CN113307240A - 一种具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子及其制备方法。该方法包括：将氨基酸和无水柠檬酸混匀，热解处理，得到热解液，进行透析处理，取保留液，干燥，得到手性碳点粉末；将手性碳点粉末与钙源混匀，滴加至磷源中，水热反应，得到反应产物，洗涤，干燥，得到具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子。该纳米羟基磷灰石粒子呈短棒状，其平均直径为15～25nm，平均长度为50～65nm，平均长径比为2～5，结晶度高且粒子分布均匀。本发明提供的尺寸分布均匀可控的纳米羟基磷灰石粒子，其对肿瘤细胞具有较强的增殖抑制作用，其中800μg/mL的纳米羟基磷灰石与骨肉瘤细胞(143b)共培养，细胞增殖抑制率可达到40％。

Description

一种具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子及其制备方法
技术领域
本发明属于无机生物医用材料领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子及其制备方法。
背景技术
羟基磷灰石(HAp)作为生理条件下最稳定的磷酸钙盐，在自然界中脊椎动物的骨骼和牙齿中普遍存在，是生物矿物主要的无机成分，具有独特的生物活性和生物相容性，它植入体内安全、无毒，能够参与生物体的正常代谢，是理想的生物活性材料，已被广泛应用于生物医用领域，如硬组织修复材料、药物载体，基因载体等。近年来，羟基磷灰石作为一种生物相容性良好且可以安全降解的材料，与人体细胞的相互作用已成为研究热点。有研究显示羟基磷灰石纳米粒子对肿瘤细胞的生长增殖呈现出一定的抑制作用。然而，通过一般方法生产出的大多数羟基磷灰石并没有抗肿瘤效果。目前现有技术所得的羟基磷灰石纳米颗粒因制备方法不同，显示出不同的形态特征，不同的性质以及良莠不齐的抗肿瘤作用。因此，本领域需要进一步探索羟基磷灰石纳米粒子的抗肿瘤作用，并且通过改良优化其制备技术，开发出新型的、效果优异的羟基磷灰石纳米粒子。
手性在化学、生物学、药理学和药学等领域处于重要地位，在手性检测、手性分离及不对称催化等方面尤其重要。目前，人们对纳米尺度手性的认识尚处于起步阶段，将分子的手性引入纳米材料，开发新型的手性纳米材料，已经成功为纳米材料的发展开辟了一个新的方向。手性碳点作为碳点的一个重要的研究方向，因兼具优异的荧光性质、良好的生物相容性、低的毒性以及手性特征等，已应用到手性催化、手性检测、抑菌、高尔基体靶向成像、调控酶的活性、调控细胞能量代谢和促进植物生长等领域。以手性氨基酸作为原料制备氨基酸修饰碳点是获得手性碳点的主要方法之一。目前对于手性碳点的应用局限于手性碳点本身，尚缺乏手性碳点与无机材料的结合的相关技术研究。将手性碳点引入无机材料，不仅可以扩大手性碳点的应用范围，还将对提升无机材料的性能产生重要影响。然而目前对于手性碳点与无机材料结合，特别是利用手性碳点制备羟基磷灰石，提升抗肿瘤活性方面尚缺乏相关研究。
如何提升羟基磷灰石抗肿瘤活性，是本领域需要解决的技术难题。本技术提供了一种采用氨基酸修饰的碳点制备具有抗肿瘤活性羟基磷灰石的方法。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子及其制备方法。
本发明提供的制备方法，是以硝酸钙溶液和磷酸钠溶液为初始反应物，通过添加手性碳点调控产物形貌并增强其抗肿瘤活性。通过调整手性碳点的浓度，可实现对纳米羟基磷灰石粒径的调控，其平均直径为15～25nm，平均长度为50～65nm，平均长径比为2～5，结晶度高且粒子分布均匀，其粉体形状为短棒状。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)手性碳点的制备：将氨基酸和无水柠檬酸混合均匀，置于电炉上升温进行热解处理，固体完全溶化后得到液态混合物，待混合物颜色为黄色并不产生气泡，往热解液中加入去离子水，混合均匀，得到混合液1，调节所述混合液1的pH为中性，然后进行透析处理，取保留液，干燥，得到手性碳点粉末(浅绿色)；
(2)具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石的制备：将步骤(1)所述手性碳点粉末与钙源混合均匀，得到混合液2，然后将所述混合液2滴加至磷源中，得到混合液3，调节所述混合液3的pH为碱性，升温进行水热反应，得到反应产物，洗涤，干燥，得到所述具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子。
进一步地，步骤(1)所述氨基酸为L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸中的一种以上；
进一步地，步骤(1)所述氨基酸和无水柠檬酸的质量比为0.2～1:1。所述氨基酸为手性氨基酸，所述氨基酸为天然氨基酸或者所述天然氨基酸的对映异构体。
进一步地，步骤(1)所述热解处理的温度为180～230℃，
优选地，步骤(1)所述热解处理的温度为185℃。
优选地，步骤(1)所述热解处理的温度为200℃。
优选地，步骤(1)所述热解处理的温度为210℃。
进一步地，步骤(1)所述热解处理的时间为10～20min。
进一步地，步骤(1)所述无水柠檬酸与水的质量比为1：5～55。
优选地，步骤(1)所述无水柠檬酸与水的质量比为1：50。
进一步地，步骤(1)所述透析处理采用的透析袋截留分子量为500～3000Da；所述透析处理的时间为12h以上；
优选地，步骤(1)所述透析处理采用的透析袋截留分子量为500Da，所述透析处理的时间为24小时。
进一步地，步骤(1)所述干燥的温度为160～200℃。
优选地，步骤(1)所述干燥的方式为热干燥。
优选地，步骤(1)所述干燥的温度为180℃。
进一步地，在步骤(2)所述混合液2中，手性碳点粉末的浓度为0.1～2.5mg/mL。
进一步地，步骤(2)所述钙源为Ca(NO3)2溶液；所述Ca(NO3)2溶液的浓度为0.1～1.0mol/L。
进一步地，步骤(2)所述磷源为Na3PO4溶液；所述Na3PO4溶液的浓度为0.05～0.5mol/L。
进一步地，在步骤(2)所述混合液3中，Ca(NO3)2与Na3PO4的摩尔比为5:2～5:4。
优选地，在步骤(2)所述混合液3中，Ca(NO3)2与Na3PO4的摩尔比为5:3。
进一步地，步骤(2)中，调节所述混合液3的pH为9.5～13.5；
进一步地，步骤(2)所述水热反应的温度为120℃～200℃，水热反应的时间为6～18h。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子。该纳米羟基磷灰石粒子呈短棒状，其平均直径为15-25nm，平均长度为50-65nm，平均长径比为2-5，结晶度高且粒子分布均匀。本发明提供的尺寸分布均匀可控的纳米羟基磷灰石粒子，其对肿瘤细胞具有较强的增殖抑制作用，其中800μg/mL的纳米羟基磷灰石与骨肉瘤细胞(143b)共培养，细胞增殖抑制率可达到40％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明制备的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子呈短棒状，尺寸比无碳点存在的颗粒尺寸小，为B型取代羟基磷灰石，尺寸随着手性碳点含量的增加而减小，具有抗肿瘤活性，在纳米医药领域具有潜在的应用前景。
附图说明
图1a为非手性碳点(CDs)和手性碳点(L-Glu-CDs)的傅里叶转换红外光谱图；
图1b为非手性碳点(CDs)和手性碳点(L-Glu-CDs)的圆二色谱图；
图1c为非手性碳点(CDs)的透射电子显微镜图；
图1d为手性碳点(L-Glu-CDs)的透射电子显微镜图；
图2a为不同手性碳点浓度制备的羟基磷灰石的X射线衍射图；
图2b为不同手性碳点浓度制备的羟基磷灰石的傅里叶转换红外光谱图；
图2c为不同手性碳点浓度制备的羟基磷灰石的透射电子显微镜图；
图3a为羟基磷灰石与骨肉瘤细胞(143b)共培养后的细胞增殖的情况，当*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示有显著性差异；
图3b为不同浓度羟基磷灰石(2.0-G-HAp)与骨肉瘤细胞(143b)共培养后的细胞增殖的情况，当***P<0.001表示有显著性差异；
图3c为羟基磷灰石与小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)共培养后的细胞增殖的情况，当*P<0.05表示有显著性差异；
图3d为不同浓度羟基磷灰石(2.0-G-HAp)与小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)共培养后的细胞增殖的情况，当*P<0.05表示有显著性差异。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
对比例1。
本对比例无手性碳点添加的纳米羟基磷灰石的制备：
配制0.5mol/L Ca(NO3)2溶液和0.1mol/L Na3PO4溶液分别作为反应体系的钙源和磷源，量取12.5mL钙源并逐滴加到37.5mL磷源中，得到反应液；调节反应液pH值为11.5，加入5mL去离子水，使溶液体积达到55mL，操作期间使用磁力搅拌器充分混合，得到混合液，操作完成后将混合液转移到反应釜中，并在150℃烘箱中保温12h，得到反应产物。反应产物用去离子水离心洗涤三遍再用无水乙醇离心洗涤一遍，得到的湿态固体在60℃烘箱内干燥12h，最后研磨得到纳米羟基磷灰石粉体(HAp)。
对比例2。
本对比例非手性碳点添加的纳米羟基磷灰石的制备：
称取10g无水柠檬酸与烧杯中，并置于200℃电炉热解；当烧杯固体完全溶解，液体颜色为黄色并不产生气泡时，加入50mL去离子水混合均匀后冷却；随后加入1mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH值至中性；将上述得到的溶液装进MWCO＝500Da的透析袋中透析24h，期间每12h换一次水，待透析袋中溶液体积无明显变化后，收集透析袋中的溶液并置于180℃电炉上加热除去水分，最终得到浅黄色的碳点粉末(非手性碳点CDs)。
纳米羟基磷灰石的制备：
称取0.110g柠檬酸碳点于装有12.5mL钙源的烧杯中，待充分超声混合均匀后，得到混合液，在所述混合液中，柠檬酸碳点的浓度为55.0mg/mL，将所述混合液逐滴加到37.5mL磷源中，得到反应液；1mol/L的NaOH溶液调节反应液pH值为11.5，加入5mL去离子水，使溶液体积达到55mL，操作期间使用磁力搅拌器充分混合，操作完成后将反应液转移到反应釜中，并在150℃烘箱中保温12h，得到反应产物。反应产物用去离子水离心洗涤三遍再用无水乙醇离心洗涤一遍，得到的湿态固体在60℃烘箱内干燥12h，最后研磨得到羟基磷灰石(2.0-C-HAp)。
实施例1
手性碳点的制备：
按照柠檬酸：L-谷氨酸质量比为4:1分别称取1.0g无水柠檬酸和4.0g L-谷氨酸于50mL烧杯中，充分混合后置于200℃电炉热解；当烧杯中固体完全溶解，液体颜色为黄色并不产生气泡时，加入50mL去离子水混合均匀后冷却；随后加入1mol/L NaOH溶液调节溶液的pH值至中性；将上述得到的溶液装进MWCO＝500Da的透析袋中透析24h，期间每12h换一次水，待透析袋中溶液体积无明显变化后，收集透析袋中的溶液并置于180℃电炉上加热除去水分，最终得到浅绿色的手性碳点粉末(L-Glu-CDs)。
具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石的制备：
准确称取0.0275g的柠檬酸碳点于装有12.5mL钙源的烧杯中，待充分超声混合均匀后，得到混合液，在所述混合液中，柠檬酸碳点的浓度为22.5mg/mL，将所述混合液逐滴加到37.5mL磷源中，得到反应液；使用1.0mol/L的NaOH溶液调节反应液pH值为11.5，加入5mL去离子水，使溶液体积达到55mL，操作期间使用磁力搅拌器充分混合，操作完成后将反应液转移到反应釜中，并在150℃烘箱中保温12h，得到反应产物。反应产物用去离子水离心洗涤三遍再用无水乙醇离心洗涤一遍，得到的湿态固体在60℃烘箱内干燥12h，最后研磨得到羟基磷灰石(0.5-G-HAp)。
实施例2
手性碳点制备同实施例1。
准确称取0.055g的柠檬酸碳点于装有12.5mL钙源的烧杯中，待充分超声混合均匀后，逐滴加到37.5mL磷源中；使用1mol/L的NaOH溶液调节反应液pH值为11.5，加入5mL去离子水，使溶液体积达到55mL，操作期间使用磁力搅拌器充分混合，操作完成后将反应液转移到反应釜中，并在150℃烘箱中保温12h。反应液用去离子水离心洗涤三遍再用无水乙醇离心洗涤一遍，得到的湿态固体在60℃烘箱内干燥12h，最后研磨得到羟基磷灰石(1.0-G-HAp)。
实施例3
手性碳点制备同实施例1。
准确称取0.0825g的柠檬酸碳点于装有12.5mL钙源的烧杯中，待充分超声混合均匀后，逐滴加到37.5mL磷源中；使用1mol/L的NaOH溶液调节反应液pH值为11.5，加入5mL的去离子水，使溶液体积达到55mL，操作期间使用磁力搅拌器充分混合，操作完成后将反应液转移到反应釜中，并在150℃烘箱中保温12h。反应液用去离子水离心洗涤三遍再用无水乙醇离心洗涤一遍，得到的湿态固体在60℃烘箱内干燥12h，最后研磨得到羟基磷灰石(1.5-G-HAp)。
实施例4
手性碳点制备同实施例1。
准确称取0.11g的柠檬酸碳点于装有12.5mL钙源的烧杯中，待充分超声混合均匀后，逐滴加到37.5mL磷源中；使用1mol/L的NaOH溶液调节反应液pH值为11.5，加入5mL去离子水，使溶液体积达到55mL，操作期间使用磁力搅拌器充分混合，操作完成后将反应液转移到反应釜中，并在150℃烘箱中保温12h。反应液用去离子水离心洗涤三遍再用无水乙醇离心洗涤一遍，得到的湿态固体在60℃烘箱内干燥12h，最后研磨得到羟基磷灰石(2.0-G-HAp)。
效果验证
对对比例2所得的非手性碳点(CDs)和实施例1所得的手性碳点(L-Glu-CDs)进行形貌和结构表征。结果如图1a、图1b、图1c及图1d所示。图1a为非手性碳点(CDs)和手性碳点(L-Glu-CDs)的傅里叶转换红外光谱图；图1b为非手性碳点(CDs)和手性碳点(L-Glu-CDs)的圆二色谱图；图1c为非手性碳点(CDs)的透射电子显微镜图；图1d手性碳点(L-Glu-CDs)的透射电子显微镜图；
由图1a的傅里叶转换红外光谱可以看到L-Glu-CDs在1700cm-1附近的吸收增强，表明L-谷氨酸已被成功键接；由图1c和图1d的透射电镜图可以看到非手性碳点(CDs)和手性碳点(L-Glu-CDs)的平均尺寸均为3～4nm；由圆二色谱图(图1b)可以看到CDs没有圆二色信号，而L-Glu-CDs出现了两个圆二色吸收信号峰。
所得的纳米羟基磷灰石(对比例1的HAp、实施例1的0.5-G-HAp、实施例2的1.0-G-HAp、实施例3的1.5-G-HAp、实施例4的2.0-G-HAp)进行X射线衍射测试、傅立叶变换红外光谱测试、透射电子显微镜拍摄，测定材料的结构和形貌，结果如图2a、图2b及图2c所示。
由图2a的X射线衍射图可以看到各组均为羟基磷灰石相，没有杂质相，结晶度较高；由图2b傅里叶转换红外光谱图可以看加入手性碳点的纳米羟基磷灰石在1455、1430和864cm-1出现了典型B型取代羟基磷灰石的吸收峰；由图2c透射电子显微镜可以看到手性碳点制备的羟基磷灰石平均宽度为20nm，长度在40～60nm之间，尺寸分布均匀，晶体完整性较好。
纳米羟基磷灰石粒子的抗肿瘤活性测试
对实施例1、2、3、4以及对比例1和比例2所得羟基磷灰石粒子进行CCK-8法肿瘤细胞毒性分析。实验过程如下：称取样品于灭菌的离心管中，用15k Gy的γ-射线辐照灭菌12h后，配置成5.0mg/mL浓度的粉体-完全培养基悬浮液，封口并置于4℃冰箱密封，使用前稀释成不同浓度的粉体-完全培养基悬浮液。使用小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)考察合成材料的细胞相容性；使用人骨肉瘤细胞(143b)考察合成材料对肿瘤细胞的影响作用。细胞所用培养基为含10％胎牛血清的基础高糖培养基，细胞生长环境为37℃、5％CO2的细胞培养箱。当细胞融合达到80％～90％时，可进行细胞的传代及种植，细胞传代过程为：倒掉培养液，PBS润洗两次，加入10～12滴0.25wt.％的胰酶-EDTA溶液消化，1.5min后加入完全培养基终止消化，吹打后转移至离心管中进行离心(12000rpm，5min)，用完全培养基重悬后可进行传代。细胞的种植过程为：将细胞进行消化、离心、重悬后进行计数，配置一定浓度的细胞悬液进行种板。细胞的接种密度为8000个/孔(96孔板)。在细胞种板贴壁12h后，换入配置好的粉体样品培养基，在与细胞分别共培养一定天数后，吸出培养基，每孔中加入100μL CCK-8工作液，最后将孔板放回细胞培养箱中避光孵育2h。从每孔吸出70μL反应后的工作液转移到96孔板中，利用多功能酶标仪(Thermo3002，Thermo，USA)检测其在波长450nm处的吸光度，换算后得到细胞存活结果如图3a、图3b、图3c及图3d所示。该实验还设置了空白对照组(图3a和图3c中的Control)，空白对照组的操作与上述实验组的操作一样，唯一不同之处在于，空白对照组不加入任何羟基磷灰石粒子。
图3a为羟基磷灰石与骨肉瘤细胞(143b)共培养后的细胞增殖的情况，当*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示有显著性差异；图3b为不同浓度羟基磷灰石(2.0-G-HAp)与骨肉瘤细胞(143b)共培养后的细胞增殖的情况，当***P<0.001表示有显著性差异；图3c为羟基磷灰石与小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)共培养后的细胞增殖的情况，当*P<0.05表示有显著性差异；图3d为不同浓度羟基磷灰石(2.0-G-HAp)与小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)共培养后的细胞增殖的情况，当*P<0.05表示有显著性差异。
由图3a可以看到，在对肿瘤细胞(143b)的抑制活性方面，手性碳点制备的羟基磷灰石比纯羟基磷灰石和非手性碳点制备的羟基磷灰石抑制作用强，特别是2.0-G-HAp组，在800μg/mL抑制率达40％。由图3b可以看出手性碳点制备的羟基磷灰石对肿瘤细胞的毒性呈现微弱的剂量效应，在浓度400μg/mL时的抑制率与800μg/mL相比相差不大。此外，由图3c和图3d可以看出材料对正常细胞都显示了低毒性，表明通过手性碳点制备的羟基磷灰石生物相容性较好。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将氨基酸和无水柠檬酸混合均匀，升温进行热解处理，得到热解液，往热解液中加入水，混合均匀，得到混合液1，调节所述混合液1的pH为中性，然后进行透析处理，取保留液，干燥，得到手性碳点粉末；
(2)将步骤(1)所述手性碳点粉末与钙源混合均匀，得到混合液2，然后将所述混合液2滴加至磷源中，得到混合液3，调节所述混合液3的pH为碱性，升温进行水热反应，得到反应产物，洗涤，干燥，得到所述具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述氨基酸为L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸中的一种以上；步骤(1)所述氨基酸和无水柠檬酸的质量比为0.2～1:1。
3.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述热解处理的温度为180～230℃，热解处理的时间为10～20min。
4.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，其特征在于，所述无水柠檬酸与水的质量比为1：5～55。
5.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述透析处理采用的透析袋截留分子量为100～3000Da；所述透析处理的时间为12小时以上；步骤(1)所述干燥的温度为160～190℃。
6.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，其特征在于，在步骤(2)所述混合液2中，手性碳点粉末的浓度为0.1～2.5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述钙源为Ca(NO3)2溶液；所述Ca(NO3)2溶液的浓度为0.1～1.0mol/L；步骤(2)所述磷源为Na3PO4溶液；所述Na3PO4溶液的浓度为0.05～0.5mol/L。
8.根据权利要求7所述的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，其特征在于，在步骤(2)所述混合液3中，Ca(NO3)2与Na3PO4的摩尔比为5:2～5:4。
9.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，调节所述混合液3的pH为9.5～13.5；步骤(2)所述水热反应的温度为120℃～200℃，水热反应的时间为6～18h。
10.一种由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的具有抗肿瘤活性的纳米羟基磷灰石粒子。
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