CN101419233A - 一种检测硝呋索尔代谢物的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测硝呋索尔代谢物的试剂盒，包括盒体、特异性抗体溶液、3，5－二硝基水杨酸肼(DNSH)标准溶液，酶标板、样品稀释液、洗涤液、二抗溶液、显色液A液、显色液B液和终止液。待测样品经过盐酸水解，乙醚脱脂，甲醇去蛋白，样品稀释液复溶等样品前处理步骤后，使用本试剂盒进行分析。本发明所述试剂盒适用于检测硝呋索尔代谢物具有前处理简单，快速，高通量，廉价等优点，最低检测限为0.1ng/mL。

Description

一种检测硝呋索尔代谢物的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于免疫化学分析领域，具体涉及一种分析检测硝呋索尔代谢物的酶联免疫试剂盒及其使用方法。

背景技术

硝呋索尔是一种硝基呋喃类药物，它有非常好的抗菌作用，除了作为一种抗生素被应用于兽医医疗中外，它还曾作为猪，禽与水产品生长促进剂被广泛使用。但因为其可能的不安全因素，欧盟于2002年立法禁止其在动物源性食品中的使用。研究证明硝呋索尔对光敏感，代谢快速，在动物体内若干小时就能迅速代谢，代谢物为3，5-二硝基水杨酸肼(DNSH)，该化合物能在体内停留较长时间。所以分析硝呋索尔主要目标物为其代谢物。

测定动物源性食品中的DNSH残留量，目前国内报道的检测方法主要有液-质联用(LC-MS)；高效液相-质谱联用法(HPLC-MS)。仪器法是一种精确，稳定的确证方法，但具有成本高，低通量，前处理烦琐，操作复杂等缺点，不易广泛普及。随着我国与欧盟农产品贸易的不断增长，对硝呋索尔的检测要求也不断增加。仪器法显然无法应对大批量样品短时间的快速检测。酶联免疫方法能弥补仪器法的上述缺点，做为仪器法的补充，被广泛运用于小分子农兽药残留的检测。作为商品化的硝呋索尔酶联免疫检测试剂盒，因其具有较高的稳定性和灵敏度以及方便的操控性，如果能够研究开发出来，将在硝呋索尔检测中发挥重要作用。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有技术的不足，提供一种检测硝呋索尔代谢物的试剂盒，可实现大批量样品短时间的快速检测，具有较高的稳定性和灵敏度。

本发明的另一个目的是提供所述试剂盒的使用方法，使用简单，操作方便。

本发明的目的通过以下具体技术方案来予以实现：

提供一种适用于检测硝呋索尔代谢物的酶联免疫试剂盒，包括盒体、特异性抗体溶液、3，5-二硝基水杨酸肼(DNSH)标准溶液，酶标板、样品稀释液、洗涤液、二抗溶液、显色液A液、显色液B液和终止液，所述特异性抗体溶液为经过稀释的兔抗3，5-二硝基水杨酸肼(DNSH)抗体溶液，所述酶标板为孔内包被有3，5-二硝基水杨酸与卵清蛋白偶连物的ELISA板条，所述二抗溶液为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体稀释液。

所述酶标板孔内包被的3，5-二硝基水杨酸与卵清蛋白偶联物是由3，5-二硝基水杨酸与卵清蛋白通过活泼酯法交联后，透析纯化的产物，具有式(I)所示的结构：

所述特异性抗体溶液是由3，5-二硝基水杨酸肼和乙醛酸反应，所得产物偶连牛血清蛋白得到偶连物，其结构如式(II)所示，偶连物经透析纯化，免疫实验用兔，纯化兔血清，调配成抗体溶液，本发明实施例中抗体溶液以1g/L浓度分装。所述偶连物结构如式(II)所示：

本发明同时提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理；

(2)溶解有步骤(1)处理的样品的抗体稀释液50μL，加入50μL特异性抗体溶液，室温反应30min，洗涤液洗涤，拍干；

(3)加入二抗稀释液100μL，室温反应20min，洗涤液洗涤，拍干；

(4)加入将显色A液和显色B液现配的显色液100μL，室温蔽光显色10min；

(5)加入终止液体50μL，测定OD₄₅₀值；利用标准品做出标准曲线，通过标准曲线算出样品中硝呋索尔代谢物的含量。

步骤(1)所述样品为动物肌肉、肝脏等，样品前处理包括盐酸水解、乙醚脱脂、甲醇去蛋白、样品稀释液复溶等步骤。具体操作是在玻璃试管中加入1g样品，0.9mL蒸馏水，0.1mL1M的盐酸，振荡10min，10000rpm离心2min，吸取上清液混合1mL的乙醚，振荡60s，10000rpm离心2min。去除有机层；水层用氮气吹干，加入2mL甲醇，振荡10min后10000rpm离心2min，用氮气吹干甲醇，加入0.5mL样品稀释液。该稀释液用于酶联免疫(ELISA)分析。

步骤(4)所述显色液中显色A液体：显色B液的体积比为1：1。

本发明的有益效果是：

本发明设计半抗原制备的免疫原免疫产生的抗体具有灵敏度高，特异性好等优点，采用间接竞争ELISA法，实现了动物肌肉、肝脏中硝呋索尔代谢物的快速批量检测。本发明样品前处理简单，操作快速，高通量；本发明试剂盒具有较高的稳定性和灵敏度，最低检测限为0.1ng/mL，并且成本较低，完全可作为商品化的硝呋索尔酶联免疫检测试剂盒，将在硝呋索尔检测中发挥重要作用。

附图说明

图1DNSH的间接竞争ELISA标准曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1 半抗原的合成

将0.11g乙醛酸溶解于10mL甲醇中，加入3，5-二硝基水杨酸肼(DNSH)0.24g，搅拌3h，过滤并甲醇洗涤沉淀，得到半抗原DNSHA0.21g，产率72％。APCI-MS m/z：297[M-H]^-.APCI-MS/MS m/z：281[M-OH]^-；281(M-OH)；226(M-NCHCOOH)；210(M-H⁺-NHNCHCOOH)；183(M-H⁺-2CONHNCHCOOH)。¹H NMR(600MHz，d₆-DMSO，TMS)：δ 14.13(s，1H)；8.78(d，J＝3.0Hz，1H)；8.580(d，J＝3.0Hz，1H)；7.95(s，1H)；7.70(s，1H)。

实施例2 抗原的合成

取半抗原DNSHA0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液；称取BSA140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMF1 mL，搅拌溶解制备B液；磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换3次透析液，得到的全抗原DNSHA-BSA以1g/L浓度分装，冻存于-20℃冰箱中，供免疫用。制备的全抗原DNSHA-BSA结构式为：

实施例3 包被原的合成

取3，5-二硝基水杨酸(DNSA)0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液；称取BSA140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMF1 mL，搅拌溶解制备B液；磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换3次透析液，得到的包被原DNSA-OVA以1g/L浓度分装，冻存于-20℃冰箱中，供包被用。

制备的包被原DNSA-OVA结构式为：

实施例4 抗体的制备

多克隆抗体的制备：人工免疫抗原免疫新西兰大白兔，采用背部多点免疫法，首次用弗氏完全佐剂乳化，间隔4周，以后免疫每隔两周免疫，用弗氏不完全佐剂乳化，免疫三次。最后一次免疫后7天心脏采血，离心保留血清。用辛酸-硫酸铵法纯化。抗体经冷冻干燥，存放于-20℃冰箱中。间接竞争ELISA测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血清的测定值为准，测得抗体的阳性滴度为1:320000。

实施例5 本发明方法灵敏度的测定

采用方阵滴定法确定抗体及各包被原工作浓度。使用最佳浓度包被的酶标板，加入50μL0.2ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL的代谢物，50μL最佳工作浓度的抗体。37℃水浴温育1h。洗涤三次后拍干，加入一定浓度羊抗兔IgG-HRP，每孔100μL，37℃水浴中温育1h。洗涤三次拍干，加入四甲基联苯胺(TMB)底物溶液，每孔100μL，室温避光显色15min，向每孔中加入50μL止液，测读各孔450nm处吸光值。DNSH的间接竞争ELISA标准曲线见附图1，其IC₅₀为5.6ng/mL，最低检测限为0.1ng/mL。

实施例6 方法特异性测定

将呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因配成不同浓度溶液，测定其交叉反应率，结果见表1，发现与同类药物无交叉反应。

表1.交叉反应试验结果

以上实验结果说明由所设计半抗原制备的免疫原免疫产生的抗体具有灵敏度高，特异性好等优点。

实施例7 样品前处理

在玻璃试管中加入1g样品，0.9mL蒸馏水，0.1mL1M的盐酸。振荡10min，10000rpm离心2min，吸取上清液混合1mL的乙醚，振荡60s，10000rpm离心2min，去除有机层，水层用氮气吹干，加入2mL甲醇，振荡10min后10000rpm离心2min，用氮气吹干甲醇，加入0.5mL样品稀释液。该稀释液用于酶联免疫(ELISA)分析。

实施例8 试剂盒精密度的检测

按照本试剂盒的使用方法测定标准溶液，做6个重复，以吸光值计算变异系数，结果见表2：

表2  icELISA方法的批内和批间误差(n＝6)

实施例9 试剂盒对实际样品的检测结果

表3icELISA方法检测加标鱼肉，虾肉样品的检测结果和回收率(n＝6)

本试剂盒选用不含DNSH的鱼，虾肉，添加DNSH标样，评价试剂盒对实际样品检测能力。表3显示其平均添加回收率为60.0～79.0％之间。本发明方法在对所有低药物浓度样品均能检出阳性，阴性样品无假阳性，说明本方法具有初步筛选所要求的稳定性，能够准确筛选出阳性样品。

Claims (6)

1、一种检测硝呋索尔代谢物的试剂盒，包括盒体、特异性抗体溶液、3，5-二硝基水杨酸肼(DNSH)标准溶液，酶标板、样品稀释液、洗涤液、二抗溶液、显色液A液、显色液B液和终止液，其特征在于所述特异性抗体溶液为经过稀释的兔抗3，5-二硝基水杨酸肼(DNSH)抗体溶液，所述酶标板为孔内包被有3，5-二硝基水杨酸与卵清蛋白偶连物的ELISA板条，所述二抗溶液为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体稀释液。

2、根据权利要求1所述检测硝呋索尔代谢物的试剂盒，其特征在于所述酶标板孔内包被的3，5-二硝基水杨酸与卵清蛋白偶联物是由3，5-二硝基水杨酸与卵清蛋白通过活泼酯法交联后，透析纯化的产物，具有式(I)所示的结构：

3、根据权利要求1所述检测硝呋索尔代谢物的试剂盒，其特征在于所述特异性抗体溶液是由3，5-二硝基水杨酸肼和乙醛酸反应，所得产物偶连牛血清蛋白得到偶连物，偶连物经透析纯化，免疫实验用兔，纯化兔血清，调配成抗体溶液；所述偶连物结构如式(II)所示：

4、一种权利要求1所述检测硝呋索尔代谢物的试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品前处理；

(2)溶解有步骤(1)处理的样品的抗体稀释液50μL，加入50μL特异性抗体溶液，室温反应30min，洗涤液洗涤，拍干；

(3)加入二抗稀释液100μL，室温反应20min，洗涤液洗涤，拍干；

(4)加入将显色A液和显色B液现配的显色液100μL，室温蔽光显色10min；

(5)加入终止液体50μL，测定OD₄₅₀值；利用标准品做出标准曲线，通过标准曲线算出样品中硝呋索尔代谢物的含量。

5、根据权利要求4所述检测硝呋索尔代谢物的试剂盒的使用方法，其特征在于步骤(1)所述样品前处理包括盐酸水解、乙醚脱脂、甲醇去蛋白和样品稀释液复溶步骤。

6、根据权利要求4所述检测硝呋索尔代谢物的试剂盒的使用方法，其特征在于步骤(4)所述显色液中显色A液体：显色B液的体积比为1：1。

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