CN113303225B - 一种以奇异源四倍体百合作父本获得远缘杂交后代的胚培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种以奇异源四倍体百合作父本获得远缘杂交后代的胚培养方法，以奇异源四倍体百合‘Honesty’作父本，与LA系三倍体、四倍体或A系二倍体、四倍体百合杂交，将杂交后的胚珠外植体放入液体诱导培养基进行暗培养，得到幼胚萌发试管苗；将得到的幼胚萌发试管苗转接于固体生根培养基进行光照培养，促进试管苗生根；将生根试管苗接种于增殖培养基进行光照培养，获得每个杂交后代增殖的试管苗；将试管苗接种于成球培养基进行暗培养，促进杂交后代发育为鳞球。本发明采用液体培养基浸润胚珠的方式开展后代胚培养，解决了液体培养基浸泡易导致缺氧的问题，同时，优化了LA系和A系百合杂交后代胚培养不同阶段培养基配方，提高了幼胚萌发率和成活率。

Description

一种以奇异源四倍体百合作父本获得远缘杂交后代的胚培养 方法

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种百合远缘杂交后代胚培养方法。

背景技术

百合(Lilium spp)，百合科(Liliaceae)百合属多年生植物，是世界上著名的观赏植物，也是我国重要的原生药食同源类植物。选育赏食兼备的高附加值百合品种是百合产业发展的趋势，而百合杂交后代种子萌发时间较长，一般播种到开花需要2-3年的时间，有的种子在萌发期间容易霉烂，不仅降低了种子萌发率，而且幼苗萌发不整齐，育种周期长，严重制约了百合育种的发展。除此之外，在百合杂交选配过程中，部分种间杂交组合虽亲和，但由于胚或胚乳和母体生理机能不协调等原因，其杂交后代存在受精后障碍，导致受精后胚胎败育，引起杂交育种的失败。

采用组织培养进行胚挽救是克服受精后障碍的主要方法，在葡萄、桃、菊花、苦瓜等园艺植物中都取得了成功。在百合远缘杂交种，采用胚挽救技术获得成功已有报道，如专利“远缘百合杂交植株的培育方法”(CN101411304A)，采用常规授粉和子房切断的非常规方式进行O型百合‘蒂伯’和OT型百合‘黄色风暴’离体授粉，45～50d后进行胚珠培养，100～120d后剥出胚培养获得杂交植株，但这种方法需在组培条件下授粉，操作复杂，技术难度较高，且需要胚珠培养和胚培养2步，操作较复杂。专利“一种促进东方百合种子萌发的方法”(CN104303637A)，报道了一种促进百合种子萌发的方法，将杂交种子的胚剪切并去除其周围的胚乳和翅，并在添加蔗糖的MS培养基中促进种子萌发，可显著提高东方百合‘马可波罗’ב索邦’种子的发芽势和萌发率，但此方法需要对每粒杂交种子进行剪切前处理，操作费时、费力；专利“新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法”(CN105123528A)主要针对新铁炮百合品种‘Augusta’或‘雷山3号’与东方百合品种‘索邦’杂交授粉后5～25d的子房切片培养得到胚珠后，对胚珠进行固体培养，得到杂交组培苗；对授粉后35～40d发育阶段的胚珠或胚进行固体培养，得到杂交组培苗，优化了培养基和激素浓度添加，但仍采用固体培养，未提到不同培养方法对幼胚萌发时间的影响。

国内外学者也开展了很多相关研究，如屈云慧等对不同远缘杂交百合10-20d的授粉子代采用子房切片法开展胚挽救研究，筛选出MS+NAA 1mg/l+蔗糖6％+琼脂6％，pH值5.5为最适用固体培养基[1]；于晓英等以授粉后35d的百合幼胚为外植体，在含有IAA 1mg/l，GA₃ 1mg/l，CH 600mg/l和蔗糖6％～8％的MS培养基上百合幼胚胚性生长最好，30d后得到正常胚，然后在含0.1mg/l NAA和1mg/l 6-BA的MS培养基上可形成淡绿色愈伤组织，1/2MS培养基上分化形成不定芽[2]；孙晓梅等以胚龄30～50d的幼胚为外植体接种于固体培养基，2个月后筛选获得最优组合为MS+6-BA 0.1mg/l+NAA 0.001mg/l+CH+VB6，pH为5.0[3]；刘凤栾等对亚洲百合和东方百合杂交组合‘多安娜’ב西伯利亚’和‘普瑞头’ב雪皇后’授粉70d后的种子在MS固体培养基上培养30d后萌发成苗[4]；沈革志等对百合杂交组合‘Pollyana’בEnchantment’和‘兰州百合’בConnecticut King’杂交70d后的杂种胚开展离体培养研究，结果表明，未剥除胚乳的种子需要45d后才观察到胚的萌发，68d后，仅16％的种子萌发[5]。雷家军等开展大花卷丹与亚洲百合、东方百合杂种幼胚进行离体研究，筛选授粉后40～50d的杂种胚最适于胚培养，最适幼胚萌发培养基为MS+NAA 0.01mg/l+6-BA 0.1mg/l[6]；邵杨等研究表明东方百合系内杂交授粉约70d后采用切胚珠接种较胚珠直接接种的杂种胚萌动快、萌发率高，而且前者的胚挽救效率也明显高于授粉40d后的“剥胚式接种”，但每粒胚珠切割费时费力[7]；Okazaki等开展东方百合和亚洲百合杂交后代胚培养研究，结果表明培养基中添加超过3％的蔗糖胚可以正常生长，即使培养基中添加激素等物质，添加低于3％的蔗糖胚也不能正常生长，高浓度的蔗糖有利于杂交胚生长[8]；VanTuyl等研究表明MS培养基添加5％的蔗糖和0.1mg/l NAA对杂交后代胚珠培养更有效，MS培养基添加10％的蔗糖和1.0mg/l NAA对子房切片培养更有效[9]；Ikeda等研究表明1/2B5培养基添加9％的蔗糖对胚珠培养有更好的效果[10]；Wang等采用B5培养基开展铁炮百合和线叶百合杂交10d后子房切片培养，仅有1.17％发育成苗，铁炮百合种内杂交25d后子房切片培养仅有0.99％发育成苗，子房切片培养中，约3％的蔗糖对胚胎发育更有利[11]。虽然子房切片培养、胚培养、胚珠培养等方法均可帮助克服百合受精后障碍，但不同的百合远缘杂交组合最适培养基配方均不同。

培养基的相态包括固体、固液双相和液体，其中固体培养基虽能支撑胚珠，但不利于有害物质的扩散，液体培养基虽有利于有害物质的扩散，但胚珠在液体培养基中长期浸泡易导致缺氧，在无核葡萄胚挽救选育过程中对不同的培养基相态对萌发率的影响开展了研究，如唐冬梅等比较了固体培养和液体培养对‘无核白’、‘火焰无核’和‘红脸无核’等葡萄品种胚珠发育的影响，结果表明固体培养有利于葡萄胚珠的发育[12]；李桂荣等报道对自然授粉65d的‘红宝石’葡萄胚珠，采用固液双层基本培养基附加45g·L^-1蔗糖，培养时间49d时，胚珠发育率最高[13]。

奇异源四倍体百合‘Honesty’，含有一套铁炮百合(L)的染色体组和三套亚洲百合(A)的染色体组，在目前的百合杂交育种研究中，这一类型的百合比较特殊，探究奇异源四倍体百合的育性对指导百合育种有重要意义。谭欣(2013)报道‘Honesty’作母本与4个四倍体亚洲百合杂交均获得成功[14]；肖孔钟(2019)报道以奇异源四倍体百合‘Honesty’作母本与3个二倍体亚洲百合杂交萌发率在37.3％～42.3％之间，与5个LAAA×AAAA杂交组合经胚培养获得594株组培苗，表明奇异源四倍体‘Honesty’可用作母本参与杂交，且与四倍体亚洲百合的亲和性好[15]。但尚未见关于‘Honesty’作父本获得杂交后代的报道。本发明以奇异源四倍体百合‘Honesty’作父本，与LA或A系二倍体或三倍体百合杂交，采用本发明中的胚培养方法成功获得杂交后代，为百合远缘杂交育种及相关理论研究奠定基础。

参考文献：

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[3]孙晓梅，罗凤霞，王亚斌，董胜君，郭蕊.百合幼胚离体培养基的筛选[J].沈阳农业大学学报,2002-02,33(1):22-26.

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[13]李桂荣，全冉，程珊珊，侯小进，樊秀彩，扈惠灵.无核葡萄离体胚珠发育影响因子及其生理变化[J].中国农业科学,2020,53(22):4646-4657.

[14]谭欣.奇异源四倍体百合‘Honesty’种质渗入分析.浙江大学,2013.

[15]肖孔钟.奇-异源四倍体百合(Lilium)育性分析.江西农业大学,2019。

发明内容

发明目的：针对现有技术中，对百合杂交后代胚珠培养多采用固体培养，部分远缘杂交组合从胚珠接种到幼胚萌发所需时间较长，易败育，本发明提出了一种百合易败育杂交后代胚培养方法，适用于百合种内杂交和种间杂交后代因胚胎发育不良产生的胚败育现象。

为实现上述目的，本发明提出一种以奇异源四倍体百合作父本获得远缘杂交后代的胚培养方法，包括如下步骤：

(1)以奇异源四倍体百合‘Honesty’作父本与LA系三倍体、四倍体或A系二倍体、四倍体百合杂交，采集杂交授粉后40d～50d的蒴果，置于0℃～4℃打破休眠后，对蒴果进行消毒，取出胚珠作为胚珠外植体备用；

将无菌纱布铺设于培养皿中，然后将步骤(1)得到的胚珠外植体置于纱布上，并并倒入液体诱导培养基没入胚珠外植体不超过1/3，保证2/3胚珠外植体暴露，进行连续黑暗培养，培养温度为25±2℃，促进所述胚珠外植体萌发，培养7～10d后添加少量液体培养基使纱布保持保湿，得到幼胚萌发试管苗；通过采用纱布浸润的方式，胚珠外植体部分接触到液体培养基，利于营养吸收，除此之外，外植体暴露在空气中，能保证一定的透气性，如果不用纱布，纯液体培养透气性差，影响萌发率；

(3)将步骤(2)得到的长度大于2cm的幼胚萌发试管苗转接于固体生根培养基进行光照培养，培养温度为25±2℃，光照强度为40～60μmol·m^-2·s^-1，光照时间为15～17h，促进试管苗生根，得到生根试管苗；

(4)将步骤(2)得到的根长2～4cm的生根试管苗接种于增殖培养基进行光照培养，培养温度为25±2℃，光照强度为40～60μmol·m^-2·s^-1，光照时间为15～17h，获得每个杂交后代增殖的试管苗；

(5)将步骤(3)得到的增殖2～3倍的试管苗接种于成球培养基进行暗培养，培养温度为25±2℃，促进杂交后代发育为鳞球。

其中，步骤(1)中消毒方法为将蒴果接种于体积比浓度为70％～75％的乙醇水溶液中进行30～40秒表面处理，然后在体积比浓度为10％的次氯酸钠溶液中进行15～20分钟的杀菌处理，再用无菌水冲洗5～8次，完成所述蒴果的消毒灭菌处理。优选地，所述消毒方法采用75％(v/v)酒精浸泡1-2min，10％(v/v)次氯酸钠浸泡10-15min，无菌水冲洗5-8次。

步骤(1)中的液体诱导培养基配方为：1/2MS培养基+6-BA 0.08～0.12mg/L+NAA0.04～0.06mg/L+蔗糖38～32g/L+水解酪蛋白480～520mg/L，pH 5.6～6.0；优选地，所述液体诱导培养基配方为：1/2MS培养基+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+水解酪蛋白500mg/L，pH 5.8。在一种实施方式中，所述培养容器为90mm直径培养皿，底部垫2-3层纱布，培养7～10d后添加少量液体培养基保湿，以使纱布保持浸湿为宜。

步骤(2)中，所述生根培养基配方为：1/2MS培养基+NAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖28～32g/L+活性炭0.6～0.9g/L+琼脂6～8g/L，pH 5.6～6.0。优选地，生根培养基的优配方为：1/2MS培养基+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

所述增殖培养基为：MS培养基+6-BA 0.04～0.06mg/L+NAA 0.08～0.12mg/L+蔗糖28～32g/L+琼脂6～8g/L，pH 5.6～6.0；优选地，所述的增殖培养的配方为：MS培养基+6-BA0.05mg/L+NAA 0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

所述成球培养基为：MS培养基+蔗糖35～45g/L+活性炭0.6～0.9g/L+琼脂6～8g/L，pH 5.6～6.0。优选地，所述成球培养的优选配方为：MS培养基+蔗糖40g/L+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

在一种优选的实施方式中，所述液体诱导培养基配方为：1/2MS培养基+6-BA0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+水解酪蛋白500mg/L，pH 5.8；所述生根培养基的配方为：1/2MS培养基+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L，pH 5.8；所述增殖培养的配方为：MS培养基+6-BA 0.05mg/L+NAA 0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8；所述成球培养的配方为：MS培养基+蔗糖40g/L+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

有益效果：本发明采用液体培养基浸润胚珠的方式开展百合远缘杂交后代胚培养，解决了液体培养基浸泡易导致缺氧的问题，为百合杂交后代胚培养提供了新的培养方法，同时，优化了LA系和A系百合杂交后代胚培养不同阶段培养基配方，提高了幼胚萌发率和成活率，为百合远缘杂交后代胚培养提供参考。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)有效缩短幼胚萌发时间：相较于前人报道的百合远缘杂交后代胚挽救多采用固体培养基，本发明在胚培养前期采用无菌纱布上倒入液体培养基的方式，使胚珠外植体能有效吸收培养基中的养分，促进幼胚萌发；

(2)显著提高幼胚萌发率：与液体培养方式不同，本发明中的外植体部分暴露在空气中，利于胚珠呼吸，减少死亡率，胚珠外植体在适宜的条件下，萌发率显著提高；

(3)直接萌发，未诱导产生愈伤组织：胚培养过程中，固体培养激素浓度过高有时易诱导产生愈伤组织，本发明在培养基中添加了激素，但整个培养过程中均未观察到愈伤组织的产生，减少了杂交后代产生变异的概率；

(4)快速获得增殖杂交后代：本发明对萌发的幼胚生根后进行增殖培养，先获得备份杂交后代后再成球培养，确保杂交后代的成活率，为选育新品种奠定基础；

(5)采用本发明中的方法首次成功获得三倍体LAA、二倍体AA及四倍体AAAA百合作母本，奇异源四倍体LAAA百合‘Honesty’为父本的杂交育种后代。

附图说明

图1为百合‘Nashville’בHonesty’远缘杂交后代胚培养过程，其中，A：杂交后代胚珠接种；B：接种后15d；C：萌发后幼胚接种于培养基；D：生根培养；E：增殖培养；F：成球培养；

图2为本发明方法在不同百合杂交组合胚珠培养的结果图，其中，1、2、3、7为:White twinkle(♀)×Trible dance 600(♂)；4为Tiny pearl(♀)×Eremo(♂)；5为Armandale(♀)×White twinkle(♂)；6为Nashville(♀)×Honesty(♂)；8为Sweet sugar(♀)×Tresor(♂)；9为Tiny pearl(♀)×Tiny rocket(♂)；10为R×R；11为Merlet(♀)×Tresor(♂)；12为Armandale(♀)×Tresor(♂)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

(一)培养基的配制

1)诱导培养基：1/2MS培养基+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+水解酪蛋白500mg/L，pH 5.8。

2)生根培养基：1/2MS培养基+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

3)增殖培养基：MS培养基+6-BA 0.05mg/L+NAA 0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

4)成球培养基：MS培养基+蔗糖40g/L+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

以配制1L的诱导培养基为例，其具体配制过程是：称取1L培养基所需的1/2MS培养基的各质量份依次溶解、混合；然后依次称取诱导培养基配方中的NAA 0.05mg、6-BA0.1mg，水解酪蛋白500mg、蔗糖30g，分别加入到MS溶液中依次溶解，定容，调节PH值为5.8；分装至三角瓶中，在高温121℃、高压0.1MPa灭菌15～20分钟，冷却后待用。

本发明中，对于各阶段所使用的培养基，其配方中各组分的含量允许在一定范围内变化，例如，诱导培养基的培养为：1/2MS培养基+6-BA 0.08～0.12mg/L+NAA 0.04～0.06mg/L+蔗糖38～32g/L+水解酪蛋白480～520mg/L，pH H 5.6～6.0。生根培养基的配方为：1/2MS培养基+NAA 0.1～0.3mg/L+蔗糖28～32g/L+活性炭0.6～0.9g/L+琼脂6～8g/L，pH 5.6～6.0。增殖培养基的配方为：MS培养基+6-BA 0.04～0.06mg/L+NAA 0.08～0.12mg/L+蔗糖28～32g/L+琼脂6～8g/L，pH 5.6～6.0。成球培养基的配方为：MS培养基+蔗糖35～45g/L+活性炭0.6～0.9g/L+琼脂6～8g/L，pH H 5.6～6.0。

上述培养基质量份数及pH值的变化基本不会对百合胚培养及成苗过程产生影响。

(二)胚培养

1)杂交蒴果消毒：以LA系百合‘Nashville’(三倍体LAA)或A系二倍体百合‘Heartstrings’或A系四倍体百合‘Pink flight’为母本，以LA系百合‘Honesty’(四倍体LAAA)为父本，杂交授粉后40d～50d采集蒴果，并置于0℃～4℃打破休眠后，对蒴果进行消毒，取出胚珠备用。消毒方法采用75％(v/v)酒精浸泡1min，10％(v/v)次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗5-8次。

2)幼胚萌发培养：将胚珠外植体置于培养皿中的纱布上，并倒入液体诱导培养基，使培养基没入胚珠外植体不超过1/3，进行连续黑暗培养，所述培养温度为25±2℃，促进胚珠外植体萌发，缩短幼胚萌发时间，提高幼胚萌发率，培养7～10d后添加液体培养基使纱布保持湿润，得到幼胚萌发试管苗；

3)生根培养：长度大于2cm的幼胚萌发试管苗转接于固体生根培养基进行光照培养，所述光照培养条件为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，促进试管苗生根；

4)增殖培养：将根长2～4cm的生根试管苗接种于增殖培养基进行光照培养，所述光照培养条件为50μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h，获得每个杂交后代增殖的试管苗；

5)成球培养：将增殖2～3倍的试管苗接种于成球培养基进行暗培养，促进杂交后代发育为鳞球。

(三)百合杂交后代不同胚培养技术对比试验

该试验在上海市农业科学院林木果树研究所组织培养中心内进行。

以LA系百合‘Nashville’(三倍体)、A系二倍体百合‘Heartstrings’或A系四倍体百合‘Pink flight’为母本，以LA系百合‘Honesty’(四倍体)为父本，杂交授粉后40d～50d采集蒴果消毒后胚珠为外植体；

对照培养基：

1)诱导培养基：MS+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.8。

2)生根培养基：1/2MS培养基+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

3)增殖培养基：MS培养基+6-BA 0.05mg/L+NAA 0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

4)成球培养基：MS培养基+蔗糖40g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

本发明处理培养基：

1)诱导培养基：1/2MS培养基+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+水解酪蛋白500mg/L，pH 5.8。

2)生根培养基：1/2MS培养基+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

3)增殖培养基：MS培养基+6-BA 0.05mg/L+NAA 0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

4)成球培养基：MS培养基+蔗糖40g/L+活性炭0.8g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。

以前述(一)中配制的各阶段培养基作为胚培养过程中的培养基；分别将胚珠接种于对照固体培养基和前述各阶段培养基培养。组培过程中各个阶段的对比结果见表1。

表1不同杂交组合及不同胚培养方法效果对比

表2不同诱导培养方式效果对比

由表1可见，通过本发明报道的胚培养方式成功获得了‘Nashville’(三倍体百合LAA)、‘Heartstrings’(二倍体亚洲百合AA)及‘Pink flight’(四倍体亚洲百合AAAA)作母本，异源四倍体‘Honesty’(LAAA)作父本的杂交后代，采用本发明中的方法，幼胚萌发率分别达40％、57％和78％，幼胚萌发时间最早仅需12d，较固体培养基培养提前一周左右，生根率分别达96％、95％和97％，增殖倍数达3～5倍。使用本发明的方法首次获得了奇异源四倍体百合作父本，三倍体LA百合、二倍体亚洲百合和四倍体亚洲百合作母本的杂交后代植株。

本发明还对比了液体半浸润培养方式和液体全浸润培养对胚珠外植体萌发效果的影响，结果表明，前期采用液体半浸润的方式诱导培养，幼胚萌发率高于液体全浸润培养(表2)。

本发明前期诱导阶段采用液体半浸润方式培养，而对照诱导培养方式为固体培养基或液体培养基；采用本发明中的胚培养方法，成功获得奇异源四倍体百合作父本的杂交后代。本发明在培养基中添加活性炭，并在培养基中添加适量激素，促进未发育成熟的幼胚或后期可能发生败育的幼胚萌发，通过这个阶段的处理能显著提高幼胚萌发率和生根率。采用的对比例1是没有经过液体培养阶段，直接将外植体接种于固体培养基中让其萌发，萌发后生根和增殖培养阶段均一致，对比例中采用的是固体培养，虽然培养基中添加相同的激素种类和浓度，但获得的萌发率明显低于液体半浸润培养方式。采用的对比例2是液体全浸润培养，其幼胚萌发率低于采用纱布的液体半浸润式培养。

(四)本发明中方法在不同百合杂交组合中的应用

为了进一步证明本方法在不同百合杂交组合中的适用性，开展不同百合杂交组合胚珠培养研究(表3，图2)，后期均获得了萌发的幼胚，结果表明，本发明方法可被广泛应用于不同百合种系杂交后代的挽救中。

表3本发明方法在不同百合杂交组合中的应用

本发明提供了一种百合远缘杂交后代胚培养方法的思路，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (2)

1.一种以奇异源四倍体百合作父本获得远缘杂交后代的胚培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以奇异源四倍体百合‘Honesty’作父本与LA系三倍体、四倍体或A系二倍体、四倍体百合杂交，采集杂交授粉后40d~50d的蒴果，置于0℃~4℃打破休眠后，对蒴果进行消毒，取出胚珠作为胚珠外植体备用；

（2）将无菌纱布铺设于培养皿中，然后将步骤（1）得到的胚珠外植体置于纱布上，并倒入液体诱导培养基，使培养基没入胚珠外植体不超过1/3，进行连续黑暗培养，培养温度为25±2℃，促进所述胚珠外植体萌发，培养7~10d后添加液体培养基使纱布保持湿润，得到幼胚萌发试管苗；

（3）将步骤（2）得到的长度大于2cm的幼胚萌发试管苗转接于固体生根培养基进行光照培养，培养温度为25±2℃，光照强度为40~60μmol·m^-2·s^-1，光照时间为15~17h，促进试管苗生根，得到生根试管苗；

（4）将步骤（3）得到的根长2~4 cm的生根试管苗接种于增殖培养基进行光照培养，培养温度为25±2℃，光照强度为40~60μmol·m^-2·s^-1，光照时间为15~17h，获得每个杂交后代增殖的试管苗；

（5）将步骤（4）得到的增殖2~3倍的试管苗接种于成球培养基进行暗培养，培养温度为25±2℃，促进杂交后代发育为鳞球；其中，步骤（2）中的所述液体诱导培养基配方为：1/2MS培养基+6-BA 0.08~0.12 mg/L+NAA 0.04~0.06 mg/L+蔗糖38~32g/L+水解酪蛋白480~520mg/L，pH 5.6~6.0；步骤（3）中，所述固体生根培养基配方为：1/2MS培养基+NAA 0.1~0.3mg/L+蔗糖28~32g/L+活性炭0.6~0.9g/L+琼脂6~8 g/L，pH 5.6~6.0；所述增殖培养基的配方为：MS培养基+6-BA 0.04~0.06 mg/L+NAA 0.08~0.12 mg/L+蔗糖28~32g/L+琼脂6~8 g/L，pH 5.6~6.0；所述成球培养基的配方为：MS培养基+蔗糖35~45g/L+活性炭0.6~0.9g/L+琼脂6~8 g/L，pH 5.6~6.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，消毒方法为将蒴果接种于体积比浓度为70%~75%的乙醇水溶液中进行30~40秒表面处理，然后在体积比浓度为10%的次氯酸钠溶液中进行15~20分钟的杀菌处理，再用无菌水冲洗5~8次，完成所述蒴果的消毒灭菌处理。

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