CN113264917A - 一种抗乙肝病毒化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗乙肝病毒化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗乙肝病毒化合物及其制备方法和应用；所述制备方法包括以下步骤：(1)将5‑氟‑11‑(吡咯烷‑1‑基)‑8H‑二苯并[3,4；6,7]环庚并[1,2‑b]噻吩‑8‑酮溶于第一有机溶剂中，降温至0℃后，加入NBS，搅拌均匀后，转移至25℃下反应得到5‑氟‑2‑溴‑11‑(吡咯烷‑1‑基)‑8H‑二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2‑b]噻吩‑8‑酮；(2)将5‑氟‑2‑溴‑11‑(吡咯烷‑1‑基)‑8H‑二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2‑b]噻吩‑8‑酮、碱试剂、催化剂以及硼酸化合物溶于第二有机溶剂中，在25℃‑100℃发生偶联反应，得到抗乙肝病毒化合物。本发明制备得到的化合物，经生物活性检测，对肝细胞内HBV的cccDNA具有抑制作用，且对正常肝细胞毒性低，可用于预防、处理、治疗或减轻乙肝患者病毒感染性疾病。

Description

一种抗乙肝病毒化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，尤其涉及一种抗乙肝病毒化合物及其制备方法和应用。
背景技术
乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒感染机体后引起的疾病。乙肝病毒在人体内连续不断的复制会引起肝脏病变，严重危害患者健康。虽然乙肝疫苗的诞生大大降低了感染乙肝的风险，但世界各地每年还是有大量的人员感染乙型肝炎病毒，在庞大的感染人群中，据估计，全球每年有超过80万人死于包括慢性活动性肝炎、乙肝相关肝硬化及原发性肝癌等在内的各类由乙肝病毒感染引起的肝脏疾病，在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，乙型肝炎病毒(慢性感染)在一类致癌物清单中。
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，简称HBV)是一种全球常见的血液传播病原体，某些患者可引起肝硬化和肝癌，甚至死亡。乙型肝炎病毒是引起乙型肝炎的病原体，属嗜肝DNA病毒科，该科病毒包含正嗜肝DNA病毒属和禽嗜肝DNA病毒属两个属，引起人体感染的是正嗜肝DNA病毒属。HBV感染是全球性的公共卫生问题。
HBV感染的肝细胞内稳定存在的共价闭合环状DNA(cccDNA)是造成HBV感染持续、抗病毒治疗停药后病毒反弹的重要原因。现有研究认为，慢性乙型肝炎病毒患者被HBV感染的肝细胞内稳定存在的cccDNA是HBV的转录复制模板，其大量制造的HBV病毒和乙肝表面抗原(HBsAg)是导致感染者Anti-HBV免疫失能进而造成HBV长期持续携带的重要原因之一。现有Anti-HBV药物难以有效清除或直接抑制肝内cccDNA是慢性乙肝难以治愈的关键瓶颈。
抗乙肝病毒常见的药物有干扰素和核苷类似物。干扰素通过上调一系列抗病毒干扰素刺激基因改变乙肝病毒的cccDNA表观基因组特性、抑制病毒复制或者刺激天然杀伤细胞活性发挥作用，但干扰素治疗对于不同基因型病毒感染存在显著的差异，并且只有约10％的病人可以实现持续的病毒学应答。核苷类似物通过抑制病毒由前基因组RNA到DNA逆转录过程，直接作用于病毒复制；长期核苷酸类似物治疗可改善肝脏疾病、抑制肝脏代谢失代偿、降低肝癌发病率及死亡率，但核苷酸类似物不直接作用于cccDNA池，并不能影响病毒转录与相关病毒蛋白的生成，故即便使用核苷酸类似物长期治疗，HBsAg的清除率也是非常低的(0～5％)，且这些药物只能功能性抑制乙肝病，难以实现对乙型肝炎病毒的功能性治愈。随着人们对乙型肝炎病毒特征的了解，越来越多的靶向病毒不同生命周期的先导化合物进入临床前或者临床研究阶段。长期以来，研究人员一直在探索抗乙肝病毒的机理，开发新的抗乙肝病毒的药物。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种抗乙肝病毒化合物的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种抗乙肝病毒化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚并[1,2-b]噻吩-8-酮溶于第一有机溶剂中，降温至0℃后，加入NBS，搅拌均匀后，转移至25℃下反应得到5-氟-2-溴-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮；
(2)将5-氟-2-溴-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮、碱试剂、催化剂以及硼酸化合物溶于第二有机溶剂中，在25℃-100℃发生偶联反应，得到抗乙肝病毒化合物；
其中，所述硼酸化合物为苯硼酸、对氟苯硼酸、对溴苯硼酸、对氰基苯硼酸、对乙酰基苯硼酸、对甲氧基苯硼酸、对羟基苯硼酸、4-叔丁基苯硼酸、4-(二苯基胺基)苯硼酸、3-噻吩硼酸、5-甲醛基呋喃-2-硼酸中的一种。
进一步地，所述步骤(1)中，第一有机溶剂为1,4-二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃中的至少一种；优选地，所述第一有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
进一步地，所述步骤(1)中，5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚并[1,2-b]噻吩-8-酮溶与NBS的摩尔比为1：0.8-1.5，优选为1:1.2。
进一步地，所述步骤(2)中，碱试剂为磷酸钾、碳酸钾、醋酸钾、碳酸钠和碳酸铯中的至少一种。
优选地，所述碱试剂为碳酸钾。
进一步地，所述步骤(2)中，所述催化剂为钯催化剂；所述钯催化剂为醋酸钯，双三苯基膦二氯化钯、四三苯基膦钯、1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯、双(三-o-甲苯磷)钯(0)、双(三环己基膦)二氯化钯、二(三苯基膦)醋酸钯、双(苯腈)氯化钯，三(dba)二钯-dba，三(二亚苄基丙酮)二钯，苄基双(三苯基膦)氯化钯，双(三叔丁基膦)钯(0)、二(三苯基膦)二乙酸钯(II)中的至少一种。
优选地，所述钯催化剂双三苯基膦二氯化钯。
进一步地，所述步骤(2)中，第二有机溶剂为1,4-二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃中的一种；优选地，所述第二有机溶剂为1,4-二氧六环。
进一步地，所述步骤(2)中，5-氟-2-溴-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮、硼酸化合物和碱试剂三者的摩尔比为1：0.9-1.5：2-4，优选为1:1.2:3。
进一步地，所述步骤(2)中，反应温度为40℃-60℃。
本发明的另一目的还在于提供一种抗乙肝病毒化合物，其是采用上述方法制备获得的；所述抗乙肝病毒化合物为化合物12a、12b、12c、12d、12e、12f、12g、12h、12i、12j或12k；所述化合物12a、12b、12c、12d、12e、12f、12g、12h、12i、12j和12k的结构式依次为：
Figure BDA0003089810750000041
本发明的另一目的还在于提供上述方法制备获得的抗乙肝病毒化合物在抗乙肝病毒中的应用，所述抗乙肝病毒化合物对肝细胞内HBV的cccDNA具有抑制作用。
本发明具有以下有益效果：
本发明所制备得到的化合物，经生物活性检测，对肝细胞内HBV的cccDNA具有抑制作用，且对正常肝细胞毒性低，可用于预防、处理、治疗或减轻乙肝患者病毒感染性疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的合成路线示意图；
图2为本发明中化合物12k对HBV cccDNA的体外活性抑制结果示意图；
图3为本发明中化合物10和化合物12k的细胞毒性实验结果示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
本发明实施例1-15的合成线路如图1所示。
在本发明的实施例中，室温为25℃；完全培养基为现有的细胞生长培养基。
在本发明的实施例中，将5-氟-2-苯基-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮记为化合物10；将5-氟-2-溴-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮记为化合物11。
实施例1-15
实施例1
本实施例提供一种5-氟-2-苯基-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：化合物11的制备
将3.492g化合物10(10mmol)溶于30mL DMF中，降温至0℃，逐滴加入1.961g NBS(11mmol)的DMF溶液，搅拌30分钟后，转移至25℃下反应，待反应充分后加入饱和亚硫酸钠溶液淬灭，并用乙酸乙酯进行萃取，合并有机相后用无水硫酸钠干燥，过滤得到滤液，滤液经减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到3.270g淡黄色固体化合物11。产率为77％。
化合物11的结构表征数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.07(s,1H),7.91(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.37–7.31(m,3H),7.11–7.04(m,1H),6.96(s,1H),3.57–3.50(m,4H),1.97-1.86(m,4H).
步骤(2)：5-氟-2-苯基-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备
将0.340g化合物11(0.8mmol)、0.120g苯硼酸(1.0mmol)、0.028g双三苯基膦二氯化钯(0.04mmol)和0.330g碳酸钾(2.4mmol)加至反应瓶内，再加入8mL 1,4-二氧六环和2mL水，通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.230g的5-氟-2-苯基-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮，产率67％，并标记为化合物12a。
化合物12a的结构表征数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.91(dt,J＝12.0,6.0Hz,1H),7.75(s,1H),7.40–7.32(m,5H),7.29(dd,J＝10.3,4.8Hz,2H),7.24–7.21(m,1H),7.06(ddd,J＝8.7,7.9,2.5Hz,1H),7.02(s,1H),3.02–2.95(m,4H),1.76–1.72(m,4H).
实施例2
本实施例提供一种化合物12a的制备方法：
实施例2的制备方法与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)中，将0.087g化合物11(0.20mmol)、0.030g苯硼酸(0.24mmol)、0.007g双三苯基膦二氯化钯(0.01mmol)和0.085g碳酸钾(0.6mmol)加至反应瓶内，加入4mL THF和1mL，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到为0.051g的化合物12a，产率为60％。
实施例3
本实施例提供一种化合物12a的制备方法：
实施例3的制备方法与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)中，将0.085g化合物11(0.2mmol)、0.034g苯硼酸(0.24mmol)、0.007g 1,1’-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(0.01mmol)和0.082g碳酸钾(0.6mmol)加至反应瓶内，加入4mL N,N-二甲基甲酰胺和1mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.049g的化合物12a，产率为58％。
实施例4
本实施例提供一种化合物12a的制备方法：
实施例4的制备方法与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)中，将0.087g化合物11(0.2mmol)、0.030g苯硼酸(0.24mmol)、0.012g四三苯基膦钯(0.01mmol)和0.084g碳酸钾(0.6mmol)加至反应瓶内，加入4mL二甲基亚砜和1mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.053g的化合物12a，产率为62％。
实施例5
本实施例提供一种5-氟-2-(4-氟苯基)-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备方法，包括以下步骤：
将0.343g化合物11(0.8mmol)、0.134g对氟苯硼酸(0.96mmol)、0.028g双三苯基膦二氯化钯(0.04mmol)和0.333g碳酸钾(2.4mmol)加至反应瓶内，并加入8mL 1,4-二氧六环和2mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.241g的5-氟-2-(4-氟苯基)-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮，产率为68％，同时标记为化合物12b。
化合物12b的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.74(d,J＝14.2Hz,1H),7.40–7.28(m,5H),7.10–7.04(m,1H),7.03–6.96(m,2H),3.05–2.92(m,4H),1.83–1.70(m,4H).
实施例6
本实施例提供一种化合物12b的制备方法
实施例6的制备方法与实施例5相比，区别在于：
将0.086g化合物11(0.2mmol)、0.033g对氟苯硼酸(0.24mmol)、0.012g四三苯基膦钯(0.01mmol)和0.083g碳酸钾(0.6mmol)加至反应瓶内，并加入4mL 1,4-二氧六环和1mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.355g的化合物12b，产率为55％。
实施例7
本实施例提供一种2-(4-溴苯基)-5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备方法，包括以下步骤：
将0.257g化合物11(0.6mmol)、0.181g对溴苯硼酸(0.9mmol)、0.022g双三苯基膦二氯化钯(0.03mmol)和0.250g碳酸钾(1.8mmol)加至反应瓶内，并加入8mL1,4-二氧六环和2mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.115g的2-(4-溴苯基)-5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮，产率为40％，同时标记为化合物12c。
化合物12c的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.71(s,1H),7.47–7.33(m,5H),7.23(dd,2H),7.10–7.04(m,1H),7.03(s,1H),3.06–2.92(m,4H),1.83–1.69(m,4H).
实施例8
本实施例提供一种4-(5-氟-8-氧代-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-2-基)苄腈的制备方法，包括以下步骤：
将0.107g化合物11(0.25mmol)、0.044g对氰基苯硼酸(0.3mmol)、0.009g双三苯基膦二氯化钯(0.013mmol)和0.104g碳酸钾(0.75mmol)加至反应瓶内，并加入8mL1,4-二氧六环和2mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.065g的4-(5-氟-8-氧代-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-2-基)苄腈，产率为58％，并标记为化合物12d。
化合物12d的结构表征数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.91(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.73(s,1H),7.60(d,J＝8.3Hz,2H),7.47(d,J＝8.3Hz,2H),7.41–7.35(m,3H),7.10–7.06(m,1H),7.06(s,1H),3.01–2.93(m,4H),1.82–1.74(m,4H).
实施例9
本实施例提供一种2-(4-乙酰苯基)-5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备方法，包括以下步骤：
将0.214g化合物11(0.5mmol)、0.098g对乙酰基苯硼酸(0.6mmol)、0.035g双三苯基膦二氯化钯(0.03mmol)和0.208g碳酸钾(1.5mmol)加至反应瓶内，并加入8mL1,4-二氧六环和2mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.126g的2-(4-乙酰苯基)-5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮，产率为54％，并标记为化合物12e。
化合物12e的结构表征数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.94–7.87(m,3H),7.77(s,1H),7.45(d,J＝8.3Hz,2H),7.41–7.34(m,3H),7.09–7.06(m,1H),7.05(s,1H),3.02–2.95(m,4H),2.57(s,3H),1.80–1.71(m,4H).
实施例10
本实施例提供一种5-氟-2-(4-甲氧基苯基)-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备方法，包括以下步骤：
将0.342g化合物11(0.8mmol)、0.146g对甲氧基苯硼酸(0.96mmol)、0.029g双三苯基膦二氯化钯(0.04mmol)和0.332g碳酸钾(2.4mmol)加至反应瓶内，加入8mL1,4-二氧六环和2mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.201g的5-氟-2-(4-甲氧基苯基)-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮，产率为55％，并标记为化合物12f。
化合物12f的结构表征数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.91(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.73(s,1H),7.41–7.32(m,3H),7.28–7.24(m,2H),7.09–7.03(m,1H),7.01(s,1H),6.86–6.80(m,2H),3.78(s,3H),3.03–2.95(m,4H),1.78–1.70(m,4H).
实施例11
本实施例提供一种5-氟-2-(4-羟苯基)-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备方法，包括以下步骤：
将0.216g化合物11(0.5mmol)、0.083g对羟基苯硼酸(0.6mmol)、0.035g双三苯基膦二氯化钯(0.03mmol)和0.206g碳酸钾(1.5mmol)加至反应瓶内，并加入8mL 1,4-二氧六环和2mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.112g的5-氟-2-(4-羟苯基)-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮，产率为51％，并标记为化合物12g。
化合物12g的结构表征数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.96(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.75(s,1H),7.43–7.34(m,3H),7.15(dd,J＝8.9,2.3Hz,2H),7.11–7.05(m,1H),7.01(s,1H),6.83–6.78(m,2H),3.04–2.97(m,4H),1.78–1.71(m,4H).
实施例12
本实施例提供一种2-(4-(叔丁基)苯基)-5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备方法，包括以下步骤：
将0.215g化合物11(0.5mmol)、0.107g 4-叔丁基苯硼酸(0.6mmol)、0.035g双三苯基膦二氯化钯(0.03mmol)和0.207g碳酸钾(1.5mmol)加至反应瓶内，加入8mL1,4-二氧六环和2mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.128g的2-(4-(叔丁基)苯基)-5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮，产率为53％，并标记为化合物12H。
化合物12H的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.75(s,1H),7.40–7.33(m,3H),7.32–7.24(m,4H),7.09–7.02(m,2H),3.06–2.97(m,4H),1.80–1.70(m,4H),1.28(s,9H).
实施例13
本实施例提供一种2-(4-(二苯胺基)苯基)-5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备方法，包括以下步骤：
将0.343g化合物11(0.8mmol)、0.278g 4-(二苯基胺基)苯硼酸(0.96mmol)、0.027g双三苯基膦二氯化钯(0.04mmol)和0.332g碳酸钾(2.4mmol)加至反应瓶内，再加入8mL1,4-二氧六环和2mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.285g的2-(4-(二苯胺基)苯基)-5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮，产率为60％，并标记为化合物12i。
化合物12i的结构表征数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.92(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.77(s,1H),7.39–7.31(m,3H),7.19(dd,J＝14.6,6.4Hz,6H),7.07–7.04(m,5H),7.01(dd,J＝8.6,6.1Hz,3H),6.95(t,J＝7.3Hz,2H),3.11–3.02(m,4H),1.83–1.73(m,4H).
实施例14
本实施例提供一种5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-2-(噻吩-3-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮的制备方法，包括以下步骤：
将0.214g化合物11(0.5mmol)、0.076g3-噻吩硼酸(0.6mmol)、0.036g双三苯基膦二氯化钯(0.03mmol)和0.208g碳酸钾(1.5mmol)加至反应瓶内，再加入8mL1,4-二氧六环和2mL水，并通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.114g的5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-2-(噻吩-3-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮，产率为53％，并标记为化合物12j。
化合物12j的结构表征数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.91(dd,J＝8.7,6.1Hz,1H),7.79(s,1H),7.40–7.32(m,3H),7.24(dd,J＝4.8,3.0Hz,1H),7.20(dd,J＝2.8,1.1Hz,1H),7.12(dd,J＝4.8,1.1Hz,1H),7.06(td,J＝8.6,2.5Hz,1H),7.02(s,1H),3.08–3.00(m,4H),1.81–1.73(m,4H).
实施例15
本实施例提供一种5-(5-氟-8-氧代-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-2-基)-呋喃-2-甲醛的制备方法，包括以下步骤：
将0.215g化合物11(0.5mmol)、0.084g 5-甲醛基呋喃-2-硼酸(0.6mmol)、0.035g双三苯基膦二氯化钯(0.03mmol)和0.209g碳酸钾(1.5mmol)加至反应瓶内，再加入8mL1,4-二氧六环和2mL水，通入氩气保护，在温度50℃中反应过夜，停止加热后冷却至室温，过滤得到滤液，滤液减压浓缩后得到残留物，残留物经硅胶柱层析纯化，得到0.130g的5-(5-氟-8-氧代-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-2-基)-呋喃-2-甲醛，产率为59％，并标记为化合物12k。
化合物12k的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.58(s,1H),7.98(s,1H),7.91(dd,J＝8.8,6.1Hz,1H),7.39(s,2H),7.37(dd,J＝10.1,2.5Hz,1H),7.27(d,J＝3.2Hz,1H),7.09(ddd,J＝8.7,7.8,2.5Hz,1H),7.02(s,1H),6.60(d,J＝3.6Hz,1H),3.24–3.07(m,4H),1.91–1.78(m,4H).
实施例1-15所制得的化合物12a-12k均为淡黄色固体，其结构式依次如下所示：
Figure BDA0003089810750000131
化合物12a-12k对cccDNA的体外活性抑制实验以及细胞毒性实验
1.化合物12a-12k对cccDNA的体外活性抑制实验：
包括以下实验步骤：
1.1完全培养基的配制；1.2HepG2.2.15细胞复苏；1.3细胞传代；1.4细胞冻存；1.5细胞种板。
1.6待测样品的配制
(1)分别称3mg实施例的化合物10以及化合物12a-12k，均配制成浓度为20mM的母液；(2)采取等倍稀释的方式，用培养基稀释成浓度为1μM，10μM和100μM的含药培养液。
1.7含药细胞培养
(1)向96孔培养板中分别加入200μL不同浓度的含药培养液，同时设定空白对照组，在96孔培养板的周围加入200μL的灭菌PBS。
(2)将96孔培养板放入培养箱(37℃，5％CO2)培养4天后，吸出培养液，更换相同浓度的新鲜培养液；
(3)放入培养箱中，继续培养4天。
1.8测定
(1)根据乙型肝炎病毒核酸定量试剂盒(PCR荧光探针法)说明书，配制反应体系；(2)在含药培养液培养2天、4天、6天和8天，离心后，上机测定cccDNA的含量。
测试结果：
以化合物12k为代表，对本发明所制备的抗乙肝病毒化合物进行cccDNA的体外活性抑制实验分析。
本实验设置了三个浓度：1μM，10μM和100μM，在含药培养2天，4天，6天，8天后分别测定cccDNA的含量。实验结果显示，本实施例所合成的抗乙肝病毒化合物都具有一定的抑制活性，其中，以化合物12k为例，如图2所示，化合物12k在浓度为100μM时对cccDNA具有明显抑制作用。
2.化合物12a-12k的细胞毒性实验
以化合物12k为代表，对本发明所制备的抗乙肝病毒化合物进行细胞毒性实验分析。
包括以下实验步骤：
(1)含药培养第8天，将96孔培养板离心2分钟；
(2)将培养上清液吸入1.5mL离心管中，同时采用DMSO溶液，作为空白对照组；
(3)以完全培养基：CCK8＝100：10的比例混合得到CCK8混合液；
(4)用排枪往离心管中加入100μL CCK8混合液，在培养箱中培养35分钟左右；
(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
测试结果如图3所示。
根据图3的测试结果可知：化合物12k没有导致细胞数量的减少，说明化合物12k对cccDNA具有抑制作用，且细胞毒性低。
综上所述，本发明所设计合成的抗乙肝病毒化合物均具有抑制肝细胞内cccDNA活性的作用，以化合物12k为例，化合物12k对cccDNA具有抑制作用，且细胞毒性低，因此，本发明所制备得到的化合物12a-12k，尤其是化合物12k有希望作为新的抗乙肝病毒先导化合物进行研究。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种抗乙肝病毒化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚并[1,2-b]噻吩-8-酮溶于第一有机溶剂中，降温至0℃后，加入NBS，搅拌均匀后，转移至25℃下反应得到5-氟-2-溴-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮；
(2)将5-氟-2-溴-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮、碱试剂、催化剂以及硼酸化合物溶于第二有机溶剂中，在25℃-100℃发生偶联反应，得到抗乙肝病毒化合物；
其中，所述硼酸化合物为苯硼酸、对氟苯硼酸、对溴苯硼酸、对氰基苯硼酸、对乙酰基苯硼酸、对甲氧基苯硼酸、对羟基苯硼酸、4-叔丁基苯硼酸、4-(二苯基胺基)苯硼酸、3-噻吩硼酸、5-甲醛基呋喃-2-硼酸中的一种。
2.根据权利要求1所述的抗乙肝病毒化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，第一有机溶剂为1,4-二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的抗乙肝病毒化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，5-氟-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚并[1,2-b]噻吩-8-酮溶与NBS的摩尔比为1：0.8-1.5。
4.根据权利要求1所述的抗乙肝病毒化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，碱试剂为磷酸钾、碳酸钾、醋酸钾、碳酸钠和碳酸铯中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的抗乙肝病毒化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述催化剂为钯催化剂；所述钯催化剂为醋酸钯，双三苯基膦二氯化钯、四三苯基膦钯、1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯、双(三-o-甲苯磷)钯(0)、双(三环己基膦)二氯化钯、二(三苯基膦)醋酸钯、双(苯腈)氯化钯，三(dba)二钯-dba，三(二亚苄基丙酮)二钯，苄基双(三苯基膦)氯化钯，双(三叔丁基膦)钯(0)、二(三苯基膦)二乙酸钯(II)中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的抗乙肝病毒化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，第二有机溶剂为1,4-二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的抗乙肝病毒化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，5-氟-2-溴-11-(吡咯烷-1-基)-8H-二苯并[3,4；6,7]环庚[1,2-b]噻吩-8-酮、硼酸化合物和碱试剂三者的摩尔比为1：0.9-1.5：2-4。
8.根据权利要求1所述的抗乙肝病毒化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应温度为40℃-60℃。
9.一种抗乙肝病毒化合物，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的方法制备而成；所述抗乙肝病毒化合物为化合物12a、12b、12c、12d、12e、12f、12g、12h、12i、12j或12k；所述化合物12a、12b、12c、12d、12e、12f、12g、12h、12i、12j和12k的结构式依次为：
Figure FDA0003089810740000021
10.根据权利要求9所述的抗乙肝病毒化合物在抗乙肝病毒中的应用，其特征在于，所述抗乙肝病毒化合物对肝细胞内HBV的cccDNA具有抑制作用。
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