CN113336754B - 一种荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及有机合成领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法，其中荧光探针通过化合物Ⅰ经内成环、缩合、羟基消除步骤制备得到。该荧光探针具有较好的修饰性，修饰时不易产生副产物，且合成较为简单，产率较高。

Description

一种荧光探针及其制备方法
技术领域
本申请涉及有机合成领域，更具体地说，它涉及一种荧光探针及其制备方法。
背景技术
荧光素类荧光探针是一种常用生物荧光探针，其在金属离子检测方面具有广泛的运用，被广泛地运用于生物体内和自然环境中。
荧光素的分子结构中，其分子结构如图1所示。其中，当需要对1～4号位碳进行修饰时，常会有副反应发生在在6号位和11号位上，因此对其修饰较为困难。
发明内容
为了获得一种修饰性能较强的荧光探针，本申请提供一种荧光探针及其制备方法。
首先，本申请提供的一种荧光探针，其化学式如下所示：
Figure GDA0003541171710000011
在上述技术方案中，分子上部分结构为内酰胺二氢吡啶体系，其具有较大的共轭体系的同时，氮上的孤对电子对于共轭体系的富电子程度有着较大的提升作用，使得酯基上非常容易发生酯交换反应，而且由于酯基相较于其他基团较为稳定，因此合成过程中，可以起到保护乙酰基的作用，使得该化合物较为容易合成，合成成本较低。
其次，本申请提供一种荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)对化合物Ⅰ，在碱作用下，使之形成内环，得到化合物Ⅱ，具体反应如式Ⅰ所示；
Figure GDA0003541171710000021
(2)将化合物Ⅱ与2-氯间二苯酚进行反应，得到化合物Ⅲ，具体反应式如式Ⅱ所示；
Figure GDA0003541171710000022
(3)在酸作用下，使化合物Ⅲ中的羟基消除，得到化合物Ⅳ，具体反应如式Ⅲ所示；
Figure GDA0003541171710000031
在上述技术方案中，通过化合物Ⅰ在碱作用下内成环的方式，得到化合物Ⅱ，式Ⅰ的反应转化率较高，基本无副反应，且后续进一步发生缩合反应和消除反应可以在同一体系下进行，整体产率较高，分离方便，具有较好的经济效应。
可选的，化合物Ⅰ通过如下方法进行合成：
将2-(1，2-二氢吡啶基)乙酰氯(后称化合物Ⅵ)与2-卤代甲酰丙二酸二乙酯(后称化合物Ⅶ)进行反应，制备得到化合物Ⅴ，再将化合物Ⅴ与2-氯苯酚进行酰基化反应，得到化合物Ⅰ，具体反应如式Ⅳ和式Ⅴ所示：
Figure GDA0003541171710000032
Figure GDA0003541171710000041
其中，X为氯或溴。
在上述技术方案中，通过化合物Ⅵ和化合物Ⅶ为初始原料，对化合物Ⅰ进行制备，原料简单易得，副产物少，符合绿色合成的理念，具有较好的环保效应和经济效应。
可选的，化合物Ⅰ的合成具体包括如下步骤：
S1、将化合物Ⅶ以10～100mM的浓度溶解于溶剂Ⅰ中，并加入碱Ⅰ，保持混合均匀，随后在5～20min内向其中分批投入化合物Ⅵ，充分反应后得到混合体系Ⅰ；
S2、向上述混合体系Ⅰ中，加入酸Ⅰ调节至酸性，继续加入2-氯苯酚，充分反应后，得到混合体系Ⅱ；
所述溶剂Ⅰ为非芳香族非质子溶剂，所述碱Ⅰ为可溶于溶剂Ⅰ的有机碱；所述碱Ⅰ的用量为化合物Ⅶ物质的量的3～10倍，步骤S1反应温度为20～40℃，所述化合物Ⅵ与化合物Ⅶ的物质的量之比为1∶(1～1.1)，所述酸Ⅰ为三氟乙酸或三氟甲酸，所述2-氯苯酚与化合物Ⅵ的物质的量之比为(1.05～1)∶1，步骤S2反应温度为20～80℃，且不高于溶剂Ⅰ的沸点。
在上述技术方案中，采用一锅煮的方法完成步骤S1和步骤S2，即式Ⅰ和式Ⅱ的合成，整体反应较为简单，产率较高。其中在步骤S1中，化合物Ⅵ分批加入的方式有助于提高整体的产率，减少副产物的生成。
可选的，所述溶剂Ⅰ为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳中的一种，或二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳以任意比例形成的混合溶液。
在上述技术方案中，采用二氯甲烷、三氯甲烷和四氯甲烷作为溶剂，极性较低且不参与反应，对于提高生成的化合物Ⅰ的纯度有着较好的效果。
可选的，在步骤S2后，还包括步骤S3，对混合体系Ⅱ进行分离处理，具体如下：
S3、对混合体系Ⅱ，除去溶剂后，对产物进行柱层析处理，分离得到化合物Ⅰ，柱层析所用固定相为100～500目氧化铝，柱层析所用流动相为含有0～1％质量分数的甲醇的二氯甲烷。
相较于硅胶作为固定相的体系，氧化铝作为固定相，整体具有较好的分离效果，在色谱柱上拖尾现象不明显，不同组分之间分离性较好，且流动相通过的速率较快，完成柱层析的时间较短，有助于提高生产效率。
可选的，对于式Ⅰ～Ⅲ，具体采用如下步骤进行合成：
S4、将化合物Ⅰ溶解于溶剂Ⅱ中，加入碱Ⅱ，在10～45℃的温度下反应充分，随后加入酸Ⅱ，调节pH至酸性，升温至60～100℃，但不超过溶剂Ⅱ的沸点，继续充分反应，得到混合体系Ⅲ；
S5、对混合体系Ⅲ进行分离，得到化合物Ⅱ；
S6、将化合物Ⅱ溶解于酸液Ⅰ中，混合均匀后，继续加入2-氯间二苯酚，加热至60～100℃，充分反应，得到混合体系Ⅳ；
S7、对混合体系Ⅳ进行进一步分离，得到目标产物；
其中，所述溶剂Ⅱ为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、二氯乙烷、苯、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、间三甲苯中的任意一种，或任意数种形成的混合体系；
所述碱Ⅱ为氨，二甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺中的任意一种；
所述酸Ⅱ为三氟乙酸、三氯乙酸、三氟甲基磺酸中的一种。
所述酸液Ⅰ为三氟甲基磺酸、三氟乙酸、三氯乙酸、磷酸、高氯酸中任意一种，溶解于乙醇、乙腈、丙醇、正丁醇、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜中的任意种，形成的均相混合体系。
在上述技术方案中，进一步通过化合物Ⅰ合成了目标产物，在合成过程中，化合物条件较为温和，且反应的选择性较好，得到的目标产物具有较高的产率，且容易与其他杂质分离。
可选的，在步骤S6中，在酸液Ⅰ中，酸的用量为化合物Ⅰ的物质的量的2～10倍。
在上述技术方案中，采用过量的酸，可以提供过量的质子，加速整个体系的反应，且在反应过程中可以减少副产物的生成。
可选的，在步骤S7中，具体步骤如下：将混合体系Ⅵ蒸干，随后在乙酸乙酯和/或乙醚体系中进行重结晶，保留滤渣，用水淋洗，烘干后，得到目标产物。
采用重结晶的方式进行分离，过程较为简单的同时，可以得到较好的纯度，杂质含量较少。
可选的，在步骤S4中，所述碱Ⅱ的物质的量与化合物Ⅰ的物质的量之比为(0.6～1)∶1。
上述技术方案中，碱采用较大的用量而非催化量，反应进程可以较快地完成，且加快反应对于副产物的生成没有明显的影响。
综上所述，本申请至少包括如下一种有益效果：
1.在本申请中提供了一种荧光探针，具有类似荧光素的结构，同时具有可修饰的酯基，可以进行进一步修饰，具有较好的适用范围。
2.在本申请中，提供了上述荧光探针的制备方法，通过化合物Ⅰ经过内成环后再进行缩合和消除，反应取向性较好，副产物较少，分离较为容易。
3.在本申请进一步设置中，化合物Ⅰ通过化合物Ⅵ和化合物Ⅶ经缩合反应后，再与2-氯苯酚进行酰基化反应得到，反应可以采用一锅煮的方式进行，反应流程简单，后续处理方便，产率好纯度高。
附图说明
图1是荧光素的化学式。
图2是本申请中制备得到的荧光探针在二氯甲烷体系中的质谱图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例1，一种荧光探针，其化学式如图2所示。
该荧光探针通过如下步骤合成：
S1、反应式如式Ⅵ所示。
Figure GDA0003541171710000081
步骤S1具体如下：称取化合物Ⅴ444mg(2mmol)，溶解于200mL溶剂Ⅰ中，随后加入5当量的碱Ⅰ，在20℃下搅拌并混合均匀，随后在5min内向其中均匀投入化合物Ⅵ314mg(2mmol)，充分反应TLC监测至化合物Ⅵ的原料点反应完全，得到混合体系Ⅰ。其中，溶剂Ⅰ选用二氯甲烷，碱Ⅰ选用三乙胺。
S2、反应式如式Ⅴ所示。
Figure GDA0003541171710000082
步骤S2具体如下：向上述混合体系Ⅰ中，滴加三氟乙酸至pH值小于4，加入256mg(2mmol)2-氯苯酚，在20℃下继续反应，TLC监测直至化合物Ⅴ的点消失，得到混合体系Ⅱ。
值得注意的是，在该步骤中，将酰氯替换为酰溴，同样可以实现反应，由于羟基存在导致苯环上电子云密度增大的效应，因此活性稍差的酰溴也具有较好的反应效果。
S3、对混合体系Ⅱ进行分离，具体如下：
对混合体系Ⅱ，通过旋蒸除去溶剂，以含有0.1％甲醇的二氯甲烷溶液，以200～300目氧化铝为固定相，进行柱层析分离，得到纯品化合物Ⅰ810.1g，收率93.1％。
在步骤S3中，选用100～500目范围内的氧化铝，均可以对物料进行分离，依照实际需求，可以在二氯甲烷中掺入质量分数为0～1％的甲醇，调整分离效果。而换用硅胶柱时，分离效果较差，有一定的拖尾现象。
S4、反应式如式Ⅰ和式Ⅱ所示。
Figure GDA0003541171710000091
步骤S4具体如下：称取化合物Ⅰ97.0mg(0.2mmol)，溶解于200mL溶剂Ⅱ中，并加入0.2mmol的碱Ⅱ，在20℃下反应，2h后，加入酸Ⅱ调节pH至4，并升温至60℃使体系回流，反应4h后原料点消失，得到混合体系Ⅲ。其中，碱Ⅱ为三乙胺，酸Ⅱ为三氟乙酸，溶剂Ⅱ为二氯甲烷。
S5、对混合体系Ⅲ，通过旋蒸除去溶剂，以含有0.1％甲醇的二氯甲烷溶液，以200～300目硅胶为固定相，进行柱层析分离，得到纯品化合物Ⅱ73.6g，收率98.6％。
S6、反应式如式Ⅲ所示。
Figure GDA0003541171710000101
步骤S6具体如下；称取化合物Ⅱ38.2mg(0.1mmol)，溶解于50mL酸液Ⅰ中，充分搅拌均匀后，再向其中加入2-氯间二苯酚14.4mg(0.1mmol)，加热至100℃，充分反应并通过点板监测直至原料点消失，得到混合体系Ⅳ。其中，酸液为含有0.2mmol磷酸的乙醇和正丁醇以1∶1的体积比形成的混合溶液。
S7、对上述混合体系Ⅳ，在旋蒸中蒸干，随后在乙醚中进行重结晶，过滤，保留滤渣，用水淋洗后在真空干燥箱中烘干，得到目标产物43.8g，产率88.5％。
制备得到的目标产物，溶解于氘代氯仿中，核磁共振氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.16(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),8.43(d,J＝1.1Hz,1H),8.12–8.07(m,2H),7.79(s,1H),7.50(s,1H),7.33(ddd,J＝8.9,7.9,1.3Hz,1H),7.23(td,J＝7.9,0.7Hz,1H),6.98(s,1H),6.81(s,1H),4.30(q,J＝7.1Hz,2H),1.29(t,J＝7.1Hz,3H)。
制备得到目标产物的质谱如图2所示。
实施例2～20，均为一种荧光探针，与实施例1的区别在于，对步骤S1～S3进行了调整，具体如下。
实施例2～12，对选用的溶剂Ⅰ、溶剂Ⅰ的用量、选用的碱Ⅰ、碱Ⅰ的用量及选用的酸Ⅰ、酸Ⅰ的用量中的任意一者进行调整，其结果如表1所示。
表1、化合物Ⅰ制备用料调整
Figure GDA0003541171710000111
在上述技术方案中，对溶剂Ⅰ、碱Ⅰ和酸Ⅰ进行了调整，可见其中溶剂已选用二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳时具有较好的反应性能，而乙醇和乙腈则反应性能较差。其中，乙醇在反应进行中，可能会产生部分副反应，而乙腈中的碳氮三键同样存在一定的反应性，因此选用惰性的卤代烷烃具有更好的效果。其中四氯甲烷反应得到的产率最高，但是四氯甲烷沸点高，后处理麻烦，因此后续选用二氯甲烷为溶剂进行反应。
进一步，调节步骤S1和S2的反应参数，得到如下实施例.
实施例13～20，一种荧光探针，与实施例1的区别在于，反应S1和S2中的参数如表2所示。
表2、步骤S1和S2参数调整对化合物Ⅰ对产率的影响
Figure GDA0003541171710000121
注①：在实施例16中，化合物Ⅵ一次性全部投入到混合体系中。
注②：在实施例19中，溶剂Ⅰ改为等体积四氯化碳。
通过上述实验可知，在步骤S1中，将化合物Ⅵ分批投入到体系中，相较于一次性直接将化合物Ⅵ加入到体系中，具有较好的效果，可能是由于化合物Ⅵ在浓度过大时，会发生化合物Ⅵ与化合物Ⅵ分子间的酰基化反应，进而导致生成副产物增多。
在实施例21～35中，对步骤S4和步骤S5进行调整，进而制备得到化合物Ⅱ。
实施例21～30，一种荧光探针，与实施例1的区别在于，在步骤S4中，选用的溶剂Ⅱ、碱Ⅱ和酸Ⅱ，以及溶剂Ⅱ和碱Ⅱ的物质的量，具体如表3所示。
表3、化合物Ⅱ制备用料调整
Figure GDA0003541171710000122
Figure GDA0003541171710000131
在上述反应中，由于内成环的反应具有较强的趋向性，动力学上极易发生，反应可以快速进行，因此选用极性溶剂，如乙腈等，既具有较好的溶解性，促进反应快速进行，也不会参与到反应过程中。溶剂的用量较大，一般控制化合物Ⅰ浓度在20mM以下，可以进一步减少分子间缩合的现象发生，提高反应的产率。
对于碱Ⅱ的用量，通过实施例29～30可见，当碱Ⅱ的用量过少时，反应产率会降低，可能是由于碱Ⅱ的用量过少时，由于体系整体较稀，催化效果较差。另外，当碱Ⅱ的用量减少时，反应所需的时间也同步延长。
进一步地，在实施例22的基础上，对步骤S4的反应温度和2-氯间二苯酚的用量进行调整，得到实施例31～35结果如表4所示。
表4、步骤S4中温度调整
Figure GDA0003541171710000132
通过上述实验数据可知，在实施例33中，加酸前反应温度过高，偶联反应发生太快，分子间反应速率同样会提高，导致化合物Ⅱ的产率下降。
在实施例36～51中，对步骤S6～S7进行了调整，结果如下。
实施例36～46，一种荧光探针，步骤S5～S7中与实施例1的区别在于，对酸液进行了调整，其具体参数和结果如表5所示。
表5、酸液对步骤S6～S7反应结果的影响
Figure GDA0003541171710000141
在上述技术方案中，通过对酸液进行调整，一定程度上优化了反应条件。在此处，选择具有较大极性的溶剂，可以提高反应的产率，而由于N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲亚砜具有较好的分散性能，反应活性较好，但是沸点较高，不易分离，后续处理较为麻烦。
在实施例44～46中，对酸液中酸的用量进行了调整，当体系中酸的用量较少时，反应产率降低。可能是由于过量的酸可以提高羟基质子化的效率，使式Ⅲ中的消除反应更容易发生。
进一步地，对步骤S6中的反应温度和其他参数进行调整。
实施例47～51，一种荧光探针，与实施例1的区别在于，步骤S6中的部分参数具体如表6所示。
表6、步骤S6中溶剂和温度对反应的影响
Figure GDA0003541171710000142
Figure GDA0003541171710000151
在上述技术方案中，在步骤S6中采用了不同的温度，温度升高可以加速反应，但是部分副反应也会被加快，导致反应产率降低。实际生产中可以根据需求确定不同的反应温度。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种荧光探针的制备方法，其特征在于，所述荧光探针的化学式如下所示：
Figure FDA0003541171700000011
所述荧光探针的制备方法包括如下步骤：
(1)对化合物Ⅰ，在碱作用下，使之形成内环，得到化合物Ⅱ，具体反应如式Ⅰ所示；
Figure FDA0003541171700000012
(2)将化合物Ⅱ与2-氯间二苯酚进行反应，得到化合物Ⅲ，具体反应式如式Ⅱ所示；
Figure FDA0003541171700000013
(3)在酸作用下，使化合物Ⅲ中的羟基消除，得到化合物Ⅳ，具体反应如式Ⅲ所示；
Figure FDA0003541171700000021
2.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物Ⅰ通过如下方法进行合成：
将2-(1，2-二氢吡啶基)乙酰氯(后称化合物Ⅵ)与2-卤代甲酰丙二酸二乙酯(后称化合物Ⅶ)进行反应，制备得到化合物Ⅴ，再将化合物Ⅴ与2-氯苯酚进行酰基化反应，得到化合物Ⅰ，具体反应如式Ⅳ和式Ⅴ所示：
Figure FDA0003541171700000022
Figure FDA0003541171700000031
其中，X为氯或溴。
3.根据权利要求2所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物Ⅰ的合成具体包括如下步骤：
S1、将化合物Ⅶ以10～100mM的浓度溶解于溶剂Ⅰ中，并加入碱Ⅰ，保持混合均匀，随后在5～20min内向其中分批投入化合物Ⅵ，充分反应后得到混合体系Ⅰ；
S2、向上述混合体系Ⅰ中，加入酸Ⅰ调节至酸性，继续加入2-氯苯酚，充分反应后，得到混合体系Ⅱ；
所述溶剂Ⅰ为非芳香族非质子溶剂，所述碱Ⅰ为可溶于溶剂Ⅰ的有机碱；所述碱Ⅰ的用量为化合物Ⅶ物质的量的3～10倍，步骤S1反应温度为20～40℃，所述化合物Ⅵ与化合物Ⅶ的物质的量之比为1∶(1～1.1)，所述酸Ⅰ为三氟乙酸或三氟甲酸，所述2-氯苯酚与化合物Ⅵ的物质的量之比为(1.05～1)∶1，步骤S2反应温度为20～80℃，且不高于溶剂Ⅰ的沸点。
4.根据权利要求3所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于，所述溶剂Ⅰ为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳中的一种，或二氯甲烷、三氯甲烷和四氯化碳以任意比例形成的混合溶液。
5.根据权利要求3所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤S2后，还包括步骤S3，对混合体系Ⅱ进行分离处理，具体如下：
S3、对混合体系Ⅱ，除去溶剂后，对产物进行柱层析处理，分离得到化合物Ⅰ，柱层析所用固定相为100～500目氧化铝，柱层析所用流动相为含有0～1％质量分数的甲醇的二氯甲烷。
6.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于，对于式Ⅰ～Ⅲ，具体采用如下步骤进行合成：
S4、将化合物Ⅰ溶解于溶剂Ⅱ中，加入碱Ⅱ，在10～45℃的温度下反应充分，随后加入酸Ⅱ，调节pH至酸性，升温至60～100℃，但不超过溶剂Ⅱ的沸点，继续充分反应，得到混合体系Ⅲ；
S5、对混合体系Ⅲ进行分离，得到化合物Ⅱ；
S6、将化合物Ⅱ溶解于酸液Ⅰ中，混合均匀后，继续加入2-氯间二苯酚，加热至60～100℃，充分反应，得到混合体系Ⅳ；
S7、对混合体系Ⅳ进行进一步分离，得到目标产物；
其中，所述溶剂Ⅱ为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、二氯乙烷、苯、甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、间三甲苯中的任意一种，或任意数种形成的混合体系；
所述碱Ⅱ为氨，二甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺中的任意一种；
所述酸Ⅱ为三氟乙酸、三氯乙酸、三氟甲基磺酸中的一种；
所述酸液Ⅰ为三氟甲基磺酸、三氟乙酸、三氯乙酸、磷酸、高氯酸中任意一种，溶解于乙醇、乙腈、丙醇、正丁醇、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜中的任意种，形成的均相混合体系。
7.根据权利要求6所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤S6中，在酸液Ⅰ中，酸的用量为化合物Ⅰ的物质的量的2～10倍。
8.根据权利要求6所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤S7中，具体步骤如下：将混合体系Ⅵ蒸干，随后在乙酸乙酯和/或乙醚体系中进行重结晶，保留滤渣，用水淋洗，烘干后，得到目标产物。
9.根据权利要求6所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述碱Ⅱ的物质的量与化合物Ⅰ的物质的量之比为(0.6～1)∶1。
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