CN113295800A - 一种合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法 - Google Patents

Abstract

一种合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：样品在特制萃取管中使用的0.1%的甲酸乙腈溶液超声提取后，用碳化钛纳米片原位净化后过滤，以合相色谱‑串联质谱测定提取液中氟砜灵代谢物残留量的方法。本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，填补了该类物质测定的空白，能够为相关农残的测定和方法技术的开发提供诸多借鉴，与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：本发明方法样品前处理过程简单、快速、集萃取与净化于一体，具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

Description

一种合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法

技术领域

本发明属于食品中农药残留的理化检验技术领域，具体说是一种通过特制萃取管超声萃取食物中氟砜灵代谢物残留，萃取后进行原位净化，以合相色谱-串联质谱（UPC2-MS/MS）测定净化液中氟砜灵代谢物残留量的方法。

背景技术

农药残留量问题食品安全性问题中的重要组成部分，食品中农药残留量指标是各国食品质量控制中的重要内容。氟砜灵是在1993-1994年发现，2014年在美国取得登记的非熏蒸性杀线虫剂，是氟代烯烃类硫醚化合物，对多种植物寄生线虫有防治作用，毒性低，如对有益和非靶标生物低毒，是许多氨基甲酸酯和有机磷类杀线虫剂等的“绿色”替代品。氟砜灵在植物体内容易转化成其代谢物3,4,4-三氟丁-3-烯-1-磺酸（3,4,4-Trifluorobut-3-ene-sulfonic acid）。

目前未见关于氟砜灵代谢物测定的文献报道，而现有的农药残留的测定方法，不能够满足农作物中氟砜灵代谢物的准确定量测定，因此建立一种氟砜灵代谢物的快速检测方法具有很强的必要性。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法,具体是通过特制萃取管超声萃取食物中的氟砜灵代谢物残留，萃取后原位进行净化，以合相色谱-串联质谱测定净化液中氟砜灵代谢物残留量的方法。该方法操作简单，能快速、准确检测样品中氟砜灵代谢物残留量，测定结果准确、测定干扰少。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，样品在特制萃取管中使用有机溶剂超声提取后，用碳化钛纳米片原位净化后过滤，以合相色谱-串联质谱测定提取液中氟砜灵代谢物残留量的方法；所述特制萃取管由上至下包括萃取腔、储液腔和净化腔，萃取腔与储液腔之间由筛板隔离，储液腔和净化腔之间设有旋钮，净化腔上部开有取液口。

具体包括以下步骤：

a、样品准备：样品干燥粉碎后过2 mm的筛子，所述样品包括烟草、谷物和茶叶。

b、样品的提取：准确称取0.8-1.2 g样品（精确至0.01 g），通过样品导入管转移至萃取腔中，加入8-12 mL的0.1%的甲酸乙腈溶液，堵上样品导入管入口。超声提取20-30min。由于筛板的作用样品处于筛板上方，所述溶液一部分通过筛板流入储液腔，一部分在萃取腔中并可覆盖样品。

c、样品净化：净化腔中预先放入20-30 mg的碳化钛纳米片；打开储液腔和净化腔间的旋钮，在净化腔中放入1.0-1.5 mL的萃取液；继续超声5 min。

d、样品分析：取出净化液，过0.45μm的有机相滤膜，用乙腈稀释5倍后进UPC2-MS/MS分析。

e、基质标准工作溶液制备：称取10 mg氟砜灵代谢物标准品到10mL容量瓶中，用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液（氟砜灵代谢物在其他有机溶剂中溶解度低）；分别移取上述标准工作溶液200 μL和200 μL空白样品提取溶液，然后加入600 μL乙腈，配制成基质标准工作溶液；配置的各基质标准工作溶液浓度分别为0.004 μg/mL, 0.01μg/mL, 0.02 μg/mL, 0.04 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.2 μg/mL。

f、农药残留量测定结果的计算

以外标法进行农药残留量的定量分析，即以基质标准工作溶液中氟砜灵代谢物的色谱峰面积与对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.995；对提取后的样品进行测定，测得检出氟砜灵代谢物的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中氟砜灵代谢物的残留量。

采用的色谱条件为：色谱柱：Viridis HSS C18 SB(100 mm×3.0 mm，1.8 μm, 美国Waters公司)；补偿溶剂：含0.1%甲酸的甲醇溶液；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为CO₂；补偿溶剂流速：0.2 mL/min；柱温：40 ℃；背压：2000psi; 进样量：2μL；梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

时间（min）	流速（mL/min）	流动相A(%)	流动相B(%)
				0	2.0	5	95
1	2.0	5	95
				2	2.0	10	90
5	2.0	10	90
				5.01	2.0	5	95
6	2.0	5	95

采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描； 电喷雾离子源(ESI)；离子源温度150℃； 毛细管电压：2.3 kV；锥孔气流量：55 L/hour；脱溶剂气流量：650 L/hour；脱溶剂气温度：300 ℃；MRM模式采集。MRM参数见表2。

表2质谱条件

*定量离子

所述的碳化钛纳米片可以为碳化钛少层纳米片，也可为碳化钛多层纳米片。优选碳化钛多层纳米片，碳化钛多层纳米片的片径为2-10 μm，厚度为100 nm-200 nm。

需要进一步说明的是，本发明的特制萃取管由上至下包括萃取腔、储液腔和净化腔，萃取腔与储液腔之间由筛板（孔径0.2 mm）隔离，储液腔和净化腔之间设有旋钮，净化腔上部开有取液口；所述萃取腔用于放置样品，萃取腔体积在15-25 mL；萃取腔中设有回流塔板以及样品导入管，回流塔板便于超声过程中蒸发的有机溶剂回流到萃取腔，样品导入管上带有磨口玻璃塞，样品导入管内径4-5cm。储液腔用于存放有机溶剂，储液腔体积在5-10mL。净化腔用于萃取液净化，净化腔体积在1-1.5 mL，取液口开设在净化腔刻度线上方，取液口内径为1-2 cm，并带有橡胶堵头。

所述特制萃取管（包括萃取腔、储液腔和净化腔）均为玻璃材质。

本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对植物源性食物样品（烟草、谷物和茶叶）优化了样品前处理方法和仪器检测条件，与现有技术相比具有如下优良效果：

⑴本发明方法将样品萃取和净化集于一体，简化操作。

本发明方法将样品用0.1%甲酸乙腈溶液进行提取后，采用碳化钛多层纳米片进行原位净化，最后取萃取液进行过滤并分析。该方法提高萃取效率，又能对植物源性食物中的色素及植物组织的其他共萃物（脂肪酸、磷脂等）起到很好的吸附净化作用，避免了样品浓缩、净化过程造成的待测农药组分损失，又使实验操作更加简单、快捷。

再者，原位净化中使用碳化钛多层纳米片，这种材料与多壁碳纳米管、N-丙基乙二胺（PSA）、C18不同。碳化钛纳米片具有较大的长径比、高比表面积、较多的活性位点，可有效避免紧密堆积、提高吸附性能、缩短净化时间，被广泛应用到纳米吸附、生物传感器，离子筛分、催化、锂离子电池、超级电容器、润滑等诸多领域。其可以最大程度除去不同基质中的干扰，而在乙腈溶液中不易吸附目标物，且耐超声。

（2）本发明方法具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。

①本发明方法的检测限：

在三种空白样品中分别加入不同浓度的氟砜灵代谢物农药标准工作溶液，经过萃取、净化后注入UPC2-MS/MS，以产生3倍信噪比（S/N = 3）的浓度作为方法检测限（LOD），产生10倍信噪比（S/N = 3）的浓度作为方法定量限（LOQ）。检测限为4.1-4.5 μg/kg，定量限为14.6-15.7 μg/kg。

②本发明方法的重复性和加标回收率：

在植物源性食物样品（烟叶、谷物和茶叶）中加入不同浓度的氟砜灵代谢物标准溶液，然后进行萃取、净化和UPC2－MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表3。由表3可以看出，回收率在90.1％－105.8％之间，相对标准偏差（RSD）均小于5.0 %，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

附图说明

图1为本发明的测定方法流程图；

图2为本发明中使用的特制萃取管结构示意图；

图2中标记如下：样品导入管堵头1、样品导入管2、萃取腔3、样品筛板4、储液腔5、净化液取液口6、净化腔7、回流塔板8、旋钮9、刻度线10。

图3为空白加标样品（2 mg/kg）的提取液中氟砜灵代谢物的选择离子色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例具体说明本发明所述方法的应用。特别需要指出的是，本发明说明书所举实施例只是为了帮助理解本发明，它们不具任何限制作用，即本发明除说明书所举实施例外，还可以有其他实施方式。因此，凡是采用等同替换或等效变换形式形成的任何技术方案，均落在本发明要求的保护范围中。

实施例中涉及的仪器与试剂规格/型号如下：

农药：氟砜灵代谢物，均为标准品；乙腈、甲醇为农残级；甲酸为分析纯；碳化钛多层纳米片的片径为2-10 μm，厚度为100 -200 nm（南京先丰纳米材料科技有限公司）。

Waters合相色谱串联质谱仪；BSA2245-CW电子天平（感量：0.0001g，德国赛多利斯）。

一、实施例

本实施例的植物源性食物中氟砜灵代谢物的测定方法，以烘干后的烟叶样品为待测样品，测定流程如图1所示，所用萃取管结构参见图2，具体包括以下步骤：

步骤1.样品干燥粉碎，过筛。准确称取1.0g样品（精确至0.01 g），通过样品导入管2转移至萃取腔3中，加入10 mL的0.1%的甲酸乙腈溶液，并用样品导入管堵头1堵上样品导入管入口，超声提取20 min；

步骤2. 把取液口6堵上，打开储液腔5和净化腔7间的旋钮9，在净化腔7中放入1.0mL的萃取液。净化腔中预先放入20 mg的碳化钛多层纳米片；继续超声5 min。从取液口取出净化液，过0.45μm的有机相滤膜，用乙腈稀释5倍后进UPC2-MS/MS分析。

步骤3.准备标准工作溶液：称取10 mg氟砜灵代谢物标准品（精确至0.0001 g）至不同的10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，制得1.0 mg/mL的一级标准储备液。然后移取上述标准储备液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度。配得10μg/mL二级标准储备液。分别移取一定体积的二级标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，即配制成不同浓度的标准工作溶液，标准序列：0.02 μg/mL, 0.05 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.2 μg/mL,0.5 μg/mL, 1.0 μg/mL。分别移取上述标准工作溶液200μL和200μL空白样品（不含氟砜灵代谢物）提取溶液混合，然后加入600μL乙腈，即配制成不同浓度的基质标准工作溶液。配置的各基质标准工作溶液浓度分别为0.004 μg/mL, 0.01μg/mL, 0.02 μg/mL, 0.04 μg/mL,0.1 μg/mL, 0.2 μg/mL。分别对这些基质标准溶液进行UPC2-MS/MS分析。

步骤4.测定方法: 将配制好的不同浓度的基质标准工作溶液注入UPC2-MS/MS，并对该标准溶液的氟砜灵代谢物定量离子峰面积（y）和其浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线。对提取后的样品待测液进行测定，测得待测物定量离子峰面积，代入标准曲线，求得样品中氟砜灵代谢物低于检出限。

采用的色谱条件为：色谱柱：Viridis HSS C18 SB(100 mm×3.0 mm，1.8 μm, 美国Waters公司)；补偿溶剂：含0.1%甲酸的甲醇溶液；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为CO₂；补偿溶剂流速：0.2 mL/min；柱温：40 ℃；背压：2000psi; 进样量：2μL；梯度洗脱，洗脱程序见表1。

采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描； 电喷雾离子源(ESI)；离子源温度150℃； 毛细管电压：2.3 kV；锥孔气流量：55 L/hour；脱溶剂气流量：650 L/hour；脱溶剂气温度：300 ℃；MRM模式采集。MRM参数见表2。

为判断方法的准确性，在此样品中加入10 µg/mL的标准溶液,使得样品中氟砜灵代谢物的含量为2.0 mg/kg，进行同上的样品前处理，以UPC2-MS/MS测得氟砜灵代谢物定量离子峰面积之和，代入标准曲线，求得此时样品中氟砜灵代谢物含量为1.92 mg/kg，即氟砜灵代谢物的加标回收率为96.0％，说明此方法是准确的。

二、对比例1

本对比例以《Analysis of 118 pesticides in tobacco after extractionwith the modified QuEChRS method by LC-MS-MS.》（Fei Yang等，J Chromatogr Sci,2014, 52(8): 788-792.）中的前处理条件对实施例1中的烘烤后的烟叶添加样品(氟砜灵代谢物的含量为2.0 mg/kg)进行处理并按照本发明的检测条件进行检测，其加标回收率如表4所示。

通过本发明与对比例的结果我们发现，本发明前处理简便，将萃取和净化集于一体，无繁琐操作，所采用的材料（碳化钛）比对比例中采用的净化材料（PSA）效果更好，回收率更高。

表4 各方法的回收率

方法	回收率（%）
		本发明	92.6％-104.4％
对比例1	88.8%-94.8%

对比例2

本对比例以《多壁碳纳米管分散固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定茶叶中5种烟碱类农药的残留量》（黄超群等，理化检验-化学分册, 2018, 54(5): 584-590）中的前处理条件对实施例1中的烘烤后的烟叶添加样品(氟砜灵代谢物的含量为2.0 mg/kg)进行处理并按照本发明的检测条件进行检测，其加标回收率如表5所示。

通过本发明与对比例的结果我们发现，本发明前处理简便，将萃取和净化集于一体，无繁琐操作，所采用的材料（碳化钛）比对比例中采用的净化材料（多壁碳纳米管）效果更好，回收率更高。

表5 各方法的回收率

方法	回收率（%）
		本发明	92.6％-104.4％
对比例2	85.2%-91.3%

对比例3

本对比例以《分散固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法同时测定柑橘中春雷霉素与噻霉酮残留》（安娇等，分析测试学报, 2020, 39(3): 358-364）中的前处理条件对实施例1中的烘烤后的烟叶添加样品(氟砜灵代谢物的含量为2.0 mg/kg)进行处理并按照本发明的检测条件进行检测，其加标回收率如表6所示。

通过本发明与对比例的结果我们发现，本发明前处理简便，将萃取和净化集于一体，无繁琐操作，所采用的材料（碳化钛）比对比例中采用的净化材料（C18）效果更好，回收率更高。

表6 各方法的回收率

方法	回收率（%）
		本发明	92.6％-104.4％
对比例3	90.2%-94.6%

Claims (9)

1.一种合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：样品在特制萃取管中使用有机溶剂超声提取后，用碳化钛纳米片原位净化后过滤，以合相色谱-串联质谱测定提取液中氟砜灵代谢物残留量的方法；所述特制萃取管由上至下包括萃取腔、储液腔和净化腔，萃取腔与储液腔之间由筛板隔离，储液腔和净化腔之间设有旋钮，净化腔上部开有取液口。

2.根据权利要求1所述的合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：该测定方法具体步骤如下：

a、样品准备：样品干燥粉碎后过筛；

b、样品的提取：准确称取0.8-1.2 g样品，通过样品导入管置入萃取腔中，加入8-12 mL的0.1%的甲酸乙腈溶液，堵上样品导入管入口；超声提取20-30 min；由于筛板的作用样品处于筛板上方，所述溶液一部分通过筛板流入储液腔，一部分在萃取腔中并可覆盖样品；

c、样品净化：净化腔中预先放入20-30 mg的碳化钛纳米片；打开储液腔和净化腔间的旋钮，在净化腔中放入1.0-1.5 mL的萃取液；继续超声5 min；

d、样品分析：取出净化液，过0.45μm的有机相滤膜，用乙腈稀释5倍后进合相色谱串联质谱（UPC2-MS/MS）分析；

e、基质标准工作溶液制备：称取10 mg氟砜灵代谢物标准品到10mL容量瓶中，用甲醇稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液；分别移取上述标准工作溶液200 μL和200μL空白样品提取溶液，然后加入600 μL乙腈，配制成基质标准工作溶液；配置的各基质标准工作溶液浓度分别为 0.004 μg/mL, 0.01 μg/mL, 0.02 μg/mL, 0.04 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.2 μg/mL；

f、农药残留量测定结果的计算

以外标法进行氟砜灵代谢物残留量的定量分析，即以基质标准工作溶液中氟砜灵代谢物的色谱峰面积与对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.995；对提取后的样品进行测定，测得检出氟砜灵代谢物的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中氟砜灵代谢物的残留量。

3.根据权利要求1或2所述的合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：采用的色谱条件为：色谱柱：Viridis HSS C18 SB，规格100 mm×3.0 mm，1.8 μm；补偿溶剂：含0.1%甲酸的甲醇溶液；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为CO₂；补偿溶剂流速：0.2mL/min；柱温：40 ℃；背压：2000 psi; 进样量：2μL；梯度洗脱；采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描； 电喷雾离子源(ESI)；离子源温度150℃； 毛细管电压：2.3 kV；锥孔气流量：55 L/hour；脱溶剂气流量：650 L/hour；脱溶剂气温度：300 ℃；MRM模式采集。

4.根据权利要求3所述的合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：所述色谱条件中梯度洗脱的具体程序如表1所示：

表1 梯度洗脱程序

时间（min） 流速（mL/min） 流动相A(%) 流动相B(%) 0 2.0 5 95 1 2.0 5 95 2 2.0 10 90 5 2.0 10 90 5.01 2.0 5 95 6 2.0 5 95

所述质谱条件中MRM参数如表2所示：

表2质谱条件

*定量离子。

5.根据权利要求1或2所述的合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：所述样品包括烟叶、谷物和茶叶。

6.根据权利要求1或2所述的合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：所述萃取腔用于放置样品，萃取腔体积在15-25 mL；储液腔用于存放有机溶剂，储液腔体积在5-10 mL；净化腔用于萃取液净化，净化腔体积在1-1.5 mL；在萃取腔的内壁设有回流塔板，便于超声过程中蒸发的有机溶剂回流到萃取腔；所述筛板孔径0.2 mm；在萃取腔内部有样品导入管，并带有磨口玻璃塞，样品导入管内径4-5cm；取液口开设在净化腔刻度线上方，取液口内径为1-2 cm，并带有橡胶堵头。

7.根据权利要求1或2所述的合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：所述碳化钛纳米片或为碳化钛多层纳米片，或为碳化钛少层纳米片。

8.根据权利要求7所述的合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：所述碳化钛多层纳米片的片径为2-10 μm，厚度为100 nm-200 nm。

9.根据权利要求1或2所述的合相色谱串联质谱测定氟砜灵代谢物的方法，其特征在于：所述特制萃取管为玻璃材质。

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