CN113287751A - 一种复合益生菌及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合益生菌制剂及制备方法，该复合益生菌包含益生菌、益生元、膳食纤维、益生菌裂解物提取物以及猪大肠脱细胞基质，该复合益生菌中各组分的含量分别如下：益生菌2～25重量份；益生元50～200重量份；膳食纤维300～500重量份；益生菌裂解物提取物5～25重量份；猪大肠脱细胞基质2～25重量份；本发明所述的复合益生菌能够有效调节肠道菌群，其中益生菌裂解物提取物的添加，保证益生菌到达肠道中的活菌量，增强保健功能，猪大肠脱细胞基质的添加，促进益生菌在肠道内定植生长，在益生菌利用上具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于益生菌领域，具体涉及一种复合益生菌制剂及其制备方法与应用。
背景技术
肠道微生物不仅可以作为天然屏障维持肠上皮的完整性，防止病原微生物入侵，还通过调节肠道粘膜分泌抗体作用于肠道免疫系统，并进一步影响天然免疫和获得性免疫，因此肠道微生物又被认为是人体最大的“免疫器官”。肠道微生物维持的免疫平衡在机体自身免疫疾病的预防过程中起着重要作用，当某些因素导致肠道菌群发生改变时，会进一步影响到人的其它免疫系统，这种免疫平衡一旦被打破，就容易导致各种疾病的产生。越来越多的实验证据表明，肠道微生物不仅影响人体肠道本身的功能，还通过调控人的免疫系统，从不同角度和层面影响人的健康。
益生菌是一类定植于人体肠道、生殖系统内的对宿主有益的活性微生物。益生菌通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，起到促进营养吸收、防治肠道相关疾病、增强机体免疫力和延缓衰老等生理作用，进而产生健康功效并改善宿主的健康状况。益生菌还能够产生抗菌肽（细菌素）和酸。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等，其被广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。益生菌是有生命活力的微生物，从生产(包括菌种的筛选、生产环境、包装等)、在货架待售、食用后经过胃酸、胆汁等极端环境到达肠道--这层层考验均会消耗益生菌的活性，只有经过这些关卡并终在肠道定点生殖存活的益生菌才能真正发挥作用。然而由于经过长期的损耗，现有的益生菌产品通常在到达人体中的益生菌产品的活菌数目降低，很难保证最终到达大肠的活菌量。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种复合益生菌，通过添加胞外基质蛋白，提高益生菌的活性，保证在大肠的定植活菌数；并通过添加益生菌裂解物提取物，快速发挥调控肠道粘膜下免疫细胞的作用。
本发明的另一目的在于提供一种复合益生菌的制备方法。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：
一种复合益生菌，包括以下份数原料：
益生菌 2~25重量份；
益生元 50~200重量份；
膳食纤维 300~500重量份；
益生菌裂解物提取物 5~25重量份；
猪大肠脱细胞基质 2~25重量份。
优选地，所述益生菌活菌量为107～1010CFU/g。
优选地，所述益生菌为质量比1：1：1的罗伊式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌。
优选地，所述益生元质量比1：1：1的菊粉、胶原蛋白粉、低聚木糖。
优选地，所述膳食纤维为戊聚糖、β－1,3葡聚糖、β－1,4葡聚糖、可溶性果胶、阿拉伯聚糖、魔芋多糖、抗性糊精中的一种或两种以上混合。
优选地，所述益生菌裂解物提取物为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳双歧杆菌中的一种或三种以上混合的裂解物提取物；其中，益生菌活菌量为107～1010CFU/g。
优选地，所述猪大肠脱细胞基质是由猪大肠脱脂脱细胞后制得，制备得到的猪大肠脱细胞基质进行冻干备用。
上述复合益生菌的制备方法，包括以下步骤：
（1）在氮气氛围下，将益生菌、猪大肠脱细胞基质与部分膳食纤维混合均匀；
（2）加入剩余部分膳食纤维和益生元，混合均匀；无菌下包装。
优选地，所述步骤（1）的部分膳食纤维的用量为益生菌重量的4-5倍。
上述复合益生菌在调节肠道菌群上的应用。
所述猪大肠脱细胞基质的制备过程为：将新鲜取下的猪大肠组织在流水中冲洗，并用镊子将大肠外的结缔组织、脂肪、淋巴结等钝性剥离后去除，反复用PBS进行清洗；将处理好的猪大肠横断剪成长3.0~4.0 cm的长条管状，把黏膜层向外翻，使用10%~30% 的NaOH溶液浸泡，室温下摇床振荡24 h，每3 h换液1次，之后用2% SDS + 0.5% EDTA溶液浸泡，室温下摇床振荡12 h，每3 h换液1次。随后取出，用PBS浸泡洗涤10~15次，浸入1% Triton X-100+0.5% EDTA室温振荡12 h，每3 h换液1次；取出后用PBS冲洗10~15次，制备得到的猪大肠脱细胞基质进行冻干。
本发明的有益效果
1. 本发明所述的复合益生菌能够有效调节肠道菌群，促进益生菌在肠道内定植和增殖长，保证益生菌在肠道中的活菌量，增强保健功能；
2. 在本发明中，使用了益生菌裂解物提取物与益生菌、益生元、膳食纤维等结合，相互促进，具有良好的协同作用；
3. 猪大肠脱细胞基质有利于益生菌在肠道的定植，也有利于益生菌抵抗体内炎性环境和自由基等逆境；
4. 本发明所述的复合益生菌为散剂剂型，可以作为添加剂添加到其他产品(乳制品等)中，是一种安全健康的保健品。
具体实施方式
实施例中所用猪大肠脱细胞基质的制备过程为：将新鲜取下的猪大肠组织在流水中冲洗，并用镊子将大肠外的结缔组织、脂肪、淋巴结等钝性剥离后去除，反复用PBS进行清洗；将处理好的猪大肠横断剪成长3.0~4.0 cm的长条管状，把黏膜层向外翻，使用15% 的NaOH溶液浸泡，室温下摇床振荡24 h，每3 h换液1次，之后用2% SDS + 0.5% EDTA溶液浸泡，室温下摇床振荡12 h，每3 h换液1次。随后取出，用PBS浸泡洗涤15次，浸入1% TritonX-100+0.5% EDTA室温振荡12 h，每3 h换液1次；取出后用PBS冲洗15次，制备得到的猪大肠脱细胞基质进行冻干。
实施例1
一种复合益生菌，该复合益生菌包含益生菌、益生元、膳食纤维以及益生菌裂解物提取物，该复合益生菌中各组分的含量分别如下：
罗伊式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌（1：1：1，益生菌活菌量为107CFU/g） 2g
菊粉：胶原蛋白粉：低聚木糖（1：1：1） 50g
可溶性果胶 500g
益生菌裂解物提取物 5g
猪大肠脱细胞基质 2g
通过以下方法制备而成：
其制备方法为：
1) 将4倍重量于罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌的抗性糊精置于用医用氮气置排空的混合机内，然后加入罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌，唾液乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌裂解物提取物及猪大肠脱细胞基质，并混合均匀；
2) 待步骤1) 完成后，加入剩余的抗性糊精和配方量的低聚木糖、胶原蛋白粉和菊粉，混合均匀，无菌下包装。
实施例2
一种复合益生菌，该复合益生菌包含益生菌、益生元、膳食纤维以及益生菌裂解物提取物，该复合益生菌中各组分的含量分别如下：
罗伊式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌（1：1：1，益生菌活菌量为1010CFU/g） 10g
菊粉：胶原蛋白粉：低聚木糖（1：1：1 ） 200 g
β－1,3葡聚糖 300 g
益生菌裂解物提取物 10 g
猪大肠脱细胞基质 10 g
通过以下方法制备而成：
其制备方法为：
1)将4倍重量于罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌的抗性糊精置于用医用氮气置排空的混合机内，然后加入罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌，唾液乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌裂解物提取物及猪大肠脱细胞基质，并混合均匀；
2)待步骤1)完成后，加入剩余的抗性糊精和配方量的低聚木糖和菊粉，混合均匀，无菌下包装。
实施例3
一种复合益生菌，该复合益生菌包含益生菌、益生元、膳食纤维以及益生菌裂解物提取物，该复合益生菌中各组分的含量分别如下：
罗伊式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌（1：1：1，益生菌活菌量为109CFU/g） 20 g
菊粉：胶原蛋白粉：低聚木糖（1：1：1 ） 100 g
魔芋多糖 400 g
益生菌裂解物提取物 20 g
猪大肠脱细胞基质 20 g
通过以下方法制备而成：
其制备方法为：
1)将5倍重量于罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌的抗性糊精置于用医用氮气置排空的混合机内，然后加入罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌，唾液乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌裂解物提取物及猪大肠脱细胞基质，并混合均匀；
2)待步骤1)完成后，加入剩余的抗性糊精和配方量的低聚木糖、胶原蛋白粉和菊粉，混合均匀，无菌包装。
实施例4
一种复合益生菌，该复合益生菌包含益生菌、益生元、膳食纤维以及益生菌裂解物提取物，该复合益生菌中各组分的含量分别如下：
罗伊式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌（1：1：1，益生菌活菌量为108CFU/g） 25 g
菊粉：胶原蛋白粉：低聚木糖（1：1：1 ） 150 g
抗性糊精 400 g
益生菌裂解物提取物 25 g
猪大肠脱细胞基质 25 g
通过以下方法制备而成：
其制备方法为：
1)将5倍重量于罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌的抗性糊精置于用医用氮气置排空的混合机内，然后加入罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌，唾液乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌裂解物提取物及猪大肠脱细胞基质，并混合均匀；
2)待步骤1)完成后，加入剩余的抗性糊精和配方量的低聚木糖、胶原蛋白粉和菊粉，混合均匀，无菌下包装。
功能试验
一、所述模拟胃液的制备方法包括：量取盐酸234 mL，加水稀释至1000 mL，得到含盐酸为9.5%-10.5%的稀盐酸；称取16.4 mL所述稀盐酸、800 mL水和10g胃蛋白酶，于烧杯中混合均匀后，加水定容至1000 mL，此时得到pH应为0.9~1.5的人工模拟胃液。
二、对本发明的复合益生菌调节肠道菌群功能试验
试验对象：24 只3~4周龄雄性 SD 大鼠和 35 只3~4周龄雄性 ICR 小鼠
分组及剂量：将大鼠随机分成 4 组，每组 6 只，包括空白对照组、复合益生菌处理组1（实施例1制备的复合益生菌）、复合益生菌处理组2（实施例2制备的复合益生菌）、复合益生菌处理组3（实施例3制备的复合益生菌）和复合益生菌处理组4（实施例4制备的复合益生菌）；将小鼠随机分成 5 组，每组 7 只，包括空白对照组、模型组、复合复合益生菌处理组1（实施例1制备的复合益生菌）、复合益生菌处理组2（实施例2制备的复合益生菌）、复合益生菌处理组3（实施例3制备的复合益生菌）和复合益生菌处理组4（实施例4制备的复合益生菌），进入正式实验。大鼠和小鼠的 4 组益生菌处理组分别一次性灌胃 1×109 CFU/d的复合益生菌。大鼠及小鼠分别灌胃35天和28天，空白对照组和模型组在整个实验周期内则灌胃 0.5 mL 生理盐水，其中小鼠模型组及小鼠实验组仅在小肠运动试验当天灌胃复方地芬诺酯来抑制小鼠小肠运动性。
指标检测：复合益生菌对小鼠肠道运动性、大鼠体重、大鼠消化酶类活性、大鼠血液生化指标的影响。
小鼠灌胃 28 d 后进行小肠运动实验，空白对照组灌胃同体积蒸馏水，模型组和各实验组给复方地芬诺酯30 min 后，各组灌胃墨汁（5%活性炭粉、10%阿拉伯树胶的水溶液）。给墨汁 25 min 后颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管。将小肠拉成直线，测量肠管长度作为“小肠总长度”，从幽门至炭末前沿的距离作为“炭末在肠内推进距离”，按下式计算炭末推进百分率。
结果如下：
表1：复合益生菌对小鼠肠道运动性的影响
实验开始前称量大鼠体重为初始体重。处理组大鼠益生菌灌胃，空白对照组灌胃同体积生理盐水，经 5 周试验结束时称量大鼠最终体重。
结果如下：
表2：益生菌对大鼠体重的影响
处理组大鼠益生菌灌胃，空白对照组灌胃同体积生理盐水，经 5 周试验结束时，检测大鼠胃液蛋白酶、肠液中胰蛋白酶和淀粉酶活力的指标。
结果如下：
表3：复合益生菌对大鼠消化酶类活性的影响
处理组大鼠益生菌灌胃，空白对照组灌胃同体积生理盐水，经 5 周试验结束时检测大鼠血清蛋白含量的指标。
结果如下：
表4：益生菌对大鼠血清蛋白含量的影响
处理组大鼠益生菌灌胃，空白对照组灌胃同体积生理盐水，经 5 周试验结束时检测大鼠血脂指标。
结果如下：
表5：益生菌对大鼠血脂指标的影响
以上结果提示该复合益生菌能够通过促进宿主肠道运动性，提高肠液中胰蛋白酶的活力，在提高宿主动物的体重增重的同时并不会带来不良影响，具有一定的安全性，因此，可认为该复合益生菌将来可促进人类健康。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种复合益生菌，其特征在于，包括以下份数原料：
益生菌 2~25重量份；
益生元 50~200重量份；
膳食纤维 300~500重量份；
益生菌裂解物提取物 5~25重量份；
猪大肠脱细胞基质 2~25重量份。
2.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述益生菌活菌量为107～1010CFU/g。
3.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述益生菌为质量比1：1：1的罗伊式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌。
4.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述益生元质量比1：1：1的菊粉、胶原蛋白粉、低聚木糖。
5.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述膳食纤维为戊聚糖、β－1,3葡聚糖、β－1,4葡聚糖、可溶性果胶、阿拉伯聚糖、魔芋多糖、抗性糊精中的一种或两种以上混合。
6.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述益生菌裂解物提取物为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳双歧杆菌中的一种或三种以上混合的裂解物提取物；其中，益生菌活菌量为107～1010CFU/g。
7.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述猪大肠脱细胞基质是由猪大肠脱脂脱细胞后制得，制备得到的猪大肠脱细胞基质进行冻干备用。
8.权利要求1所述的复合益生菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在氮气氛围下，将益生菌、猪大肠脱细胞基质与部分膳食纤维混合均匀；
（2）加入剩余部分膳食纤维和益生元，混合均匀；无菌下包装。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的部分膳食纤维的用量为益生菌重量的4-5倍。
10.权利要求1所述的复合益生菌在调节肠道菌群上的应用。
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