CN113331137B - 一种结肠炎复合免疫佐剂及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了医学技术领域的发明一种用于构建慢性结肠炎模型所需的免疫佐剂及其制备方法,佐剂原料来源广泛、安全稳定、制备过程方便;应用该发明建立的实验模型模型具有成功率高、重复性好、观察周期长、不易自行恢复的特点,适用于发病机制研究、药品、医疗器械、生物活性材料的研究评价。
Description
技术领域
本发明涉及医学实验技术领域的一种用于慢性溃疡结肠炎发病机制和治疗研究的免疫制剂和实验动物模型。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是全世界常见的一种特发性炎症性肠病(inflammatorybowel disease,IBD),其发病诱因来自于遗传易感性、环境因素、肠粘膜屏障紊乱、免疫应答异常、肠道微生态失衡多重因素影响。在新兴国家中,UC发病率以14%/年的增幅迅速增加,到2025年,全球预计将达3000万人。UC患者在年龄分布上呈双峰,第一高峰在15~30岁之间,第二高峰在50~70岁之间,UC能增加结直肠癌的患病风险。
对于治疗UC药物的研究,依赖通过构建UC实验模型阐明发病机制和或药理毒理学评价。然而,目前尚无完全模拟人类UC模型的方法。因此诱导机制具有自发性、诱发部位明确、造模时间短、操作简便、病变持续时间较长,且模型一致性好的动物模型是研究的重点。目前慢性结肠炎疾病模型传统采用的模型方法,主要有化学法、免疫法、复合法等。
化学法操作简便,成功率高,常用的化学品是2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-Benzenesulfonic acid,TNBS)。作为制备UC模型的经典方法,TNBS+乙醇法用于制备制备UC模型的机制为:对于机体而言,TNBS作为一种外源性半抗原化学品,仅在与组织蛋白结合形成完全抗原后,才能介导细胞免疫反应。当TNBS溶于乙醇灌肠时,在乙醇的毒性作用下,使TNBS与肠组织蛋白结合形成完全抗原,导致发生针对肠粘膜的免疫反应。从物理化学性质上来看,TNBS属于危险化学品,储存温度条件2~8℃,在水中保存易析出沉淀,造成浓度差异,不易保存。TNBS具有对热不稳定,与高热气体或氧化剂混合,存在引起燃烧爆炸的可能。TNBS还对人眼睛、皮肤、呼吸道黏膜具有刺激性、易诱发过敏反应,具有致癌性。化学法模型自愈性强,与临床上UC的致病因素差异大,慢性期表现不如免疫复合法,与临床UC病程表现不太一致。
我国是全球第一大酒水消费国,2020年我国酒类消费市场规模近9000亿元,规模以上企业酿酒总产量高达5400.74万千升。虽然制酒工艺在不断进步、健康饮酒观念已成为社会共识,但是,乙醇在基酒中的核心地位一时无法取代。乙醇具有易挥发性、易燃性、氧化性和微毒性,被世卫组织列入一类致癌物质。乙醇能导致结肠上皮的通透性增加,降低结肠上皮抵御肠道细菌入侵的屏障功能,从而引起宿主免疫反应发生变化。由于单独给予TNBS或乙醇均不能引起UC,而过量饮用酒能使消化道细菌移位。因此乙醇是UC的危险因素和外部诱因。
免疫法是制备UC模型的传统方法,通常实验取家兔结肠黏膜融冻后,制成组织匀浆,4℃离心,速度3500r/min,离心时间30min。间隔2周给予兔肠黏膜制备的抗原乳液共免疫2~5次。免疫法存在工艺复杂、模型多靶器官损害、模型成功率不稳定、病变部位不一致的不足。
本发明的免疫复合法是传统方法基础上的改进。先利用异源种属的结肠黏膜蛋白(或LPS)使目标实验动物异体抗原刺激增加、黏膜保护条件或局部组织环境改变,导致肠腔内致病菌(和条件致病菌)增多,肠道菌群失衡;再用乙醇诱导,使肠黏膜通透性增加,使佐剂与肠组织大分子组织蛋白结合后成为完全抗原,进而肠腔内细菌及/或细菌产物向黏膜固有层移位,引起免疫细胞的过度激活及加重炎性过程,导致针对自身肠黏膜的免疫反应,从而诱导UC的发生。避免了毒性外源性物质,提高了模型成功率和稳定性,病变部位一致性好。
本发明所用材料之一脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的一种组成成分,是由脂质和多糖构成的物质(糖脂质)。LPS是一种“存在于细菌体内”而不分泌到细菌外部的毒素物质,所以又被称为内毒素,常作为导致炎症的物质用于炎症和免疫学的研究。LPS具有一定的热稳定性和化学稳定性,可以在一般高压蒸汽灭菌条件下(121℃,93kPa,20min)保持特有的毒理学活性,因此LPS干热灭活条件需要250℃加热30min。
发明内容
本发明的目的:针对现有技术的不足,发明一种慢性结肠炎实验动物疾病模型,该动物疾病模型具有操作过程方便、成功率高、稳定性好,重复性好、观察周期长、不易自行恢复的特点,应用于药品、医疗器械、生物活性材料的研究评价和慢性结肠炎发病机制研究。
为实现上述目的,本发明以下技术方案实现:
1方法设计:健康大鼠48只,随机分为6组,即正常组(8只),免疫组(24只,分为结肠免疫+乙醇组、结肠免疫+乙醇+药物组、LPS免疫+乙醇+药物组,每组8只),TNBS组(16只,TNBS+乙醇组、TNBS+乙醇+药物组,每组8只),每组雌雄各半。
1.1实验动物:SPF级SD大鼠,雌雄各半。
1.2药品与仪器设备:某新型结肠炎治疗药物、电子分析天平、电子计价秤、生物组织脱水机、生物组织包埋机、切片机、生物显微镜。
2制备抗原
2.1佐剂A的制备
将灭活结核分枝杆菌干粉与石蜡油按1:850充分混合制得不完全佐剂A。
2.2佐剂B的制备
将灭活结核分枝杆菌干粉与石蜡油按1:70混合制得不完全佐剂B。
2.3结肠冻干粉的制备
无菌方式取实验兔或实验鼠的新鲜结肠组织,0.9%氯化钠注射液漂洗后,无菌水冰浴、剥离刮取结肠黏膜上皮组织,与0.9%氯化钠注射液体积比1:1混合,研磨、40KHz超声5min,4000转/min,离心,将上清液置于入液氮负压容器中,缓慢升温抽真空制得。
2.4抗原A的制备(结肠抗原A)
取健康新西兰兔结肠粘膜研磨匀浆,4000转/min,离心,将上清液与佐剂按体积比1:1混合、40KHz超声5min、6000、8000、10000、120000rpm机械乳化各2min,制得佐剂抗原A。
2.5抗原B的制备(LPS抗原B)
取LPS 30mg与0.9%氯化钠注射液按质量分数比1:1000混合,30KHz超声5min、6000、8000、10000rpm机械乳化各2min,制得抗原B。
2.6抗原C的制备(结肠激发抗原)
取0.9%氯化钠注射液与佐剂A按体积比1:1混合、40KHz超声5min、6000、8000、10000、120000rpm机械乳化各2min,再与50%乙醇按体积比1:1混合,制得佐剂抗原C。
2.7抗原D的制备(LPS激发抗原)
取0.9%氯化钠注射液与佐剂B按质量分数比1:1混合,30KHz超声5min,6000、8000rpm机械乳化各2min,再与50%乙醇按体积比1:1混合,制得佐剂抗原D。
2.8抗原E的制备(冻干粉激发抗原)
取结肠冻干粉抗原、0.9%氯化钠注射液与佐剂A按质量分数比1:1:1混合,30KHz超声5min,6000、8000、10000rpm机械乳化各2min,再与50%乙醇按体积比1:1混合,制得佐剂抗原E。
2.9TNBS溶液的制备(TNBS+乙醇)
将5%TNBS水溶液与无水乙醇体积比1:1混合,制得TNBS溶液。
3复合免疫法建立大鼠UC模型
3.1免疫诱导
免疫组第0d、第14d和第28d分别于大鼠腹部、颈部和背部皮下注射1次佐剂抗原0.4ml/只。免疫诱导期间,待免疫的动物仅进行佐剂抗原A或B的注射,不进行局部灌肠。
3.2免疫激发
免疫组第42d,禁食不禁水24h后,麻醉动物,经肠道轻缓插入导尿管,深度距肛门8cm,佐剂抗原C或D与E的混合物0.6ml注入结肠。将大鼠倾斜45°倒置,1min后,平卧放入饲养盒中。
4建立TNBS诱导大鼠UC模型
采用TNBS进行局部灌肠造模,禁食不禁水24h后,麻醉动物,经肠道轻缓插入导尿管,深度距肛门8cm,将TNBS溶液按4ml/kg注入结肠,剂量为100mg/kg。灌注后,将大鼠倾斜45°倒置,1min后,平卧放入饲养盒中。
5给药
大鼠清醒后次日开始灌胃给药,动物给予参比药物,模型组和正常组给予等容量的纯水,给药容积为5mL/kg,连续给药14d。
6取材与病理
末次给药24h后,麻醉动物,取出结肠组织。纵行剖开肠管,以生理盐水漂洗干净后,肉眼观察结肠病变程度,进行肉眼评分。取损伤处结肠组织,甲醛溶液固定,进行组织病理学检查。
7评价指标
7.1临床观察
给药期间每天定时观察动物外观体征、行为活动和粪便情况,记录动物存活情况。
7.2病理学分级
镜下观察大鼠结肠病理分级。分级规则:结肠黏膜完好,无炎性细胞浸润及溃疡(-);结肠黏膜较完好,轻度充血、水肿,少量炎性细胞浸润(+);结肠黏膜充血、水肿、炎细胞浸润,肠壁纤维增生,表层单个溃疡形成(++);结肠黏膜充血、水肿、大量炎性细胞浸润,表层缺损坏死,多个溃疡形成(+++)。
7.3粘连评分
肉眼观察大鼠结肠黏膜粘连情况,并进行评分。评分规则:0分:无粘连;1分:轻度粘连;2分:重度粘连。
7.4溃疡评分
肉眼观察大鼠结肠溃疡程度,并进行评分。评分规则:0分:无明显异常;1分:局部充血无溃疡;2分:溃疡部位不伴有充血或肠壁增厚;3分:1处溃疡伴炎症;4分:≥2处溃疡伴炎症;5分:≥2处溃疡伴炎症,且较大溃疡损伤范围>1cm;6~10分:损伤宽度>2cm,损伤长度每增加1cm,评分加1。
7.5炎症评分
肉眼观察大鼠结肠病变炎症程度,并进行评分。评分规则:0分,无损伤;1分,黏膜充血、水肿、无糜烂;2分,黏膜充血、水肿、轻度糜烂;3分,黏膜充血、水肿、中度糜烂;4分,黏膜充血、水肿、高度糜烂;5分,黏膜充血、水肿、重度糜烂。
8统计方法
所有数据均使用SPSS软件进行统计分析。等级评分数据采用非参数检验,经Kruskal-Wallis H检验后,进一步作多个样本间两两比较的双侧秩和检验。P<0.05认为有统计学意义。
具体实施方式
实施例1
9临床观察
正常组动物日常活动状态无异常;结肠免疫+乙醇组、TNBS+乙醇组、LPS免疫+乙醇组实验动物消瘦明显,日常活动减少、多腹泻、粪便粘附在肛周;结肠免疫+乙醇+药物组和TNBS+乙醇+药物组动物腹泻较轻,肛周较清洁。
10结肠组织病理学分级
(1)正常组:所有动物组织结构正常,未见明显组织病理学变化(-)。
(2)TNBS+乙醇组:可见粘膜充血、水肿、炎细胞浸润,中重度糜烂,多数动物溃疡形成(+++)。
(3)TNBS+乙醇+药物组:可见粘膜充血、水肿、炎细胞浸润,部分动物重度糜烂,溃疡形成(++)。
(4)结肠免疫+乙醇组:可见粘膜充血、水肿、炎细胞浸润,中重度糜烂,多数动物溃疡形成(+++)。
(5)结肠免疫+乙醇+药物组:粘连、溃疡以及炎症情况不同程度改善。少数动物局部粘膜充血、水肿、炎细胞浸润,部分动物重度糜烂,溃疡形成(++)。
(6)LPS免疫+乙醇组:可见粘膜充血、水肿、炎细胞浸润、粘连,中重度糜烂,部分动物溃疡形成(+++)。
结果表明,采用结肠炎复合免疫佐剂方法获得的结肠炎模型,具有与慢性结肠炎相似的观察体征和组织病理学改变,可以作为一种替代方法用于研究评价。
实施例2
11粘连评分
结肠免疫+乙醇组、TNBS+乙醇组、LPS免疫+乙醇组粘连均较正常组严重。各给药组粘连情况略轻,结肠免疫+乙醇+药物组均较结肠免疫+乙醇组低,粘连情况不同程度改善。TNBS+乙醇+药物组均较TNBS+乙醇组低,粘连程度改善。可以认为给药具有显著改善结肠粘连的作用。见表1。
12溃疡评分
结肠免疫+乙醇组、TNBS+乙醇组、LPS免疫+乙醇组溃疡评分均较正常组增加。各给药组溃疡程度有所改善,相较TNBS+乙醇组,TNBS+乙醇+药物组溃疡评分较低;相较结肠免疫+乙醇组,结肠免疫+乙醇+药物组溃疡评分较低。可以认为给药后结肠溃疡情况显著改善。见表2。
13炎症评分
结肠免疫+乙醇组、TNBS+乙醇组、LPS免疫+乙醇组炎症评分均较正常组升高。各给药组炎症情况不同程度改善,相较结肠免疫+乙醇组,结肠免疫+乙醇+药物组炎症评分较低;相较TNBS+乙醇组,TNBS+乙醇+药物组炎症评分较低。可以认为药物对改善结肠炎症具有一定作用。见表3。
结果表明,连续给药7天可一定程度上改善大鼠结肠粘连、溃疡的症状,受试药物具有改善结肠炎症状的作用。采用结肠炎复合免疫佐剂获得的结肠炎模型的组织粘连情况、溃疡形成-修复情况、炎症表现与传统TNBS法有相似特征,具有可以作为结肠炎评价的改进方法。
结肠炎复合免疫佐剂具有原料安全性好、稳定性好、节省原料、制备过程方便的优势。运用结肠炎复合免疫佐剂制备的结肠炎模型具有成功率高、重复性好、观察周期长、不易自行恢复的特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其细节上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
表1.各实验组结肠黏膜粘连评分结果(评分对应的动物数)
n=8;aP<0.05,aaP<0.01,与对应模型组比较;bP<0.05,bbP<0.01,与正常组比较。
表2.各实验组结肠黏膜溃疡评分结果(评分对应的动物数)
n=8;aaP<0.01,与对应模型组比较;bbP<0.01,与正常对照组比较。
表3.各组实验结肠黏膜炎症评分结果(评分对应的动物数)
n=8;bbP<0.01,与正常对照组比较。
Claims (6)
1.一种结肠炎复合免疫佐剂,其特征为, 原料组分包括制备抗原的原料,原料包括石蜡油且包括灭活结核分枝杆菌、结肠组织、结肠冻干粉、脂多糖、乙醇中的一种或多种,灭活结核分枝杆菌干粉与石蜡油按质量分数范围是1:70~1: 850,结肠组织或结肠冻干粉与石蜡油按质量分数范围是1:10~1: 900,脂多糖与石蜡油按质量分数范围是1:10~1: 900;免疫佐剂的制备方法包括将灭活结核分枝杆菌干粉与石蜡油按1: 850充分混合制得不完全佐剂A;将灭活结核分枝杆菌干粉与石蜡油按1: 70混合制得不完全佐剂B;免疫佐剂抗原的制备方法包括:无菌方式取实验兔或实验鼠的新鲜结肠组织,0.9%氯化钠注射液漂洗后,无菌水冰浴、剥离刮取结肠黏膜上皮组织,与0.9%氯化钠注射液体积比1:1混合,研磨、40KHz超声5min,4000转/min,离心,将上清液置于入液氮负压容器中,缓慢升温抽真空制得结肠冻干粉;取实验兔结肠粘膜研磨匀浆,4000转/min,离心,将上清液与佐剂按体积比1:1混合、40KHz超声5min、6000、8000、10000、120000rpm机械乳化各2min,制得佐剂抗原A;取LPS30mg与0.9%氯化钠注射液按质量分数比1:1000混合,30KHz超声5min、6000、8000、10000rpm机械乳化各2min,制得抗原B;取0.9%氯化钠注射液与不完全佐剂A按体积比1:1混合、40KHz超声5min、6000、8000、10000、120000rpm机械乳化各2min,再与50%乙醇按体积比1:1混合,制得佐剂抗原C;取0.9%氯化钠注射液与不完全佐剂B按质量分数比1:1混合,30KHz超声5min,6000、8000rpm机械乳化各2min,再与50%乙醇按体积比1:1混合,制得佐剂抗原D;取结肠冻干粉抗原、0.9%氯化钠注射液与不完全佐剂A按质量分数比1:1:1混合,30KHz超声5min,6000、8000、10000rpm机械乳化各2min,再与50%乙醇按体积比1:1混合,制得佐剂抗原E;免疫诱导包括:免疫组第0d、第14d和第28d分别于大鼠腹部、颈部和背部皮下注射佐剂抗原A或抗原B,0.4ml/只/次;免疫激发包括:免疫组第42d,禁食不禁水24h后,麻醉动物,经肠道轻缓插入导尿管,深度距肛门8cm,佐剂抗原C或佐剂抗原D 与佐剂抗原E的混合物 0.6ml注入结肠,建立大鼠UC模型,用于药品、医疗器械、生物活性材料的评价和疾病研究。
2.根据权利要求1所述的一种结肠炎复合免疫佐剂,其特征为,制备抗原的结肠组织的来源为实验鼠、实验兔、犬、猴、猪、人的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的一种结肠炎复合免疫佐剂,其特征为,抗原制备的制备工艺包括混合、取材、漂洗、冰浴、剥离、超声、研磨、离心、移液、抽真空、冲洗、乳化、浓缩、纯化、分装、高压、灭菌、冷却、灌装、辐照、冷藏操作中一种或多种,以及实施其中若干循环操作。
4.根据权利要求3所述的一种结肠炎复合免疫佐剂,其特征为,制备抗原的工艺包括超声频率10~100KHz、维持时间1~25min、研磨转速为4000~12000rpm、离心转速为2000~10000rpm、抽真空压强10~30pa中的一种或多种。
5.根据权利要求3或4所述的一种结肠炎复合免疫佐剂,其特征为,用于制备抗原的稀释剂,包括无菌水、0.9%氯化钠水溶液、5%葡萄糖水溶液、磷酸盐缓冲溶液。
6.根据权利要求5所述的一种结肠炎复合免疫佐剂,其特征为,所述免疫佐剂的应用方法包括:技术环节、实施途径;技术环节包括免疫诱导和免疫激发2个技术环节,2者可分别进行一次或多次;实施途径包括皮下注射、肌肉注射、静脉注射、肠腔灌注一种或多种;实施部位包括:足趾、腹股沟、颈部、背部、腹部、侧腹部、躯干、四肢中的一种或多种;结肠炎复合免疫佐剂适用于疾病模型、药品、医疗器械、生物活性材料的评价和疾病研究;应用过程在符合GLP要求的实验室中进行。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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