CN113308573A - 一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括：引物、Ex Taq buffer、Ex Taq Hot‑start DNA聚合酶、MgCl2、dNTP，其中引物序列为：F:5’‑AGTAGTGACTGTCGTGTAAG‑3’，R:5’‑CTGCTATTGAGGAGGAAGATA‑3’，本发明试剂盒引物是针对2018年在中国流行的非洲猪瘟病毒的p54蛋白序列设计PCR引物，可以更早期、更高效、灵敏的检测目前国内流行的非洲猪瘟病毒。

Description

一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefeve r virus，ASFV)引起的烈性传染病，非洲猪瘟是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物疾病，同时也是《中华人民共和国动物防疫法》规定的一类动物疾病。非洲猪瘟在临床症状上与猪瘟(Classical swine fever，CSF)极为相似，以高热、高死亡率、全身广泛性出血、呼吸障碍以及神经功能紊乱为主要特征，而且目前还没有有效的疫苗用于非洲猪瘟的预防和治疗，主要通过检疫和扑杀来控制该病的流行。

p54蛋白同样是非洲猪瘟病毒的重要结构蛋白，由E183L基因编码，蛋白的分子质量约为25ku，蛋白分子中含有一段跨膜区域，主要集中于衍生的内质网膜处，p54蛋白的跨膜结构区域对病毒蛋白经过内质网膜转化成病毒包膜前体的过程十分重要，p54蛋白与细胞质动力蛋白DLC8可发生特殊的交叉反应，介导病毒的细胞内运输，在细胞对病毒内摄过程和病毒在细胞内的加工过程中都起着重要作用，目前已经表明p54对病毒的存活相关，参与病毒的吸附与进入，参与病毒的早期感染。

PCR检测具有检测特异性高、灵敏度强、操作简单、可大批量检测等特点，用于检测各种组织、体液中病原微生物的核酸，与其它试验相比，此方法更加快速、敏感，且不需要分离培养病原微生物，并能进行大批量的流行病学调查，然而最近的两份研究报告分别显示OIE推荐的常规PCR敏感性和特异性降低，推测可能是因为病毒变异引起的，因此有必要针对现在主流病毒株保守序列设计新的PCR引物，本发明特别的选择2018年国内流行的非洲猪瘟病毒的p54蛋白序列设计PCR引物，可以更早期、更高效、灵敏的检测目前国内流行的非洲猪瘟病毒。

发明内容

本发明的目的之一是提供检测非洲猪瘟病毒的PCR引物，该引物是针对2018年在中国流行的非洲猪瘟病毒的p54蛋白序列设计，可以更早期、更高效、灵敏的检测目前国内流行的非洲猪瘟病毒。

本发明的目的之二是提供一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，引物序列为：F:5’-AGTAGTGACTGTCGTGTAAG-3’(Seq ID No.1)，R:5’-CTGCTATTGAGGAGGAAGATA-3’(Seq ID No.2)，长度287bp；

具体的，本发明检测非洲猪瘟病毒的试剂盒包括：引物、Ex Taq buffer、Ex TaqHot-start DNA聚合酶、MgCl₂、dNTP；

更进一步地，本发明还提供了上述检测非洲猪瘟病毒试剂盒的应用。

具体的，本发明检测非洲猪瘟病毒试剂盒的应用方法如下：

①提取待测样品的DNA；

②以待测样品的DNA为模板，采用本试剂盒建立PCR反应体系进行PCR扩增；

本发明PCR反应的体系如下：总体积20μl，10×Ex Taq buffer 2.0μl、1.5U/μl ExTaq Hot-start DNA聚合酶0.2μl、10μM引物1μl、2.5μM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl₂2μl、DNA2μl、3ddH₂O 10.8μl；

本发明PCR反应的程序为：95℃5min，(94℃1min，50℃30s，72℃1min)35个循环；72℃10min；

③对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现287bp的条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

本发明进一步对所建立的非洲猪瘟病毒检测试剂盒的特异性、敏感性和通用性进行分析，其中：

特异性检测：本发明以猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PrV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andres piratory syndrome virus,PRRS)、猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus infection,PPI)的DNA为模板，用本试剂盒进行PCR检测，均无阳性信号，说明了本试剂盒特异性良好；

敏感性检测：将初始浓度为400ng/μl的标准模板ASFV DNA分别按1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100稀释，从每个稀释度各取2μl模板用本试剂盒进行检验，本试剂盒均能检出，说明本试剂盒敏感性良好；

ASFV不同毒株检测：本发明对来自7种不同毒株的DNA进行检测，均能得到阳性结果，说明本试剂盒通用性良好。

本发明的有益效果是：

本发明试剂盒引物是针对2018年在中国流行的非洲猪瘟病毒p54蛋白保守序列设计，可以更早期、更高效、灵敏的检测目前国内流行的非洲猪瘟病毒，且本发明试剂盒具有良好的特异性、敏感性和通用性。

附图说明

图1序列对比图

图2特异性检验结果图

图3敏感性检验结果图

图4不同毒株非洲猪瘟病毒检测

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1.主要试剂

Ex Taq Hot-start DNA酶、PCR Marker、dNTP、10×buffer、琼脂糖购自大连宝生生物工程有限公司，TwistAmp^TM DNA amplification kit购自英国TwistDx公司，DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，感受态细胞DH5α购自Takara公司；

2.主要仪器设备

AB104-N电子分析天平购自梅特勒-托利多上海有限公司，PTC-200型PCR仪购自美国MJ Research公司，DYY-6D型核酸电泳仪购自北京市六一仪器厂，GelDoc凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司，Sigma 3K-15高速冷冻离心机购自德国Sigma公司，MilliQ Integral超纯水仪购自美国Milipore公司，电热恒温水槽(DK-8D)购自上海一恒科技有限公司；

3.从NCBI上获得2018年在中国流行的非洲猪瘟p54蛋白序列(MK214679.1，Seq IDNo.3)，通过NCBI Blast功能，获得保守序列，比对结果见图1，由比对结果可以看出，p54序列非常保守；

4.使用Primer Premier 6.0针对保守序列设计引物，设计的引物序列为：F:5’-AGTAGTGACTGTCGTGTAAG-3’(Seq ID No.1)，R:5’-CTGCTATTGAGGAGGAAGATA-3’(Seq IDNo.2)，长度287bp；

5.DNA模板

ASFV China/Jilin/2018/boar DNA序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，连接于pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，扩大培养，抽提质粒DNA；

6.PCR扩增

用EcoRⅠ酶切步骤三所得质粒DNA，以此为模板，配制总体积20μl的PCR反应体系：10×Ex Taq buffer 2.0μl、1.5U/μl Ex Taq Hot-start DNA聚合酶0.2μl、10μM引物1μl、2.5μM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl₂2μl、DNA 2μl、3ddH₂O 10.8μl，PCR反应的程序为：95℃5min，(94℃1min，50℃30s，72℃1min)35个循环；72℃10min；

7.对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现287bp的条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

实验一试剂盒特异性检验

1.用本试剂盒以非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PrV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、猪细小病毒(Porcine parvovirusinfection,PPI)的DNA为模板，用设计的引物PCR扩增，观察结果，结果见图2。

根据实验结果可以看出，本试剂盒在猪瘟病毒样品中可以扩增出特异条带，ASFVDNA为模板的体系扩增出了特异性条带，在PrV、PCV2、PRRSV、JEV、PPI DNA为模板的PCR体系中未扩增出特异性条带，说明本试剂盒特异性良好。

实验二：试剂盒敏感性检验

将初始浓度为400ng/μl的标准模板ASFV DNA分别按1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100稀释，从每个稀释度各取2μl模板用ASFV PCR试剂盒进行检验，观察结果，实验结果见图3。

结果显示1％稀释的ASFV DNA模板也能用本试剂盒检测出来。

实验三：不同基因型的非洲猪瘟病毒能力检测

从NCBI上查找相差比较大的非洲猪瘟病毒序列MN913970.1、KC535550.1、LC088174.1、X84890.1、KC662379.1、MN194591.1、MH910495.1，人工合成相关的4Kb的DNA序列，插入pGEM-T载体，瞬时转染大肠杆菌DH5а，挑选克隆测序，测序正确的菌株，扩大培养，提取DNA，用本试剂盒PCR检测，实验结果见图4。

1泳道为MN913970.1、2泳道为KC535550.1、3泳道为LC088174.1、4泳道为X84890.1、5泳道为KC662379.1、6泳道为MN194591.1、7泳道为MH910495.1，从实验结果可以看出，均出现了目的条带，说明本试剂盒能够很好的检测不同基因型的非洲猪瘟病毒，具有很好的通用性。

序列表

<110> 广州博识生物科技有限公司

<120> 一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtagtgact gtcgtgtaag 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgctattga ggaggaagat a 21

<210> 3

<211> 555

<212> DNA

<213> African swine fever virus

<400> 3

ttacaaggag ttttctaggt ctttatgcgt ataggtgttt ctttgtcgta aattttcaat 60

agccgacatt gtttgtgaag cagtgttctg agtagtgact gtcgtgtaag gctcagccgg 120

atgagcagga gcactcgcgg ccgcaggtgc ggccgccggc ccgccagttg ccatgactag 180

tctgtccgta actgggttgt ccgtaactgg tttgtttgtt gctggtctgt ttgttgccgg 240

tctgcccgtg actggcttgc ctacacttgc tgtagtcgct ccagctggtt tagaggtacc 300

tggttgtgga gtgacttcta cccactgctg atcttgataa ggatttataa actgtatatc 360

ttcctcctca atagcagcag cttttttctt tcttgaagag aatagataga ttagaacgat 420

gataatgatg actaagacca cgatagcaat gagaatagta tacatatgtg tggagaagaa 480

gcttggtgta gtgactggtg acaaacactc accataatgc cgcggataaa ccggttgaaa 540

aaattcagaa tccat 555

Claims (2)

1.一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：引物、Ex Taqbuffer、Ex Taq Hot-start DNA聚合酶、MgCl₂、dNTP，其中引物序列为F:5’-AGTAGTGACTGTCGTGTAAG-3’，R:5’-CTGCTATTGAGGAGGAAGATA-3’。

2.一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：

①提取待测样品的DNA；

②以待测样品的DNA为模板，采用本试剂盒建立PCR反应体系进行PCR扩增；

PCR反应的体系如下：总体积20μl，10×Ex Taq buffer 2.0μl、1.5U/μl Ex Taq Hot-start DNA聚合酶0.2μl、10μM引物1μl、2.5μM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl₂ 2μl、DNA 2μl、3ddH₂O 10.8μl；

PCR反应的程序为：95℃5min，(94℃1min，50℃30s，72℃1min)35个循环；72℃10min；

③对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现287bp的条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

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