毒的引物、针对新型鸭呼肠孤病毒的引物、针对新型鹅细小病毒的引物、DreamTaq Green PCR 预混液、谷氨酰胺和扩增促进剂，各类引物的序列如下：
针对鸭坦布苏病毒(DTMUV)的引物：
上游：5’-GCAGGGTTTGAAGCTGAAAG-3’；
下游：5’-CCCACTTCTATGCCACTGGT-3’；
针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的引物：
上游：5’-TCGTCACTACTGTCAAGCTC-3’；
下游：5’-TATGTATGAGAGGAGCCACA-3’；
针对新型鹅细小病毒(NGPV)的引物：
上游：5’-GGCTCACTGAGAACCGAGAC-3’；
下游：5’-AGACCCTCCCAAAATTGCTT-3’。
2.根据权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述扩增促进剂的制备方法为：硝酸铈加入去离子水中配成硝酸铈的水溶液，将所述硝酸铈的水溶液水浴恒温至90±5℃的温度范围内，然后加入甘氨酸和蛋氨酸，加料完成后搅拌溶液3h以上，然后在90±5℃的温度范围内蒸干液相，所得固相为所述扩增促进剂。
3.根据权利要求2所述的一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述硝酸铈的水溶液中，硝酸铈的浓度为0.1～0.2mol/L，其余为水；所述甘氨酸和蛋氨酸的加入量与所述硝酸铈的水溶液的比例为甘氨酸：蛋氨酸：硝酸铈的水溶液=2～4g:1～5g:100mL。
4.如权利要求1～3任一项所述多重PCR检测试剂组合的使用方法，其特征在于，向所述DreamTaq Green PCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入DTMUV cDNA、NDRV cDNA、NGPV DNA，再用灭菌水调节至反应所需总体积，使得其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；然后再加入谷氨酰胺和扩增促进剂，进行扩增反应。
5.如权利要求1～3任一项所述多重PCR检测试剂组合进行的不以疾病诊断治疗为目的的病毒检测方法，其特征在于，步骤包括：
1) 按照TIANamp Virus DNA/RNA Kit方法提取NDRV及DTMUV的RNA，NGPV的 DNA；
2) 将NDRV、DTMUV的RNA反转录成cDNA；
3) 利用所述多重PCR检测试剂组合对所述病毒DNA和cDNA进行扩增；
4) 判断临床样品是否为NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染。
6.根据权利要求5所述的病毒检测方法，其特征在于，所述步骤2)的反转录反应条件为：用HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒对所述RNA进行反转录：采用50 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板5μL、5×HiScript Ⅱ Buffer 10μL，随机引物2μL、dNTP Mix(2.5mM each)4μL、HiScript ⅡReverse Transcriptase(200U/μL)1μL, RNase inhibitor(40U/μL)2μL，补充RNase-free ddH2O至总体积共50μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 2 min、4℃ 5min的程序进行一个循环。
7.根据权利要求5所述的病毒检测方法，其特征在于，所述步骤3)的扩增反应条件为：反应总体积为20μL：向5μL DreamTaq Green PCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入上述所得DTMUV cDNA、NDRVcDNA、NGPV DNA各0.2μL，再加灭菌水至总体积为20 μL，其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；再加入0.8μg谷氨酰胺和0.6μg的扩增促进剂，扩增程序为95℃2min，95℃30s，54℃30 s，72℃30s，40个循环；然后72℃5min，再降温到4℃结束反应。
8.根据权利要求5所述的病毒检测方法，其特征在于，测试扩增产物的电泳图，通过观察扩增产物电泳图是否包含相应病毒对应的预期条带，来判断临床样品是否为DTMUV、NDRV、NGPV的单一感染或混合感染，其中鸭坦布苏病毒对应的预期条带为328bp，新型鸭呼肠孤病毒对应的预期条带为594bp，新型鹅细小病毒对应的预期条带为467bp。
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