CN113264829A - 马齿苋中四种木脂素及其提取分离方法 - Google Patents

马齿苋中四种木脂素及其提取分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出新的四种木脂素类化合物及其提取分离方法。所述的新化合物，分子式分别为C18H14O6、C19H16O7、C18H14O6和C18H16O4，并且根据结构命名为6,7‑dihydroxy‑4‑(4''‑hydroxy‑3''‑methoxyphenyl)‑2‑naphthoic acid、6,7‑dihydroxy‑4‑(4‑hydroxy‑3,5‑dimethoxyphenyl)‑2‑naphthoic acid、4‑(3,4‑dihydroxyphenyl)‑6‑hydroxy‑7‑methoxy‑2‑naphthoic acid和8‑(4‑hydroxy‑3‑methoxyphenyl)‑3‑methoxynaphthalen‑2‑ol。还提供上述四种新化合物的提取分离方法，依次采用乙醇回流提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱纯化及HPLC进行分离纯化与制备。其结构采用HR‑ESI‑TOF‑MS、1H‑NMR、13C‑NMR及二维核磁波谱解析的方法鉴定为四种新木脂素类化合物。本发明四种新木脂素化合物及其盐或衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，用于制备抗炎和抗氧化的药物或保健品。

Description

马齿苋中四种木脂素及其提取分离方法
技术领域
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的木脂素类化合物及其提取分离方法。
背景技术
马齿苋（Portulaca oleracea L.），又名长命菜、五行草，为马齿苋科一年生草本植物。马齿苋耐旱耐涝，且耐光耐阴，分布广泛、资源丰富，作为药食两用的野生植物备受关注。2020版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血以及崩漏下血等。
马齿苋现代药理学研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。研究表明马齿苋众多化学成分为其多样的药理作用提供了物质基础，马齿苋主要化学成分包括木脂素类、黄酮类、香豆素类、萜类、甾类、有机酸类、挥发油、生物碱类、氨基酸类、各种色素类和矿物质类等。其中木脂素是马齿苋中一类常见的化学成分，目前已报道的木脂素类成分有丁香酯醇、香脂树脂A、3,3',4,4'-四羟基-δ-精氨酸单甲酯、5,5'-二甲氧基-7,7'-二羟基-9'-β-吡喃葡萄糖基氧基-开环异落叶松树脂酚、oleralignan和oleralignan A等。
目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。
发明内容
针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取的四种木脂素类化合物，经研究发现本发明的四种化合物具有抗炎、抗氧化的作用，同时提供一种针对本发明化合物的简便、快速、环保以及纯度高的提取分离方法。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供一种从马齿苋药材中分离出的木脂素类化合物，其特征在于，所述木脂素类化合物包括如下四种：
分子式分别为C18H14O6、C19H16O7、C18H14O6和C18H16O4，并且根据结构命名为6,7-dihydroxy-4-(4''-hydroxy-3''-methoxyphenyl)-2-naphthoic acid（1）、6,7-dihydroxy-4-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-2-naphthoic acid（2）、4-(3,4-dihydroxyphenyl)-6-hydroxy-7-methoxy-2-naphthoic acid（3）和8-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-methoxynaphthalen-2-ol（4），其化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明还提供了一种从马齿苋药材中分离出四种木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述提取分离方法的具体步骤包括：
步骤1：取马齿苋干燥药材，采用乙醇提取，醇提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；
步骤2：将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，乙醇蒸干后上硅胶柱，依次用乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，减压浓缩至干，备用；
步骤4：将步骤3中所得物经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得到浓缩物备用；
步骤5：将步骤4中所得浓缩物进行HPLC分离制备，以乙腈-0.1%甲酸（体积百分数）为流动相进行等度洗脱，最终得到本发明所述的四种木脂素类化合物。
进一步地，所述步骤1中乙醇回流提取两次，每次2小时，乙醇量为药材的8倍～16倍。
进一步地，所述步骤2中所用流动相洗脱程序为等度洗脱。
进一步地，所述步骤3中用水和乙醇的体积比为70∶30和95∶5梯度洗脱；所用乙酸乙酯洗脱程序为等度洗脱，乙酸乙酯和甲醇的体积比为5∶1和2∶1梯度洗脱。
进一步地，所述步骤4中用甲醇和水的体积比为60∶40、70∶30、80∶20和90∶10梯度洗脱。
进一步地，所述步骤4中所用的ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。进一步地，所述步骤5中以乙腈-0.1%甲酸为流动相，用体积比分别为20∶80（1）、19∶81（2）、20∶80（3）和40∶60（4）等度洗脱，保留时间分别为11.27min（1）、10.67min（2）、11.63min（3）和11.04min（4）。
本发明还提供了一种如上所述任意一种木脂素类化合物的用途，其特征在于，所述用途可用于制备抗炎和抗氧化的药物或保健品。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明中所述马齿苋新木脂素类化合物的分离和药理活性研究未被现有论文期刊所报道。本发明提供来源于马齿苋的四种新木脂素类化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离方法，依次采用乙醇提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱纯化及HPLC进行分离纯化与制备，成功提取分离出新化合物。该方法操作步骤仅为五步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用乙醇提取及乙酸乙酯洗脱，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高均大于97%。此外经研究表明此化合物具有抗炎和抗氧化作用，因此本发明新化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎和抗氧化的药物。
附图说明
图1为本发明化合物Compound 1的高分辨质谱图。
图2为本发明化合物Compound 1的1H-NMR光谱图。
图3为本发明化合物Compound 1的13C-NMR光谱图。
图4为本发明化合物Compound 1的DEPT 135光谱图。
图5为本发明化合物Compound 1的核磁共振1H-1H COSY光谱图。
图6为本发明化合物Compound 1的核磁共振HMBC光谱图。
图7为本发明化合物Compound 1的核磁共振HSQC光谱图。
图8为本发明化合物Compound 1的核磁共振ROESY光谱图。
图9为本发明化合物Compound 2的高分辨质谱图。
图10为本发明化合物Compound 2的1H-NMR光谱图。
图11为本发明化合物Compound 2的13C-NMR光谱图。
图12为本发明化合物Compound 2的DEPT 135光谱图。
图13为本发明化合物Compound 2的核磁共振1H-1H COSY光谱图。
图14为本发明化合物Compound 2的核磁共振HMBC光谱图。
图15为本发明化合物Compound 2的核磁共振HSQC光谱图。
图16为本发明化合物Compound 2的核磁共振ROESY光谱图。
图17为本发明化合物Compound 3的高分辨质谱图。
图18为本发明化合物Compound 3的1H-NMR光谱图。
图19为本发明化合物Compound 3的13C-NMR光谱图。
图20为本发明化合物Compound 3的DEPT 135光谱图。
图21为本发明化合物Compound 3的核磁共振1H-1H COSY光谱图。
图22为本发明化合物Compound 3的核磁共振HMBC光谱图。
图23为本发明化合物Compound 3的核磁共振HSQC光谱图。
图24为本发明化合物Compound 3的核磁共振ROESY光谱图。
图25为本发明化合物Compound 4的高分辨质谱图。
图26为本发明化合物Compound 4的1H-NMR光谱图。
图27为本发明化合物Compound 4的13C-NMR光谱图。
图28为本发明化合物Compound 4的DEPT 135光谱图。
图29为本发明化合物Compound 4的核磁共振1H-1H COSY光谱图。
图30为本发明化合物Compound 4的核磁共振HMBC光谱图。
图31为本发明化合物Compound 4的核磁共振HSQC光谱图。
图32为本发明化合物Compound 4的核磁共振ROESY光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。
实施例1。
本发明提供化合物，分子式分别为C18H14O6、C19H16O7、C18H14O6和C18H16O4，并且根据结构命名为6,7-dihydroxy-4-(4''-hydroxy-3''-methoxyphenyl)-2-naphthoic acid（1）、6,7-dihydroxy-4-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-2-naphthoic acid（2）、4-(3,4-dihydroxyphenyl)-6-hydroxy-7-methoxy-2-naphthoic acid（3）和8-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-methoxynaphthalen-2-ol（4），化学结构式为：
Figure 624966DEST_PATH_IMAGE001
。
表1为四种化合物的核磁数据，其中，Compound 1～Compound 3的1H-NMR与13C-NMR在DMSO-d 6中，Compound 4的1H-NMR与13C-NMR在MeOD-d 4中。
表1：本发明Compound1～Compound4的核磁数据
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
本发明化合物结构鉴定参阅图1～图32。
本发明一种新Compound1的结构鉴定与推导。
Compound 1：红棕色油状，易溶于甲醇。点样于硅胶薄层板后，喷三氯化铁试液斑点呈青色。HR-ESI(-)TOF-MS给出m/z：325.0717[M-H]-的准分子离子峰，理论值为325.0717。结合1H-NMR、13C-NMR以及DEPT 135数据，推测该化合物可能的分子式为C18H14O6，不饱和度为12。13C-NMR谱和DEPT 135谱显示18个碳信号，分别为1个-OCH3（δc：55.7），7个烯碳（δc：107.9、111.4、113.6、115.4、121.9、123.1、127.5），10个季碳（1个羰基碳，δc：168.1；4个连O的双键碳，δc：146.0、147.3、147.4、149.1；5个双键碳，δc：124.9、128.4、129.3、131.4、137.8）。
1H-NMR谱显示1个-OCH3信号为δ H3.81（3H，s），7个烯氢信号分别为δ H：6.84（1H，dd，J=8.0，1.9Hz，H-6′′）、6.92（1H，d，J=8.0Hz，H-5′′）、6.97（1H，d，J=1.9Hz，H-2′′）、7.22（1H，s，H-5）、7.31（1H，s，H-8）、7.55（1H，d，J=1.4Hz，H-3）和8.22（1H，d，J=1.4Hz，H-1）。根据1H-NMR谱以及HMBC谱显示，H-1与C-2、C-3、C-4a和C-8a相关；H-3与C-1和C-4a相关，表明一个1,2,3,5-四取代苯环的存在；此外，H-5与C-6、C-7和C-8a相关，H-8与C-5、C-6、C-7和C-4a相关，表明了另外一个1,2,4,5-四取代苯环的存在；又因为H-1与C-4a、C-8和C-8a相关，H-5与C-4和C-8a相关，H-8与C-1和C-8a相关，说明两个四取代苯环通过C-4a，C-8a稠和形成一个萘环；且H-2′′与C-4′′和C-6′′相关，H-5′′与C-1′′、C-3′′和C-4′′相关，H-6′′与C-2′′和C-4′′相关，表明一个具有ABX系统的1,3,4-三取代苯环结构的存在，又因为H-3与C-1′′相关，H-2′′和H-6′′均与C-4相关，故C-1′′应与C-4相连。因为C-6、C-7、C-3′′和C-4′′位于低场区，提示与O相连，此外，由HMBC谱上-OCH3的δ H3.81（3H，s）与C-3′′的相关，确定-OCH3应与C-3′′相连，并结合化合物分子式C-6，C-7和C-4′′应与-OH相连。根据C-2（124.9）的化学位移，且H-1与C-2和C-1′相关，H-3与C-1′相关，可以确定-COOH应与C-2相连。根据以上信息，最终确定了Compound1的结构。
本发明一种新Compound2的结构鉴定与推导。
Compound 2：红棕色油状，易溶于甲醇。点样于硅胶薄层板后，喷三氯化铁试液斑点呈青色。HR-ESI(-)TOF-MS给出m/z：355.0823[M-H]-的准分子离子峰，其理论值为355.0822。结合1H-NMR、13C-NMR以及DEPT 135数据，推测该化合物可能的分子式为C19H16O7，不饱和度为12。13C-NMR谱和DEPT 135谱显示19个碳信号，分别为2个-OCH3（δc：56.1，重叠峰），6个烯碳（δc：107.0，重叠峰、107.9、111.4、123.1、127.5），11个季碳（1个羰基碳，δc：168.1；5个连O的双键碳，δc：134.9、147.3、147.9，重叠峰、149.1；5个双键碳，δc：124.9、128.4、129.3、130.4、137.9）。化合物2明显比1多一个-OCH3。
1H-NMR谱显示6个稀氢信号，其中4个烯氢，δ H：8.23（1H，s）、7.58（1H，s）、7.26（1H，s）和7.32（1H，s），与1中的萘环质子序列完全相同，可分别归属于H-1、H-3、H-5和H-8。1H-NMR谱中δ H6.67（2H，s，H-2′′，H-6′′），δ H3.80（6H，s）的信号和13C-NMR谱信号δ C147.9（C-3′′，C-5′′）以及HMBC谱显示，H-2′′和H-6′′均与C-1′′，C-3′′，C-4′′和C-5′′相关，证明了一个1,2,3,5-四取代苯环的存在。由HMBC谱上-OCH3的氢δ H3.80（6H，s）与C-3′′和C-5′′相关，确定-OCH3应与C-3′′和C-5′′相连，而C-4′′（134.9）位于低场区，故应与-OH相连。同时H-3与C-1′′相关，H-2′′和H-6′′均与C-4相关，故C-1′′与C-4相连。根据以上信息，最终确定了Compound 2的结构。
本发明一种新Compound3的结构鉴定与推导。
Compound 3：红棕色油状，易溶于甲醇。点样于硅胶薄层板后，喷三氯化铁试液斑点呈青色。HR-ESI(-)TOF-MS给出m/z：325.0713[M-H]-的准分子离子峰，其理论值为325.0717。结合1H-NMR、13C-NMR以及DEPT 135数据，推测该化合物可能的分子式为C18H14O6，不饱和度为12。13C-NMR谱和DEPT 135谱显示18个碳信号，分别为1个-OCH3（δc：55.5），7个烯碳（δc：107.8、108.4、115.7、117.0、120.3、123.7、127.9），10个季碳（1个羰基碳，δc：168.1；4个连O的双键碳，δc：144.9、145.1、149.2、149.3；5个双键碳，δc：125.2、128.1、129.7、131.2、137.7）。
1H-NMR谱显示1个-OCH3信号δ H3.91（3H，s），7个烯氢信号分别为δ H：6.70（1H，dd，J=7.7Hz，H-6′′）、6.84（1H，s，H-2′′）、6.87（1H，d，J=7.7Hz，H-5′′）、7.28（1H，s，H-5）、7.51（1H，s，H-8）、7.57（1H，s，H-3）和8.34（1H，s，H-1）。通过比较化合物1和3的光谱数据，发现二者基本母核完全相同，均是2-萘酸与一个ABX系统的苯环三取代相连，只是-OCH3的连接位置不同。C-6（149.2），C-7（149.3），C-3′′（145.1）和C-4′′（144.9）均位于低场区，提示均与O相连，13C-NMR谱信号δ C55.5与1H-NMR谱信号δ H3.91确定一个-OCH3的存在，并且由HMBC谱上-OCH3的氢与C-7的相关，且ROESY谱显示确定-OCH3的氢与H-8相关，故-OCH3应与C-7相连，并结合化合物分子式C-6，C-3′′和C-4′′应与羟基相连。根据以上信息，最终确定了Compound3的结构。
本发明一种新Compound4的结构鉴定与推导。
Compound 4：深灰色粉末，易溶于甲醇。点样于硅胶薄层板后，喷三氯化铁试液斑点呈青色。HR-ESI(+)TOF-MS给出m/z：297.1120[M+H]+的准分子离子峰，其理论值为297.1122。结合1H-NMR、13C-NMR和DEPT 135数据，推测该化合物可能的分子式为C18H16O4，不饱和度为11。13C-NMR谱和DEPT 135谱显示18个碳信号，分别为2个-OCH3（δ C：56.4、56.7），8个烯碳（δ C：108.2、109.6、115.1、116.3、123.8、124.3、126.1、127.1），8个季碳（四个连O的双键碳，δ C：147.1、148.1、149.0、150.1；四个双键碳，δ C：129.5、131.3、134.7、140.0）。
1H-NMR谱显示2个活泼H信号δ H8.09（1H，brs）和δ H8.56（1H，brs），表明可能存在两个-OH，2个-OCH3分别为δ H3.88（3H，s）和δ H3.99（3H，s），8个烯氢信号δ H：6.86（1H，dd，J=8.0，1.9Hz，H-2ʹʹ）、6.91（1H，d，J=8.0Hz，H-3ʹʹ）、6.98（1H，d，J=1.9Hz，H-6ʹʹ）、7.17（1H，dd，J=7.0，1.1Hz，H-3）、7.22（1H，s，H-5）、7.27（2H，t，J=9.4Hz，H-2，H-8）和7.67（1H，d，J=8.2Hz，H-1）。通过比较化合物1和4的光谱数据，发现4的基本母核比1少一个-COOH，并且二者的取代基不同。HMBC谱中，两个-OCH3中的氢分别与C-7，C-5ʹʹ相关联，说明-OCH3分别与C-7，C-5ʹʹ相连；C-6（148.1）与C-4ʹʹ（147.1）处于低场，提示与O相连，即C-6，C-4ʹʹ连有两个-OH。根据以上信息，最终确定了Compound 4的结构。
本发明还提供上述四种化合物的提取分离方法，具体步骤为：
步骤1：称取马齿苋干燥药材150kg，采用50%乙醇回流提取，50%乙醇用量（v/v）为药材的8倍～16倍，回流提取两次，每次2h，减压回收乙醇，放凉至室温，得药液备用；
步骤2：将步骤1中所得药液蒸干后经硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯（115L）等度洗脱，其中硅胶为100目～200目，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用冷水、热水和乙醇-水（70∶30、95∶5，v/v）梯度洗脱，95%乙醇蒸干后经硅胶柱层析分离，其中硅胶为200目～300目，依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇（5∶1、2∶1，v/v）梯度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，将乙酸乙酯洗脱得到部位合并，并于室温以上，40℃以下减压浓缩至干，备用；
步骤4：将步骤3中所得物再经预处理的20μm～40μm的ODS中压柱层析分离，用甲醇-水（60∶40、70∶30、80∶20、90∶10，v/v）梯度洗脱（加压，使流速为1mL/min，温度为室温），得到4个洗脱部位（即共得到4个瓶，每瓶250mL），经薄层色谱进行检测，显色，将显色的70%和80%甲醇部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用；
步骤5：将步骤4中所得物通过HPLC分离制备，以乙腈-0.1%甲酸为流动相进行等度洗脱，检测波长为210nm和280nm，最终得到本发明所述四种新木脂素类化合物，归一法测定纯度均大于97%。
所述ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无浑浊，再以初始流动相平衡。
实施例2本发明新化合物的抗炎作用。
1 主要材料。
1.1 药品和试剂：实验所用四种新木脂素化合物由上述方法制备，纯度均大于97%，精密称取，用DMSO和PBS稀释至下述各剂量组所需溶液。胎牛血清（美国Gibco公司）；CCK-8试剂盒（美国Boster公司）；DMSO（美国Sigma-Aldrich公司）；DMEM高糖培养基、LPS、IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒（索莱宝科技有限公司）；青霉素、链霉素（杭州四季青公司）；PBS（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.2 细胞株：RAW264.7巨噬细胞（美国ATCC细胞库）。
1.3 分组：分为正常组、LPS组和实验组，各一组。
2 实验方法。
2.1 细胞培养：DMEM高糖培养基，加入l0%的胎牛血清，l%抗菌素（100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素），置于37℃，5%CO2培养箱中培养。
2.2 CCK-8试剂法测定细胞活力：上述各组分别取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×104个/mL，每孔100μL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度样品溶液（5μM～50μM）孵育1h后向LPS组和实验组分别加入终浓度为1μg/mL的LPS，另设调零组（含DMSO溶媒的培养液），每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入10μL的CCK-8，温度37℃，5%CO2条件下继续孵育4h后，用酶标仪在570nm波长处测定各孔吸光值。
2.3 ELISA法测定炎症因子IL-1β、TNF-α：将对数生长期的RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为2×105个/mL，每孔1mL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜，实验组加入不同浓度样品溶液（1μM～20μM）培育1h后，在每孔加入LPS（终浓度为1μg/mL），共孵育3.25h，每组设3个复孔。ELISA法测定四种来源于马齿苋的新木脂素类化合物处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-1β和TNF-α的含量。
3 实验结果。
实验结果表明本发明四种新化合物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；并可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-1β和TNF-α，且呈浓度依赖。
细胞相对存活率实验结果如表2所示。
表2：本发明对RAW264.7巨噬细胞相对存活率的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE004
注：平均数±SD，n=3，*P<0.05与对照组比较（高浓度组有显著性差异）。
ELISA法测定炎症因子IL-1β和TNF-α结果如表3所示。
表3：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-1β和TNF-α含量的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE005
注：平均数±SD，n=3，*P<0.05与对照组比较，#P<0.05与LPS组比较。
实施例3本发明新化合物的抗氧化作用。
1 主要材料。
1.1 药品和试剂：实验所用新化合物由上述方法制备，纯度均大于97%，精密称取，用甲醇稀释至下述各剂量组所需溶液。DPPH（1,1-二苯基-2-苦基肼自由基）（Sigma-Fluka公司）；BHA（叔丁基羟茴香醚）（上海祥瑞科技有限公司）；甲醇，色谱纯（昌泰兴业有限公司）。
1.2 分组：对照组、实验组和空白组。
2 实验方法。
比色法测定消除DPPH自由基的能力：实验组取1.5mL的DPPH溶液（80μM）加入到4mL比色皿中，再加入1.5mL不同浓度样品溶液（2.5μM、5μM、10μM、20μM和40μM）；对照组取1.5mL甲醇溶液加入到4mL比色皿中，再加入1.5mL不同浓度的样品溶液；空白组取1.5mL的DPPH溶液加入到4mL比色皿中，再加入1.5mL甲醇溶液。三组均充分混匀，室温避光静置10min，517nm下测定吸光值，静置30min后，按同样方法操作。每个样品平均测定五次取平均值，阳性对照为不同浓度的BHA溶液。根据以下公式计算样品对DPPH自由基的清除率，并进一步计算其自由基清除率IC50值。
DPPH清除率(%)=1－(A1－A2)／A0×100%
其中，A0为空白组的吸光度值；A1为实验组的吸光度值；A2为对照组的吸光度值。
3 实验结果。
实验结果表明本发明化合物对DPPH自由基具有清除作用，且随药物浓度增大，清除率也明显升高。本发明化合物对DPPH自由基IC50值见表4。
表4：本发明化合物对DPPH自由基的清除作用
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
综上所述，本发明提供化合物及其提取分离方法，依次采用乙醇提取、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、ODS中压柱及HPLC进行分离纯化与制备，成功分离得到四种新化合物。该方法简便、快速、环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高。由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗炎和抗氧化作用，因此本发明的木脂素类化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。

Claims (9)

1.一种从马齿苋药材中分离出的木脂素类化合物，其特征在于，所述木脂素类化合物包括如下四种，其化学结构式如下：
分子式分别为C18H14O6、C19H16O7、C18H14O6和C18H16O4，并且根据结构命名为6,7-dihydroxy-4-(4''-hydroxy-3''-methoxyphenyl)-2-naphthoic acid（1）、6,7-dihydroxy-4-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-2-naphthoic acid（2）、4-(3,4-dihydroxyphenyl)-6-hydroxy-7-methoxy-2-naphthoic acid（3）和8-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-methoxynaphthalen-2-ol（4）：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种如权利要求1所述的四种木脂素类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述提取分离方法的具体步骤包括：
步骤1：取马齿苋干燥药材，采用乙醇提取，放凉至室温，得药液备用；
步骤2：将步骤1中药液蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤3：将步骤2中乙酸乙酯提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水梯度洗脱，乙醇蒸干后上硅胶柱，用乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇洗脱，回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯提取物；
步骤4：将步骤3中所得物经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得到浓缩物备用；
步骤5：将步骤4中所得物经HPLC分离制备，以乙腈-0.1%甲酸为流动相，检测波长为210nm和280nm，经薄层色谱进行检测，显色，最终得到本发明所述的四种新木脂素类化合物。
3.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤1中乙醇回流提取两次，每次2小时，乙醇量为药材的8倍～16倍。
4.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中所用流动相洗脱程序为等度洗脱。
5.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤3中用水和乙醇的体积比为70∶30、95∶5梯度洗脱；所用乙酸乙酯洗脱程序为等度洗脱，乙酸乙酯和甲醇的体积比为5∶1、2∶1梯度洗脱。
6.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4中用甲醇和水的体积比为60∶40、70∶30、80∶20、90∶10梯度洗脱。
7.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4中所用的ODS柱的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
8.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤5中以乙腈-0.1%甲酸为流动相，用体积比分别为20∶80（1）、19∶81（2）、20∶80（3）、40∶60（4）等度洗脱，保留时间分别为11.27min（1）、10.67min（2）、11.63min（3）、11.04min（4）。
9.一种如权利要求1所述任意一种木脂素类化合物的用途，其特征在于，所述用途可用于制备抗炎和抗氧化的药物或保健品。
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