CN113308442A - 重组酿酒酵母菌株及其构建方法 - Google Patents

重组酿酒酵母菌株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及合成生物学领域，具体涉及生产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)及其构建方法。该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SyBE_Sc06130032，简称SyBE_Sc06130032。本发明还提供了在酿酒酵母中从头构建合成田麦角碱的方法，easA成功筛选到一个新的来源，克服了在关键分支点合成田麦角碱的难点，进一步解析了田麦角碱的合成路径，为麦角生物碱的异源合成奠定了基础。

Description

重组酿酒酵母菌株及其构建方法
技术领域
本发明涉及合成生物学领域，特别涉及重组酿酒酵母菌株及其构建方法。
背景技术
麦角生物碱主要是曲霉(Aspergillus)，麦角菌属(Claviceps)以及内生真菌(Neotyphodium)这三类真菌的次生代谢产物，它是一类具有较强药理活性的真菌类吲哚类生物碱天然产物，是治疗偏头痛、子宫出血、帕金森症和其他疾病的治疗药物的原料。生物碱类药物通常从植物提取的起始原料中半合成，这往往限制了它们的可用性和最终价格。近年来合成生物学的进展使得将完整的植物途径引入微生物中来生产植物生物碱成为可能。
微生物生产改性生物碱具有加速生物碱类药物半合成的潜力，它提供了结构上更接近最终药物的高级中间体，可作为新型药物合成的高级中间体。几十年来，人们对麦角生物碱进行了深入的研究，主要是因为它们在受污染的食品和饲料中的有害作用，但也因为它们在医药和农业方面的有益应用。
麦角生物碱合成的源头底物为色氨酸和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)，尽管目前其生物合成路径中的共同前体可以确定为裸麦角碱，但是裸麦角碱的下游合成路径并不是十分清晰，具体的催化机理，反应机制不清楚。而涉及chanoclavine-I形成的一共需要四个酶，分别为dmaw和easF、EasE和EasC，dmaw和easF这两步酶不是限制chanoclavine-I形成的因素，关键是EasE和EasC的研究。2014年，Curt AF Nielsen等研究者成功地在酿酒酵母中以色氨酸和DMAPP合成了裸麦角碱，筛选到来自日本曲霉的EasE和EasC这两个蛋白实现了裸麦角碱的合成，使得EasE和EasC在酵母异源中表达成为可能，关键酶EasE和EasC的研究依赖于真菌的基因互补，但进一步的表征则受到EasE蛋白表达困难的阻碍。最终发现EasE的N端ER靶向信号肽对在酵母中表达活性有影响，研究者对EasE信号肽做了截短验证，并没有将其他酶共同作细胞器定位尝试。2015年，Dorota Jakubczyk等研究者在酿酒酵母中实现了从头合成cycloclavine，裸麦角碱的一步下游产物，通过增加了三个拷贝数的dmaw、四个拷贝数的easC实现了cycloclavine产量为529mg/L，裸麦角碱产量为0.75mg/L，平行副产物羊茅麦角碱89mg/L，发酵优化发现低温22℃对EasE和EasC催化速率有明显提高使得chanoclavine-I产量翻了十几倍。2010年，Johnathan Z.Cheng等研究者发现在麦角生物碱合成路径中EasA是一个重要的分支控制点，序列比对发现easA与黄素酶高度同源，EasA负责两个功能分别为异构化和还原性。2011年，Marco Matuschek等研究者通过在大肠杆菌中表达获得可溶性蛋白EasG，体外通过控制还原性谷胱甘肽(GSH)的量与NADPH，裸麦角碱醛混合孵育，最终获得田麦角碱。在麦角生物碱合成路径中GSH替代了EasA的作用，对此说明EasA的具体催化机理或者说裸麦角碱醛到田麦角碱的催化机制依然是不清楚的。2019年，Yongpeng Yao等研究者又进一步解析了EasC的催化反应机制，EasC主要负责麦角生物碱中心碳环的生物合成，研究者提出自由基理论，解释了EasC的双功能——过氧化氢酶和单加氧酶功能。到目前为止，在异源宿主中进行合成田麦角碱的难度在于EasA酶的功能分配，还原性功能的表达将裸麦角碱醛流向羊茅麦角碱，已实现了89mg/L的滴度。
田麦角碱作为麦角生物碱合成路径上一个重要分支点走向的中间产物，对开发生物合成麦角酸衍生物系列占有举足轻重的地位，而在麦角生物碱中麦角酸衍生物是主要用于医药开发的一类，到目前为止在酿酒酵母中还未实现其全合成，因此田麦角碱的异源表达成功对下游麦角生物碱的研究具有十分重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了生产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株的构建方法，找到了合成田麦角碱的easD，easG，easA的最佳来源组合。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了来源于C.fusiformis、Claviceps purpurea或N.lolii的easA在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；所述药物包括麦角酸衍生物。
作为优选，本发明提供了来源于C.fusiformis的easA在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；所述药物包括麦角酸衍生物。
基于上述研究，本发明提供了来源于Claviceps purpurea、Aspergillusfumigatus或N.lolii的easG；或
来源于Claviceps purpurea或Aspergillus fumigatus的easD中的一个酶或两个酶的组合，与来源于C.fusiformis、Claviceps purpurea或N.lolii的easA获得的组合酶在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；
所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；
所述药物包括麦角酸衍生物。
作为优选，本发明提供了来源于Claviceps purpurea的easG或来源于Clavicepspurpurea的easD中的一个酶或两个酶的组合，与来源于C.fusiformis的easA获得的组合酶在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；所述药物包括麦角酸衍生物。
此外，本发明还提供了表达盒，包括来源于C.fusiformis、Claviceps purpurea或N.lolii的easA。
作为优选，本发明提供的表达盒包括来源于C.fusiformis的easA。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达盒还包括来源于Clavicepspurpurea、Aspergillus fumigatus或N.lolii的easG。
作为优选，所述表达盒还包括来源于Claviceps purpurea的easG。
更重要的是，本发明还提供了表达模块，包括所述表达盒和来源于Clavicepspurpurea或Aspergillus fumigatus的easD。
作为优选，所述表达模块包括所述表达盒和来源于Claviceps purpurea的easD。
基于上述研究，本发明还提供了所述表达盒和/或所述表达模块在制备合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物的菌株中的应用；所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；所述药物包括麦角酸衍生物。
更重要的是，本发明还提供了菌株，其构建方法为：在底盘菌株中导入所述表达盒和/或所述表达模块。
在本发明中，所述底盘菌株包括酵母、藻类、霉菌或细菌中的一种多种。在本发明的一些实施例中，所述酵母包括酿酒酵母、解脂属酵母、克鲁维属酵母等；所述霉菌包括链霉菌等；所述细菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。在本发明的一些实施例中，所述酿酒酵母包括CEN.PK系列、BY系列等。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明所述底盘菌株为高产DMAPP重组酿酒酵母，由元英进课题组提供，菌株编号为CEN.PK2-1D。yCTH对CEN.PK2-1D进行了基因改造，该重组酿酒酵母所包含的基因改造为：在GAL80处通过强启动子GAL110过表达了IDI1和tHMGR，通过弱启动子HXT1p替换原ERG20启动子下调ERG20的表达。
在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株还包括第一表达模块、第二表达模块和/或内源模块；
所述第一表达模块包括dmaW-easF；所述第一表达模块的整合位点包括XV染色体的Δ22位点；和/或
所述第二表达模块包括easE-easC；所述第二表达模块的整合位点包括XVI染色体的Δ15位点；和/或
所述内源模块包括ero1-fad1；所述内源模块的整合位点包括VIII染色体的Δ14位点；和/或
来源于Claviceps purpurea或Aspergillus fumigatus的easD的整合位点包括GAL1/7/10；作为优选，来源于Claviceps purpurea的easD的整合位点包括GAL1/7/10。
本发明还提供了所述菌株的构建方法，包括如下步骤：
获得底盘菌株；
外源功能基因元件：外源基因为dmaW(来源：Aspergillus japonicus),easF(来源：Aspergillus fumigatus),easE(来源：Aspergillus japonicus),easC(来源：Aspergillus japonicus),easD(来源：Aspergillus fumigatus和Claviceps purpurea),easG(来源：Claviceps purpurea，Aspergillus fumigatus和N.lolii),easA(来源：Claviceps purpurea，C.fusiformis和N.lolii)，其均经过酿酒酵母密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后，在基因两端额外添加5’端GCGGCCGCGGTCTCCA，3’端TAAAGGAGACCGCGGCCGC通过人工合成得到；
dmaW:序列如SEQ ID No.1所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGACAGCCGGTCAAGGTATAAAAACAGGTAATGCTTCAGATTGTGAAGTCTACAGAACATTGTCCGTCGCCTTGGACTTTGCCAACCAAGACGAAGAATTGTGGTGGCACTCTACTGCTCCAATGTTTGCTCAAATGTTGCAAAGTACTAATTACAATTTGCACGCTCAATATAAGCATTTGTTGATTTATAAGAAGAACGTCATCCCATTTTTGGGTGTTTATCCTACTAATGATAAGCCAAGATGGTTATCTATTTTGACAAGATATGGTACACCATTCGAATTATCTTTGAACTGTAGTGGTCCTTTGGTCAGATATACTTATGAACCTATTAACGCTGCTACTGGTACTGCAAGAGATCCTTTTAACACCCATGCTGTCTGGGATTCTTTGGAACAATTGATGGCTTTGCAATCAGGTATTGATTTGGATTTGTTTAGACATTTCAAGAACGATTTGACCTTGTCCGCTGAAGAATCTGAATATTTGTATAAAAACAACTTGGTCGGTGAACAAATTAGAACTCAAAATAAATTGGCCTTGGATTTGCAAGATGGTGAATTTGTCGTCAAAACTTATATTTACCCAGCTTTGAAGAGTTTGGCTACCGGTAGATCAATTCATGAATTGGTTTTTGGTTCTGCTTTTAGATGGAGTAAACAATATCCAGAATTGAGAAAGCCATTGGATACTTTGGAACAATACGTTTATAGTAGAGGTCCATCAAGTACAGCTTCTCCAAGATTGTTGTCTTGTGATTTGATTGATCCTACAAAATCTAGAATCAAGATTTATTTGTTGGAAAGAATGGTCACTTTGGAAGCTTTGGAAGATTTGTGGACTATGGGTGGTGAAAGAACTGATGCTTCCACTTTGGCTGGTTTGGAAATGATAAGAGAATTGTGGGAATTGATTAGATTGCCAGCTGGTTTGCAATCTTATCCTGCTCCATATTTGCCAATTGGTACTATACCAGACGAACAATTGCCATTAATGGCTAATTATACTATCCACCATGATGATCCAGTTCCAGAACCTCAAGTTTATTTTACTACTTTTGGTAGAAACGACATGCAAATTGCTGACGCCTTAGCTACTTTTTTTGAAAGAAGAGGTTGGCATGAAATGGCAAGACAATATAAAGCTGAATTGTGTTCTCATTACCCACATGCCGATCATGAAACATTGAACTATTTGCATGCTTATATCTCTTTCTCTTACAGAAAAAATAAACCATATTTGTCTGTTTATTTGCAATCTTTGGAAACTGGTGATTGGGTTACTTCTTCTTTTAATTCTGTTCATGTTGATCCAGGTTTGTCTGCTACTGTTCAAGAATTGTCTAAATTGACTAAAACTGCTGGTACTACTGTTAGAGAAACTAAATTGCCATTGACTCCAGATGGTTCTGAACCAGGTGTTATTACTCAATATTAAAGGAGACCGCGGCCGC
easF:序列如SEQ ID No.2所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGACAATCTCCGCCCCACCAATTATTGACATTAGACAAGCCGGTTTGGAATCCTCCATTCCAGACCAAGTTGTTGAAGGTTTGACCAAAGAAGTTAAAACCTTGCCAGCATTGTTGTTTTATTCCACTAAAGGTATACAACACTGGAACAGACACTCTCATGCCGCAGATTTTTACCCAAGACACGAAGAATTGTGTATTTTGAAGGCTGAAGCTTCTAAAATGGCTGCTTCTATTGCTCAAGACTCATTAGTTATTGATATGGGTTCCGCTTCTATGGATAAAGTTATTTTGTTATTGGAAGCCTTGGAAGAACAAAAAAAATCTATTACTTATTATGCTTTGGATTTGTCTTATTCTGAATTGGCTTCTAATTTTCAAGCTATTCCAGTTGATAGATTTCATTATGTTAGATTTGCTGCTTTGCATGGTACTTTTGATGATGGTTTGCATTGGTTGCAAAATGCTCCAGATATTAGAAATAGACCAAGATGTATTTTGTTGTTTGGTTTGACTATTGGTAATTTTTCTAGAGATAATGCTGCTTCTTTTTTGAGAAATATTGCTCAATCTGCTTTGTCTACTTCTCCAACTCAATCTTCTATTATTGTTTCTTTGGATTCTTGTAAATTGCCAACTAAAATTTTGAGAGCTTATACTGCTGATGGTGTTGTTCCATTTGCTTTGGCTTCTTTGTCTTATGCTAATTCTTTGTTTCATCCAAAAGGTGATAGAAAAATTTTTAATGAAGAAGATTGGTATTTTCATTCTGAATGGAATCATGCTTTGGGTAGACATGAAGCTTCTTTGATTACTCAATCTAAAGATATTCAATTGGGTGCTCCATTGGAAACTGTTATTGTTAGAAGAGATGAAAAAATTAGATTTGGTTGTTCTTATAAATATGATAAAGCTGAAAGAGATCAATTGTTTCATTCTGCTGGTTTGGAAGATGCTGCTGTTTGGACTGCTCCAGATTGTGATGTTGCTTTTTATCAATTGAGATTGAGATTGAATTAAAGGAGACCGCGGCCGC
easE:序列如SEQ ID No.3所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGGGTCAATCTAGAGGTATATTAGGTGGTGTTAGACAATTAATTTTGGTCATTTTGGTCGGTGCTTATTTATCTAGATTATCTGCTGTTGATGACGACAGACACGACTGTAGATGTAGACCAGGTGAACCATGTTGGCCAACTGTTTCTCATTGGTCTACTTTGAATGAATCTATTGGTGGTGCTTTGGCTCATGTTAAACCTATTGCTCATGTTTGTCATCAATCTGGTCAAGATTCTTCTGCTTGTGAACAAGTTTTGCAAGAATCTTTGGACTCCAAATGGAGAGCTTCTCATACTGGTGCTTTGCAAGATTGGGTTTGGGAAGGTGGTGCTGAATCTAATCAAACATGTTATTATTTGAGATCCGGTCCAGCTGGTAGTTGTCATCAAGGTAGAATTCCATTGTATTCTGCTGCTGTTAAATCTGCTTCTGATGTTCAAAAAGTTGTTGATTTTACCAGACAACATAACTTGAGATTGGTTATTAGAAACACTGGTCATGATGGTAGTGGTAGATCCTCTGGTCCTGATTCTGTTGAAATTCATACTCATCATTTGAACTCTGTCCAATATCACCCAAATTTCAGACCAGCAGGTTCTTCTGAAAGACAAAGTGCCCCAGGTCAACCAGCTGTTACTGTTGGTGCTGGTATTTTATTGGGTGACTTATACGCTAGAGGTGCTTCTGAAGGTTGGATAGTTGTTGGTGGTGAATGTCCAACTGTAGGTGCTGCTGGTGGTTTTTTGCAAGGTGGTGGTGTTTCTTCTTGGTTGTCTTATGCTCATGGTTTGGCTGTTGATAATGTTTTGGAATATGAAGTTGTCACTGCTAAGGGTGAAATTGTTATTGCTAATGCTCATCAAAACCCTGATTTGTTTTGGGCTTTGAGAGGTGGTGGTGGTGGTACTTTTGGTGTTGTTACTCAAGCTACTTTGCAAGTTCATCCAGATTTGCCAGTTTCTGTTGCTGATGCTGTTGTTACTGGTTCTAGAGCTGATGCTACTTTTTGGTCACATGGTGTTGCTGCTTTGTTGAGAGCATTGCAATTTTTGAATAACCATGGTACTGCTGGTCAATTTATTTTGAGAAATACTGATGACGACACCGTTCAAGCTTCTTTGACTATGTATTTTTCTAACTTGACCGTTCCTGCTGTTGCTGATGAAAGAATGGACCCATTGAGAAGAGCTTTAGAACACAATGGTCACCCATATCAATTGACATCTAGATTTTTGCCTCAAATTTCTTCTACTTTCAGACATACTGCTGATAGATATCCAGAAGATTACGGTATTTTGATGGGTTCTGTTTTGGTTTCTTTGGATTTATTTAACTCCGCTACTGGTCCTGCTGCTTTAGCTCAACACTTTGCTAGATTGCCAATGACTCCAGATGATTTGTTGTTTACTAGTAATTTGGGTGGTAGAGTTTCTTCTTTGAATAGAGATCCAGCTTCTACTGCTATGCATCCAGGTTGGAGAGATGCTGCTCAATTGTTAAATTTTGTTAGAGGTGTTGGTGCTCCTTCTTTGGCTGCTAAGGCTACTGCTTTGCATGAATTGCAAACTGTTCAAATGGCTAGATTGTATGAAATTGAACCAGCTTTTCAAATCAGTTATAGAAATTTGGGTGACCCATCTGAAAGAAGATCAAGAGAAGTTTACTGGGGTTCTAATTATGCTAGATTGGTTGAAGTTAAGAGAAGATGGGACCCAGAAGGTTTGTTTTTTTCCAAGTTGGGTATTGATGGTGATGCTTGGGATGCAGAAGGTATGTGTAGACAAACTAGACAAGGTGCTTGGAATGTTGCTGTTAAATGGGTTCAATCTTTTTTGGGTTCTTTGTCTGCTAGTGTTGTTTAAAGGAGACCGCGGCCGC
easC:序列如SEQ ID No.4所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGGCACCAGACTCCAAACCAACATATACCACAGCCAACGGTTGCCCATTTCACAAGCCAGAAGGTCCACCAGCAGACGGTAGAACTTTGGCCTTGTCCGATCATCACTTGGTCGACACCTTGGCACATTTTAACAGAGAAAAAATTCCAGAAAGAGTTGTTCATGCTAAAGGTGCTGGTGCTTATGGTGAATTTGAAGTTACTGCTGATATTTCTGATATTTGTGATATTGATATGTTGGTTGGTGTTGGTAAAAAAACTCCATGTGTTACTAGATTTTCTACTACTGGTTTGGAAAGAGGTTCTAATGAAGGTATGAGAGATTTGAAAGGTATGGCTTGTAAATTTTATACTACTGAAGGTAATTGGGATTGGGTTATGTTGAATTTTCCATTTTTTTTTATTAGAGATCCAGTTAAATTTCCATCTTTGATGCATGCTCAAAGAAGAGATCCACAAACTAATTTGTTGAATCCAAATATGTATTGGGATTGGGTTACTAATAATCATGAATCTTTGCATATGGTTTTGTTGCAATTTTCTGATTTTGGTACTATGTTTAATTGGAGATCAATGTCTGGTTATATGGCTCATGCTTATAAATGGGTTAAACCAGATGGTTCTTTTAAATATGTTCATATTTTTTTGTCTTCTGATAGAGGTCCAAATTTTACTGATGGTCAACAAGCTAAAGGTACTAATGATTTGGACCCTGATCATGCTACTAGAGATTTGTATGAAGCTATTGAAAGAGGTGAATATCCAACTTGGACTGCTTCTGTTCAAGTTGTTGATCCAAAAGATGCTCCAAATTTGGGTTATAATATTTTGGATGTTACTAAACATTGGAATTTGGGTACTTATCCAAAAGATGTTACTTTGATTCCACCAAAAGTTTTTGGTAAATTGACTTTGAAAAGAAATCCAGCTAATTATTTTGCTGAAATTGAACAATTGGCTTATTCTCCATCTAATATGGTTCCAGGTGTTGCTCCATCTGAAGATCCAATTTTGCAAGCTAGAATTTTTGCTTATCCAGATGCTCAAAGATATAGATTGGGTGCTAATCATCAACAAATTCCAGTTAATAGATCAGCTCATACTTTTAATCCAATTGCTAGAGATGGTCAAGGTACTTTTGATGCTAATTATGGTGCTCATCCAGGTTTTTTGACTCAACAACAACCAGTTAGATTTGCTGAACCAAGAGAACCAGATCCAAAATATAATGAATGGTTGAAAGAAATTCAATCTAAATCTTGGTTGCAAACTACTGAACATGATTATAAATTTGCTAGAGATTTTTATGAAGTTTTGCCAGATTTTAGAGGTCAAGAATTTCAAGATACTATGGTTCAAAATATGGTTGAATCTGTTGCTCAAACTAGAGCTGAAATTCAAAAACAAGTTTATGAAACTTGGAAATTGGTTTCTCCAGCTTTGGCTGCTAGAATTCAAAAAGGTGTTGAAACTTTGTTGCAAAAATCTGAAGCTCCAGCTGAAGAATCTTTTATTCCAGCTAGATTGTAAAGGAGACCGCGGCCGC
easD_Cp:序列如SEQ ID No.5所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGCCATCCATGACCTCTAAAGTTTTTGCTATTACTGGTGGTGCTTCTGGTATTGGTGCTGCTACATGTAGATTGTTGGCTGAAAGAGATGCTGCTGTTATTTGTTTGGCTGATGTTTCTTCTACTAATTTTACTTCTTTGCAAGAATCCATTGCTAAATCTAATCCATCTACTTTGGTTCATTGTACTGAATTGGATGTTAGATCAGCTGATAAGGTTGATCAATGGTTGCAATCTATTGTTTCTACTCATGGTGATTTACATGGTGCTGCTAATGTTGCTGGTATTGCTCAAGGTGCTGGTTTGAGAGCTACTCCAACTATTTTGGAAGAAAATGATGCTGAATGGTCTAGAATTTTGGATGTTAATTTGAACGGTGTTTTCTATTCTACTAGAGCTCAAGTTAGAGTTATGAAAGATTTGCCACCAGGTCATAGATCAATTGTTAATGTTGCTTCTATTGCTGCTTTTTCTCATGTTCCAGATGTTTATGCTTATGGTACTTCTAAATCCGCTTGTGCTTACTTGACTACCTGTATTGCTGCTGATGTTTTTTGGTCTGGTATTAGAGTTAATTGTGTTTCTCCTGGTATTACTAACACTCCAATGTTGCCACAATTTGAACCTAAAGCTAAATCTTTGGATGCTATTAAAGATATGTACAGAGATCAAGGTTACCCAACTGGTGAAGCTGATGGTGTTGCTAGAACAATTGTTTGGTTATTGAGTGAAGATTCTATTCCAGTTTACGGTGCTAATATTAATGTTGGTGCTTGTCCACCATAAAGGAGACCGCGGCCGC
easD_Af:序列如SEQ ID No.6所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGGCATCCGTTGAAAGTAGAATTATTGCTATTACTGGTGGTGCTTCCGGTATTGGTGCTGCTACATGTAGATTGTTGGCTGAAAGAGGTGCTGCTGTTTTGTGTGTTTGTGATATTTCTCCTAAAAACTTCGATGATTTGAAGATTTCTATTAAGAAGATTAACCCATCCACTAAAGTTCATTGTGCTACTGTTGATGTTACATCTTCTGTTGAAGTTAGACAATGGATTGAAGGTATTATTTCTGATTTCGGTGATTTGCATGGTGCTGTTAATGCTGCTGGTATTGCTCAAGGTGCTGGTATGAGAAATACTCCTACAATTGCTGAAGAAGTTGATGAAGAATGGACTAGAATTATGAATACTAACTTGAACGGTGTTTTCTATTGTACTAGAGAAGAAGTTAGAGCTATGAAAGGTTTGCCAGCTACTGATAGATCCATTGTTAATGTTGGTAGTATTGCTTCTGTTTCCCATATGCCAGATGTTTACGCTTATGGTACCTCTAAAGGTGCTTGTGCTTATTTTACCACTTGTGTTGCTGCTGATGCTTTTCCTTTGGGTATTAGAATTAATAACGTTTCTCCTGGTGTTACTAATACTCCAATGTTGCCACAATTTGCTCCTATGGCTAAGACTTTTGAAGAAATTGAAGAATCTTACAAGAAGGAAGGTTTGTCTTTGATTGAAGCAGAAGATGTTGCTAGAACTATTGTTTGGTTGTTGTCTGAAGATAGTAGACCTGTTTTTGGTGCAAATATTAATGTTGGTGCTTGTATGCCATAAAGGAGACCGCGGCCGC
easG_NI:序列如SEQ ID No.7所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGGTTCAAATTTACTTGCCAAGATTGTCTATGAGATTAGGTTATCATGATAAGAACAACAAGATGACTATTTTGTTGACTGGTGGTAGAGGTAAAACTGCTTCTCATATTGCTTCCTTGTTGCAAGCTGCTAAAGTTCCATTTATTGTTGCAAGTAGATCCTCTGATCCATCATCTTCTTCCCCATATTATCAAAACTGTTTTGATTGGTTGGATGAAAAAACTTATGGTGATGTTTTGACTTCTAAAGATTCTATGCAACCAATTTCTACTATTTGGTTGGTTCCACCACCAATTTTTGATTTGGCTCCATTGATGATTAAATTTGTTGATTTTGCTTCTAGAAAAGGTGTTAAAAGATTTGTTTTGTTGTCTGCTTCTACTATTAAAAAAGGTGGTCCAGCTATGGGTCAAGTTCATGAATATTTGGCTTCTTTGGGTGGTATTGAATATGCTGTTTTGAGGCCTACTTGGTTTATGGAAAATTTTTCTTATCCACAAGAATTGCAAAGATTGGCTATTAAAAATGAAAATAAAATTTATTCTGCTGCTGGTGATGGTAAATTGCCATTTGTTTCTGTTGCTGATATTGCTAGAGTTGCTTTTAGAACTTTGACTGATGAAAAATCTCATAATACTGATTATGTTTTGTTGGGTCCAGAATTGATTACTTATGATCAAGTTGCTGAAACTTTGTCTACTGTTTTGGGTAGAACTATTACTCATATTAAATTGACTGAAGAAGAATTGGTTAAAAGATTGGAAAATTCTGGTATGCCAGCTGAAGATGCTAAAATGTTGGCTGGTATGGATACTTCTATTTCTGATGGTGCTGAAGATAGATTGAATAATGTTGTTAAACATGTTACTGGTGCTGATCCAAGAACTTTTTTGGATTTTGCTACTCATCAAAAAGCTACTTGGGGTTAAAGGAGACCGCGGCCGC
easG_Cp:序列如SEQ ID No.8所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGACAGTTTTGTTGACCGGTGGTACCGGTAGAACCGCTAAACATATTGCTGGTATTTTTAGACAAACCAACGTTCCATTTTTGGTTGCTTCTAGATCCTCTTCCGCTGGTACCGCTGAAAATCATAGAAAATTTGATTGGTTGGATGAAGAAACTTTCCCAAACGCTTTGTCAGTTGATCAAGGTATGAAGCCTATTTCTGTTGTTTGGTTGTGTCCTCCACCATTGTATGATTTGGCTACTCCAGTTATTAAATTCATTGATTTCGCTGTTTCCCAAAATGTTAAGAAGTTTGTTTTGTTGTCCGCTTCCGTTATTCAAAAGGGTGGTCCTGCTATGGGTAAGATTCATGGTCATTTGGATAGTATTAAGGATGTTACTTACACTGTTTTGAGGCCTACTTGGTTTATGGAAAATTTTTCTACTAAGGGTGAAATTCAATGTGAAGCTATTAGAAGAGATTCTACTGTTTATTCTGCTACAGAAAATGGTAAAATTCCTTTCATTTCCGTTGTTGATATTGCTAGAGTTGCTGCTTGTGCTTTGACTGCTGAAACTTTGAAAAATTCTGATCATATTTTGCAAGGTCCAGATTTGTTGACTTATGATGAAGTTGCTCAAGCTTTGACTGGTGTTTTGGGTAGAAAAATTACTCATACTAAGATGACTGAAGGTGAATTGGCTGAAAAATTAATGGAAGAAGGTGTTACTCCTGAAGAAGCTTATATGCATGCTGCTATGGATTCTATGATTAAGTCTGGTTCAGAAGAAAGAGTTGTTTCTGATGAAGTTAAAGAATGGACTGGTGTTAAACCAAGAGGTTTTATTAATTTCGCTTTGTCTGAAAAGGCTGCTTGGAGAGCTAGAAAGTAAAGGAGACCGCGGCCGC
easG_Af:序列如SEQ ID No.9所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGACAATTTTGGTTTTGGGTGGTAGAGGTAAGACTGCTTCTAGATTGTCCTTGTTGTTGGATAATGCTGGTGTTCCATTTTTGGTTGGTTCTTCTTCTACTTCTTATGTTGGTCCATATAAGATGACTCATTTTGATTGGTTGAACGAAGATACTTGGACTAATGTTTTTTTGAGAGCTTCTTTGGATGGTATTGATCCTATTTCTGCTGTTTATTTGGTTGGTGGTCATGCTCCTGAATTGGTTGATCCTGGTATTAGATTTATTAACGTTGCTAGAGCTCAAGGTGTTAATAGATTTGTTTTGTTGTCTGCTTCTAACATTGCTAAGGGTACTCATTCTATGGGTATTTTGCATGCTCATTTGGATTCTTTGGAAGATGTTCAATATGTTGTTTTGAGGCCTACTTGGTTTATGGAAAATTTGTTGGAAGATCCACATGTTTCTTGGATTAAAAAGGAAGATAAGATTTACTCCGCTACTGGTGATGGTAAAATTCCATTCATTAGTGCTGATGATATTGCAAGAGTTGCTTTTTCAGTTTTGACAGAATGGAAAAGTCAAAGAGCTCAAGAATATTTTGTTTTGGGTCCAGAATTGTTGTCTTATGATCAAGTTGCTGATATTTTGACTACTGTTTTAGGTAGAAAGATTACTCATGTTTCATTGGCTGAAGCTGATTTGGCTAGATTGTTGAGAGATGATGTTGGTTTGCCTCCTGATTTTGCTGCTATGTTGGCTTCTATGGAAACCGATGTTAAGCATGGTACTGAAGTTAGAAATTCTCATGATGTTAAGAAGGTTACAGGTAGTTTGCCATGTTCTTTTTTGGATTTTGCTGAACAAGAAAAGGCTAGATGGATGAGACATTAAAGGAGACCGCGGCCGC
easA_NI:序列如SEQ ID No.10所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGTCAACCTCTAACTTGTTTACCCCATTGCAATTTGGTAAATGTTTGTTGCAACATAAGTTGGTTTTGTCCCCAATGACCAGATTTAGAGCTGATAACGAAGGTGTTCCATTGCCATATGTTAAAACTTACTATTGTCAAAGAGCTTCTTTGCCAGGTACTTTGTTGTTGACCGAAGCAACTGCTATTTCCAGAAGAGCTAGAGGTTTTCCAAATGTTCCAGGTATTTGGTCACAAGAACAAATTGCTGGTTGGAAAGAAGTTGTTGATGCTGTTCATGCTAAGGGTTCTTATATTTGGTTGCAATTGTGGGCTACTGGTAGAGCTGCTGAAGTTGGTGTTTTGAAAGCTAATGGTTTTGATTTGGTTTCTTCTTCTGCTGTTCCTGTTTCTCCTGGTGAACCAACTCCAAGAGCTTTGTCTGATGATGAAATTAATTCCTATATTGGTGATTTCGTTCAAGCTGCTAAAAATGCTGTTTTGGAAGCTGGTTTTGATGGTGTTGAATTGCATGGTGCTAACGGTTTTTTGATTGATCAATTTTTGCAATCCCCTTGTAATCAAAGAACTGATCAATGGGGTGGTTGTATTGAAAATAGATCAAGATTTGGTTTGGAAATTACCAGAAGAGTTATTGATGCTGTTGGTAAAGATCATGTTGGTATGAAATTGTCTACTTGGAGTACTTTTCAAGGTATGGGTACTATGGATGATTTGATTCCTCAATTTGAACATTTCATTATGAGATTGAGAGAAATTGGTATTGCATATTTGCATTTGGCTAATTCTAGATGGGTTGAAGAAGAAGATCCAACAATTAGAACTCATCCAGATATTCATAACGAAACTTTTGTTAGAATGTGGGGTAAAGAAAAGCCAGTTTTATTGGCTGGTGGTTATGGTCCAGAATCTGCTAAATTGGTTGTTGATGAAACTTATTCCGATCATAAAAACATTGGTGTTGTTTTTGGTAGACATTATATTTCAAACCCTGATTTGCCTTTTAGATTGAAGATGGGTTTACCATTGCAAAAATATAACAGAGAAACCTTTTACATTCCATTCTCTGATGAAGGTTATTTGGATTATCCATACTCCGAAGAATATATTACTGAAAATAAGAAGCAAGCTGTTTTGGCATAAAGGAGACCGCGGCCGC
easA_Cf:序列如SEQ ID No.11所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGTCATCCTCTAACTTGTTTAAGCCAATTCCATTGGGTAGAAAAGTTTTGCAACATAAAGTTGTTTTGTCCCCAATGACCAGATTCAGAGCTGATAACGATGGTGTTCCATTGTCCTACGTTAAATCTTATTATGGTCAAAGAGCTTCCATTAGAGGTACTTTGTTGATTACAGAAGCTGTTGCTATTTGTCCAAGAGCAAAGGGTTTTTCTAATTGTCCAGGTATTTGGCATCAAGATCAAATTGCTGCATGGAAAGAAGTTGTTGATGAAGTTCATTCTAAGGGTTCAGTTATTTGGTTGCAATTGTGGGCTACTGGTAGAGCTTCTGATGCTGATACTTTAAAAGAATCAGGTTTTCATTTGGAATCCTCTAGTGATGTTCCAGTTGCTCCTGGTGAACCAGTTCCAAGACCTTTGTCAGAAGATGAAATTGAATCATATATTAGAGATTACGTTACCGGTGCTATTAATGCTGTTCAAGGTGCTGGTTTCGATGGTATTGAAATTCATGGTGCTAATGGTTTTTTGGTTGATCAATTTTTGCAAGCTTCTTGTAATACTAGAGCTGATCAATGGGGTGGTTCTATTGAAAATAGAAGTAGATTTGGTTTGGAAATTACCAGAAGAGTTGTTGATGCTGTTGGTAAAGATAGAGTTGGTGTTAAATTGTCTCCTTGGTCAACTTTTCAAGGTATGGGTACTATGGATGATTTGGTTGCTCAATTTGAACATTTTATTTCCAGATTGAGAGAAATGGATATTGCTTATATTCATTTGGTTAACACCAGATGGTTGGAAGAAGAAGAACCAGGTATTAAAACTCATCCAGATGTTGATAACCAAACTTTCGTTAGAATGTGGGGTAATAAGACCCCAATTTTATTGGCAGGTGGTTATGATGCAGATAGTGCTAGAAGATTGGTTGATGAAACATATTCCGATCAAAATAACATTATGGTTGTTTTCGGTAGACATTATATTTCTAACCCAGATTTGCCTTTTAGATTGAGATTGGGTATTCCATTGCAAAAATATAACAGAGATACCTTTTACATTCCATTCTCTGATGAAGGTTATTTGGATTATCCATTTTGTCAAGAATTCTTGGATCAACAAGATGTTGATCAAGTTGTTGTTGCTGCTTAAAGGAGACCGCGGCCGC
easA_Cp:序列如SEQ ID No.12所示
GCGGCCGCGGTCTCCAATGTCAACCTCTAACTTGTTTTCCACCGTTCCATTTGGTAAAAATGTTTTGAACCATAAGATTGTTTTGTCCCCAATGACCAGATTTAGAGCTGATGATAACGGTGTTCCATTGTCTTATATGAAAACTTTTTACGCTCAAAGAGCTTCTGTTAGAGGTACTTTGTTGGTTACTGATGCTGTTGCTATTTGTCCAAGAACAAAAGGTTTTCCAAATGTTCCAGGTATTTGGCATAAAGATCAAATTGCTGCTTGGAAAGAAGTTGTTGATGAAGTTCATTCAAAGGGTTCTTTTATTTGGTTGCAATTGTGGGCTACTGGTAGAGCTGCTGATTTGGAAGCTTTGACTTCTCAAGGTTTGAAATTGGAATCTTCTTCTGAAGTTCCTGTTGCTCCAGGTGAACCAACTCCTAGAGCTTTGGATGAAGATGAAATTCAACAATATATTTTGGATTACGTTCAAGGTGCTAAAAATGCTGTTCATGGTGCTGGTTTTGATGGTGTTGAAATTCATGGTGCTAACGGTTTTTTGATTGATCAATTTTTGCAATCCTCCTGTAATAGAAGAACTGATCAATGGGGTGGTTCCATTGAAAATAGAAGTAGATTTGGTTTGGAAATTACCAGAGGTGTTGTTGATGCTGTTGGTCATGATAGAGTTGGTATGAAATTGTCTCCATGGTCAACTTTTCAAGGTATGGGTACTATGGATGATTTGGTTCCTCAATTTGAACATTTTATTACCTGTTTGAGAGAAATGGATATTGCTTATTTGCATTTGGCTAATTCTAGATGGGTTGAAGAAGAAGATCCATCTATTAGAACTCATCCAGATTTTCATAACCAAACTTTTGTTCAAATGTGGGGTAAAAAGAGGCCTATTTTGTTGGCTGGTGGTTATGATCCAGATTCTGCTAGAAGATTGGTTGATCAAACATATTCTGATAGAAACAACGTTTTGGTTGTTTTTGGTAGACATTATATTTCCAACCCAGATTTGCCTTTTAGATTGAGAATGGGTATTGCTTGTAGATCCACAATTGAAACTCATTCTATTTTCCCAGCAAGAGAAAGAGCTATGTGGACTATTCCATCCGTTAAGAATATTTAAAGGAGACCGCGGCCGC
第一表达模块的构建：将dmaW-easF插入到XV染色体的Δ22位点；采用多片段DNA酵母快速组装方法将片段Δ22上游同源臂，leu2 ORF，dmaW ORF，easF ORF，Δ22下游同源臂，与以氨苄为抗性选择性标记的载体利用同源重组的原理进行连接，各片段之间同源臂长度为20-50bp，在Δ22上下游同源臂两侧保留NotI位点；
第二模块的构建：将easE-easC插入到XVI染色体的Δ15位点；同样采用多片段DNA酵母快速组装方法将片段Δ15上游同源臂，G418 ORF，easE ORF，easC ORF，Δ15下游同源臂，与以氨苄为抗性选择性标记的载体利用同源重组的原理进行连接，各片段之间同源臂长度为20-50bp，在Δ15上下游同源臂两侧保留NotI位点；
内源模块ero1-fad1的构建：同第一表达模块和第二表达模块的构建方法相同，将ero1和fad1通过潮霉素的抗性标记插入到VIII染色体的Δ14位点；
第三表达模块的构建：选择将两个来源的easD插入GAL1/7/10位置，采用overlap-PCR将GAL1/7/10上游同源臂，easD ORF，GAL1/7/10上游同源臂三个片段连接在一起，胶收DNA产物进行测序，保证碱基序列未发生突变，工具切割质粒CRISPR-Cas9由实验室模块库提供。关于easG-easA模块的构建，选择采用无缝克隆方法将3个来源的easG和3个来源的easA 6个基因片段进行交叉组合连入实验室模块库表达盒WN416-URA3-FBA1t-(easG)-PGal110-(easA)-TDH2t中，得到9个表达盒，分别为：
WN416-URA3-FBA1t-easG_Cp-PGal110-easA_Cf-TDH2t，
WN416-URA3-FBA1t-easG_Cp-PGal110-easA_Cp-TDH2t，
WN416-URA3-FBA1t-easG_Cp-PGal110-easA_NI-TDH2t，
WN416-URA3-FBA1t-easG_Af-PGal110-easA_Cf-TDH2t，
WN416-URA3-FBA1t-easG_Af-PGal110-easA_Cp-TDH2t，
WN416-URA3-FBA1t-easG_Af-PGal110-easA_NI-TDH2t，
WN416-URA3-FBA1t-easG_NI-PGal110-easA_Cf-TDH2t，
WN416-URA3-FBA1t-easG_NI-PGal110-easA_Cp-TDH2t，
WN416-URA3-FBA1t-easG_NI-PGal110-easA_NI-TDH2t；
模块化整合构建生产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株：将构建好的表达模块一质粒和表达模块二质粒以及内源ero1-fad1表达质粒用not1酶切位点切割，获得整合片段Δ22上游同源臂-leu2-CYC1t-dmaW-PGal110-easF-ADH1t-Δ22下游同源臂、Δ15上游同源臂-KanR-CYC1t-easE-PGal110-easC-ADH1t-Δ15下游同源臂和Δ14上游同源臂-hphMX6-CYC1t-ero1-PGal110-fad1-ADH1t-Δ14下游同源臂，采用醋酸锂法先将整合片段Δ22上游同源臂-leu2-CYC1t-dmaW-PGal110-easF-ADH1t-Δ22下游同源臂导入底盘菌株yCTH中，转化后采用SD-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为SyBE_Sc06130001。采用同样的方法将Δ15上游同源臂-KanR-CYC1t-easE-PGal110-easC-ADH1t-Δ15下游同源臂导入菌株SyBE_Sc06130001中，获得正确的重组菌株并保存甘油菌命名为SyBE_Sc06130002。再采用同样的方法将Δ14上游同源臂-hphMX6-CYC1t-ero1-PGal110-fad1-ADH1t-Δ14下游同源臂导入菌株SyBE_Sc06130002中，获得正确的重组菌株并保存甘油菌命名为SyBE_Sc06130008。然后将overlap程序获得的两个片段GAL1/7/10上游同源臂-PGal7-easD_A-GPM1t-GAL1/7/10上游同源臂和GAL1/7/10上游同源臂-PGal7-easD_Cp-GPM1t-GAL1/7/10上游同源臂通过醋酸锂法分别与CRISPR-Cas9质粒一起导入菌株SyBE_Sc06130008中，获得正确的重组菌株并保存甘油菌分别命名为SyBE_Sc06130018和SyBE_Sc06130019。最终将easG-easA的9个表达盒分别导入SyBE_Sc06130018和SyBE_Sc06130019，共获得18株产田麦角碱的菌种，依次命名为SyBE_Sc06130020--SyBE_Sc06130037。
此外，本发明还提供了所述菌株在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；所述药物包括麦角酸衍生物。
基于上述研究，本发明还提供了合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物的方法，取所述菌株，培养，获得田麦角碱；取所述田麦角碱制备获得麦角生物碱和/或药物；所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；所述药物包括麦角酸衍生物。
本发明提供了生产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：将合成田麦角碱的外源路径涉及到的七个外源基因dmaW，easF，easE，easC，easD，easG，easA划分为三个模块：dmaW-easF为第一个模块，easE-easC为第二个模块，easD，easG-easA为第三个模块。以一株高产DMAPP的重组酿酒酵母为底盘菌株，通过第一个模块和第二个模块的整合，获得生产裸麦角碱的重组酿酒酵母菌株，由于easE的N端具有定位于内质网的信号肽，并且与二硫化物的形成有关，且属于FAD依赖型功能酶，对此作者设计将ero1和fad1进行了过表达；对第三个模块进行来源组合筛选，其中easD包括两个来源，easG和easA分别包括三个来源，筛选获得生产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株。
本发明所用的酿酒酵母菌株名称为CEN.PK2-1D，但酿酒酵母不止这一种，除了CEN.PK系列以外，还有BY系列等；此外，本发明也不限于仅保护在酿酒酵母中的应用，其他酵母(如解脂属酵母、克鲁维属酵母等)、藻类、霉菌(链霉菌等)和细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)中的应用也在本发明的保护范围之内。关于easD，easG，easA的来源，本发明所用的来源为easD(来源：Aspergillus fumigatus和Claviceps purpurea),easG(来源：Claviceps purpurea，Aspergillus fumigatus和N.lolii),easA(来源：Clavicepspurpurea，C.fusiformis和N.lolii)，最佳来源组合为easD(来源：Claviceps purpurea)，easG(来源：Claviceps purpurea)，easA(来源：C.fusiformi)。
本发明的有益效果包括但不限于：本发明提供了在酿酒酵母中从头构建合成田麦角碱的方法，easA成功筛选到一个新的来源，克服了在关键分支点合成田麦角碱的难点，进一步解析了田麦角碱的合成路径，为麦角生物碱的异源合成奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示利用重组酿酒酵母合成田麦角碱的路径图；
图2示外源路径基因dmaW-easF表达盒质粒构建及整合入基因组的过程图；
图3示外源路径基因easE-easC表达盒质粒构建及整合入基因组的过程图；
图4示内源路径基因ero1-fad1表达盒质粒构建及整合入基因组的过程图；
图5(A)示外源基因easD进化树构建图；图5(B)示外源基因easA进化树构建图；图5(C)示外源基因easG进化树构建图；
图6示外源路径基因easD，easA-easG表达盒质粒构建过程图；
图7示不同来源组合的外源基因easD,easG,easA产生的田麦角碱结果图。
具体实施方式
本发明公开了重组酿酒酵母菌株及其构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的重组酿酒酵母菌株及其构建方法中，所用底盘菌株及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1高产DMAPP重组酿酒酵母(底盘菌株)的获得
底盘菌株由天津大学元英进课题组提供，菌株编号为yCTH。该重组酿酒酵母所包含的基因改造为：在GAL80处通过强启动子GAL110过表达了IDI1和tHMGR，通过弱启动子HXT1p替换原ERG20启动子下调ERG20的表达。
实施例2外源功能基因元件的获得
外源基因为dmaW(来源：Aspergillus japonicus)，easF(来源：Aspergillusfumigatus)，easE(来源：Aspergillus japonicus)，easC(来源：Aspergillus japonicus)，easD(来源：Aspergillus fumigatus、简写为Af；Claviceps purpurea、简写为Cp)，easG(来源：Claviceps purpurea、简写为Cp；Aspergillus fumigatus、简写为Af；N.lolii、简写为NI)，easA(来源：Claviceps purpurea、简写为Cp；C.fusiformis、简写为Cf；N.lolii、简写为NI)，其均经过酿酒酵母密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后，在基因两端额外添加5’端GCGGCCGCGGTCTCCA，3’端TAAAGGAGACCGCGGCCGC通过人工合成得到。
实施例3模块化整合质粒的构建
考虑到遗传稳定表达的因素，作者设计将模块一和模块二分两步整合到基因组上，模块三涉及到不同来源的组合，其中easD包括两个来源，easG和easA分别包含三个来源，将获得18种结果，对此作者选择将两个来源的easD利用CRISPR系统整合到基因组上，easG-easA以单拷贝质粒的形式进行筛选高产田麦角碱的菌株。
模块一的构建：dmaW-easF选择将其插入到XV染色体的Δ22位点，采用多片段DNA酵母快速组装方法将片段Δ22上游同源臂，leu2 ORF，dmaW ORF，easF ORF，Δ22下游同源臂，与以氨苄为抗性选择性标记的载体利用同源重组的原理进行连接，各片段之间同源臂长度为20-50bp，在Δ22上下游同源臂两侧保留NotI位点。采用醋酸锂法将以上片段转化到空白酵母中，转化后采用SD-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，挑选得到的转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落接种到5mlSD-LEU液体(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L)培养基中过夜培养，提取质粒回转到大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
模块二的构建：easE-easC选择将其插入到XVI染色体的Δ15位点，同样采用多片段DNA酵母快速组装方法将片段Δ15上游同源臂，G418 ORF，easE ORF，easC ORF，Δ15下游同源臂，与以氨苄为抗性选择性标记的载体利用同源重组的原理进行连接，各片段之间同源臂长度为20-50bp，在Δ15上下游同源臂两侧保留NotI位点。采用醋酸锂法将以上片段转化到空白酵母中，转化后采用YPD-G418固体板(20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，2％的琼脂粉，200mg/L的G418)进行筛选，挑选得到的转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的单菌落接种到5ml YPD-G418液体(20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，200mg/L的G418)培养基中过夜培养，提取质粒回转到大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
内源模块ero1-fad1的构建：同模块一和模块二的构建方法相同，选择将ero1和fad1通过潮霉素的抗性标记插入到VIII染色体的Δ14位点。
模块三的构建：
选择将两个来源的easD插入GAL1/7/10位置，采用overlap-PCR将GAL1/7/10上游同源臂，easD ORF，GAL1/7/10上游同源臂三个片段连接在一起，胶收DNA产物进行测序，保证碱基序列未发生突变，工具切割质粒CRISPR-Cas9由实验室模块库提供。关于easG-easA模块的构建，选择采用无缝克隆方法将3个来源的easG和3个来源的easA 6个基因片段进行交叉组合连入实验室模块库表达盒。
WN416-URA3-FBA1t-(easG)-PGal110-(easA)-TDH2t中，得到9个表达盒，分别为：WN416-URA3-FBA1t-easG_Cp-PGal110-easA_Cf-TDH2t；
WN416-URA3-FBA1t-easG_Cp-PGal110-easA_Cp-TDH2t；
WN416-URA3-FBA1t-easG_Cp-PGal110-easA_NI-TDH2t；
WN416-URA3-FBA1t-easG_Af-PGal110-easA_Cf-TDH2t；
WN416-URA3-FBA1t-easG_Af-PGal110-easA_Cp-TDH2t；
WN416-URA3-FBA1t-easG_Af-PGal110-easA_NI-TDH2t；
WN416-URA3-FBA1t-easG_NI-PGal110-easA_Cf-TDH2t；
WN416-URA3-FBA1t-easG_NI-PGal110-easA_Cp-TDH2t；
WN416-URA3-FBA1t-easG_NI-PGal110-easA_NI-TDH2t。
实施例4模块化整合构建生产田麦角碱的重组酿酒酵母菌株
将构建好的表达模块一质粒和表达模块二质粒以及内源ero1-fad1表达质粒用not1酶切位点切割，获得整合片段Δ22上游同源臂-leu2-CYC1t-dmaW-PGal110-easF-ADH1t-Δ22下游同源臂、Δ15上游同源臂-KanR-CYC1t-easE-PGal110-easC-ADH1t-Δ15下游同源臂和Δ14上游同源臂-hphMX6-CYC1t-ero1-PGal110-fad1-ADH1t-Δ14下游同源臂，采用醋酸锂法先将整合片段Δ22上游同源臂-leu2-CYC1t-dmaW-PGal110-easF-ADH1t-Δ22下游同源臂导入底盘菌株yCTH中，转化后采用SD-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为SyBE_Sc06130001。采用同样的方法将Δ15上游同源臂-KanR-CYC1t-easE-PGal110-easC-ADH1t-Δ15下游同源臂导入菌株SyBE_Sc06130001中，获得正确的重组菌株并保存甘油菌命名为SyBE_Sc06130002。再采用同样的方法将Δ14上游同源臂-hphMX6-CYC1t-ero1-PGal110-fad1-ADH1t-Δ14下游同源臂导入菌株SyBE_Sc06130002中，获得正确的重组菌株并保存甘油菌命名为SyBE_Sc06130008。然后将overlap程序获得的两个片段GAL1/7/10上游同源臂-PGal7-easD_Af-GPM1t-GAL1/7/10上游同源臂和GAL1/7/10上游同源臂-PGal7-easD_Cp-GPM1t-GAL1/7/10上游同源臂通过醋酸锂法分别与CRISPR-Cas9质粒一起导入菌株SyBE_Sc06130008中，获得正确的重组菌株并保存甘油菌分别命名为SyBE_Sc06130018和SyBE_Sc06130019。最终将easG-easA的9个表达盒分别导入SyBE_Sc06130018和SyBE_Sc06130019，共获得18株产田麦角碱的菌种，依次命名为SyBE_Sc06130020--SyBE_Sc06130037。
表1
Figure BDA0003044707820000151
Figure BDA0003044707820000161
实施例5筛选easD，easG，easA不同来源组合的菌株中田麦角碱最高产的菌株
试验材料：菌株SyBE_Sc06130020-SyBE_Sc06130037
试验方法：
种子培养基：SD-URA液体培养基(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸、亮氨酸、组氨酸以100*母液形式回补)；
发酵培养基：SD-URA液体培养基(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖40g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸、亮氨酸、组氨酸以100*母液形式回补)。
将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.2分别接种于50mL发酵培养基中，于22℃、220rpm条件下培养120h，监测发酵终期的菌体密度(OD600)及田麦角碱的产量。
田麦角碱的定量检测方法：取发酵终期的发酵液1ml，5000r离心分离菌体，收集上层清液，准备进行LC-MS检测所需的样品，用乙腈配制标品田麦角碱的母液得测标曲。通过QExactive HF orbitrap质谱仪与Ultimate3000 RSLC nano(Thermo Fisher Scientific,USA)在正离子模式下进行LC-MS/MS分析。采用BEH酰胺柱(2.1mm x 100mm,Waters,USA)进行LC分离。流动相A为100％乙腈+0.1％甲酸；流动相B为水+0.1％甲酸。梯度洗脱，5％(A)至95％(A)，流速0.3mL/min,20min。前体的质量分辨为120000。离子源其他详细参数如下：喷雾电压，正极为3.5kV；毛细管温度：320℃；鞘气流量(arb)，40；aux气体流量(arb)，10；探头加热器温度：350℃；质量范围(m/z)，100-500。
试验结果如图7、表2所示：
表2图7原始数据
Figure BDA0003044707820000162
Figure BDA0003044707820000171
在18株菌株中，经过对每株菌田麦角碱产量的统计发现，其中编号为SyBE_Sc06130032的产量最高，最高产量为421.388μg/L，通过对easA的来源归类整理发现，与来源于C.fusiformis的easA进行组合的菌株普遍高于easA的其他两个来源组合，其中Claviceps purpurea的组合产量均最差。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学，中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 重组酿酒酵母菌株及其构建方法
<130> MP21007774
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1472
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggccgcgg tctccaatga cagccggtca aggtataaaa acaggtaatg cttcagattg 60
tgaagtctac agaacattgt ccgtcgcctt ggactttgcc aaccaagacg aagaattgtg 120
gtggcactct actgctccaa tgtttgctca aatgttgcaa agtactaatt acaatttgca 180
cgctcaatat aagcatttgt tgatttataa gaagaacgtc atcccatttt tgggtgttta 240
tcctactaat gataagccaa gatggttatc tattttgaca agatatggta caccattcga 300
attatctttg aactgtagtg gtcctttggt cagatatact tatgaaccta ttaacgctgc 360
tactggtact gcaagagatc cttttaacac ccatgctgtc tgggattctt tggaacaatt 420
gatggctttg caatcaggta ttgatttgga tttgtttaga catttcaaga acgatttgac 480
cttgtccgct gaagaatctg aatatttgta taaaaacaac ttggtcggtg aacaaattag 540
aactcaaaat aaattggcct tggatttgca agatggtgaa tttgtcgtca aaacttatat 600
ttacccagct ttgaagagtt tggctaccgg tagatcaatt catgaattgg tttttggttc 660
tgcttttaga tggagtaaac aatatccaga attgagaaag ccattggata ctttggaaca 720
atacgtttat agtagaggtc catcaagtac agcttctcca agattgttgt cttgtgattt 780
gattgatcct acaaaatcta gaatcaagat ttatttgttg gaaagaatgg tcactttgga 840
agctttggaa gatttgtgga ctatgggtgg tgaaagaact gatgcttcca ctttggctgg 900
tttggaaatg ataagagaat tgtgggaatt gattagattg ccagctggtt tgcaatctta 960
tcctgctcca tatttgccaa ttggtactat accagacgaa caattgccat taatggctaa 1020
ttatactatc caccatgatg atccagttcc agaacctcaa gtttatttta ctacttttgg 1080
tagaaacgac atgcaaattg ctgacgcctt agctactttt tttgaaagaa gaggttggca 1140
tgaaatggca agacaatata aagctgaatt gtgttctcat tacccacatg ccgatcatga 1200
aacattgaac tatttgcatg cttatatctc tttctcttac agaaaaaata aaccatattt 1260
gtctgtttat ttgcaatctt tggaaactgg tgattgggtt acttcttctt ttaattctgt 1320
tcatgttgat ccaggtttgt ctgctactgt tcaagaattg tctaaattga ctaaaactgc 1380
tggtactact gttagagaaa ctaaattgcc attgactcca gatggttctg aaccaggtgt 1440
tattactcaa tattaaagga gaccgcggcc gc 1472
<210> 2
<211> 1052
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggccgcgg tctccaatga caatctccgc cccaccaatt attgacatta gacaagccgg 60
tttggaatcc tccattccag accaagttgt tgaaggtttg accaaagaag ttaaaacctt 120
gccagcattg ttgttttatt ccactaaagg tatacaacac tggaacagac actctcatgc 180
cgcagatttt tacccaagac acgaagaatt gtgtattttg aaggctgaag cttctaaaat 240
ggctgcttct attgctcaag actcattagt tattgatatg ggttccgctt ctatggataa 300
agttattttg ttattggaag ccttggaaga acaaaaaaaa tctattactt attatgcttt 360
ggatttgtct tattctgaat tggcttctaa ttttcaagct attccagttg atagatttca 420
ttatgttaga tttgctgctt tgcatggtac ttttgatgat ggtttgcatt ggttgcaaaa 480
tgctccagat attagaaata gaccaagatg tattttgttg tttggtttga ctattggtaa 540
tttttctaga gataatgctg cttctttttt gagaaatatt gctcaatctg ctttgtctac 600
ttctccaact caatcttcta ttattgtttc tttggattct tgtaaattgc caactaaaat 660
tttgagagct tatactgctg atggtgttgt tccatttgct ttggcttctt tgtcttatgc 720
taattctttg tttcatccaa aaggtgatag aaaaattttt aatgaagaag attggtattt 780
tcattctgaa tggaatcatg ctttgggtag acatgaagct tctttgatta ctcaatctaa 840
agatattcaa ttgggtgctc cattggaaac tgttattgtt agaagagatg aaaaaattag 900
atttggttgt tcttataaat atgataaagc tgaaagagat caattgtttc attctgctgg 960
tttggaagat gctgctgttt ggactgctcc agattgtgat gttgcttttt atcaattgag 1020
attgagattg aattaaagga gaccgcggcc gc 1052
<210> 3
<211> 1898
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggccgcgg tctccaatgg gtcaatctag aggtatatta ggtggtgtta gacaattaat 60
tttggtcatt ttggtcggtg cttatttatc tagattatct gctgttgatg acgacagaca 120
cgactgtaga tgtagaccag gtgaaccatg ttggccaact gtttctcatt ggtctacttt 180
gaatgaatct attggtggtg ctttggctca tgttaaacct attgctcatg tttgtcatca 240
atctggtcaa gattcttctg cttgtgaaca agttttgcaa gaatctttgg actccaaatg 300
gagagcttct catactggtg ctttgcaaga ttgggtttgg gaaggtggtg ctgaatctaa 360
tcaaacatgt tattatttga gatccggtcc agctggtagt tgtcatcaag gtagaattcc 420
attgtattct gctgctgtta aatctgcttc tgatgttcaa aaagttgttg attttaccag 480
acaacataac ttgagattgg ttattagaaa cactggtcat gatggtagtg gtagatcctc 540
tggtcctgat tctgttgaaa ttcatactca tcatttgaac tctgtccaat atcacccaaa 600
tttcagacca gcaggttctt ctgaaagaca aagtgcccca ggtcaaccag ctgttactgt 660
tggtgctggt attttattgg gtgacttata cgctagaggt gcttctgaag gttggatagt 720
tgttggtggt gaatgtccaa ctgtaggtgc tgctggtggt tttttgcaag gtggtggtgt 780
ttcttcttgg ttgtcttatg ctcatggttt ggctgttgat aatgttttgg aatatgaagt 840
tgtcactgct aagggtgaaa ttgttattgc taatgctcat caaaaccctg atttgttttg 900
ggctttgaga ggtggtggtg gtggtacttt tggtgttgtt actcaagcta ctttgcaagt 960
tcatccagat ttgccagttt ctgttgctga tgctgttgtt actggttcta gagctgatgc 1020
tactttttgg tcacatggtg ttgctgcttt gttgagagca ttgcaatttt tgaataacca 1080
tggtactgct ggtcaattta ttttgagaaa tactgatgac gacaccgttc aagcttcttt 1140
gactatgtat ttttctaact tgaccgttcc tgctgttgct gatgaaagaa tggacccatt 1200
gagaagagct ttagaacaca atggtcaccc atatcaattg acatctagat ttttgcctca 1260
aatttcttct actttcagac atactgctga tagatatcca gaagattacg gtattttgat 1320
gggttctgtt ttggtttctt tggatttatt taactccgct actggtcctg ctgctttagc 1380
tcaacacttt gctagattgc caatgactcc agatgatttg ttgtttacta gtaatttggg 1440
tggtagagtt tcttctttga atagagatcc agcttctact gctatgcatc caggttggag 1500
agatgctgct caattgttaa attttgttag aggtgttggt gctccttctt tggctgctaa 1560
ggctactgct ttgcatgaat tgcaaactgt tcaaatggct agattgtatg aaattgaacc 1620
agcttttcaa atcagttata gaaatttggg tgacccatct gaaagaagat caagagaagt 1680
ttactggggt tctaattatg ctagattggt tgaagttaag agaagatggg acccagaagg 1740
tttgtttttt tccaagttgg gtattgatgg tgatgcttgg gatgcagaag gtatgtgtag 1800
acaaactaga caaggtgctt ggaatgttgc tgttaaatgg gttcaatctt ttttgggttc 1860
tttgtctgct agtgttgttt aaaggagacc gcggccgc 1898
<210> 4
<211> 1562
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggccgcgg tctccaatgg caccagactc caaaccaaca tataccacag ccaacggttg 60
cccatttcac aagccagaag gtccaccagc agacggtaga actttggcct tgtccgatca 120
tcacttggtc gacaccttgg cacattttaa cagagaaaaa attccagaaa gagttgttca 180
tgctaaaggt gctggtgctt atggtgaatt tgaagttact gctgatattt ctgatatttg 240
tgatattgat atgttggttg gtgttggtaa aaaaactcca tgtgttacta gattttctac 300
tactggtttg gaaagaggtt ctaatgaagg tatgagagat ttgaaaggta tggcttgtaa 360
attttatact actgaaggta attgggattg ggttatgttg aattttccat ttttttttat 420
tagagatcca gttaaatttc catctttgat gcatgctcaa agaagagatc cacaaactaa 480
tttgttgaat ccaaatatgt attgggattg ggttactaat aatcatgaat ctttgcatat 540
ggttttgttg caattttctg attttggtac tatgtttaat tggagatcaa tgtctggtta 600
tatggctcat gcttataaat gggttaaacc agatggttct tttaaatatg ttcatatttt 660
tttgtcttct gatagaggtc caaattttac tgatggtcaa caagctaaag gtactaatga 720
tttggaccct gatcatgcta ctagagattt gtatgaagct attgaaagag gtgaatatcc 780
aacttggact gcttctgttc aagttgttga tccaaaagat gctccaaatt tgggttataa 840
tattttggat gttactaaac attggaattt gggtacttat ccaaaagatg ttactttgat 900
tccaccaaaa gtttttggta aattgacttt gaaaagaaat ccagctaatt attttgctga 960
aattgaacaa ttggcttatt ctccatctaa tatggttcca ggtgttgctc catctgaaga 1020
tccaattttg caagctagaa tttttgctta tccagatgct caaagatata gattgggtgc 1080
taatcatcaa caaattccag ttaatagatc agctcatact tttaatccaa ttgctagaga 1140
tggtcaaggt acttttgatg ctaattatgg tgctcatcca ggttttttga ctcaacaaca 1200
accagttaga tttgctgaac caagagaacc agatccaaaa tataatgaat ggttgaaaga 1260
aattcaatct aaatcttggt tgcaaactac tgaacatgat tataaatttg ctagagattt 1320
ttatgaagtt ttgccagatt ttagaggtca agaatttcaa gatactatgg ttcaaaatat 1380
ggttgaatct gttgctcaaa ctagagctga aattcaaaaa caagtttatg aaacttggaa 1440
attggtttct ccagctttgg ctgctagaat tcaaaaaggt gttgaaactt tgttgcaaaa 1500
atctgaagct ccagctgaag aatcttttat tccagctaga ttgtaaagga gaccgcggcc 1560
gc 1562
<210> 5
<211> 818
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcggccgcgg tctccaatgc catccatgac ctctaaagtt tttgctatta ctggtggtgc 60
ttctggtatt ggtgctgcta catgtagatt gttggctgaa agagatgctg ctgttatttg 120
tttggctgat gtttcttcta ctaattttac ttctttgcaa gaatccattg ctaaatctaa 180
tccatctact ttggttcatt gtactgaatt ggatgttaga tcagctgata aggttgatca 240
atggttgcaa tctattgttt ctactcatgg tgatttacat ggtgctgcta atgttgctgg 300
tattgctcaa ggtgctggtt tgagagctac tccaactatt ttggaagaaa atgatgctga 360
atggtctaga attttggatg ttaatttgaa cggtgttttc tattctacta gagctcaagt 420
tagagttatg aaagatttgc caccaggtca tagatcaatt gttaatgttg cttctattgc 480
tgctttttct catgttccag atgtttatgc ttatggtact tctaaatccg cttgtgctta 540
cttgactacc tgtattgctg ctgatgtttt ttggtctggt attagagtta attgtgtttc 600
tcctggtatt actaacactc caatgttgcc acaatttgaa cctaaagcta aatctttgga 660
tgctattaaa gatatgtaca gagatcaagg ttacccaact ggtgaagctg atggtgttgc 720
tagaacaatt gtttggttat tgagtgaaga ttctattcca gtttacggtg ctaatattaa 780
tgttggtgct tgtccaccat aaaggagacc gcggccgc 818
<210> 6
<211> 818
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcggccgcgg tctccaatgg catccgttga aagtagaatt attgctatta ctggtggtgc 60
ttccggtatt ggtgctgcta catgtagatt gttggctgaa agaggtgctg ctgttttgtg 120
tgtttgtgat atttctccta aaaacttcga tgatttgaag atttctatta agaagattaa 180
cccatccact aaagttcatt gtgctactgt tgatgttaca tcttctgttg aagttagaca 240
atggattgaa ggtattattt ctgatttcgg tgatttgcat ggtgctgtta atgctgctgg 300
tattgctcaa ggtgctggta tgagaaatac tcctacaatt gctgaagaag ttgatgaaga 360
atggactaga attatgaata ctaacttgaa cggtgttttc tattgtacta gagaagaagt 420
tagagctatg aaaggtttgc cagctactga tagatccatt gttaatgttg gtagtattgc 480
ttctgtttcc catatgccag atgtttacgc ttatggtacc tctaaaggtg cttgtgctta 540
ttttaccact tgtgttgctg ctgatgcttt tcctttgggt attagaatta ataacgtttc 600
tcctggtgtt actaatactc caatgttgcc acaatttgct cctatggcta agacttttga 660
agaaattgaa gaatcttaca agaaggaagg tttgtctttg attgaagcag aagatgttgc 720
tagaactatt gtttggttgt tgtctgaaga tagtagacct gtttttggtg caaatattaa 780
tgttggtgct tgtatgccat aaaggagacc gcggccgc 818
<210> 7
<211> 962
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcggccgcgg tctccaatgg ttcaaattta cttgccaaga ttgtctatga gattaggtta 60
tcatgataag aacaacaaga tgactatttt gttgactggt ggtagaggta aaactgcttc 120
tcatattgct tccttgttgc aagctgctaa agttccattt attgttgcaa gtagatcctc 180
tgatccatca tcttcttccc catattatca aaactgtttt gattggttgg atgaaaaaac 240
ttatggtgat gttttgactt ctaaagattc tatgcaacca atttctacta tttggttggt 300
tccaccacca atttttgatt tggctccatt gatgattaaa tttgttgatt ttgcttctag 360
aaaaggtgtt aaaagatttg ttttgttgtc tgcttctact attaaaaaag gtggtccagc 420
tatgggtcaa gttcatgaat atttggcttc tttgggtggt attgaatatg ctgttttgag 480
gcctacttgg tttatggaaa atttttctta tccacaagaa ttgcaaagat tggctattaa 540
aaatgaaaat aaaatttatt ctgctgctgg tgatggtaaa ttgccatttg tttctgttgc 600
tgatattgct agagttgctt ttagaacttt gactgatgaa aaatctcata atactgatta 660
tgttttgttg ggtccagaat tgattactta tgatcaagtt gctgaaactt tgtctactgt 720
tttgggtaga actattactc atattaaatt gactgaagaa gaattggtta aaagattgga 780
aaattctggt atgccagctg aagatgctaa aatgttggct ggtatggata cttctatttc 840
tgatggtgct gaagatagat tgaataatgt tgttaaacat gttactggtg ctgatccaag 900
aacttttttg gattttgcta ctcatcaaaa agctacttgg ggttaaagga gaccgcggcc 960
gc 962
<210> 8
<211> 905
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcggccgcgg tctccaatga cagttttgtt gaccggtggt accggtagaa ccgctaaaca 60
tattgctggt atttttagac aaaccaacgt tccatttttg gttgcttcta gatcctcttc 120
cgctggtacc gctgaaaatc atagaaaatt tgattggttg gatgaagaaa ctttcccaaa 180
cgctttgtca gttgatcaag gtatgaagcc tatttctgtt gtttggttgt gtcctccacc 240
attgtatgat ttggctactc cagttattaa attcattgat ttcgctgttt cccaaaatgt 300
taagaagttt gttttgttgt ccgcttccgt tattcaaaag ggtggtcctg ctatgggtaa 360
gattcatggt catttggata gtattaagga tgttacttac actgttttga ggcctacttg 420
gtttatggaa aatttttcta ctaagggtga aattcaatgt gaagctatta gaagagattc 480
tactgtttat tctgctacag aaaatggtaa aattcctttc atttccgttg ttgatattgc 540
tagagttgct gcttgtgctt tgactgctga aactttgaaa aattctgatc atattttgca 600
aggtccagat ttgttgactt atgatgaagt tgctcaagct ttgactggtg ttttgggtag 660
aaaaattact catactaaga tgactgaagg tgaattggct gaaaaattaa tggaagaagg 720
tgttactcct gaagaagctt atatgcatgc tgctatggat tctatgatta agtctggttc 780
agaagaaaga gttgtttctg atgaagttaa agaatggact ggtgttaaac caagaggttt 840
tattaatttc gctttgtctg aaaaggctgc ttggagagct agaaagtaaa ggagaccgcg 900
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<210> 9
<211> 905
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcgg tctccaatga caattttggt tttgggtggt agaggtaaga ctgcttctag 60
attgtccttg ttgttggata atgctggtgt tccatttttg gttggttctt cttctacttc 120
ttatgttggt ccatataaga tgactcattt tgattggttg aacgaagata cttggactaa 180
tgtttttttg agagcttctt tggatggtat tgatcctatt tctgctgttt atttggttgg 240
tggtcatgct cctgaattgg ttgatcctgg tattagattt attaacgttg ctagagctca 300
aggtgttaat agatttgttt tgttgtctgc ttctaacatt gctaagggta ctcattctat 360
gggtattttg catgctcatt tggattcttt ggaagatgtt caatatgttg ttttgaggcc 420
tacttggttt atggaaaatt tgttggaaga tccacatgtt tcttggatta aaaaggaaga 480
taagatttac tccgctactg gtgatggtaa aattccattc attagtgctg atgatattgc 540
aagagttgct ttttcagttt tgacagaatg gaaaagtcaa agagctcaag aatattttgt 600
tttgggtcca gaattgttgt cttatgatca agttgctgat attttgacta ctgttttagg 660
tagaaagatt actcatgttt cattggctga agctgatttg gctagattgt tgagagatga 720
tgttggtttg cctcctgatt ttgctgctat gttggcttct atggaaaccg atgttaagca 780
tggtactgaa gttagaaatt ctcatgatgt taagaaggtt acaggtagtt tgccatgttc 840
ttttttggat tttgctgaac aagaaaaggc tagatggatg agacattaaa ggagaccgcg 900
gccgc 905
<210> 10
<211> 1175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcggccgcgg tctccaatgt caacctctaa cttgtttacc ccattgcaat ttggtaaatg 60
tttgttgcaa cataagttgg ttttgtcccc aatgaccaga tttagagctg ataacgaagg 120
tgttccattg ccatatgtta aaacttacta ttgtcaaaga gcttctttgc caggtacttt 180
gttgttgacc gaagcaactg ctatttccag aagagctaga ggttttccaa atgttccagg 240
tatttggtca caagaacaaa ttgctggttg gaaagaagtt gttgatgctg ttcatgctaa 300
gggttcttat atttggttgc aattgtgggc tactggtaga gctgctgaag ttggtgtttt 360
gaaagctaat ggttttgatt tggtttcttc ttctgctgtt cctgtttctc ctggtgaacc 420
aactccaaga gctttgtctg atgatgaaat taattcctat attggtgatt tcgttcaagc 480
tgctaaaaat gctgttttgg aagctggttt tgatggtgtt gaattgcatg gtgctaacgg 540
ttttttgatt gatcaatttt tgcaatcccc ttgtaatcaa agaactgatc aatggggtgg 600
ttgtattgaa aatagatcaa gatttggttt ggaaattacc agaagagtta ttgatgctgt 660
tggtaaagat catgttggta tgaaattgtc tacttggagt acttttcaag gtatgggtac 720
tatggatgat ttgattcctc aatttgaaca tttcattatg agattgagag aaattggtat 780
tgcatatttg catttggcta attctagatg ggttgaagaa gaagatccaa caattagaac 840
tcatccagat attcataacg aaacttttgt tagaatgtgg ggtaaagaaa agccagtttt 900
attggctggt ggttatggtc cagaatctgc taaattggtt gttgatgaaa cttattccga 960
tcataaaaac attggtgttg tttttggtag acattatatt tcaaaccctg atttgccttt 1020
tagattgaag atgggtttac cattgcaaaa atataacaga gaaacctttt acattccatt 1080
ctctgatgaa ggttatttgg attatccata ctccgaagaa tatattactg aaaataagaa 1140
gcaagctgtt ttggcataaa ggagaccgcg gccgc 1175
<210> 11
<211> 1181
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcggccgcgg tctccaatgt catcctctaa cttgtttaag ccaattccat tgggtagaaa 60
agttttgcaa cataaagttg ttttgtcccc aatgaccaga ttcagagctg ataacgatgg 120
tgttccattg tcctacgtta aatcttatta tggtcaaaga gcttccatta gaggtacttt 180
gttgattaca gaagctgttg ctatttgtcc aagagcaaag ggtttttcta attgtccagg 240
tatttggcat caagatcaaa ttgctgcatg gaaagaagtt gttgatgaag ttcattctaa 300
gggttcagtt atttggttgc aattgtgggc tactggtaga gcttctgatg ctgatacttt 360
aaaagaatca ggttttcatt tggaatcctc tagtgatgtt ccagttgctc ctggtgaacc 420
agttccaaga cctttgtcag aagatgaaat tgaatcatat attagagatt acgttaccgg 480
tgctattaat gctgttcaag gtgctggttt cgatggtatt gaaattcatg gtgctaatgg 540
ttttttggtt gatcaatttt tgcaagcttc ttgtaatact agagctgatc aatggggtgg 600
ttctattgaa aatagaagta gatttggttt ggaaattacc agaagagttg ttgatgctgt 660
tggtaaagat agagttggtg ttaaattgtc tccttggtca acttttcaag gtatgggtac 720
tatggatgat ttggttgctc aatttgaaca ttttatttcc agattgagag aaatggatat 780
tgcttatatt catttggtta acaccagatg gttggaagaa gaagaaccag gtattaaaac 840
tcatccagat gttgataacc aaactttcgt tagaatgtgg ggtaataaga ccccaatttt 900
attggcaggt ggttatgatg cagatagtgc tagaagattg gttgatgaaa catattccga 960
tcaaaataac attatggttg ttttcggtag acattatatt tctaacccag atttgccttt 1020
tagattgaga ttgggtattc cattgcaaaa atataacaga gatacctttt acattccatt 1080
ctctgatgaa ggttatttgg attatccatt ttgtcaagaa ttcttggatc aacaagatgt 1140
tgatcaagtt gttgttgctg cttaaaggag accgcggccg c 1181
<210> 12
<211> 1142
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcggccgcgg tctccaatgt caacctctaa cttgttttcc accgttccat ttggtaaaaa 60
tgttttgaac cataagattg ttttgtcccc aatgaccaga tttagagctg atgataacgg 120
tgttccattg tcttatatga aaacttttta cgctcaaaga gcttctgtta gaggtacttt 180
gttggttact gatgctgttg ctatttgtcc aagaacaaaa ggttttccaa atgttccagg 240
tatttggcat aaagatcaaa ttgctgcttg gaaagaagtt gttgatgaag ttcattcaaa 300
gggttctttt atttggttgc aattgtgggc tactggtaga gctgctgatt tggaagcttt 360
gacttctcaa ggtttgaaat tggaatcttc ttctgaagtt cctgttgctc caggtgaacc 420
aactcctaga gctttggatg aagatgaaat tcaacaatat attttggatt acgttcaagg 480
tgctaaaaat gctgttcatg gtgctggttt tgatggtgtt gaaattcatg gtgctaacgg 540
ttttttgatt gatcaatttt tgcaatcctc ctgtaataga agaactgatc aatggggtgg 600
ttccattgaa aatagaagta gatttggttt ggaaattacc agaggtgttg ttgatgctgt 660
tggtcatgat agagttggta tgaaattgtc tccatggtca acttttcaag gtatgggtac 720
tatggatgat ttggttcctc aatttgaaca ttttattacc tgtttgagag aaatggatat 780
tgcttatttg catttggcta attctagatg ggttgaagaa gaagatccat ctattagaac 840
tcatccagat tttcataacc aaacttttgt tcaaatgtgg ggtaaaaaga ggcctatttt 900
gttggctggt ggttatgatc cagattctgc tagaagattg gttgatcaaa catattctga 960
tagaaacaac gttttggttg tttttggtag acattatatt tccaacccag atttgccttt 1020
tagattgaga atgggtattg cttgtagatc cacaattgaa actcattcta ttttcccagc 1080
aagagaaaga gctatgtgga ctattccatc cgttaagaat atttaaagga gaccgcggcc 1140
gc 1142

Claims (10)

1.来源于C.fusiformis、Claviceps purpurea或N.lolii的easA在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；
所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；
所述药物包括麦角酸衍生物。
2.来源于Claviceps purpurea、Aspergillus fumigatus或N.lolii的easG；或
来源于Claviceps purpurea或Aspergillus fumigatus的easD中的一个酶或两个酶的组合，与来源于C.fusiformis、Claviceps purpurea或N.lolii的easA获得的组合酶在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；
所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；
所述药物包括麦角酸衍生物。
3.表达盒，其特征在于，包括来源于C.fusiformis、Claviceps purpurea或N.lolii的easA。
4.如权利要求3所述的表达盒，其特征在于，还包括来源于Claviceps purpurea、Aspergillus fumigatus或N.lolii的easG。
5.表达模块，其特征在于，包括如权利要求3或4所述的表达盒和来源于Clavicepspurpurea或Aspergillus fumigatus的easD。
6.如权利要求3或4所述的表达盒和/或如权利要求5所述的表达模块在制备合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物的菌株中的应用；
所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；
所述药物包括麦角酸衍生物。
7.菌株，其特征在于，其构建方法为：在底盘菌株中导入如权利要求3或4所述的表达盒和/或如权利要求5所述的表达模块。
8.如权利要求7所述的菌株，其特征在于，还包括第一表达模块、第二表达模块和/或内源模块；
所述第一表达模块包括dmaW-easF；所述第一表达模块的整合位点包括XV染色体的Δ22位点；和/或
所述第二表达模块包括easE-easC；所述第二表达模块的整合位点包括XVI染色体的Δ15位点；和/或
所述内源模块包括ero1-fad1；所述内源模块的整合位点包括VIII染色体的Δ14位点；和/或
来源于Claviceps purpurea或Aspergillus fumigatus的easD的整合位点包括GAL1/7/10。
9.如权利要求7或8所述的菌株在合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物中的应用；
所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；
所述药物包括麦角酸衍生物。
10.合成田麦角碱、麦角生物碱和/或药物的方法，其特征在于，取如权利要求7或8所述的菌株，培养，获得田麦角碱；取所述田麦角碱制备获得麦角生物碱和/或药物；所述麦角生物碱包括麦角酸衍生物；所述药物包括麦角酸衍生物。
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