CN113214109A - 一种硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物化工领域。具体涉及一种硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。所述硝呋索尔半抗原结构如式(I)所示，其和载体蛋白偶联后得到所述人工抗原，以所述人工抗原作为免疫原制备得到相应的杂交瘤细胞3H10，所述杂交瘤细胞3H10分泌的单克隆抗体可以用于硝呋索尔的检测。本发明提供的硝呋索尔半抗原制备得到的人工抗原免疫小鼠制备得到的单克隆抗体在检测硝呋索尔及其衍生物时具有较高的灵敏度，为建立快速、简便、价廉、灵敏和特异的硝呋索尔检测方法提供了新的物质基础。

Description

一种硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物化工领域。具体涉及一种硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
背景技术
硝呋索尔(Nifursol)，又称硝呋柳肼，是一种硝基呋喃类抗菌药物，作为饲料添加剂被广泛用于治疗猪、家禽和水产动物胃肠道感染(由大肠杆菌和沙门氏菌引起)，是预防火鸡组织球虫病(黑头病)的最后一道防线。硝呋索尔的结构和性质与其它硝基呋喃类药物相似，原药在体内代谢迅速，但其有毒代谢物却与蛋白质结合稳定，能在生物组织中存留较长时间。硝呋索尔原药在动物体内的主要代谢产物为3，5-二硝基水杨酸肼(3，5-dinitrosalicylic acid hydrazide，DNSH)和5-硝基2-糠酸，二者均可作为硝呋索尔的残留标志物。
为了对硝呋索尔进行残留监控，需要建立快速、准确和可靠的分析方法，并要求高灵敏度(在RPA水平甚至更低)。目前，硝呋索尔及其代谢物的检测方法主要有高效液相色谱、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等仪器方法，酶联免疫吸附(ELISA)、免疫层析等免疫分析方法也有少量报道。仪器分析方法虽然灵敏度高、重现性好，但耗时费力、检测成本昂贵并不适合大量样本的高通量检测。而基于抗原抗体特异性反应的免疫分析方法灵敏、快速、成本低且操作简便，非常适合现场检测。因此，设计免疫半抗原分子，开发一种简单、快捷、用于检测硝呋索尔代谢物的单克隆抗体显得尤为重要。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。通过该硝呋索尔半抗原制备得到的人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的针对硝呋索尔及其衍生物的特异性抗体。
第一方面，本发明提供硝呋索尔半抗原，其结构如式(I)所示：
Figure BDA0003023064730000021
其中，R为
Figure BDA0003023064730000022
第二方面，本发明提供所述硝呋索尔半抗原的制备方法。具体地，针对式(II)所示化合物，其制备方法如下：
Figure BDA0003023064730000023
(1)3，5-二硝基水杨酸和浓硫酸经过回流反应得到3，5-二硝基水杨酸甲酯；
(2)将3,5-二硝基水杨酸甲酯、NaOH和水合肼在70～75℃反应5～6h后调节pH至酸性，得到3,5-二硝基水杨酰肼；
(3)5-羟基-2硝基苯甲醛、4-溴丁酸乙酯和碳酸钾反应得到3-醛基-4硝基苯氧丁酸乙酯；
(4)将3-醛基-4硝基苯氧丁酸乙酯和NaOH在30～35℃反应2～3h后调节pH至酸性得到3-醛基-4硝基苯氧丁酸；
(5)3-醛基-4硝基苯氧丁酸和3,5-二硝基水杨酰肼反应得到所述硝呋索尔半抗原；
针对如式(III)所示化合物，其制备方法如下：
Figure BDA0003023064730000031
(1)3,5-二硝基水杨酸和浓硫酸经过回流反应得到3,5-二硝基水杨酸甲酯；
(2)将3,5-二硝基水杨酸甲酯、NaOH和水合肼在70～75℃反应5～6h后调节pH至酸性，得到3,5-二硝基水杨酰肼；
(3)5-羟基-2硝基苯甲醛、2-溴乙酸乙酯和碳酸钾反应得到3-醛基-4硝基苯氧乙酸乙酯；
(4)将3-醛基-4硝基苯氧乙酸乙酯和NaOH在30～35℃反应2～3h后调节pH至酸性得到3-醛基-4硝基苯氧乙酸；
(5)3-醛基-4硝基苯氧乙酸和3,5-二硝基水杨酰肼反应得到所述硝呋索尔半抗原；
针对如式(IV)所示化合物，其制备方法如下：
Figure BDA0003023064730000041
(1)3,5-二硝基水杨酸和浓硫酸经过回流反应得到3,5-二硝基水杨酸甲酯；
(2)将3,5-二硝基水杨酸甲酯、NaOH和水合肼在70～75℃反应5～6h后调节pH至酸性，得到3,5-二硝基水杨酰肼；
(3)3,5-二硝基水杨酰肼与6-溴己酸乙酯在35～40℃反应24～28h得到6-(3,5-二硝基水杨酰肼基)溴己酸乙酯；
(4)将6-(3,5-二硝基水杨酰肼基)溴己酸乙酯与NaOH在30～35℃反应2～3h，调节pH至酸性得到所述硝呋索尔半抗原。
第三方面，本发明提供一种人工抗原，所述人工抗原由所述硝呋索尔半抗原制备得到。
进一步地，所述人工抗原由所述硝呋索尔半抗原和载体蛋白偶联得到；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
进一步地，式(II)所示硝呋索尔半抗原与载体蛋白的偶联摩尔比为6.4∶1。
具体地，在上述技术方案中，式(III)所示硝呋索尔半抗原与载体蛋白的偶联摩尔比为6.5∶1。
具体地，在上述技术方案中，式(IV)所示硝呋索尔半抗原与载体蛋白的偶联摩尔比为9.1∶1。
本发明进一步提供含有所述硝呋索尔半抗原或所述人工抗原的试剂盒。
本发明进一步提供由所述人工抗原制备的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。
第四方面，本发明提供杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株以所述人工抗原为免疫原制备得到。
本发明进一步提供所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
本发明进一步提供所述硝呋索尔半抗原，所述人工抗原，所述试剂盒和所述单克隆抗体在检测硝呋索尔或其衍生物中的应用；优选地，所述衍生物为3，5-二硝基水杨酸肼。
本发明具备如下有益效果：
(1)本发明首次公开了三种新的硝呋索尔半抗原、人工抗原及其制备方法，用该硝呋索尔人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体；
(2)利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备硝呋索尔抗体，制备过程简单、经济，抗体对于DNSH、NPDNSH和Nifursol的检测灵敏度可达0.91ng/ml、0.72ng/ml和0.85ng/mL，其实用价值高，在兽药残留检测中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的式(II)所示硝呋索尔半抗原制备的流程图；
图2为本发明实施例1提供的式(III)所示硝呋索尔半抗原制备的流程图；
图3为本发明实施例1提供的式(IV)所示硝呋索尔半抗原制备的流程图；
图4为本发明实施例1提供的式(II)所示硝呋索尔半抗原的质谱图；
图5为本发明实施例1提供的式(III)所示硝呋索尔半抗原的质谱图；
图6为本发明实施例1提供的式(IV)所示硝呋索尔半抗原的质谱图；
图7为本发明实施例1提供的式(II)所示硝呋索尔半抗原的1H NMR核磁谱图；
图8为本发明实施例1提供的式(III)所示硝呋索尔半抗原的1H NMR核磁谱图；
图9为本发明实施例1提供的式(IV)所示硝呋索尔半抗原的1H NMR核磁谱图；
图10为本发明实施例2提供的BSA的MALDI-TOF-MS图；
图11为本发明实施例2提供的DNSH①-BSA的MALDI-TOF-MS图；
图12为本发明实施例2提供的DNSH②-BSA的MALDI-TOF-MS图；
图13为本发明实施例2提供的DNSH③-BSA的MALDI-TOF-MS图；
图14为本发明实施例3提供的利用单克隆抗体检测硝呋索尔代谢物DNSH的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写；DCC为二环己基碳二亚胺的缩写；DMF为N,N-二甲基甲酰胺的缩写；NHS、DCC、牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)以及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。
实施例1硝呋索尔半抗原的制备和表征
一、硝呋索尔半抗原的制备
1、如式(II)所示半抗原的制备
Figure BDA0003023064730000071
如图1所示，具体包括以下步骤：
S1、12g 3,5-二硝基水杨酸溶于200ml甲醇中，滴加3ml浓硫酸，回流反应24h，后处理直接浓缩除去大部分甲醇，然后冷却至室温，析出固体，抽滤，真空干燥，得白色产物约12g，收率90％；
S2、配制1mol/L 1eq的氢氧化钠溶液，剧烈搅拌下加入步骤S1产物，加毕升温至70℃，再加入1.3eq水合肼溶液，加毕70℃反应5h，然后滴加1eq硫酸水溶液，加毕冷却至室温，析出固体，抽滤，真空干燥得黄色固体A-1(式V所示化合物)，收率60％；
Figure BDA0003023064730000072
S3、乙腈作溶剂，依次加入1eq 5-羟基-2硝基苯甲醛、1eq 4-溴丁酸乙酯和2eq碳酸钾，加入少量KI做催化剂，回流反应过夜，后处理先浓缩除去大部分乙腈，然后倒入水中，加乙酸乙酯提取3次，乙酸乙酯合并后水洗，干燥，旋干，收率约60％，无须纯化，直接下投；
S4、1eq步骤S3产物加入甲醇中，然后加入3eq 1mol/L的氢氧化钠水溶液，30℃反应2h，后处理倒入水中，加盐酸调节至酸性，析出固体，抽滤，干燥，收率约80％；
S5、无水乙醇作溶剂，加入1eq步骤S4产物和1eq A-1，回流反应3h，冷却，抽滤，滤饼真空干燥，得到的浅黄色粉末固体即为式(II)所示硝呋索尔半抗原，收率95％。
2、如式(III)所示半抗原的制备
Figure BDA0003023064730000081
如图2所示，具体包括以下步骤：
S1、乙腈作溶剂，依次加入1eq 5-羟基-2硝基苯甲醛、1eq 2-溴乙酸乙酯和2eq碳酸钾，加入少量KI做催化剂，回流反应过夜，后处理先浓缩除去大部分乙腈，然后倒入水中，加乙酸乙酯提取3次，乙酸乙酯合并后水洗，干燥，旋干，收率约60％，无须纯化，直接下投；
S2、1eq步骤S1产物加入甲醇中，然后加入3eq 1mol/L的氢氧化钠水溶液，30℃反应2h，后处理倒入水中，加盐酸调节至酸性，析出固体，抽滤，干燥，收率约80％；
S3、无水乙醇作溶剂，加入1eq步骤S2产物和1eq A-1，回流反应3h，冷却，抽滤，滤饼真空干燥，得到的浅黄色粉末固体即为式(III)所示硝呋索尔半抗原，收率95％。
3、如式(IV)所示半抗原的制备
Figure BDA0003023064730000091
如图3所示，具体包括以下步骤：
S1、1eq A-1和1eq 6-溴己酸乙酯溶于DMF中，加入2eq醋酸钠做缚酸剂，35℃反应24h，后处理倒入水中，析出粘稠固体，粘稠固体用PE∶EA＝1∶1重结晶三次，得黄色粉末固体，收率约40％；
S2、将步骤S1产物分散于少量甲醇中，滴加3eq 1mol/L氢氧化钠溶液，滴毕，30℃反应2h，后处理倒入水中，加醋酸调节pH至4左右，冰水浴搅拌1h，析出固体，抽滤，真空干燥，得到的黄色固体即为式(IV)所示硝呋索尔半抗原，收率80％。
二、硝呋索尔半抗原的表征
1、质谱鉴定
上述式(II)所示硝呋索尔半抗原的质谱检测结果如图4所示，结果分析如下，MSm/z[M-H]-理论值为477.3，实测值为476.1，与目标产物的分子量相吻合。
上述式(III)所示硝呋索尔半抗原的质谱检测结果如图5所示，结果分析如下，MSm/z[M-H]-理论值为449.3，实测值为448.0，与目标产物的分子量相吻合。
上述式(IV)所示硝呋索尔半抗原的质谱检测结果如图6所示，结果分析如下，MSm/z[M+H]+理论值为356.3，实测值为357.2，与目标产物的分子量相吻合。
2、核磁共振鉴定
上述式(II)所示硝呋索尔半抗原的核磁共振检测结果如图7所示，结果分析如下，1H NMR(400MHz，dmso)δ8.83-8.78(m，1H，ArH)，8.74(s，1H，CHO),8.60-8.55(m,1H，ArH),8.09(d,J＝9.1Hz,1H,ArH),7.44(s,1H,ArH),7.17(d,J＝9.1Hz，1H,ArH),4.15(t,J＝5.9Hz，2H，CH2),2.40(t,J＝7.1Hz,2H,CH2),2.04-1.90(m,2H，CH2)；分析上述数据结果表明，所合成的产物即为目标产物。
上述式(III)所示硝呋索尔半抗原的核磁共振检测结果如图8所示，结果分析如下，NMR(400MHz,)δ8.82(d,J＝2.9Hz，1H，ArH),8.75(s,1H,CH),8.59(d,J＝3.1Hz,1H，ArH),8.10(d，J＝9.1Hz，1H，ArH)，7.43(d，J＝2.3Hz，1H,NH),7.17(dd，J＝9.2，2.3Hz，1H，ArH)，4.90(s，2H，CH2)；分析上述数据结果表明，所合成的产物即为目标产物。
上述式(IV)所示硝呋索尔半抗原的核磁共振检测结果如图9所示，结果分析如下，1H NMR(400MHz，dmso)δ8.69(d，J＝2.9Hz，1H，ArH)，8.58(d，J＝2.9Hz，1H，ArH)，3.37-3.17(t，J＝7.1Hz，2H，CH2)，2.18(t，J＝7.1Hz,2H,CH2),1.65-1.53(m,2H，CH2),1.53-1.40(m,2H,CH2),1.32(d,J＝6.9Hz,2H，CH2)；分析上述数据结果表明，所合成的产物即为目标产物。
实施例2硝呋索尔人工抗原的制备和表征
所述免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于载体蛋白的使用类型，所述免疫原载体蛋白主要采用KLH，所述包被原载体蛋白主要采用BSA，所用偶联方法为活化酯法。
一、硝呋索尔包被原的合成和鉴定
1、硝呋索尔包被原的制备
S1、将20mg实施例1制备得到的式(II)所示化合物溶于2mL DMF中，加入10mg NHS和10mg DCC，室温下搅拌过夜，得到溶液I；
S2、将7mg BSA加入7mL PBS缓冲液中，充分溶解，即为溶液II；
S3、将溶液I缓慢滴加至溶液II中，缓慢4℃搅拌24h后装入透析袋，在生理盐水中4℃透析72h(中间换水6次)，得到硝呋索尔包被原溶液，-20℃保存。
以上式(II)所示化合物合成的硝呋索尔包被原简称DNSH①-BSA。
类似地，采用上述方法制备式(III)、式(IV)所示化合物合成的硝呋索尔包被原，分别简称DNSH②-BSA、DNSH③-BSA。
2、硝呋索尔包被原的鉴定
用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)法分别测定DNSH①-BSA溶液、DNSH②-BSA溶液和DNSH③-BSA溶液中BSA与半抗原的结合比。
结合比＝[M(偶联物)-M(蛋白质)]/M(半抗原)。
式(II)中半抗原的分子量为477.3，载体BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图10所示)分子量为64356.34，偶联物DNSH①-BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图11所示)分子量为67395.157，偶联物的分子量高于载体蛋白BSA的分子量，说明DNSH①-BSA合成成功。
经计算得出，BSA与半抗原的结合比为6.4，即DNSH①-BSA中一个BSA分子上平均偶联6.4个半抗原。
式(III)半抗原的分子量为449.3，载体BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图10所示)分子量为64356.34，偶联物DNSH②-BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图12所示)分子量为67280.73，偶联物的分子量高于载体蛋白BSA的分子量，说明DNSH②-BSA合成成功。
经计算得出，BSA与半抗原的结合比为6.5，即DNSH②-BSA中一个BSA分子上平均偶联6.5个半抗原。
式(IV)中半抗原的分子量为356.3，载体BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图10所示)分子量为64356.34，偶联物DNSH③-BSA的MALDI-TOF-MS(结果如图13所示)分子量为67584.60，偶联物的分子量高于载体蛋白BSA的分子量，说明DNSH③-BSA合成成功。
经计算得出，BSA与半抗原的结合比为9.1，即DNSH③-BSA中一个BSA分子上平均偶联9.1个半抗原。
二、硝呋索尔免疫原的合成
1、硝呋索尔免疫原的制备
制备方法与上述硝呋索尔包被原的制备方法类似，区别在于，用KLH代替BSA。
式(II)、式(III)和式(IV)所示化合物合成硝呋索尔免疫原分别简称DNSH①-KLH、DNSH②-KLH和DNSH③-KLH。
实施例3硝呋索尔单克隆抗体的制备
一、动物免疫
将实施例2制备的DNSH①-KLH、DNSH②-KLH和DNSH③-KLH溶液分别免疫Balb/c小鼠，每只小鼠单次免疫100μg，共免疫4次，每次间隔三周，前三次的免疫方式为颈背部皮下多点注射，最后一次的免疫方式为腹膜内注射。
二、细胞融合与克隆化
1、硝呋索尔代谢物DNSH对DNSH③-KLH溶液免疫的Balb/c小鼠抗血清抑制率高，因此本研究使用DNSH③-KLH免疫过的Balb/c小鼠进行细胞融合实验。
2、第四次免疫3天后，取脾细胞，按5∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。
3、利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到可以分泌硝呋索尔单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将一株杂交瘤细胞株命名为抗硝呋索尔单克隆抗体杂交瘤细胞3H10(简称杂交瘤细胞3H10)。
三、细胞冻存和复苏
用冻存液将杂交瘤细胞3H10制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。
四、单克隆抗体的制备与纯化
1、腹水制备
Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.5mL/只)。7天后腹腔注射杂交瘤细胞3H10(5×105个/只)。7天后采集腹水。
2、抗体纯化
用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。
五、单克隆抗体的鉴定
将步骤四得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定：
1、利用间接ELISA法测定单克隆抗体的效价
(1)用DNSH③-BSA作为包被原包被酶标板
采用实施例2制备的DNSH③-BSA溶液(用碳酸盐缓冲液稀释)进行包被，稀释为系列浓度，每一浓度包被一行，100μL/孔。
(2)37℃孵育2h。
(3)封闭并洗板。
(4)每孔加入100μL系列浓度的单克隆抗体溶液(用PBS缓冲液进行稀释)。
(5)37℃孵育30min，洗板。
(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5000)，37℃孵育30min。
(7)洗板。
(8)加入TMB显色液，避光显色15min。
(9)每孔加入50μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
判定结果：以OD450值为1.6时对应的抗体稀释度初步作为抗体的效价。
采用间接ELISA法检测抗体的效价为1∶27000。
2、单克隆抗体灵敏度的计算
(1)采用实施例2制备的DNSH③-BSA溶液(用碳酸盐缓冲液进行稀释)进行包被，100μL/孔。
(2)37℃孵育2h。
(3)封闭并洗板。
(4)每孔加入50μL DNSH(或NPDNSH或Nifursol)标准品溶液(由标准品和PBS缓冲液组成；标准品的浓度分别为0.03ng/mL、0.09ng/mL、0.27ng/mL、0.81ng/mL、2.43ng/mL、7.29ng/mL、21.87ng/mL；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。
(5)每孔加入50μL单克隆抗体溶液。
(6)37℃孵育30min，洗板。
(7)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5000)，37℃孵育30min。
(8)洗板。
(9)加入TMB显色液，避光显色15min。
(10)每孔加入50μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
以－log10(标准品浓度)值为横坐标，以OD值为纵坐标，利用Origin 8.5的四参数方程进行拟合，建立标准曲线获得IC50值，如图14所示。单克隆抗体检测DNSH的灵敏度(IC50值)为0.91ng/mL，检测NPDNSH、Nifursol的灵敏度(IC50值)分别为0.72、0.85ng/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种硝呋索尔半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：
Figure FDA0003023064720000011
其中，R为
Figure FDA0003023064720000012
2.权利要求1所述硝呋索尔半抗原的制备方法，其特征在于，当R为
Figure FDA0003023064720000013
时，其制备方法包括：
(1)3,5-二硝基水杨酸和浓硫酸经过回流反应得到3,5-二硝基水杨酸甲酯；
(2)将3,5-二硝基水杨酸甲酯、NaOH和水合肼在70～75℃反应5～6h后调节pH至酸性，得到3,5-二硝基水杨酰肼；
(3)5-羟基-2硝基苯甲醛、4-溴丁酸乙酯和碳酸钾反应得到3-醛基-4硝基苯氧丁酸乙酯；
(4)将3-醛基-4硝基苯氧丁酸乙酯和NaOH在30～35℃反应2～3h后调节pH至酸性得到3-醛基-4硝基苯氧丁酸；
(5)3-醛基-4硝基苯氧丁酸和3,5-二硝基水杨酰肼反应得到所述硝呋索尔半抗原；
当R为
Figure FDA0003023064720000021
时，其制备方法包括：
(1)3,5-二硝基水杨酸和浓硫酸经过回流反应得到3,5-二硝基水杨酸甲酯；
(2)将3,5-二硝基水杨酸甲酯、NaOH和水合肼在70～75℃反应5～6h后调节pH至酸性，得到3,5-二硝基水杨酰肼；
(3)5-羟基-2硝基苯甲醛、2-溴乙酸乙酯和碳酸钾反应得到3-醛基-4硝基苯氧乙酸乙酯；
(4)将3-醛基-4硝基苯氧乙酸乙酯和NaOH在30～35℃反应2～3h后调节pH至酸性得到3-醛基-4硝基苯氧乙酸；
(5)3-醛基-4硝基苯氧乙酸和3,5-二硝基水杨酰肼反应得到所述硝呋索尔半抗原；
当R为
Figure FDA0003023064720000022
时，其制备方法包括：
(1)3,5-二硝基水杨酸和浓硫酸经过回流反应得到3,5-二硝基水杨酸甲酯；
(2)将3,5-二硝基水杨酸甲酯、NaOH和水合肼在70～75℃反应5～6h后调节pH至酸性，得到3,5-二硝基水杨酰肼；
(3)3,5-二硝基水杨酰肼与6-溴己酸乙酯在35～40℃反应24～28h得到6-(3,5-二硝基水杨酰肼基)溴己酸乙酯；
(4)将6-(3,5-二硝基水杨酰肼基)溴己酸乙酯与NaOH在30～35℃反应2～3h，调节pH至酸性得到所述硝呋索尔半抗原。
3.一种人工抗原，其特征在于，所述人工抗原由权利要求1所述硝呋索尔半抗原制备得到。
4.根据权利要求3所述的人工抗原，其特征在于，所述人工抗原由权利要求1所述硝呋索尔半抗原和载体蛋白偶联得到；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述硝呋索尔半抗原或权利要求3或4所述人工抗原。
6.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株以权利要求3或4所述人工抗原为免疫原制备得到。
7.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求6所述杂交瘤细胞株分泌得到。
8.权利要求1所述硝呋索尔半抗原，或权利要求3或4所述人工抗原，或权利要求5所述试剂盒，或权利要求7所述单克隆抗体在检测硝呋索尔或其衍生物中的应用；优选地，所述衍生物为3,5-二硝基水杨酸肼。
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