CN113226330A - 抗人诺如病毒剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种抗人诺如病毒剂，其能够抑制人诺如病毒的感染和增殖。本发明人等发现，通过提供以岩藻糖类似物为有效成分的抗人诺如病毒剂，其中岩藻糖类似物伴有抑制由岩藻糖转移酶(FUT)进行的糖链修饰的活性，能够解决上述课题。作为该有效成分，例如可例示下述式(III)或(IV)的岩藻糖类似物或它们的盐。[化1]
Figure DDA0003132815620000011
[式中，式(III)或(IV)各自为α或β端基异构体，R1、R3及R4各自为‑OH或‑OAc，R2为卤素原子、‑OH或‑OAc，R5为‑CH3、‑C≡CH、‑C≡CCH3或‑CH2C≡CH。]。

Description

抗人诺如病毒剂
技术领域
本发明涉及感染症治疗药物，更具体地，涉及抗人诺如病毒剂。
背景技术
诺如病毒(Norovirus)是环状病毒科中具有的4个病毒属的1个，在现在时点，诺瓦克病毒(Norwalk virus)是作为病毒种类的唯一的。
人诺如病毒主要经由食品(鱼贝类或水)感染人，即使是食品中100-1000个左右的微小病毒粒子也能够感染，传染力非常强。由于人诺如病毒引起的食物中毒占病毒性食物中毒的90％以上。
人诺如病毒感染症的主症状是恶心、呕吐、腹泻，也发现有发热。呕吐或腹泻从一日数次到严重时为10次以上，有时在吐出物中胆汁或肠内物会混合，导致剧烈的痛苦。
北美数据中，全年约2000万人患有人诺如病毒感染症、约200万人就诊医院、40万人转运到急救，7万人住院、7000人死亡。
日本国中的基于人诺如病毒感染的呕吐腹泻症根据国立感染病研究所的推测，在数十年全年达到100-300万人，确认了由此带来的严重的社会、经济的影响。由于这样的情形，对于来自日本国民的抗病毒药物、疫苗等的需求高，在行政上也将开发优先顺序定位在第四位。在日本国，虽然人诺如病毒感染病几乎没有成为死因的死亡例，但在其他疾病的发病者、老年人的情况下，存在长期化、严重化的高风险。另外，即使上述症状治愈，传染力非常强的人诺如病毒在大便中的排泄持续7-14天，在长的情况下持续2个月以上，其间不能恢复去学校或工作场所。进而，通常检测到全部人口的百分之几的比例的人诺如病毒的非显性感染者。报告了由于人诺如病毒的不显性感染者不会注意到感染者自身的病毒感染，通过例如该不显性感染者从事食品从业者的工作而引起大规模食物中毒的情况。
这样，人诺如病毒是发病频率高、伴随患者的痛苦的食物中毒性的病毒、且感染力强、发现是不显性感染的病毒，但是现状是不存在特效药。进行的应对疗法有：基本上是通过经口或点滴等的水分补给，在防止脱水症的同时，经过观察；其他是给予止吐剂、整肠剂等。止泻剂的使用会将病毒积存在肠道内而使恢复延迟，因此至少在发病初期进行消极指导。
2002年法国的小组报道了人的组织血型抗原(HBGA)与人诺如病毒的病毒样中空粒子(VLP)结合，提出了该分子是人诺如病毒的受体的可能性的倡议(非专利文献1)。
之后，通过人志愿者进行验证，可知HBGA非分泌型个体(non-secretorindividual)不易感染人诺如病毒，HBGA分泌型个体(secretor individual)容易感染人诺如病毒(非专利文献2)。
然而，目前，HBGA自身不是负责人诺如病毒向细胞内侵入的受体。这基于以下的理由。
分泌状态(secretor status)，即，是否HBGA被分泌到唾液或粘膜中，与FUT2(岩藻糖转移酶2号、第1-8个中的第2个)基因多态性具有关系。然而，即使将FUT2基因导入HBGA未在细胞表面表达的细胞中，进行HBGA的分泌和细胞表面的表达，人诺如病毒对该细胞的感染也不成立。因此，不能说HBGA自身是负责人诺如病毒向细胞内的侵入的受体，对于FUT2基因多态性与人诺如病毒感染感受性之间的因果关系(直接、间接的关系)，尚未阐明(非专利文献3)。
专利文献1是关于后述的作为本发明的抗诺如病毒剂的有效成分的岩藻糖类似物，公开了主要是抗癌剂用途的现有技术文献。在专利文献1中，虽然确认了针对感染症治疗用途的一般的记载，但没有公开实施例。另外，在专利文献1中列举的病毒中没有公开诺如病毒及其近缘的感染病毒，而且在专利文献1中记载的相对感染症的作用机理是免疫应答的亢进，与本发明的抗诺如病毒剂完全不同。
专利文献2中记载了实施例中使用的2D类器官。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]专利第5918235号公报
[专利文献2]WO2018/038042国际公开小册子
[专利文献3]日本特开2018-2666号公报
[非专利文献]
[非专利文献1]Marionneau，S.et al.，GASTROENTEROLOG122：1967-1977(2002)
[非专利文献2]Hutson，A.M.et al.，Journal of Medical Viro.77:116-120(2005)
[非专利文献3]Guix，S，et al.，J.Virol.，81(22)：12238-12248(2007)
[发明内容]
[发明所要解决的课题]
本发明的课题在于提供一种具有对人诺如病毒的实质性治疗效果的抗诺如病毒剂。
[用于解决课题的手段]
本发明人等为了解决上述课题而进行了研究，结果发现，通过抑制由岩藻糖转移酶(FUT)进行的糖链修饰的岩藻糖类似物的给药，令人惊讶的是，能够在作为人诺如病毒的感染细胞的肠道细胞中抑制该病毒的感染，进一步抑制该细胞内的人诺如病毒的增殖，从而完成了本发明。
即，本发明提供一种抗人诺如病毒剂(以下，也称为本发明的抗诺如病毒剂)，其将抑制由岩藻糖转移酶(FUT)进行的糖链修饰的岩藻糖类似物或它们的盐作为有效成分。在此，优选的是，所述峰位素酶包含FUT2。
如果更具体地说明本发明，
本发明的抗诺如病毒剂是以下述式(I)或(I I)的岩藻糖类似物或它们的盐(以下，只要没有特别说明，岩藻糖类似物包含其盐)作为有效成分的抗人诺如病毒剂。需要说明的是，本说明书中，有时用原子记号及“-”表示官能团。例如，“-OH”表示羟基。另外，有时将碳原子数表示为例如C1-C10(碳原子数1-10)。“盐”是药学上或生物学上可接受的盐，可以是正盐、酸性盐、碱性盐中的任一种。
[化1]
Figure BDA0003132815600000041
[式中，式(I)或(II)各自为α或β端基异构体；
R1、R2、R3、及R4各自独立地选自由氟原子(F)、氯原子(Cl)、-OH、-OC(O)H、-OC(O)C1-C10烷基、-OC(O)C2-C10烯基、-OC(O)C2-C10炔基、-OC(O)芳基、-OC(O)杂环、-OC(O)C1-C10亚烷基(芳基)、-OC(O)C2-C10亚烯基(芳基)、-OC(O)C2-C10炔基(芳基)、-OC(O)C1-C10亚烷基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚烯基(杂环)、-OC(O)C2-C10亚炔基(杂环)、-OCH2OC(O)烷基、-OCH2OC(O)O烷基-OCH2OC(O)芳基、-OCH2OC(O)O芳基、-OC(O)CH2O(CH2CH2O)nCH3、-OC(O)CH2CH2O(CH2CH2O)nCH3、-O-三-C1-C3烷基甲硅烷基、及-OC1-C10烷基组成的组，各n为0～5独立地选择的整数；
R2a和R3a各自独立地选自由氢原子(H)、F和Cl组成的组；
R5选自-CH3、-CHF2、-CH＝C＝CH2、-C≡CH、-C≡CCH3、-CH2C≡CH、-C(O)OCH3、-CH(OAc)CH3、-CN、-CH2CN、-CH2X(X为F、溴原子(Br)、Cl或碘原子(I)以及甲氧基硅烷(methoxylane)。
在R5为-CH＝C＝CH2、-CH2F或-CHF2以外的情况下，R1、R2、R3、R2a和R3a中的至少一个为F或Cl。]
在上述中，作为本发明的抗诺如病毒剂的有效成分的岩藻糖类似物或它们的盐优选为式(I)的岩藻糖类似物或其盐。另外，除了盐形态以外，还允许溶剂合物形态。
已知对于上述式(I)或(II)的岩藻糖类似物，相对于不进行该岩藻糖类似物的给药的情况下的蛋白质的岩藻糖基化，具有至少10％的岩藻糖基化降低效果(专利文献1)。本发明中的“抑制由岩藻糖转移酶酶(FUT)进行的糖链修饰”是指，该10％以上的岩藻糖基化降低效果。
作为本发明的抗诺如病毒剂的应用对象的诺如病毒是人诺如病毒。本发明的抗诺如病毒剂能够抑制该病毒向作为人诺如病毒的感染细胞的肠道细胞的感染，进一步抑制该细胞内的人诺如病毒的增殖。
作为本发明的抗诺如病毒剂的有效成分的岩藻糖类似物，为了发挥其抗诺如病毒效果，优选对人的细胞具有细胞膜透过性、至少对肠道细胞的细胞膜透过性。因此，在不损害作为岩藻糖类似物的FUT抑制效果的限度内，R1、R2、R3、R2a和R3a中的1个以上为“-OC(O)C1-C10烷基”，优选为O乙酰基(OAc)，即“-OC(O)CH3”(专利文献3)。
作为本发明的抗诺如病毒剂的有效成分的岩藻糖类似物，抑制肠道细胞中的岩藻糖转移酶(FUT)进行的糖链修饰。特别是，抑制由FUT2进行的糖链修饰与抗诺如病毒效果一起被确认。
上述式(I)或(II)的岩藻糖类似物优选为下述式(III)或(IV)的岩藻糖类似物或它们的盐。
[化2]
Figure BDA0003132815600000061
[式中，式(III)或(IV)各自为α或β端基异构体，
R1、R3及R4各自为-OH或-OAc，
R2为F(氟原子)或Cl(氯原子)的卤素原子、-OH或-OAc，
R5为-CH3、-C≡CH、-C≡CCH3或-CH2C≡CH。]
(1)上述式(III)或(IV)中，R2为F(氟原子)或Cl(氯原子)的卤素原子的情况下，优选R1、R3和R4中的至少1个为-OAc，进一步优选R1、R3和R4的2个以上为-OAc，R1、R3和R4全部为-OAc是最优选的方案之一。
另外，在上述式(III)或(IV)中，R2为F(氟原子)或Cl(氯原子)的卤素原子的情况下，优选R5为-CH3，优选上述卤素原子为F(氟原子)。
(2)上述式(III)或(IV)中，R5为-C≡CH、-C≡CCH3或-CH2C≡CH的情况下，优选R2为-OH或-OAc。另外，优选R1、R2、R3和R4中的至少1个为-OAc，进一步优选R1、R2、R3和R4中的2个以上为-OAc，R1、R2、R3和R4全部为-OAc是最优选的方案之一。进而，上述炔基为-C≡CH为优选的方案之一。
(3)在上述(1)和(2)中，作为本发明的抗诺如病毒剂的有效成分的岩藻糖类似物或它们的盐优选为式(III)的岩藻糖类似物或其盐。另外，除了盐形态以外，还允许溶剂合物形态。
认为本发明的抗诺如病毒剂的有效成分即上述式(I)或(II)、或(III)或(IV)的岩藻糖类似物或它们的盐或溶剂化物被导入肠道细胞的内部，通过在作为代谢中间体的GDP-岩藻糖的岩藻糖部分的替换，由此抑制正常的糖链的形成，通过该作用而发挥所期望的抗诺如病毒效应，但其因果关系的详细情况不明确。具体而言，(a)通过上述作用阻止人诺如病毒向肠道细胞内的侵入(感染)。然而，如上所述那样，对人诺如病毒的细胞表面中负责向细胞内的侵入的受体尚不知道。如在HIV、HCV、HBV中确认的那样，在人诺如病毒中，也是通过多个受体分子的协调作业，形成人诺如病毒的感染的可能性，关于上述受体的特定状况是混迷的。令人惊讶的是，作为本发明的抗诺如病毒剂的有效成分的岩藻糖类似物，能够作用于该未知的受体分子或分子群(的任一个或其以上)，抑制人诺如病毒对肠道细胞的感染。更令人惊讶的是，(b)伴随着上述作用，可以抑制肠道细胞内的人诺如病毒的增殖。
发明效果
根据本发明，提供一种抗诺如病毒剂，其能够抑制人诺如病毒在肠道细胞中的感染、增殖，预防、治疗人的诺如病毒感染症。
附图的简单说明
图1是表示诺如病毒的系统(系列(Lineage))，特别是对人诺如病毒GII(人诺如病毒的频繁出现的基因型)分类的3个系列(系列1-3)进行表示的图。
图2是表示2fp岩藻糖(2fp-fuc)对来自肠道干细胞的2D类器官的细胞毒性进行研究的结果的图。
图3是表示研究通过2fp岩藻糖(2fp-fuc)处理的、来自肠道干细胞的2D类器官表面的HBGA的减少(a)和VLP的附着的减少(b)的结果的图。
图4是表示针对属于诺如病毒GII的系列1-3的各个的分离株，研究了2fp岩藻糖处理的2D类器官的效果的结果的图。
图5是表示研究1-4天的2fp岩藻糖处理对来自肠道干细胞的2D类器官中的人诺如病毒增殖的影响的结果的图。
图6是表示对2fp岩藻糖和其他病毒增殖抑制剂对来自肠道干细胞的2D类器官中的人诺如病毒增殖抑制效果进行比较研究的结果的图。
图7是表示通过RT-PCR对类器官中的直到FUT1-11的FUT在来自肠道干细胞的2D类器官内表达的程度进行考察的结果的图。
图8是表示用蛋白质印迹，对来自敲除FUT2基因的肠道干细胞的2D类器官、和野生型该2D类器官中的FUT2基因的表达的状态进行研究的结果的图。
图9是表示对于来自敲除FUT2基因的肠道干细胞的2D类器官和野生型该2D类器官的、细胞表面的HBGA的状态，以两者中的FITC(荧光体)标记UEA-1的结合为指标，进行研究的结果的图。
图10是表示对于FUT2基因敲除的来自肠道干细胞的2D类器官和野生型该2D类器官，进行VLP结合试验的结果的图。
图11是表示在FUT2基因敲除的来自肠道干细胞的2D类器官中，再次恢复FUT基因时2D类器官中有无VLP附着进行研究的结果的图。
图12是表示对于来自野生型的肠道干细胞的2D类器官、FUT2基因敲除的该2D类器官、FUT2基因恢复的该2D类器官，使其感染人诺如病毒，并对各类器官的增殖率进行比较研究的结果的图。
图13是表示使用了6a岩藻糖的诺如病毒增殖抑制试验的结果的图。
图14是表示根据2fp岩藻糖、6a岩藻糖的病毒感染后的处理效果有关的研究结果的图。
具体实施方式
[1]岩藻糖类似物
如上所述，本发明的抗诺如病毒剂的有效成分，如前述那样，为岩藻糖类似物(I)或(II)[包含(III)或(IV)]，或者它们的盐，根据情况为溶剂化物。
R1、R2、R3和R4各自可独立地采用的原子或官能团中，“烷基”是指所定义的范围的碳原子数的、被取代或未被取代的、饱和直链烃基或饱和支链烃基。
作为未被取代的该烷基，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-己基、3-己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、1-甲基苄基、2-甲基苄基、3-甲基苄基、4-甲基苄基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基等。
取代的烷基可由卤素原子取代，进而可由选自-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、-C(O)R′、-OC(O)R′、-C(O)OR′、-C(O)NH2、-C(O)NHR′、-C(O)N(R′)2、-NHC(O)R′、-SR′、-SO3R′、-S(O)2R′、-S(O)R′、-OH、＝O、-NH2、-NH(R′)、-N(R′)2、及-CN等中的1个以上的基团、优选1-3个基团取代。其中各R′独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、及芳基。
R′可采用的烯基例如可列举：乙烯或乙烯基、烯丙基、-1丁烯基、-2丁烯基、-异丁烯基、-1戊烯基、-2戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2丁烯基、及-2，3-二甲基-2-丁烯基等，但并不限定于这些。
R′可采用的炔基例如可列举：乙炔基、丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-戊炔基等，但并不限定于这些。
R1、R2、R3和R4各自能够独立地采用的原子或官能团中，“烯基”和“炔基”是所定义的范围的碳原子数的、被取代或未被取代的、不饱和直链烃基或不饱和支链烃基。
烯基链在链中具有至少一个以上的双键、炔基链在链中具有至少一个三键。
作为未被取代的烯基的例子，与上述R′可采用的烯基同样地，例如可列举出乙烯或乙烯基、烯丙基、-1丁烯基、-2丁烯基、-异丁酰基、-1戊烯基、-2戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、-2甲基2丁烯基、及-2，3-二甲基2丁烯基等，但并不限定于这些。
作为未经取代的炔基的例子，与上述R′可采用的烯基同样，例如可举出乙炔基、丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-戊炔基等，但并不限定于这些。
在被取代的情况下，烯基和炔基可以被卤素原子取代，并且可以由选自-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、-C(O)R′、-OC(O)R′、-C(O)OR′、-C(O)NH2、-C(O)NHR′、-C(O)N(R′)2、-NHC(O)R′、-SR′、-SO3R′、-S(O)2R′、-S(O)R′、-OH、＝O、-NH2、-NH(R′)、-N(R′)2和-CN等中的1个以上的基团、优选1-3个基团取代。在此，各R′与上述“被取代的R′”相同。
R1、R2、R3和R4各自可独立地采用的原子或官能团中，“亚烷基(基)”是指具有所定义的范围的碳原子数的两个1价基团中心的、未被取代或未被取代的、饱和分枝烃基或饱和直链烃基，代表性的未被取代的亚烷基有亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚己基、亚壬基、亚癸基、1，4-亚丙基等，但并不限定于这些。
所取代的亚烷基可由卤素原子取代，进而可由选自-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、-C(O)R′、-OC(O)R′、-C(O)OR′、-C(O)NH2、-C(O)NHR′、-C(O)N(R′)2、-NHC(O)R′、-SR′、-SO3R′、-S(O)2R′、-S(O)R′、-OH、＝O、-NH2、-NH(R′)、-N(R′)2、及-CN等中的1个以上的基团、优选1-3个基团取代。在此，各R′与上述“被取代的R′”相同。
R1、R2、R3、及R4各自可独立地采用的原子或官能团中，“亚烯基(基)”是指具有从作为烯基(如上所述)的、母烯烃的相同或2个不同的碳原子中去除2个氢原子而衍生的2个1价基团中心的、不饱和的分支或直链或环状的烃基。“亚烯基”基团可以不被取代，烯基也可以如上述那样被取代。在一部分实施方式中，“亚烯基”基团没有被取代。
“亚炔基(基)”是从作为炔基(如上所述)的亲体炔的相同或2个不同的碳原子中脱离2个氢原子而衍生的具有2个1价基团中心的、被取代或未被取代的、不饱和的、支链、直链或环状的烃基。
R1、R2、R3、及R4各自可独立地采用的原子或官能团中，“芳基(基)”是指通过从亲芳香环系的1个碳原子中除去1个氢原子而得到的6-20个碳原子的、被取代或未被取代的1价芳香族烃基。一些芳基在示例性的结构中表示为“Ar”。作为代表性的未被取代的芳基包含由苯、取代苯、苯基、萘、蒽、联苯等得到的基团，但并不限定于这些基团。
取代的芳基可由卤素原子取代，进而可由选自-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、-C(O)R′、-OC(O)R′、-C(O)OR′、-C(O)NH2、-C(O)NHR′、-C(O)N(R′)2、-NHC(O)R′、-SR′、-SO3R′、-S(O)2R′、-S(O)R′、-OH、＝O、-NH2、-NH(R′)、-N(R′)2、及-CN等中的1个以上的基团、优选1-3个基团取代。在此，各R′与上述“被取代的R′”相同。
R1、R2、R3和R4各自可独立地采用的原子或官能团中，“杂环”是指具有至少1个环原子为选自N、O、P或S的杂原子的3-7个或3-10个环原子的、被取代或未被取代的单环式环系。杂环中的1个以上的N、C或S原子可以被氧化。单环式杂环优选具有3～7个环成员(例如2-6个碳原子、以及独立地选自N、O、P及S的1-3个杂原子)。含有杂原子的环可以为芳香族或非芳香族。只要没有特别提及，杂环与带来稳定的结构的任意的杂原子或碳原子中的侧基键合。
杂环记载于Paquette，"Principles of Heterocyclic Chemistry"(W.A.Benjamin，New York，1968)，特别是1，3，4，6，7和9章；“The Chemistry ofHeterocyclic Compounds，A Series of Monographs”(John Wiley&Sons，New York，1950年以后)，特别是13，14，16，19和28章；以及J.Am.Chem.Soc.，82：5566(1960)。作为未被取代的“杂环”基的例子，可例示出吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、岩藻糖基、氮丙啶基、氮杂环丁烷基、氧杂环丙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基等，但并不限定于这些。
所取代的杂环基可以由卤素原子取代，进而，可以由选自-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、-C(O)R′、-OC(O)R′、-C(O)OR′、-C(O)NH2、-C(O)NHR′、-C(O)N(R′)2、-NHC(O)R′、-SR′、-SO3R′、-S(O)2R′、-S(O)R′、-OH、＝O、-NH2、-NH(R′)、-N(R′)2和-CN等中的1个以上的基团、优选1-3个基团取代。在此，各R′与上述“被取代的R′”相同。
作为更详细的杂环基的例子，碳键杂环基的可以在以下的位置结合：
吡啶的2、3、4、5或6位；哒嗪的3、4、5或6位；嘧啶的2、4、5或6位；吡嗪的2、3、5或6位；呋喃、四氢呋喃、噻吩、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位；噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位；异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位；氮丙啶(aziridene)的2或3位；氮杂环丁烷的2、3或4位。
作为这样的碳键杂环基的例子，可以有2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-哒嗪基、3-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基等。
氮键杂环基可以与氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉或1H-吲唑的1位；异吲哚或异吲哚啉的2位；以及吗啉的4位结合。作为代表性的氮键合杂环基，可举出1-氮丙啶基、1-氮杂环丁烷基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基、1-哌啶基等。
上述的R1、R3及R4各自可独立地采用的“-OC(O)C1-C10烷基”的“C1-C10烷基”是碳原子数为1-10个的烷基，该碳原子数的被取代或未被取代的饱和直链基或分枝烃基。作为未被取代的该烷基，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-己基、3-己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、1-甲基苄基、2-甲基苄基、3-甲基苄基、4-甲基苄基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基等。未被取代的上述烷基为甲基时，“-OC(O)C1-C10烷基”为O乙酰基(-OAc)、即“-OC(O)CH3”，作为优选的形态而例示。另外，该情况下，优选R1、R3及R4的1个以上为-OAc，进一步优选2个以上为-OAc，3个全部为-OAc为最优选的方案之一。
进一步被取代的烷基可由卤素原子取代，进而可由选自-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、-C(O)R′、-OC(O)R′、-C(O)OR′、-C(O)NH2、-C(O)NHR′、-C(O)N(R′)2、-NHC(O)R′、-SR′、-SO3R′、-S(O)2R′、-S(O)R′、-OH、＝O、-NH2、-NH(R′)、-N(R′)2、及-CN等中的1个以上的基团、优选1-3个基团取代。其中各R′独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、及芳基。
R′可采用的烯基例如可列举：乙烯或乙烯基、烯丙基、-1丁烯基、-2丁烯基、-异丁酰基、-1戊烯基、-2戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2丁烯基、及-2，3-二甲基-2-丁烯基等，但并不限定于这些。
R′可采用的炔基例如可列举：乙炔基、丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-戊炔基等，但并不限定于这些。
可以通过公知的方法制造岩藻糖类似物(I)或(II)[(III)或(IV)]、或它们的盐或溶剂化物。例如，如专利文献3所公开的那样，使用L-半乳糖作为起始原料，将该羟基彼此进行异亚丙基化而进行保护，实施用于将该保护部分以外的侧链作为所期望的取代基(例如，在5位的碳上加成炔基)的公知的方法后，对上述异亚丙基部分进行脱保护，从而能够根据需要对脱保护的羟基进行公知的乙酰化处理。
另外，也可以使用包含合成委托在内的市售品。
[2]药物组合物
作为本发明的抗诺如病毒剂的有效成分的岩藻糖类似物(I)或(II)[(III)或(IV)]、或它们的盐或溶剂化物(以下，在该药物组合物的单元中，也称为岩藻糖类似物)可以直接用于抗诺如病毒用途，也可以进一步制成对其实施了适当的制剂的药物组合物(以下也称为组合物)。组合物含有治疗上有效量的岩藻糖类似物，代表性地含有1个以上的载体(例如包含花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等来源于石油、动物、植物或合成的油，水和油等灭菌液体)。水是指静脉给药组合物时的代表性的载体。进而，生理盐水、右旋糖及甘油水溶液也可以作为注射用溶液的液体载体使用。作为适当的赋形剂，例如有氨基酸、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、小麦粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。在期望的情况下，组合物可以根据需要还含有润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、崩解剂、甜味剂、防腐剂、色素/着色剂等。这些组合物可采用溶液剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂、肠溶剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形态。
组合物为肠溶胶囊、明胶胶囊这样的胶囊形态的情况下，除了上述材料以外，还可以含有聚乙二醇、环糊精、脂肪油等液体载体。
该组合物中的岩藻糖类似物的含量在相对于组合物为0.01-99质量％的范围内，可根据剂型、给药形态等自由地选择。
给予人的本发明的抗诺如病毒剂的岩藻糖类似物的用量为0.01-500mg/kg体重，更优选为0.1-200mg/kg体重。
本发明的抗诺如病毒剂的给药方式可以根据其目的进行选择。
例如，在利用人诺如病毒的胃肠炎的流行时，在食用无法否定感染人诺如病毒的可能性的食材(贝类等)之前，或向人诺如病毒流行的地域移动前等以预防人诺如病毒感染为目的而给予本发明的诺如病毒剂的情况下，在该行为的当日-4日以上、优选从3-4日前开始进行给药，给药间隔应设定为在给药期间中体内的岩藻糖类似物的浓度不会经时极端降低，根据剂型、给药量也不同，但至少1天1次给药是标准的。
例如，在患有由人诺如病毒引起的胃肠炎的情况下，尽可能早地给药，与上述同样地，给药间隔应该设定为体内的岩藻糖类似物的浓度不会经时极端降低，根据剂型、给药量也不同，但至少1天1次给药是标准的。给药期间优选给药直至人诺如病毒RNA从粪便中消失。
如后所述，本发明的抗诺如病毒剂的特征在于，防止肠道细胞中的人诺如病毒的感染，在中止给药后，从成为对象的肠道细胞中除去岩藻糖衍生物，未确认到细胞毒性，具有对身体更柔和的特征，长期施用也容易。本发明的抗诺如病毒剂由于具有这样的特征，因此容易对抵抗力弱的人、陷入免疫缺陷的状态的人、老人进行给药。另外，由于能够长期使用，因此通过中毒症状消失后的给药，能够防止2次感染。
[实施例]
以下，公开本发明的实施例。本发明的范围并不限定于该公开。在该实施例的栏中，将本发明的抗诺如病毒剂的有效成分也称为“岩藻糖类似物”。
[材料]
(1)来自肠道干细胞的2D类器官与人诺如病毒的培养
所谓的来自肠道干细胞的2D类器官，其为如专利文献2中公开的，
“人腹泻症病毒(包含诺如病毒)的感染、增殖培养用2D类器官，其通过如下的工序获得：
在细胞外基质上对含有人肠道上皮干细胞、人肠道上皮细胞、或这些细胞中的至少任一种的组织进行立体培养，得到3D类器官的工序1，
通过使上述工序1中得到的上述3D类器官分散而制备单一细胞，将上述单一细胞在细胞外基质上进行单层培养，构成含有分化后的绒毛细胞及杯状细胞的人肠道内腔的上皮细胞成为单层结构，获得2D类器官的工序2。”。利用该2D类器官，能够培养以往不可能的人诺如病毒。
在本实施例中，通过专利文献2的[0130]-[0139]中公开的方法，制备来自诺如病毒敏感性的人肠道干细胞的2D类器官，用于各试验。
具体的工序等如下所述。这些工序中使用的培养基、药剂可以全部从市售品中选择，也可以根据需要进行自家制造而使用。
(a)细胞培养用培养基
首先，在高级DMEM/F-12培养基(例如，Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制)中，以最终浓度成为1μg/mL的方式添加人重组R-海绵1(例如，R&Dsystem公司制)，以最终浓度成为100ng/mL的方式添加Noggin(ノギン)(例如Peprotech公司制)，以最终浓度成为500nM的方式添加A83-01(例如，Tocris公司制)(以下称为NRA培养基)。
进而，准备培养基，其中将终浓度300ng/mL的Wnt3a、终浓度500ng/mL的IGF1(例如Biolegend公司制)、终浓度50ng/mL的FGF2(例如，peprotech公司制)、终浓度50ng/mL的EGF(例如，Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制)各自按照以下的组合进行添加。
·WNRA+IGF1+FGF2培养基
·ENRA培养基
这些培养基中使用的缩写的含义如下。
W:Wnt3A
E:EGF
N:Noggin
R:Rspondin1
A:A-83-01
(b)2D类器官的制备
例如，基于由庆应义塾大学医学部伦理委员会所承认的伦理研究计划，从给予说明和得到同意的健康人和消化道肿瘤患者中，采集距离消化道肿瘤至少5cm以上的部分作为正常粘膜。采集的组织通过EDTA或释放酶TH提取上皮细胞，包埋在マトリゲル(注册商标)中。
将含有上皮细胞(以下也称为肠道干细胞)的マトリゲル(注册商标)接种于48孔板中进行培养。具体而言，如下所述。
将培养的肠道干细胞与25μL的マトリゲル(注册商标)(BD Bioscience公司制)一起接种于48孔板。将通过(a)所制备的WNRA+IGF1+FGF2培养基在孔中各添加100μL，在37℃下培养。从培养起，每2天进行培养基交换，培养7天，得到来自肠道干细胞的3D类器官。
另一方面，将用PBS(-)稀释的2.5％マトリゲル(注册商标)以50μL/孔添加到96孔板中，在37℃下孵育1小时以上。然后，将各孔用PBS(-)洗涤3次，制作2D类器官制备用的孔板。
使用例如TrypLE(商标)Express(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制)将上述的3D类器官粉碎，制成单一细胞。用ENRA培养基洗涤该单一细胞后，悬浊于加入了终浓度10μM的Y-27632(Rock抑制剂：例如，和光纯药公司制造)的ENRA培养基中。将该细胞悬浮液以1×105细胞/孔撒入到上述孔板的各孔中，静置3小时以上并粘接于平板，制作来自肠道干细胞的2D类器官。以下，只要没有特别说明，则将该“来自肠道干细胞的2D类器官”记载为“2D类器官”。
(c)人诺如病毒的培养
人诺如病毒感染患者的粪便含有大量的感染性人诺如病毒。将该人诺如病毒感染者的粪便以最终浓度成为约10％的方式悬浮于蒸馏水等而得到的物质作为“10％便悬浮乳剂”。将该10％便悬乳剂在ENRA培养基中稀释至10倍左右，以5μL/孔加入到上述各孔的2D类器官中，进行3小时左右的孵育，由此能够增殖培养人诺如病毒。验证的结果是，通过使用了该2D类器官的培养系统，确认到人诺如病毒增殖到当初的10万倍左右。
在本实施例中，以上述的要领从过去的人诺如病毒感染患者的粪便中得到的、预先储存的、占感染患者的80-90％的基因组2(GII)的诺如病毒中的、作为GII中所包含的系统[系列(Lineage)](图1),以分类为“系列1”的GII.6、分类为“系列2”的GII.3、分类为“系列3”的GII.4的分离株这3种，作为受试对象(GII.6：K2017株、GII.3：TCH2004株、GII.4：K2017株)。
(2)病毒样中空粒子(VLP)
VLP是将人诺如病毒基因组的结构蛋白质区域组装到杆状病毒中，用昆虫细胞表达而得到的与人诺如病毒粒子非常相似的结构体。VLP的结构为人诺如病毒本身，具有与病毒粒子同等的抗原性，但在内部不具有基因组RNA，中空且没有感染性。
在本实施例中，使用将编码诺如病毒GI I.4中的结构蛋白质区域的碱基序列(AB447456)组装到杆状病毒中，并使其在昆虫细胞(SF9细胞)中表达而得到的物质。
(3)药剂
作为本实施例中使用的岩藻糖类似物的1种，使用(3S，4R，5R，6S)-3-氟-6-甲基四氢-2H-吡喃-2，4，5-三基三乙酸酯((3S,4R,5R,6S)-3-fluoro-6-methyltetrahydro-2H-pyran-2,4,5-triyl triacetate)(默克(Merck)公司制造：以下，也称为2fp岩藻糖)。2fp岩藻糖是在式(III)的岩藻糖类似物中，R1、R3和R4为-OAc，R2为F的方案。具体而言，为下述式(V)所表示的岩藻糖类似物。
[化3]
Figure BDA0003132815600000211
作为本实施例中使用的岩藻糖类似物的其他1种，使用6-炔基岩藻糖(1，2，3，4-四-O-乙酰基-6，7-二脱氧-L-半乳-庚-6-基吡喃糖(1,2,3,4-Tetra-O-acetyl-6,7-dideoxy-L-galacto-hept-6-ynopyranose)(株式会社肽研究所制：以下也称为6a岩藻糖)。6a岩藻糖为式(III)的岩藻糖类似物中，R1、R2、R3和R4为-OAc，R5为-C≡CH的实施方式。具体地，是下式(VI)表示的岩藻糖类似物。
[化4]
Figure BDA0003132815600000221
作为用于比较的市售的抗病毒剂，获得了索非布韦(sofosbuvir)、拉米夫定(Lamivudine)、利巴韦林(Ribavirin)、咪唑立宾(Mizoribine)。
[采用2fp岩藻糖的人诺如病毒增殖抑制试验]
(1)2fp岩藻糖对2D类器官的细胞毒性
以3.0-1000μM的2fp岩藻糖7天持续处理2D类器官，通过锥虫蓝染色求出处理后的死细胞的数量。该试验独立进行3次。将结果示于图2。图中的误差棒表示SEM。
如图2所示，即使处理后经过7天，在全部的2fp岩藻糖处理量中细胞的存活量没有发现相对于非处理的情况(0μM)的显著性差异。
该结果表示2fp岩藻糖对细胞的安全性。
(2)2fp岩藻糖处理对2D类器官表面HBGA表达的影响
对2D类器官进行4天持续的2fp岩藻糖处理(0、8、40、200、1000μM)，研究了FITC(荧光体)标记UEA-1(Ulex europaeus agglutinin-1)是否与细胞表面的含有HBGA的岩藻糖修饰的蛋白质的减少结合。另外，UEA-1与经岩藻糖修饰的蛋白质反应。
首先，可知通过2fp岩藻糖处理，2D类器官表面的含有HBGA的α连接岩藻糖的表达量相对于2fp岩藻糖浓度依赖性地降低，特别是超过200μM时，其倾向变得明显(图3(a))。图3(a)是黑白的照片图像。
另一方面，在诺如病毒GII.4的VLP上标记AF488(アレクサフロー488；绿色荧光体)，加入精制后的该荧光标记VLP，观察VLP何种程度地与2fp岩藻糖处理2D类器官表面结合。2fp岩藻糖处理浓度与上述UEA-1的情况同样地为0、8、40、200、1000μM(4天处理)。其结果，VLP的结合量相对于2fp岩藻糖浓度依赖性地降低，当2fp岩藻糖浓度超过40μM时，确认到2D类器官表面的VLP的附着明确的减少(图3(b))。图3(b)是黑白的照片图像。
明确地出现上述VLP(GII.4)向2D类器官表面的附着减少的2fp岩藻糖浓度为“40μM”，与图4所示的诺如病毒的GII.4分离株中的增殖抑制效果明确出现的“200μM以上”(后述)相比，为低浓度。与此相对，上述的UEA-1在2D类器官上的荧光光度的明确的减少发生在“2fp岩藻糖超过200μM”，与上述的图4所示的人诺如病毒分离株中的增殖抑制效果明确地出现的2fp岩藻糖浓度重叠。这暗示了：在2fp岩藻糖浓度为40μM时，虽然2D类器官表面的未知的人诺如病毒受体(或受体群)的作用降低，但没有完全受损。这认为是如下的缘故：对于2D类器官的细胞表面的附着人诺如病毒粒子的结构，VLP附着而表现为荧光，但并非如此的相当数量的VLP被摄取到2D类器官内。被摄取到2D类器官内的VLP被迅速分解而确认不到荧光色素的存在，识别为荧光的减少量。
另一方面，认为是UEA-1具有与被广泛岩藻糖修饰的蛋白质结合的性质，如果2fp岩藻糖浓度超过40μM变为200μM左右时，则2fp岩藻糖在本来应岩藻糖修饰的细胞内和细胞表面的蛋白质中遍布，其表现为细胞表面中的明显的UEA-1的结合抑制现象。认为是细胞内也存在许多岩藻糖修饰蛋白质，参与人诺如病毒粒子摄取后的反应，这些细胞内岩藻糖修饰蛋白质的作用，通过达到200μM左右的2fp岩藻糖抑制其产生而被妨碍，其结果，细胞内的人诺如病毒的增殖被抑制。
如此，强烈暗示本发明的抗诺如病毒剂的有效成分即岩藻糖类似物不仅具有阻碍人诺如病毒向细胞内的摄入，还具有抑制细胞内的其增殖的作用。
(3)2fp岩藻糖处理对人诺如病毒增殖的影响
对于那些诺如病毒的每个系列，为了考察2fp岩藻糖处理对人诺如病毒增殖的影响，在2fp岩藻糖的3天处理后，使上述的诺如病毒GII.6、GII.3、GII.4的分离株感染上述的2D类器官，测定感染后第3天和第6天的病毒增殖量(图4)。其结果，如图4所示，在GII.3分离株中，在40μM以上完全确认到病毒的增殖抑制。GII.6分离株在200μM以上确认到完全的增殖抑制效果。在GII.4分离株中，从40μM稍微确认到增殖抑制效果，但在200μM以上确认到完全的增殖抑制效果。根据该结果，在200μM以上的浓度，在这些系列的人诺如病毒中确认到完全的增殖抑制效果。
接着，为了研究事先的2fp岩藻糖处理的天数对岩藻糖类似物的抗人诺如病毒效果带来的影响，对上述的GII.4分离株，在1-4天进行了几个浓度的2fp岩藻糖处理。将其结果示于图5。如图5所示，在1天处理、2天处理中，人诺如病毒在接种后第3天增殖到100倍以上，由2fp岩藻糖产生的增殖抑制效果也没有发现浓度依赖性。但是，在3日处理组中，以200μM处理表现出增殖抑制效果的效果有差别。在4日处理组中，从8μM处理表现出效果，直至200μM处理，浓度依赖性地提高了增殖抑制效果。另一方面，在1000μM处理中，发现了一些人诺如病毒的增殖。因此，在该2D类器官的体系中，200μM的3-4天处理发现最高的增殖抑制效果。该试验独立进行3次。误差棒表示SEM。
(4)2fp岩藻糖与其他病毒增殖抑制剂的效果比较
对于2D类器官，实施如下的3天处理：(a)200μM的2fp岩藻糖、(b)1μM的索非布韦(sofosbuvir)、(c)1μM的拉米夫定(Lamivudine)、(d)400μM的利巴韦林(Ribavirin)、(e)100μM的咪唑立宾(Mizoribine)，然后感染人诺如病毒(上述诺如病毒GI I.4的分离株)，测定增殖抑制效果(图6)。试验独立进行3次。误差棒表示SEM。只有2fp岩藻糖从第0天至第七天几乎没有发现病毒RNA效价(滴度)的上升，确认到人诺如病毒的增殖抑制效果。其他抑制剂均与未添加药剂的组(No drug)同样的高度，病毒RNA效价上升，完全不显示人诺如病毒的增殖抑制效果。
[通过2fp岩藻糖的人诺如病毒增殖抑制机制的研究]
(1)FUT基因表达概况和2fp岩藻糖产生的细胞毒性
2fp岩藻糖在被摄入细胞后，利用岩藻糖转移酶(Fucose transferase：FUT)组装为α岩藻糖修饰。但是，由于与岩藻糖的一部分侧链不同，不能从2fp岩藻糖拉伸到下一个糖链。2fp岩藻糖是通过这样的机制抑制完全的糖链修饰的岩藻糖类似物。2fp岩藻糖在从进行α1-2岩藻糖转移的FUT1、FUT2到进行α1-3岩藻糖转移的FUT3-11为止，抑制了在哺乳类细胞中发现的全部的由岩藻糖转移酶进行的糖修饰。
在此，通过RT-PCR对作为人诺如病毒敏感性的2D类器官中的、直到FUT1-11为止的FUT的细胞内表达的程度进行了考察。将其结果示于图7。
如图7所示，负担α1-2岩藻糖转移的FUT1、2中，FUT2良好地表达，但FUT1的表达为FUT2的1/200左右。在进行α1-3岩藻糖转移的FUT3-11中，观察到FUT3、4、6、8、10、11的表达，但FUT5、7、9的表达为背景水平。在2D类器官中本来应该表达的FUT2、3、4、6、8、10、11的功能即使受到2fp岩藻糖的抑制，对细胞的生存性(存活率)也完全没有影响。
(2)使用FUT2基因敲除细胞的人诺如病毒增殖与HBGA的关系
为了研究2D类器官的HBGA的分泌状态(secretor status)与FUT2基因表达的关系，2D类器官的FUT2基因被敲除，利用蛋白质印迹确认该敲除2D类器官的FUT2基因的表达(图8)。在图8中，“WT”表示作为对照的野生的2D类器官，“KO”表示该敲除2D类器官。标记使用“Bio-Rad Precision Plus ProteinTM 2-色标1610374”。左侧的泳动图表示对FUT2进行研究的结果，右侧的泳动图表示作为对照对β肌动蛋白进行研究的结果。在左侧的电泳图中，只有从上起第五个与第六个标记之间的WT存在的条带为FUT2，在右侧的泳动图中从上起第五个之间的WT和KO的双方都存在的条带为β肌动蛋白。即，该敲除2D类器官中的FUT2的表达降低至无法通过蛋白质印迹进行检测的水平。未被敲除的2D类器官(野生型)与敲除的2D类器官的β肌动蛋白量相同，因此能够确认电泳、蛋白质印迹所提供的细胞的量相等。
图9表示对于敲除2D类器官和野生型2D类器官的细胞表面的HBGA的状态，以两者中的FITC(荧光体)标记UEA-1的结合为指标进行研究的结果。在图9中，“UEA1”是表示FITC标记UEA-1与两者接触时的荧光的分布和强度的黑白的照片图像，“融合(Merge)”是将该“UEA1”和利用Hoechst(注册商标)33342的细胞核染色(蓝色)的图像合成后的图像。如在此所示，通过FUT基因的敲除，如果在针点没有FUT2的表达，则几乎观察不到2D类器官表面的HBGA。
接着，将使用绿色荧光体AF488标记的GII.4的VLP与人诺如病毒敲除2D类器官和野生型2D类器官接触，在两者的表面是否结合有VLP进行了研究(图10)。其结果，几乎观察不到敲除2D类器官中的VLP的结合。作为黑白的照片图像的图10中的“融合(Merge)”为该“VLP”的图像和利用Hoechst(注册商标)33342的细胞核染色(蓝色)的图像的合成。
接着，对于上述的FUT2基因的敲除2D类器官，使该FUT2基因恢复(解救)，尝试FUT2的表达的恢复。用抗人诺如病毒VP1抗体对感染人诺如病毒的2D类器官进行红色染色，结果发现在分布于一面的细胞群中，虽然是低概率但确认到染色细胞，表面附着有VLP的人诺如病毒感染2D类器官存在一些(黑白的照片图像的图11的明亮点)。这暗示了在敲除2D类器官表面上HBGA以低效率恢复。
最后，使野生型2D类器官(WT)、FUT2基因敲除2D类器官(FUT2KO)、恢复了FUT2基因的2D类器官(FUT2Res)感染人诺如病毒(上述诺如病毒GII.4的分离株)，对各自的2D类器官的增殖率进行了比较研究(图12)。
如图12所示，WT在第3天、第6天确认到RNA滴度的上升，确认到人诺如病毒的增殖。但是，FUT2基因敲除2D类器官完全没有发现RNA滴度的上升，完全没有发生人诺如病毒增殖。而且，在将FUT2基因恢复到该敲除2D类器官中的细胞中，与野生型(WT)相比上升率较低，但确认到RNA滴度的上升，确认了人诺如病毒能够增殖的状态。
由于FUT2Res细胞是向FUT2KO细胞导入了FUT2基因的细胞，因此，在细胞内为了敲除FUT2而作用的FUT2gRNA和Cas9成为持续显现的状态。因此，新引入的FUT2基因也逐渐被敲除。因此，认为即使重新将FUT2基因导入FUT2KO细胞，人诺如病毒增殖能力也不会恢复到与野生型相同的水平，增殖率也低于WT。
类器官在分化为肠道细胞的过程中成为人诺如病毒感染敏感性。FUT2在其成熟过程中发挥作用，如果在细胞表面直接或间接地影响将人诺如病毒引入细胞内的人诺如病毒感染受体的成熟，则通过该试验来考虑。但是，如上所述，包含从FUT2表达到成为感染敏感性细胞为止的行程的机理尚未阐明。
[使用6-炔基岩藻糖的人诺如病毒增殖抑制试验]
对于2D类器官，将6a岩藻糖以0μM、1.6μM、8μM、40μM、200μM终浓度的方式添加到培养基中，进行4天分化诱导培养。培养在96孔板上各使用3孔，将6a岩藻糖的各自的添加系统作为每个受试人诺如病毒的试验板使用。受试人诺如病毒使用上述的GII.4分离株和GII.6分离株这2种。培养在调整为37℃的二氧化碳培养箱中进行。
在培养开始第四天除去培养基，用新的培养基洗涤后，将上述的人诺如病毒复制105RNA，静置3小时使其感染。感染处理后，将培养基中的人诺如病毒连同培养基一起除去，用新的培养基进行3次洗涤操作。
清洗后，在新培养基中再次添加6a岩藻糖以达到0μM、1.6μM、8μM、40μM、200μM终浓度，进行6天培养。
在上述(a)新培养基刚添加后，(b)3天后，(c)6天后，从各自的孔中回收10μL的培养基，用10000g离心10分钟，除去细胞沉渣，用实时RT-PCR定量上清1μL中含有的人诺如病毒基因组RNA的量。
将结果示于图13。在图13中，(a)表示人诺如病毒的GII.4分离株，(b)表示对人诺如病毒的GII.6分离株使用6a岩藻糖的结果。图13的纵轴为人诺如病毒基因组RNA的拷贝数(RNA滴度)，各个柱形图的组下的数字分别表示试验开始时的培养时间。
对于图13(a)所示的GII.4株的增殖抑制效果，从6a岩藻糖浓度1.6μM出现，未处理组在培养第6天确认到培养开始时的100倍以上的RNA滴度的上升，相对于此，各自的浓度的6a岩藻糖处理组全部被抑制在培养开始时的100倍以下的RNA滴度。详细而言，在6a岩藻糖浓度为8μM时，与上述1.6μM的情况相比，进一步抑制RNA滴度的上升，抑制为培养开始时的10倍左右的上升。6a岩藻糖浓度为40μM时，在培养开始第6天稍微超过培养开始时的测定值，但未确认到RNA滴度的上升。6a岩藻糖浓度为200μM时，RNA滴度的上升被完全抑制。
图13(b)所示的对GII.6株的增殖抑制效果在6a岩藻糖浓度1.6μM下没有确认。但是，在8μM下强烈地抑制人诺如病毒基因组的增殖，在培养第3天和第6天确认到稍上升到第0天的测定值的增殖。6a岩藻糖浓度40μM以上时，完全抑制增殖。
需要说明的是，除了通过上述培养而确认到增殖的孔以外，培养细胞(2D类器官)作为单层的片状而生存，6a岩藻糖的添加所致的细胞毒性在全部的处理浓度中完全没有观察到。
[2fp岩藻糖、6a岩藻糖对病毒感染后的处理效果的研究]
(1)试验系统的说明
类器官在分化诱导后到完全分化为小肠上皮细胞为止需要约4天。之后，细胞的分裂几乎停止，在不进行培养基更换的情况下，在7-9天开始死亡。从上述结果可知，岩藻糖类似物的效果在添加后从第二天开始显现，在4天后达到稳定水平。另一方面，人诺如病毒在感染次日开始向培养基内释放新生病毒，能够观察到增殖，增殖持续直到感染后第6天。
通常，在人体内，由于人诺如病毒引起的第一感染、细胞内增殖，小肠上皮细胞死亡、剥离时，存在于加密区部分的干细胞分裂，进行补充正常分化诱导的上皮细胞，不久绒毛的再生进展。这样新供给的细胞中，由于第一感染、细胞内增殖，从上述小肠上皮细胞释放到肠道内的新生人诺如病毒新感染，第二人诺如病毒的增殖周期再次在该新供给细胞内开始反复。在该阶段时，通常开始宿主的免疫应答产生的病毒增殖控制，因此认为病毒的感染增殖逐渐被抑制。
对于本发明的抗诺如病毒剂，为了设计适用于上述人诺如病毒的感染、增殖循环的有效果的给药形态，优选在上述的感染、增殖循环中，经时地监测岩藻糖类似物。
然而，目前，不存在能够监测人诺如病毒的感染、增殖的实验动物，在体内包括人诺如病毒增殖、细胞的再生、供给、再感染、免疫应答的监控都是困难的。
因此，在体外使用以下的条件测定人感病毒感染后的添加岩藻糖类似物的经时效果。
(2)试验体系的内容和结果(图14)
(a)将2D类器官接种于96孔板中，诱导分化后，在第5天制作添加了岩藻糖类似物[2fp岩藻糖(结果为图12(a))、6a岩藻糖(结果为图14(b))]使其各自为200μM浓度的组(添加组)和未添加的组(未处理组)。然后，在该第2天除去培养基，洗涤后，感染上述GII.4分离株和GII.6分离株的2种。
感染处理后，将培养基中的人诺如病毒连同培养基一起除去，用新的培养基进行3次洗涤操作。洗涤后，在新培养基中，再次向添加组中添加各自的上述有效成分以达到200μM，未处理组在无添加的状态下进行3天培养。从各自的孔中回收10μL的培养基，用10000g离心10分钟除去细胞沉渣，用实时RT-PCR对上清液1μL中含有的人诺如病毒基因组RNA的量进行定量。
在该时刻，未处理组(untreated)确认了10倍以上(2fp岩藻糖给药体系)或150倍以上(6a岩藻糖给药体系)的RNA滴度的上升，但添加群在两个给药体系中都未确认到人诺如病毒的增殖(RNA滴度的上升)。该结果从图14(a)、(b)的左端起在2个柱状图中示出(各自的未处理、2f-fuc或6a-fuc的柱状图)。
(b)在上述未处理组中，还残留有人诺如病毒感染敏感性细胞，表示发生由于人诺如病毒的追加感染而对残留的敏感性细胞的新的感染增殖。因此，为了研究本发明的抗诺如病毒剂对残留的敏感性细胞的效果，进行以下操作。
与上述(a)同样地，从作为未处理组进行了3天培养的各自体系中除去培养基，在洗涤操作后，使人诺如病毒再感染(reinfection：reinf.)，然后将该病毒连同培养基一起除去，在洗涤操作后添加新培养基，进一步培养3天，与上述同样地测定释放到上清液中的人诺如病毒量作为RNA滴度。在该再感染试验中，确认到比上述(a)的初次感染还高的20倍以上的RNA滴定的上升(图14(a)的reinf的柱状图)。即，表示由于再感染病毒新感染细胞，培养基内的病毒浓度比初次感染增加。
(c)接着，针对该再感染的岩藻糖类似物的效果进行研究。通常人在人诺如病毒感染后24-48小时左右发病，因此假定在发病后立即给予本发明的抗诺如病毒剂的有效量。在该情况下，从上述见解可预见从人诺如病毒的初期感染2日后以后出现抗病毒效果。另外，在初感染后从密码区部分的干细胞分化诱导的细胞，在岩藻糖类似物的存在下，在3天后与病毒接触。
在本试验体系中，对于经过上述岩藻糖类似物处理后经过了3天的2D类器官中残活的细胞(大多数是由于岩藻糖类似物的效果还未受到人诺如病毒的感染)，进行第二次感染(再感染：reinfected)操作，研究针对该再感染操作的岩藻糖类似物的效果，由此推定人诺如病毒感染后的本发明的抗诺如病毒剂带来的效果。
具体而言，与上述(a)同样地，作为添加组，从最初的感染在岩藻糖类似物(200μM)的存在下进行了3天培养的体系中分别除去培养基，在洗涤操作后，再感染人诺如病毒，然后将该病毒连同培养基一起除去，再洗涤操作后添加含有200μM的岩藻糖类似物(Reinf+2f-fuc或Reinf+6a-fuc)、或未含有岩藻糖类似物的(Reinf-2f-fuc或Reinf-6a-fuc)培养基，进一步培养3天，在该时间点与上述同样地测定上清液中释放的人诺如病毒量作为RNA滴度。该结果如图14(a)、(b)的右端表示为2个棒状图(Reinf+2f-fuc或Reinf+6a-fuc的棒状图、或Reinf-2f-fuc或Reinf-6a-fuc的棒状图)。
根据该结果可知，即使在上述再感染后添加岩藻糖类似物，从初发的人诺如病毒的感染最初开始在该有效成分的存在下生长3天的细胞也没有受到人诺如病毒的再感染。
(3)结论
由上述结果可知，人感染诺如病毒，在其发病时持续服用本发明的抗诺如病毒剂的有效量的情况下，虽然难以避免由初发感染引起的全部症状，但能够有效地抑制大致感染后2-3天后发生的由再感染引起的症状的持续表现。这在本质上及期间上缓和人诺如病毒病患者的痛苦的意义上是非常有益的。进而，通过在发病后的使用本发明的抗诺如病毒剂，在人患有诺如病毒的情况下，可预见能够大幅度地缩短人诺如病毒在大便中的排泄期间，其是由于人诺如病毒的感染扩大所导致的问题。

Claims (9)

1.一种抗人诺如病毒剂，其特征在于，以岩藻糖类似物或它们的盐作为有效成分，所述岩藻糖类似物抑制由岩藻糖转移酶(FUT)进行的糖链修饰。
2.根据权利要求1所述的抗人诺如病毒剂，其中，糖链修饰被岩藻糖类似物抑制的岩藻糖转移酶包含FUT2。
3.一种抗人诺如病毒剂，其以下述式(III)或(IV)的岩藻糖类似物或它们的盐作为有效成分，
[化1]
Figure FDA0003132815590000011
[式中，式(III)或(IV)各自为α或β端基异构体，
R1、R3及R4各自为-OH或-OAc，
R2为F(氟原子)或Cl(氯原子)的卤素原子、-OH或-OAc，
R5为-CH3、-C≡CH、-C≡CCH3或-CH2C≡CH。]
4.根据权利要求3所述的抗人诺如病毒剂，其中，在所述抗人诺如病毒剂中，R2为所述卤素原子时，R1、R3和R4中的至少1个为-OAc；
在R5为-C≡CH、-C≡CCH3或-CH2C≡CH时，R1、R2、R3及R4中的至少1个为-OAc。
5.根据权利要求3或4所述的抗人诺如病毒剂，其中，在所述抗人诺如病毒剂中，R2为所述卤素原子时，R5为-CH3；R5为-C≡CH、-C≡CCH3或-CH2C≡CH时，R2为-OH或-OAc。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的抗人诺如病毒剂，其中，在所述抗人诺如病毒剂中，R2为所述卤素原子时，R1、R3及R4全部为-OAc；
R5为-C≡CH、-C≡CCH3或-CH2C≡CH时，R1、R2、R3及R4全部为-OAc。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的抗人诺如病毒剂，其中，在所述抗人诺如病毒剂中，R2为F(氟原子)。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的抗人诺如病毒剂，其中，在所述抗人诺如病毒剂中，R5为-C≡CH。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的抗人诺如病毒剂，其中，作为有效成分的岩藻糖类似物或它们的盐是式(III)的岩藻糖类似物或其盐。
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