CN113288857B - 脐带间充质干细胞活性肽分泌物、制备方法、应用及皮肤微生态调节剂 - Google Patents

脐带间充质干细胞活性肽分泌物、制备方法、应用及皮肤微生态调节剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及美容护肤技术领域，尤其是涉及脐带间充质干细胞活性肽分泌物、制备方法、应用及皮肤微生态调节剂。脐带间充质干细胞向环境中分泌很多活性肽分子，对细胞具有多样化的调节功能。发明人无意地发现脐带间充质干细胞不仅可以调节皮肤细胞，还对皮肤表面的微生物群体分布起到了调节的作用。在研究中，发明人发现，脐带间充质干细胞活性肽分泌物，可对一种益生菌Stophylococcus epidermidis具有积极的调节作用，除此之外，其他显著性调节的菌落均没有与皮肤问题直接相关的报道。由此确定脐带间充质干细胞分泌物能够调节皮肤表面微生态。

Description

脐带间充质干细胞活性肽分泌物、制备方法、应用及皮肤微生 态调节剂
技术领域
本发明涉及美容护肤技术领域，尤其是涉及脐带间充质干细胞活性肽分泌物、制备方法、应用及皮肤微生态调节剂。
背景技术
皮肤微生物是皮肤微生态系统的重要成员，皮肤表面的菌群通常可分为常驻菌和暂驻菌。常驻菌是一群在健康皮肤上定居的微生物，与皮肤健康密切相关，包括葡萄球菌、棒状杆菌、丙酸杆菌、不动杆菌、马拉色菌、微球菌、肠杆菌及克雷伯杆菌等。暂驻菌是指通过接触外界环境而获得的一类微生物，包括金黄色葡萄球菌、溶血链球菌及肠球菌等，它们是引起皮肤感染的主要病原菌。
正常的皮肤微生态系统存在着竞争和制约关系，皮肤菌群不正常的增加、减少甚至消失，都会导致皮肤微生态被破坏。
越来越多的研究表明，化妆品领域，应用化妆品配方中的某些成分可与微生物相互作用进而影响皮肤微生态。通过鉴定能够对皮肤微生态的益生菌具有促进作用，对有害菌具有制约作用的活性肽成分对皮肤微生态的调节具有深远的应用价值。但现有化妆品的研发过程很少关注皮肤表面的微生态，也未见有对皮肤表面微生态具有调节作用的化妆品报道，鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种具有皮肤表面微生态调剂功能的脐带间充质干细胞活性肽分泌物，并将其应用于制备皮肤表面微生态调剂，从而对皮肤表面的微生物群落起到良好的调节作用，维持皮肤表面正常状态，充分发挥其天然的屏障作用，同时填补目前市场上具有皮肤表面微生态调节功能的产品的空白。
本发明的另一个目的在于，提供上述脐带间充质干细胞活性肽分泌物的制备方法，以确保采用所述制备方法制备得到的脐带间充质干细胞活性肽分泌物对于皮肤表面的常驻菌和暂驻菌的生长具有调节作用。
本发明还有一个目的在于，以上述脐带间充质干细胞活性肽分泌物为主体，通过合理地选择辅料，提供一种皮肤表面微生态调剂，以满足日用需求，同时适于工业化生产和商业推广。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供脐带间充质干细胞活性肽分泌物，所述分泌物主要由活性肽、烟酸、脂肪和糖类组成。
在可选的实施方式中，所述分泌物还包括维生素C、维生素A或维生素E中至少一种。
在可选的实施方式中，按100g分泌物计，所述分泌物包括以下组分：活性肽0.1～1g，烟酸5～25mg，脂肪0.2～0.6g，糖类10～30mg，维生素C100～500μg，维生素A 25～65μg，维生素E1～5μg。
优选地，所述糖类包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖中的至少一种。
优选地，按100g分泌物计，所述分泌物包括：活性肽0.24g，烟酸17.32mg，脂肪0.4g，糖类23.6mg，维生素C 314μg，维生素A 47.6μg和维生素E 2.7μg。
第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述分泌物的制备方法，所述制备方法包括，采集脐带，分离得到华通氏胶，破碎后培养得到原代干细胞，第一次传代融合度达到85％～90％后，继续传代培养，并收集活性肽分泌物。
在可选的实施方式中，对采集的脐带进行截段，并剔除血管得到华通氏胶。
优选地，所述截段的长度为2cm。
在可选的实施方式中，所述华通氏胶破碎至糊状后培养得到原代干细胞，所述破碎的方法为物理方法，包括剪碎或搅碎。
第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述分泌物或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的分泌物在制备皮肤微生态调节产品中的应用，所述皮肤微生态调节产品通过促进或抑制皮肤表面微生物群落生长，调节皮肤表面微生物群落分布。
第四方面，本发明提供一种皮肤微生态调节剂，包括前述实施方式任一项所述的分泌物或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的分泌物。
在可选的实施方式中，所述调节剂还包括保湿剂、乳化剂、增稠剂或防腐剂中的至少一种。
优选地，所述保湿剂包括丁二醇、甘油、1,3-丙二醇、戊二醇、异戊二醇、二甘油醇、三甘油醇、聚甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇或二乙二醇中的至少一种。
优选地，所述乳化剂包括硬脂酸、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡硬脂基葡糖、鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯、硬脂醇聚醚-20、鲸蜡醇磷酸酯钾、羊毛脂蜡或椰子油PEG-10酯类中的至少一种。
优选地，所述增稠剂包括C14～C22醇、C12～C20烷基葡糖苷、卡波姆、黄原胶、结冷胶、阿拉伯胶树胶、小核菌胶、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、聚丙烯酸酯-13、丙烯酸铵和丙烯酰胺共聚物、羟乙基丙烯酸盐、丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、聚丙烯酸钠、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物或丙烯酰二甲基牛磺酸铵/山嵛醇聚醚-25甲基丙烯酸酯交联聚合物中一种或几种组合。
优选地，所述防腐剂包括羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、氯苯甘醚、山梨酸钾、苯甲酸钠、苯甲酸、水杨酸、咪唑烷基脲、对羟基苯乙酮、辛酰羟肟酸、戊二醇，己二醇或乙基己基甘油中的至少一种。
优选地，所述皮肤微生态调节剂按照重量份数包括，脐带间充质干细胞活性肽分泌物15～25份、硬脂酸10～20份、棕榈酸乙基己酯1～3份、羊毛脂0.5～2份、鲸蜡硬脂醇0.1～0.4份、鲸蜡硬脂基葡糖苷0.1～0.4份、C14-C22醇0.1～0.5份、C12-C20烷基葡糖苷0.1～0.5份、丁二醇5～15份、山梨糖醇1～5份、氢氧化钾0.5～2份、苯氧乙醇0.1～0.7份、羟苯甲酯0.1～0.5份、香精0.05～0.2份、水40～50份。
优选地，所述皮肤微生态调节剂按照重量份数包括，脐带间充质干细胞活性肽分泌物20份、硬脂酸15份、棕榈酸乙基己酯2份、羊毛脂1份、鲸蜡硬脂醇和鲸蜡硬脂基葡糖苷共0.5份、C14-C22醇和C12-C20烷基葡糖苷共0.6份、丁二醇10份、山梨糖醇3份、氢氧化钾1份、苯氧乙醇0.5份、羟苯甲酯0.2份、香精0.1份、水46.1份。
在可选的实施方式中，所述皮肤微生态调节剂的剂型包括膏霜、乳液、水剂、凝胶、油剂、粉剂、泥类、蜡基类、贴类、膜类或冻干类。
脐带间充质干细胞向环境中分泌很多活性肽分子，对细胞具有多样化的调节功能。发明人无意地发现脐带间充质干细胞不仅可以调节皮肤细胞，还对皮肤表面的微生物群体分布起到了调节的作用。在研究中，发明人发现，脐带间充质干细胞活性肽分泌物，可对一种益生菌Stophylococcus epidermidis具有积极的调节作用，除此之外，其他显著性调节的菌落均没有与皮肤问题直接相关的报道。由此确定脐带间充质干细胞分泌物能够调节皮肤表面微生态。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例中样本内物种多样性分析结果；
图2为本发明实验例中功效测试组物种的差异图；
图3为本发明实验例中安慰剂组物种的差异图；
图4为本发明实验例中筛选出的显著变化排名前十的菌株。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在一个具体的实施方案中，本发明提供脐带间充质干细胞活性肽分泌物，所述分泌物主要由活性肽、烟酸、脂肪和糖类组成。
在可选的实施方式中，所述分泌物还包括维生素C、维生素A或维生素E中至少一种。
其中烟酸(Nicotinic acid，CAS登录号：59-67-6)也称作维生素B3，是人体必需的13种维生素之一，水溶性强，在人体内可转化为烟酰胺，进而参与合成辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ，对体内脂质代谢、组织呼吸的氧化以及糖类无氧分解具有重要作用。
维生素C(Vitamin C，CAS登录号：50-81-7)又称抗坏血酸，结构中具有烯二醇结构，具有内酯环，且有2个手性碳原子。因此，维生素C不仅性质活泼，且具有旋光性。其既可作为供氢体，又可作为受氢体，在体内多个氧化还原过程中发挥重要作用，例如促进抗体形成、促进铁的吸收、促进四氢叶酸形成，以及消除自由基等，并有报道维生素C在一定浓度下，对结核分歧杆菌和铜绿假单胞菌等可表现出一定的抑制作用。
维生素A(Vitamin A，CAS登录号：68-26-8)是一种脂溶性维生素，是调节糖蛋白合成的一种辅酶，对上皮细胞的细胞膜起稳定作用，维持上皮细胞的形态完整和功能健全。维生素A缺乏会造成上皮组织干燥，正常的柱状上皮细胞转变为角状的覆层鳞状细胞，导致细胞角化。
维生素E(Vitamin E，CAS登录号：121854-78-2)是一类脂溶性维生素，是重要的抗氧化剂，对酸、热都很稳定，能保护人体内不饱和脂肪酸免受自由基的破坏。
在可选的实施方式中，按100g分泌物计，所述分泌物包括以下组分：活性肽0.1～1g，烟酸5～25mg，脂肪0.2～0.6g，糖类10～30mg，维生素C 100～500μg，维生素A 25～65μg，维生素E1～5μg。
优选地，所述糖类包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖中的至少一种。
优选地，按100g分泌物计，所述分泌物包括：活性肽0.24g，烟酸17.32g，脂肪0.4g，维生素C 314μg，糖类23.6μg，维生素E 2.7μg。
第二方面，本发明提供前述实施方式任一项所述分泌物的制备方法，所述制备方法包括，采集脐带，分离得到华通氏胶，破碎后培养得到原代干细胞，第一次传代融合度达到85％～90％后，继续传代培养，并收集活性肽分泌物。所述第一次传代融合度包括但不限于85％、86％、87％、88％、89％或90％。
在可选的实施方式中，对采集的脐带进行截段，并剔除血管得到华通氏胶。先截段再剔除血管相比先剔除血管再进行截段血管分离的效率更高，获得的间充质干细胞得率更有优势。
优选地，所述截段的长度为2cm。
在可选的实施方式中，所述华通氏胶破碎至糊状后培养得到原代干细胞，所述破碎的方法为物理方法，包括剪碎或搅碎。与采用化学方法对华通氏胶进行破碎的方法相比，采用物理方法对华通氏胶进行破碎能够使间充质干细胞在培养基中逐步爬出，这种方式比整体消化法对细胞的损伤更小，更容易获得高质量的间充质干细胞。
活性肽是一千多种肽的总称，按照功能分类，包括结合肽、神经肽、抗菌肽和调味肽等近十余种，其中抗菌肽的来源多为微生物，如短杆菌肽、枯草菌素、乳酸链球菌肽等，动植物内源抗菌肽种类较少，而间充质干细胞分泌的活性肽具有抗菌功能报道并未见报道，发明人意外地发现，采用上述制备方法得到的活性肽分泌物具有调节皮肤表面微生态的作用，即对皮肤表面有益菌表现促进生长的同时，还对有害菌表现出了一定程度的抑制作用。
第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述分泌物或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的分泌物在制备皮肤微生态调节产品中的应用，所述皮肤微生态调节产品通过促进或抑制皮肤表面微生物群落生长，调节皮肤表面微生物群落分布。
第四方面，本发明提供一种皮肤微生态调节剂，包括前述实施方式任一项所述的分泌物或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的分泌物。
在可选的实施方式中，所述调节剂还包括保湿剂、乳化剂、增稠剂或防腐剂/抑菌剂中的至少一种。
优选地，所述保湿剂包括丁二醇、甘油、1,3-丙二醇、戊二醇、异戊二醇、二甘油醇、三甘油醇、聚甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇或二乙二醇中的至少一种。
优选地，所述乳化剂包括硬脂酸、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡硬脂基葡糖、鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯、硬脂醇聚醚-20、鲸蜡醇磷酸酯钾、羊毛脂蜡或椰子油PEG-10酯类中的至少一种。
优选地，所述增稠剂包括C14～C22醇、C12～C20烷基葡糖苷、卡波姆、黄原胶、结冷胶、阿拉伯胶树胶、小核菌胶、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、聚丙烯酸酯-13、丙烯酸铵和丙烯酰胺共聚物、羟乙基丙烯酸盐、丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、聚丙烯酸钠、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物或丙烯酰二甲基牛磺酸铵/山嵛醇聚醚-25甲基丙烯酸酯交联聚合物中一种或几种组合。
优选地，所述防腐剂包括羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、氯苯甘醚、山梨酸钾、苯甲酸钠、苯甲酸、水杨酸、咪唑烷基脲、对羟基苯乙酮、辛酰羟肟酸、戊二醇，己二醇或乙基己基甘油中的至少一种。
优选地，所述皮肤微生态调节剂按照重量份数包括，脐带间充质干细胞活性肽分泌物15～25份、硬脂酸10～20份、棕榈酸乙基己酯1～3份、羊毛脂0.5～2份、鲸蜡硬脂醇0.1～0.4份、鲸蜡硬脂基葡糖苷0.1～0.4份、C14-C22醇0.1～0.5份、C12-C20烷基葡糖苷0.1～0.5份、丁二醇5～15份、山梨糖醇1～5份、氢氧化钾0.5～2份、苯氧乙醇0.1～0.7份、羟苯甲酯0.1～0.5份、香精0.05～0.2份、水40～50份。
优选地，所述皮肤微生态调节剂按照重量份数包括，脐带间充质干细胞活性肽分泌物20份、硬脂酸15份、棕榈酸乙基己酯2份、羊毛脂1份、鲸蜡硬脂醇和鲸蜡硬脂基葡糖苷共0.5份、C14-C22醇和C12-C20烷基葡糖苷共0.6份、丁二醇10份、山梨糖醇3份、氢氧化钾1份、苯氧乙醇0.5份、羟苯甲酯0.2份、香精0.1份、水46.1份。
在可选的实施方式中，所述皮肤微生态调节剂的剂型包括膏霜、乳液、水剂、凝胶、油剂、粉剂、泥类、蜡基类、贴类、膜类或冻干类。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞活性肽分泌物的制备方法，包括以下步骤：
1.1脐带华通氏胶的分离
(1)采集脐带，将脐带放入无菌一次性脐带采集瓶，浸没在保存液中，拧紧瓶盖，并放入4℃冰箱存放；在无菌环境下测定脐带长度为55cm，而后将脐带剪成长度为2cm的小段，并剔除脐带的动脉和静脉，分离得到华通氏胶。
(2)收集华通氏胶，滴入1～2mLMEM-alpha培养基，将华通氏胶剪碎，呈糊状。
(3)取步骤(2)中剪碎的华通氏胶1mL加入到细胞培养皿中，而后再加入2～3mL的MEM-alpha培养基，将华通氏胶完全覆盖培养皿底部，放入细胞培养箱中培养。
(4)待华通氏胶生长7天后观察细胞生长状况，有细胞从组织块边沿慢慢开始爬出，然后细胞快速增殖，到15天左右，将组织去除，得到原代干细胞。
(5)原代细胞进行传代，融合度达到87％后，从培养皿中吸出培养上清收集间充质干细胞分泌多肽原液于专用收集瓶中；而后向培养皿中加入PBS洗涤，前后摇晃容器数次后吸出洗涤液丢弃，加入胰酶3mL，摇晃培养瓶使得胰酶完全覆盖细胞层，显微镜下观察细胞变圆，肉眼可见贴壁细胞层有大量细胞掉落时，倾斜培养瓶，加入大于所用胰酶一倍体积的MEM-alpha培养基终止消化，轻轻吹打细胞层表面，分散培养基，吸取细胞悬液于15mL离心管内，1000rpm离心5分钟，倒去上清液，加入5mL培养基重悬，离心洗涤倒去上清液，加入7mL培养基重悬细胞，混合均匀，加入T-75培养瓶中，放入培养箱继续培养，而后当融合度再次达到87％后，再次从培养皿中吸出培养上清收集间充质干细胞分泌多肽原液于专用收集瓶中，如此重复收集间充质干细胞分泌多肽原液。
(6)将收集的脐带间充质干细胞分泌的多肽混合原液50mL，即脐带间充质干细胞活性肽分泌物，递送嘉兴中科检测技术服务有限公司进行组成委托检测，检测结果如表1所示。
表1实施例1得到的多肽混合原液组分检测结果
测试项目 检测方法 单位 检测结果 检出限
蛋白质 GB 5009.5-2016 g/100g 0.24 /
脂肪 GB 5009.6-2016 g/100g 0.4 /
总糖 液相色谱法 g/kg 0.236 /
葡萄糖 液相色谱法 g/kg 0.236 /
维生素A 液相色谱法 μg/100g 47.6 /
维生素E 液相色谱法 μg/100g 2.7 /
维生素C 液相色谱法 μg/100g 314 /
烟酸 液相色谱法 μg/100g 17320 /
乳酸 SN/T 2007-2007 g/kg 未检出 0.25
柠檬酸 SN/T 2007-2007 g/kg 未检出 0.25
实施例2
本实施例使用实施例1得到的脐带间充质干细胞活性肽分泌物配制了一种皮肤微生态调节膏霜，其组成如表2所示。
表2实施例2提供的皮肤微生态调节膏霜组份表
Figure BDA0003079632920000111
Figure BDA0003079632920000121
对比例1
本对比例采用水替代实施例2中的脐带间充质干细胞活性肽分泌物，得到空白安慰剂组膏霜。
实验例
本实验例通过征集志愿者，分别与皮肤表面施用实施例2和对比例1提供的膏霜，而后考察志愿者施用部位皮肤表面微生物群落的生长情况。
1、材料准备
准备如下实验材料：
(1)标签；
(2)2mL螺口管(外螺旋)含MoBioBuffer 750μL；
(3)无菌采样拭子；
(4)无菌SCF-1溶液，含有50mM Tris buffer(pH 7.6)，1mM EDTA(pH 8.0)和质量百分比为0.5％的Tween-20，用于采样前湿润拭子；
(5)封口袋用于收集采样管；
(6)便携式泡沫盒(含冰块)。
2、人群皮肤确定
(1)受试者排除标准：
①受试者前七天，面部、颈部、手臂、或手上局部使用过抗生素或类固醇类药物。(当受试者满足抗生素或类固醇使用的排除时间段时，可以推迟筛选和取样)；
②痤疮不能出现在脸部、胸部、背部和肩部；
③头皮、面部、手臂、前臂或手上带有多处水泡、脓包、烫伤、脓肿、糜烂或溃疡；
④单个水泡、脓包、烫伤、脓肿、感染、溃疡、结痂、切口、裂缝或粉红斑/色素沉着斑或斑块距离取样点4cm以内的；
⑤多个粉红斑/红色鳞斑/斑块在身体的任何地方(牛皮癣或湿疹)；
⑥手掌双侧和/或脚掌出现均匀增厚的死皮，开裂和过分干燥；
⑦每天使用不了解成分的非处方去头屑洗发水长达2周的；
⑧传播性皮疹(在多个身体部位出现或延伸遍及身体大部分区域)。
(2)检测条件
皮肤检查应在良好的照明条件下进行，包括局部皮肤(整个身体)的一般调查和采样区域的详细检查。
(3)其他检测标准：
①通过目视检测仔细检查后前额、两侧面颊和双臂两肘的肘窝(内肘)；
②个体带有任何单个水疱，脓疱，烫伤，脓肿，感染，溃疡，结痂，切口，裂缝或粉红斑/色素沉着斑或斑块，可见皮肤损伤，距离采样部位超过4厘米的仍被认为有资格纳入研究。
(4)取样前8h不能进行面部清洁、不能使用任何化妆品、不能用抗菌活性肥皂洗澡。
经上述人群皮肤确定，共招募11名符合条件的志愿者。
3、样品采集方法
(1)无受试物采集:
肘窝(内肘)：指手臂和前臂的接合处正好位于内肘的弯曲处。皮肤样本采集采用两根采集拭子/样本，并用无菌SCF-1溶液湿润。用一只手拉伸肘部皮肤，另一只手，握住拭子，使轴平行于皮肤表面，并沿着肘前皱纹前后摩擦拭子约50次，施加稳定的压力(约30秒完成50次擦拭)。将拭子插入管子中，拭子头部插入到收集管中，将棉签的头部从手柄无菌切割，并且将管帽拧回到适当位置。
注意事项：
a.为了获得最佳的皮肤表面标本，采样技术的关键点：使用湿润的棉签，施加稳定的压力，以及摩擦的一致性(在采样点30秒内来回50次)。
b.左右两侧分别采样，并分别标记和保存。将管子收纳于拉链自封袋并置于液氮罐中急速冷冻2min，转移至-80℃冷冻保存，后运输至检测机构(泡沫盒内装干冰或冰块)。
(2)受试物涂抹:
志愿者定期(一天一次)于一侧肘窝涂抹对比例提供的膏霜，另一侧相同部位涂抹实施例2提供的膏霜。
(3)使用后采集：
使用当天，以及使用后的第14天和第28天进行样本采集，采集方法及细节同“(1)无受试物采集”。
4、取样后迅速在液氮罐中2min急速冷冻冻存管，并转移至-80℃中暂时保存，后运输至检测机构进行16s测序，测序步骤如下：
(1)1.1微生物组总DNA提取
使用试剂盒
Figure BDA0003079632920000141
Water DNA Kit对于皮肤样本选用微生物组总DNA提取方法，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。
(2)PCR扩增
PCR扩增体系如表3所示：
表3实验例中PCR扩增反应体系
PCR反应成分 体积
Phusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5μL
Forward Primer 2.5μL
Reverse Primer 2.5μL
Template DNA 50ng
Add ddH<sub>2</sub>O to 25μL
本实验例中共采用4对引物对，用于PCR扩增反应，具体引物序列如表4所示。
表4实验例中PCR扩增反应的引物对信息表
Figure BDA0003079632920000151
PCR扩增反应条件如表5所示：
表5实验例中PCR扩增反应条件
PCR反应温度 PCR反应时间 循环数
98℃ 30s
98℃ 10s
54℃ 30s 35cycles
72℃ 45s
72℃ 10min
4℃ ∞
使用表4给出的引物对序列进行扩增，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳确定。在整个DNA提取过程中，使用的是超纯水，以排除假阳性PCR结果作为阴性对照的可能性，PCR产物由AMPure XT beads(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA,USA)纯化，Qubit(Invitrogen,USA)定量。扩增子池用于测序，扩增子文库的大小和数量分别在Agilent2100生物分析仪(Agilent，美国)和Illumina(Kapa Biosciences,Woburn,MA，美国)的文库定量试剂盒上进行评估，而后在NovaSeq PE250平台上对库进行排序。
(3)生信分析流程
样品在Illumina NovaSeq平台上按照制造商的建议进行测序，由LC-Bio提供。根据样品条形码，将配对端序列分配给样品，并将建库引入的barcode和引物序列去除，使用FLASH合并匹配端读取。根据fqtrim(v0.94)，对原始读数据进行质量过滤，以获得高质量的clean标签。使用Vsearch软件对嵌合序列进行过滤(v2.3.4)，再利用DADA2进行解调，得到特征表和特征序列。
通过归一化到相同的随机序列来计算多样性。然后根据SILVA(release132)分类器，利用每个样本的相对丰度对特征丰度进行归一化。Alpha多样性用于分析样本物种多样性的复杂性，通过QIIME2计算出来的5个指标，包括Chao1、Observed species,Goodscoverage、Shannon、Simpson进行Alpha多样性分析。Beta多样性由QIIME2计算，R包绘制。采用Blast进行序列比对，每个代表性序列用SILVA数据库对特征序列进行注释。
样本内物种多样性分析结果(alpha多样性)如图1所示，L-D0/L-D14/L-D28为含有+20％间充质干细胞活性肽分泌提取液的测试膏霜使用前、使用14天，使用28天的皮肤表面取样检测结果，R-D0/R-D14/R-D28为安慰剂空白对照使用前、使用14天，使用28天的皮肤表面取样检测结果。通过Alpha多样性分析度量单个样本内有多少种微生物物种(即speciesrichness，丰富度)，以及每个微生物物种所占的比例(即evenness，均匀度)。当一个样本中所含微生物物种种类越多，则它的丰富度越高，所含的每种微生物物种的占比越平均，则均匀度越高。Chao反映样本中物种丰富度均匀度。
在实际的图形化展示中，小提琴图集合了箱形图和密度图的特征。左上角给出了差异分析使用的检验方法和计算得到的p值。当p<0.01，则标记为**，表示差异极显著；当p<0.05，则标记为*，表示差异显著；当p>0.05，则标记为ns，表示无显著性差异。
从结果中可以看出，使用前后，不论是功效测试组还是安慰剂组，本底的膏霜对多样性产生了显著性的影响。但是在使用中的14天和28天，功效测试组和安慰剂组在微生物整体的多样性上没有显著性差异，说明间充质干细胞活性肽分泌提取液不会显著改变皮肤表面微生物丰富度。
基于样本物种相对丰度表，对两组样本之间物种的差异比较采用Kruskal-Wallistest，对有生物学重复样品的多组之间比较。功效测试组和安慰剂组的物种的差异分别如图2和图3所示，在图2和图3中分别筛选出功效测试组和安慰剂组中显著变化排名前十的菌株，如图4所示。
Placebo为安慰剂组中显著变化的菌种top10，+20％ARRESO为间充质干细胞活性肽分泌提取液的测试膏霜组中显著变化的菌top10。两者在这个层面具有显著的差异。
其中top5中显著变化的，且科学领域标注清晰的菌种整理如下表：
表6显著变化top5且科学领域标注清晰的菌种
Figure BDA0003079632920000181
Figure BDA0003079632920000191
由表6可以看出，4种菌株中，Staphylococcus hominis、Pseudomonasfluorescens、Pseudomonas sp P6在文献检索和报道中未见有害报道。Stophylococcusepidermidis属于益生菌，在间充质干细胞活性肽分泌提取液中随着时间比例显著提升，据报道Stophylococcus epidermidis可以有效抑制痤疮丙酸杆菌P-acnes，从而降低痤疮的风险，还可以有效抑制金黄色葡萄球菌P.S.aureus，从而降低敏感肌风险，可以有效抑制紫外引起的皮肤癌风险，可见，采用本发明实施例1提供制备方法得到的间充质干细胞活性肽分泌物用于皮肤微生态调剂膏霜能够在整体微生物群落共同生长的条件下，促进益生菌生长，同时对包括Staphylococcus hominis、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas sp P6等菌在内的多达十种以上的微生物的生长发挥调节作用，起到了皮肤表面微生态调节的功能。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 启迪禾美生物科技(嘉兴)有限公司
<120> 脐带间充质干细胞活性肽分泌物、制备方法、应用及皮肤微生态调节剂
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
cctacgggng gcwgcag 17
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gactachvgg gtatctaatc c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgycagcmg ccgcggtaa 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggactachvg ggtwtctaat 20
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgccagcmg ccgcgg 16
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgtcaattc mtttragttt 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gygcascagk cgmgaaw 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (15)

1.脐带间充质干细胞活性肽分泌物在制备皮肤微生态调节产品中的应用，所述皮肤微生态调节产品通过促进皮肤表面Staphylococcus epidermidis生长，调节皮肤表面微生物群落分布；
按100g活性肽分泌物计，所述活性肽分泌物包括以下组分：活性肽 0.1~1g，烟酸5~25mg，脂肪0.2~0.6g，糖类10~30mg，维生素C 100~500μg，维生素A 25~65μg，维生素E 1~5μg。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖类包括葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，按100g活性肽分泌物计，所述分泌物包括：活性肽 0.24g，烟酸 17.32mg，脂肪 0.4g，糖类 23.6mg，维生素C 314μg，维生素A 47.6μg和维生素E 2.7μg。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述活性肽分泌物的制备方法包括，采集脐带，分离得到华通氏胶，破碎后培养得到原代干细胞，第一次传代融合度达到85%~90%后，继续传代培养，并收集活性肽分泌物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，对采集的脐带进行截段，并剔除血管得到华通氏胶。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述截段的长度为2cm。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述华通氏胶破碎至糊状后培养得到原代干细胞，所述破碎的方法为物理方法，包括剪碎或搅碎。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤微生态调节产品还包括保湿剂、乳化剂、增稠剂或防腐剂中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述保湿剂包括丁二醇、甘油、1,3-丙二醇、戊二醇、异戊二醇、二甘油醇、三甘油醇、聚甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇或二乙二醇中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述乳化剂包括硬脂酸、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡硬脂基葡糖、鲸蜡硬脂醇乙基己酸酯、硬脂醇聚醚-20、鲸蜡醇磷酸酯钾、羊毛脂蜡或椰子油PEG-10酯类中的至少一种。
11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述增稠剂包括C14～C22醇、C12～C20烷基葡糖苷、卡波姆、黄原胶、结冷胶、阿拉伯胶树胶、小核菌胶、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、聚丙烯酸酯-13、丙烯酸铵和丙烯酰胺共聚物、羟乙基丙烯酸盐、丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、聚丙烯酸钠、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物或丙烯酰二甲基牛磺酸铵/山嵛醇聚醚-25甲基丙烯酸酯交联聚合物中一种或几种组合。
12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述防腐剂包括羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、氯苯甘醚、山梨酸钾、苯甲酸钠、苯甲酸、水杨酸、咪唑烷基脲、对羟基苯乙酮、辛酰羟肟酸、戊二醇，己二醇或乙基己基甘油中的至少一种。
13.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述皮肤微生态调节产品按照重量份数包括，脐带间充质干细胞活性肽分泌物15~25份、硬脂酸10~20份、棕榈酸乙基己酯1~3份、羊毛脂0.5~2份、鲸蜡硬脂醇0.1~0.4份、鲸蜡硬脂基葡糖苷0.1~0.4份、C14~C22醇0.1~0.5份、C12~C20烷基葡糖苷0.1~0.5份、丁二醇5~15份、山梨糖醇1~5份、氢氧化钾0.5~2份、苯氧乙醇0.1~0.7份、羟苯甲酯0.1~0.5份、香精0.05~0.2份、水40~50份。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述皮肤微生态调节产品按照重量份数包括，脐带间充质干细胞活性肽分泌物20份、硬脂酸15份、棕榈酸乙基己酯2份、羊毛脂1份、鲸蜡硬脂醇和鲸蜡硬脂基葡糖苷共0.5份、C14~C22醇和C12~C20烷基葡糖苷共0.6份、丁二醇10份、山梨糖醇3份、氢氧化钾1份、苯氧乙醇0.5份、羟苯甲酯0.2份、香精0.1份、水46.1份。
15.根据权利要求8~14任一项所述的应用，其特征在于，所述皮肤微生态调节产品的剂型包括膏霜、乳液、水剂、凝胶、油剂、粉剂、泥类、蜡基类、贴类、膜类或冻干类。
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