CN113289020A

CN113289020A - 蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN113289020A
Application number: CN202110531251.2A
Authority: CN
Inventors: 黄明东; 袁彩; 梁程辉; 李金宇; 刘见永; 王帅; 江龙光; 徐芃
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2041-05-17
Also published as: CN113289020B

Abstract

本发明公开了8种蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂及其在抗血栓形成中的应用。提供了8种分属多种结构类型的蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂及其用途。荧光结合实验及胰岛素还原实验表明8种蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂均能结合在PDI‑b’x结构域而抑制蛋白质二硫键异构酶的活性。取三种黄酮类小分子抑制剂做体内实验，在电刺激诱导的小鼠血栓形成模型中，小分子抑制剂能有效延后小鼠血栓形成时间，表现出好的抗凝效果。

Description

蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂及其应用。

背景技术

蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）是内质网中一类重要的氧化还原酶，主要包含a-b-b’-a’4个类硫氧还蛋白结构域，晶体结构表明PDI的四个结构域呈U型结构排列。其中a与a’结构域是其催化结构域，位于U型的开口处，“CGHC”基序构成其活性中心，负责二硫键的形成，断裂和重排；b与b’ 结构域不具有催化能力，位于U型结构的底部区域，主要负责底物的结合。PDI可以通过自身活性中心氧化还原状态的变化将二硫键引入新生蛋白质；也可以作为分子伴侣帮助蛋白质正确折叠，在维持内质网的稳态中起着重要的作用。PDI在一些情况下还可以分泌到细胞外，调节细胞表面受体的构象二硫键而调节受体蛋白活性，进而调节一系列生理过程。

在血栓形成过程中，PDI会从活化的血小板中分泌出来，调节多种血小板表面整合素受体（如αIIbβ3，GPIbα等）及凝血因子（如血小板因子V，组织因子等）的活性而调节血栓的形成，在血栓形成的过程中起着极其重要的作用。在小鼠实验模型中，PDI抗体的加入明显抑制了小鼠血栓的形成，表明PDI可以作为一个抗血栓形成的药物开发靶点。近年来，高通量筛选及虚拟筛选的应用促进了小分子抑制剂的发展，以PDI为靶点的抗血栓形成抑制剂开发也成为当下的一个热点。本发明通过体外实验筛选出的8 种PDI小分子抑制剂，它们都是通过直接结合PDI的b’x结构域而抑制PDI的活性。这些抑制剂在电刺激诱导的小鼠血栓形成模型中有效的延长了小鼠血栓形成时间，表现出良好的抗凝效果。

发明内容

本发明的目的在于提供了8种靶向蛋白质二硫键异构酶（PDI）的小分子抑制剂及其应用，这8种小分子抑制剂的结构与目前现有的PDI小分子抑制剂结构不同。体外实验表明，这些小分子抑制剂均可不同程度的抑制PDI活性。

一种蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂，所述蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂为化合物2-氨基-3-羟基-N’-（2,3,4-三羟基苄基）丙酰肼盐酸盐、3-羟基-2-苯基-4H-色烯-4-酮、乙酸4-甲酰基-2-甲氧基苯酯、2-羟基-N-苯基苯甲酰胺、3,5,7-三羟基-2-苯基-4H-色烯-4-酮、1-（2,4-二羟基苯基）-3-（4-羟基苯基）丙-2-烯-1-酮、4'-O-(3,4-二甲基三甘醇基苄基)、4'-O-(4-硝基苄基)槲皮素中的一种。上述述8种蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂化合物的结构如下：

上述蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂能直接结合PDI-b’x结构域，抑制蛋白质二硫键异构酶的活性。

上述蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂在抗血栓形成中的应用。

上述蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂在制备抗血栓形成的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了8种小分子抑制剂作为蛋白质二硫键异构酶抑制剂的应用。在分子水平上，这几种小分子抑制剂可以与蛋白质二硫键异构酶的b’x结构域直接相互作用而抑制PDI的活性。Galangin, 4’-O-(3,4-triethyleneglycol)-quercetin及4’-O-(4-nitrobenzyl)-quercetin三种黄酮类小分子在电刺激诱导的小鼠血栓形成模型中，明显延后小鼠血栓形成时间，表现出良好的抗血栓形成效果。

附图说明

图1：蛋白质二硫键异构酶全长及其截断体PDI-b’x蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。

图2：荧光淬灭实验确定8种小分子抑制剂与PDI-b’x的结合。

图3：8种小分子抑制剂对全长PDI还原胰岛素能力的抑制作用。

图4：三种黄酮类小分子在动物模型上抗血栓形成效果。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的方法和优点作进一步说明。

实施例一：蛋白质二硫键异构酶全长及其截短体PDI-b’x的表达、纯化

蛋白质二硫键异构酶全长及其截短体表达菌株为均来自本实验室（Lin L,Gopal S, Sharda A, et al. Quercetin-3-rutinoside Inhibits Protein DisulfideIsomerase by Binding to Its b ' x Domain. J Biol Chem, 2015, 290(39): 23543-23552.），培养过程均用含终浓度100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养。含表达质粒的BL2(DE3)菌株挑取甘油菌经扩大培养后转到1 L LB培养基中培养至OD值达到0.5，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达5小时后收菌。发酵液 4500 rpm离心25分钟后，加入20 mM Tris-HCl PH7.4，150 mM NaCl，1 mM DTT的裂解液重悬菌体，当菌体完全重悬无结块后移入高压破碎仪进行破碎。破碎物在65000 rpm的转速下离心40分钟，收集含目的蛋白的上清液。

含两种蛋白的上清液通过镍柱捕获后，用含20 mM Tris-HCl PH7.4，150 mMNaCl，20 mM咪唑，1 mM DTT的缓冲液进行洗杂，含20 mM Tris-HCl PH7.4，150 mM NaCl，300 mM咪唑，1 mM DTT的洗脱液进行目的蛋白的洗脱，并用SDS-PAGE对其纯度进行鉴定。镍柱粗纯化产物浓缩后经分子筛（superdex75）进一步纯化，得到纯度大于95%的全长PDI和截短体PDI-b’x，见图1。目的蛋白浓缩并分装，保存于-80℃备用。

实施例二：荧光淬灭实验检测8种小分子抑制剂与PDI-b’x的结合

由于PDI-b’x在波长为280 nm处有吸收，并在280 nm处激发后，能在340 nm附近得到一个发射光谱。而其它小分子在280 nm处无此特征吸收光谱。利用这一点，采用荧光检测分析8种小分子抑制剂与PDI-b’x的结合。

具体测定过程

1、材料

经上述实施例1获得的PDI-b’x截短体蛋白质、8种PDI小分子抑制剂。

缓冲液：20 mM Tris-HCl PH7.4，150 mM NaCl，1 mM DTT，0.22 μm孔径滤膜过滤。

所述8种小分子抑制剂的结构如下：

2、步骤

用DeNovix超微量紫外可见光分光光度计测定PDI-b’x蛋白的浓度，并用含20 mMTris-HCl PH7.4，150 mM NaCl，1 mM DTT的缓冲液将其稀释到终浓度为25 μM的PDI-b’x母液，小分子抑制剂Salicylanilide，Galangin，Isoliquiritigenin，Benserazidehydrochloride，3-hydroxyflavine，Acetylvanillin，4’-O-(3,4-triethyleneglycol)-quercetin及4’-O-(4-nitrobenzyl)-quercetin的母液终浓度为分别为9.5 mM，7.4 mM，7.8 mM，6.8 mM，8.4 mM，10.3 mM，7.7 mM，4.3 mM根据需要加入到200 μL反应体系中，按照以下顺序加入样品：

10μl PDI-b’x母液（1.25 μM）+ 190 μl 缓冲液；

10μl PDI-b’x母液（1.25 μM）+ 5 μl Salicylanilide母液（238 μM）+ 185 μl 缓冲液；

10μl PDI-b’x母液（1.25 μM）+ 5 μl Galangin母液（185 μM）+ 185 μl 缓冲液；

10μl PDI-b’x母液（1.25 μM）+ 5 μl Isoliquiritigenin母液（195 μM）+ 185 μl缓冲液；

10μl PDI-b’x母液（1.25 μM）+ 5 μl Benserazide hydrochloride母液（170 μM）+ 185 μl 缓冲液；

10μl PDI-b’x母液（1.25 μM）+ 5 μl 3-hydroxyflavine母液（210 μM）+ 185 μl缓冲液；

10μl PDI-b’x母液（1.25 μM）+ 5 μl Acetylvanillin母液（258 μM）+ 185 μl 缓冲液；

10μl PDI-b’x母液（1.25 μM）+ 5 μl 4’-O-(3,4-triethyleneglycol)-quercetin母液（193 μM）+ 185 μl 缓冲液；

10μl PDI-b’x母液（1.25 μM）+ 5 μl 4’-O-(4-nitrobenzyl)-quercetin母液（108 μM）+ 185 μl 缓冲液。

在室温孵育15分钟后，放入BioTek Synergy 4酶标仪中检测荧光值变化。设置激发光波长为280 nm，并在310 nm-400 nm范围内扫发射光谱，得到数据用统计软件进行处理，得到图2 所示的曲线。与对照（PDI-b’x）的荧光强度相比，8种小分子抑制剂的加入使得PDI-b’x蛋白的荧光被明显淬灭，表明8种小分子抑制剂能有效的结合PDI的b’结构域，而导致x-linker上的Trp347离开疏水性口袋发生淬灭。

实施例三：胰岛素还原实验检测8种小分子抑制剂对全长PDI的活性抑制

由于PDI在还原剂DTT存在的条件下能还原胰岛素，使得胰岛素的两条链之间的二硫键被还原，还原的胰岛素会沉淀使溶液变浑浊，并且在650 nm处有最大吸收。当PDI抑制剂存在时，这种还原作用被抑制而胰岛素不能被还原。利用此原理，检测Salicylanilide，Galangin，Isoliquiritigenin，Benserazide hydrochloride，3-hydroxyflavine，Acetylvanillin，4’-O-(3,4-triethyleneglycol)-quercetin，4’-O-(4-nitrobenzyl)-quercetin这 8种小分子抑制剂是否抑制全长PDI活性。

具体测定过程

1，材料

经上述实施例1获得的PDI全长蛋白质、8种小分子抑制剂、胰岛素。

缓冲液为：20 mM Tris-HCl pH7.4，150 mM NaCl，1 mM DTT，1 mM EDTA。0.22 μm孔径滤膜过滤。

2，步骤

用DeNovix超微量紫外可见光分光光度计测定PDI全长蛋白的浓度，并用含20 mMTris-HCl PH7.4，150 mM NaCl，1 mM DTT的缓冲液将其稀释到终浓度为36 μM的PDI母液，小分子抑制剂的母液浓度如实施例1所列，根据需要加入到200 μL反应体系中，按照以下顺序加入样品：

10μl PDI母液（1.8 μM）+170 μl 缓冲液+20μl胰岛素；

10μl PDI母液（1.8 μM）+ 5 μl Salicylanilide母液（238 μM）+ 165 μl 缓冲液+20 μl胰岛素；

10μl PDI母液（1.8 μM）+ 5 μl Galangin母液（185 μM）+ 165 μl 缓冲液+20 μl胰岛素；

10μl PDI母液（1.8 μM）+ 5 μl Isoliquiritigenin母液（195 μM）+ 165 μl 缓冲液+20 μl胰岛素；

10μl PDI母液（1.8 μM）+ 5 μl Benserazide hydrochloride母液（170 μM）+ 165μl 缓冲液+20 μl胰岛素；

10μl PDI母液（1.8 μM）+ 5 μl 3-hydroxyflavine母液（210 μM）+ 165 μl 缓冲液+20 μl胰岛素；

10μl PDI母液（1.8 μM）+ 5 μl Acetylvanillin母液（258 μM）+ 165 μl 缓冲液+20 μl胰岛素；

10μl PDI母液（1.8 μM）+ 5 μl 4’-O-(3,4-triethyleneglycol)-quercetin母液（193 μM）+ 165 μl 缓冲液+20 μl胰岛素；

10μl PDI母液（1.8 μM）+ 5 μl 4’-O-(4-nitrobenzyl)-quercetin母液（108 μM）+ 165 μl 缓冲液+20 μl胰岛素。

按照上述顺序，将相应成分加入到96孔透明板中，在加入胰岛素前，将体系混匀并于37℃孵育15分钟。最后加入胰岛素后并立即放入BioTek Synergy 4酶标仪中在650 nm处，1min/read进行检测90 min。检测数据使用统计软件处理。

各种小分子抑制PDI活性的曲线如图3所示。与不加任何小分子抑制剂的对照相比，小分子抑制剂的加入，不同程度地抑制了PDI还原胰岛素的能力。

实施例4：小鼠血栓形成模型评价三种黄酮类小分子的抗血栓效果

当小鼠颈动脉受到电流刺激时会形成血栓。在血栓形成过程中，PDI能调节血小板表面受体及多种凝血因子的活性而调控血栓的形成；当小分子抑制剂加入后，它能抑制PDI的活性而抑制血栓的形成。本实验运用此原理，用小动物血栓生成仪提供直流电电流刺激，诱导血栓形成，并观察记录给药组与对照组小鼠的血栓形成时间。

具体实验过程

1，材料

ICR清洁级雄鼠，小动物血栓生成仪，胶带，剪刀，细绳，止血钳，镊子，Galangin，4’-O-(3,4-triethyleneglycol)-quercetin，4’-O-(4-nitrobenzyl)-quercetin，生理盐水。

2，步骤

将实验小鼠随机分为四组，一组为对照组，三组为实验组。小鼠在实验1.5小时前灌胃处理，对照组用生理盐水灌胃（300 μl），实验组用同体积的Galangin (30 mg/kg)、4’-O-(3,4-triethyleneglycol)-quercetin (40 mg/kg)及4’-O-(4-nitrobenzyl)-quercetin (40 mg/kg)三种小分子灌胃。实验时，用水合氯醛腹腔注射将小鼠麻醉，将麻醉后的小鼠用胶带固定于解剖板上。用75%的酒精擦拭小鼠颈部消毒，用剪刀在颈部剪一条1cm长的口子，露出小鼠的气管。用止血钳夹住颈部两侧剪开组织，用镊子轻轻拨动小鼠气管附近区域，寻找小鼠左侧颈动脉。将找到的颈动脉用细绳提起，挂到血栓生成仪的探头上面。设置电流为0.5 mA ,当脉搏信号稳定以后，开始测定小鼠血栓形成时间，当血管堵塞时(堵塞率显示为95%及以上时)，记录血栓形成时间。

实验组与对照组实验数据经统计软件处理，得到图4所示结果，图4结果表明实验组给药小鼠血栓形成时间明显延后，表现出较好的抗凝效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂，其特征在于：所述蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂为化合物2-氨基-3-羟基-N’-（2,3,4-三羟基苄基）丙酰肼盐酸盐、3-羟基-2-苯基-4H-色烯-4-酮、乙酸4-甲酰基-2-甲氧基苯酯、2-羟基-N-苯基苯甲酰胺、3,5,7-三羟基-2-苯基-4H-色烯-4-酮、1-（2,4-二羟基苯基）-3-（4-羟基苯基）丙-2-烯-1-酮、4'-O-(3,4-二甲基三甘醇基苄基)、4'-O-(4-硝基苄基)槲皮素中的一种。

2.根据权利要求1所述的蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂，其特征在于：蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂能直接结合PDI-b’x结构域，抑制蛋白质二硫键异构酶的活性。

3.如权利要求1所述的蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂在抗血栓形成中的应用。

4.如权利要求1所述的蛋白质二硫键异构酶小分子抑制剂在制备抗血栓形成的药物中的应用。