CN113209177A - 超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种柑橘皮中提取黄酮类化合物的方法及其功能的研究。本发明公开了一种超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：新鲜的柑橘皮经干燥、粉碎，得柑橘皮粉；在柑橘皮粉中加入乙醇溶液后进行超声提取，得到黄酮粗提液；再使用大孔树脂纯化柑橘皮中的黄酮类化合物，得含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物。该含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物，不仅具有高体外抗氧化活性，还能高效降糖、降脂，还能与肠道菌群高效发酵，提高肠道微生物多样性。

Description

超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种柑橘皮中提取黄酮类化合物的方法及其功能的研究。

背景技术

中国柑橘资源丰富、种类齐全。“柑橘”并不局限于字面上的“柑”和“橘”，而是芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Auramtioideae)下的一类植物。据统计，我国近5年柑橘平均年产量超过3500万吨，产生的柑橘加工副产物约占总产量的三分之一，总价值高达350亿～400亿元。然而，我国在柑橘加工副产物利用技术方面较为薄弱，尚不能充分实现柑橘副产物的高值化利用。除小部分柑橘加工副产物用作开发畜禽饲料、生产有机肥和制取香精油外，大部分被填埋处理。

目前，柑橘黄酮的提取方法主要包括有机溶剂提取法、超临界萃取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法等。其中，超声辅助提取法是在溶剂提取的基础上辅助超声波处理的方法，提取物质之所以得到充分扩散、溶解，主要是靠超声波产生的可破碎植物细胞壁的空化效应、帮助有效成分溶出的热效应、强化介质扩散的机械效应。这种方法可以在较为温和的条件下，获得较高的提取率；操作简单、快速；能很好地保持天然活性成分的生物活性。为了提高提取物的纯度，通常会采用一系列纯化技术，如纯化膜分离技术、柱层析法以及大孔树脂技术等，由于大孔吸附树脂具有价廉、吸附性能好、能反复使用等优点，被广泛应用于分离纯化植物活性成分。

黄酮类化合物是一类重要的含氧杂环天然有机化合物，广泛存在于一些植物和浆果中，在柑橘皮中已经鉴定出60多种黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶、结合胆酸盐、调节肠道微生态等能力，对提高机体氧化应激能力、增加胰岛素敏感性、降血脂作用、维持肠道健康等将发挥积极作用。国内外研究表明，柑橘黄酮类化合物在疾病治疗和膳食健康方面发挥着重要作用。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种高提取率的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法。

为了解决上述问题，本发明提供一种超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法(利用超声辅助有效提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法)，包括以下步骤：

1)、原材料预处理：

新鲜的柑橘皮经干燥、粉碎(过40目筛)，得柑橘皮粉；

2)、利用超声辅助法提取柑橘皮中黄酮类化合物：

2.1)、称取柑橘皮粉1g，按照1g/40～45mL的料液比，加入体积浓度为50～55％的乙醇溶液，充分混匀；

2.2)、混合液超声处理：

将步骤2.1)所得的混合液超声提取后，离心，离心所得上清液用滤膜抽滤(从而除去杂质)，得滤液；

超声提取的功率为325±25W，超声时间17±2min；

2.3)、定容：

在步骤2.2)所得的滤液中加入体积浓度为58～62％的乙醇溶液定容至100mL，得到黄酮粗提液；

3)、使用大孔树脂纯化柑橘皮中的黄酮类化合物：

3.1)、柑橘果皮黄酮粗提液前处理：

先将黄酮粗提液进行浓缩(例如浓缩至原体积的1/8)，再加入体积浓度≥95％的乙醇溶液或乙醇，从而使所得液中乙醇浓度≥80％(体积％)，接着静置(4℃静置12h)，弃沉淀，取上清，将上清液减压浓缩至无醇味，得前处理后黄酮粗提液；

3.2)、大孔树脂(称取10g大孔树脂)湿法装柱，将前处理后黄酮粗提液用超纯水配成100～120μg/mL浓度后上样，动态吸附(1.5±0.5mL/min的流速动态吸附2.5±0.5h)，然后利用体积浓度48～52％的乙醇溶液进行洗脱，得洗脱液；

3.3)、将洗脱液经减压浓缩至无醇味后，真空冷冻干燥，得含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物。

作为本发明的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法的改进，步骤1)还包括将柑橘皮粉进行冷冻干燥：

取柑橘皮粉-80±10℃预冻6±0.5h，然后进行真空冷冻干燥，得冻干处理后柑橘皮粉；以冻干处理后柑橘皮粉代替柑橘皮粉进行后续的步骤2)。

作为本发明的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法的进一步改进，步骤1)的真空冷冻干燥为：先于主冻干隔板温度-5℃、真空度0.1mbar冻干14h，再于隔板温度5℃、真空度为0.01mbar解析干燥10h，得冻干处理后柑橘皮粉。

说明：对粉碎后的柑橘皮粉采用上述冷冻干燥技术进行干燥，能降低柑橘皮粉中抗氧化活性物质的损失。

作为本发明的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法的进一步改进：所述步骤2.2)中，用0.22μm滤膜进行抽滤，10000±1000r/min室温离心15±5min。

作为本发明的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法的进一步改进：所述步骤3.2)中，大孔树脂型号为XAD-16，上样量为2±0.5倍柱体积，洗脱时，体积浓度48～52％的乙醇溶液的用量是4.5～5.5倍柱体积。

大孔树脂XAD-16使用前先经过常规的预处理。

作为本发明的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法的进一步改进：所述步骤3.3)的真空冷冻干燥为：先于主冻干隔板温度-5℃、真空度0.1mbar冻干14h，再于隔板温度5℃、真空度为0.01mbar解析干燥10h。

作为本发明的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法的进一步改进：所述步骤1)为：新鲜的柑橘皮经40±5℃烘干48±2h、粉碎过40目筛，得柑橘皮粉(可保存于-80℃)。

作为本发明的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法的进一步改进：所述步骤2.1)中，乙醇溶液的体积浓度为52％，料液比为1g/42mL；

所述步骤2.2)中，超声提取的功率为325W，超声时间17min；

所述步骤2.3)中，乙醇溶液的体积浓度为60％；

所述步骤3.2)中，黄酮粗提液的浓度为107μg/mL，上样体积为2倍柱体积，1.5mL/min的流速动态吸附2.5h，利用5倍柱体积的50％乙醇溶液(体积％)进行洗脱，洗脱时间为2h。

本发明所得的含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物(以下简称冷冻粉末)，可按照下述方法进行检测：

1)、取含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物(冷冻粉末)1g加入适量超纯水溶解，按照芦丁标准曲线法测定OD值，得柑橘皮中的黄酮总含量。

2)、建立HPLC方法分析柑橘皮中黄酮化合物组分及占比(即，黄酮成分的分析)：选择Sun Fire^TM C18柱(5μm，4.6×150mm)，流动相A(0.1％乙酸-水)，流动相B(纯乙腈)，流量0.7mL/min，柱温25℃，进样量20μL，检测波长283nm(黄烷酮)和330nm(多甲氧基黄酮)，梯度洗脱程序：0～5min，A 85％～75％；5～15min，A 75％～70％；15～25min，A 70％～60％；25～35min，A 60％～45％；35～40min，A 45％～40％；40～45min，A40％～85％。

在本发明中，

步骤1)所得的柑橘皮粉或冻干处理后柑橘皮粉保存于-80℃冰箱备用。

本发明的技术优势在于：

采用本发明方法所得的含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物具有高抗氧化活性，其抗氧化活性综合(antioxidant potency composite，APC)指数总体水平高，在39.69％～92.19％之间；对α-葡萄糖苷酶具有很好的抑制效果，以阿卡波糖为阳性对照，得到柑橘果皮黄酮对α-葡萄糖苷酶的相对抑制率变幅为14.69％～59.87％；对胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘胆酸钠具有较高的结合能力，吸附量范围为0.27μmol/mg～0.44μmol/mg。以上数据表明，利用本发明方法所得的含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物，不仅具有高体外抗氧化活性，还能高效降糖、降脂。

此外，本发明方法所得的含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物，能与肠道菌群高效发酵，提高肠道微生物多样性，提高肠道中双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)等有益菌属的相对丰度，并增加肠道微生物代谢的短链脂肪酸含量，特别是乙酸含量显著提高，有利于维持宿主肠道健康稳态。

综上所述，本发明解决了黄酮类化合物在提取过程中出现的提取效率低、容易失活、设备要求高等问题，为提高柑橘副产物在工业生产中得利用率奠定理论基础，以减少资源浪费。

本发明优化了超声辅助与大孔树脂分离纯化的工艺参数，提取柑橘果皮中的黄酮类化合物，实现了黄酮类化合物的高效提取，为柑橘加工副产物实现高值化利用以及深入研究柑橘果皮黄酮类化合物的功能特性奠定理论基础。

附图说明

图1是11种黄酮类化合物标准品HPLC图谱；

图1中：

a为283nm波长检测图谱，其中，峰1代表为圣草次苷(Eriocitrin)，峰2代表为芸香柚皮苷(Narirutin)，峰3代表为橙皮苷(Hesperidin)，峰4代表为香蜂草苷(Didymin)，峰5代表为枸橘柑(Poncirin)，峰6代表为柚皮素(Naringenin)，峰7代表为橙皮素(Hesperitin)；

b为330nm波长检测图谱，其中，峰8代表为甜橙黄酮(Sinensetin)，峰9代表为川陈皮素(Nobiletin)，峰10代表为桔皮素(Tangeretin)，峰11代表为去甲基川陈皮素(5-O-Demethylnobiletin)。

图2是采用DPPH、ABTS、FRAP、CUPRAC四种方法检测到的14种柑橘果皮黄酮的抗氧化活性；

图2中：

a为14种柑橘果皮黄酮对DPPH自由基的清除能力；

b为14种柑橘果皮黄酮对ABTS自由基的清除能力；

c为14种柑橘果皮黄酮对FRAP铁离子还原能力；

d为14种柑橘果皮黄酮对CUPRAC铜离子还原能力；

e为14种柑橘果皮黄酮的综合APC指数。

图3是14种柑橘果皮黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

图4是14种柑橘果皮黄酮对胆酸盐的结合能力；

图4中：

a为14种柑橘果皮黄酮对胆酸钠的结合能力；

b为14种柑橘果皮黄酮对牛磺胆酸钠的结合能力；

c为14种柑橘果皮黄酮对甘胆酸钠的结合能力。

图5是粪便样本发酵前后菌群的相对丰度(门水平)；

图5中：

Ori代表为未经发酵的原始粪便样品组；

P代表为空白组；

A～N代表为柑橘果皮黄酮在志愿者提供的肠道菌群发酵后的样品：A代表为温州蜜柑，B代表为茶枝柑，C代表为椪柑，D代表为伦晚脐橙，E代表为血橙，F代表为苹果柚，G代表为马家柚，H代表为遂川金柑，I代表为龙岩金柑，J代表为不知火，K代表为胡柚，L代表为沃柑，M代表为柠檬，N代表为佛手。

图6是粪便样本发酵前后菌群相对丰度(属水平)；

图6中：

a为3名肠型1志愿者粪便样本发酵前后组间菌群相对丰度(属水平)柱状图；

b为4名肠型2志愿者粪便样本发酵前后组间菌群相对丰度(属水平)柱状图；

Ori代表为未经发酵的原始粪便样品组；

P代表为空白组；

A～N代表为柑橘果皮黄酮在志愿者提供的肠道菌群发酵后的样品：A代表为温州蜜柑，B代表为茶枝柑，C代表为椪柑，D代表为伦晚脐橙，E代表为血橙，F代表为苹果柚，G代表为马家柚，H代表为遂川金柑，I代表为龙岩金柑，J代表为不知火，K代表为胡柚，L代表为沃柑，M代表为柠檬，N代表为佛手。

图7是发酵前后各组微生物菌落结构丰度(属水平)的LefSe(Line DiscriminantAnalysis effect size)线性判别分析；

图7中：

a为进化分支图，圆圈由内至外代表门至种的分类级别，圆点(黄色：无显著差异，其他颜色：存在组间差异)代表该水平下的一个分类；

b为LDA值分布柱状图，展示了LDA Score大于4.0的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小；

B组为添加茶枝柑果皮黄酮发酵的试验组，K组为添加胡柚果皮黄酮发酵的试验组。

图8是粪便样本体外发酵前后短链脂肪酸的含量变化；

图8中：

a为粪便样本体外发酵前后短链脂肪酸总酸含量；

b为粪便样本体外发酵前后乙酸的含量；

P代表空白组；

A～N代表柑橘果皮黄酮在志愿者提供的肠道菌群发酵后的样品：A代表为温州蜜柑，B代表为茶枝柑，C代表为椪柑，D代表为伦晚脐橙，E代表为血橙，F代表为苹果柚，G代表为马家柚，H代表为遂川金柑，I代表为龙岩金柑，J代表为不知火，K代表为胡柚，L代表为沃柑，M代表为柠檬，N代表为佛手。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

实施例1：超声提取柑橘皮黄酮类化合物

(1)、将新鲜的柑橘皮经40℃烘干48h、粉碎过40目筛后倒入玻璃培养皿，封上一层保鲜膜，并用1mL无菌注射器针头在保鲜膜上扎3到4圈小孔以便冻干时水气排出。在-80℃冰箱中预冻6h后，用真空冷冻干燥机冻干24h，真空冷冻干燥条件为：主冻干隔板温度-5℃，冻干14h，真空度0.1mbar；解析干燥阶段：隔板温度5℃，干燥10h，真空度为0.01mbar；得到冷冻干燥后的柑橘皮粉(保存于-80℃冰箱备用)。

(2)、在100mL的圆底烧瓶中称取步骤(1)所得的冷冻干燥后的柑橘皮粉1g，以1:42(g:mL)的料液比加入52％(体积％)的乙醇溶液42mL，进行超声辅助提取：功率325W，超声时间17min。

提取结束后以转速10000r/min离心15min，弃滤渣，得上清液。将上清液用0.22μm滤膜抽滤，除去杂质，取滤液盛于100mL容量瓶中，并用60％(体积％)乙醇溶液定容至100mL，，得柑橘果皮的黄酮粗提液。

可设置3个重复。

将14种柑橘的新鲜柑橘皮分别按照上述实施例1进行提取，因此分别获得14种柑橘果皮的黄酮粗提液。

实施例2：大孔树脂纯化柑橘皮黄酮类化合物：

将实施例1所得14种柑橘的柑橘果皮的黄酮粗提液分别进行如下步骤：

(1)、将黄酮粗提液浓缩至原体积的1/8，加入95％(体积％)乙醇溶液复溶至柑橘果皮黄酮粗提液的原体积；

从而使得复溶后的粗提液中乙醇浓度高于80％(约为85％)，置于4℃静置12h，弃沉淀，取上清，将上清使用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，得前处理后黄酮粗提液；旋转蒸发浓缩条件：水浴温度50℃，压力60±5mbar，旋转速度50rpm。

(2)、挑选称取10.00g的非极性XAD-16大孔树脂(比表面积为800m²/g，孔径大小为150A)预处理，预处理方式：XAD-16大孔树脂完全浸没在无水乙醇中，室温下浸泡12-14h。然后将预处理的XAD-16大孔树脂湿法装柱，将前处理后黄酮粗提液用超纯水配成浓度为107μg/mL(107μg前处理后黄酮粗提液加超纯水定容至1mL)的溶液，上样体积为2倍柱体积，1.5mL/min的流速动态吸附2.5h。

说明：1nm＝10A。

将吸附过后的树脂放于锥形瓶中，加入5倍柱体积的50％(体积％)乙醇溶液，洗脱2h。

(3)、所得的洗脱液使用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，得浓缩后的洗脱液。旋转蒸发浓缩条件：水浴温度50℃，压力60±5mbar，旋转速度50rpm，

(4)、将浓缩后的洗脱液在-80℃冰箱中预冻6h后，真空冷冻干燥24h，真空冷冻干燥条件：主冻干隔板温度-5℃，冻干14h，真空度0.1mbar；解析干燥阶段：隔板温度5℃，干燥10h，真空度为0.01mbar。

所得冻干粉即为含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物。

因此，分别得14种含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物。

实施例3：柑橘皮黄酮总含量及黄酮类化合物组分测定

(1)、称取芦丁标准品2mg，转移至10mL容量瓶中，加入70％乙醇溶液定容，得到200μg/mL的标准溶液。稀释成3.125μg/mL～100μg/mL范围内不同质量浓度的系列标准溶液，将系列标准溶液分别进行以下操作：

取1mL系列标准溶液于10mL比色管，加入1mL 60％(体积％)乙醇溶液，再加入0.3mL质量浓度为0.05g/mL的亚硝酸钠溶液(称取5g亚硝酸钠加入100mL容量瓶中，再用超纯水定容致100mL)，震荡混匀，反应6min，加入0.3mL质量浓度为0.10g/mL的硝酸铝溶液(称取10g亚硝酸钠加入100mL容量瓶中，再用超纯水定容致100mL)，震荡混匀，静置6min，最后加入2mL质量浓度为0.04g/mL的氢氧化钠溶液(称取4g亚硝酸钠加入100mL容量瓶中，再用超纯水定容致100mL)。混匀后静置10min，取200μL于510nm测定OD值，平行试验3次。以芦丁浓度为横坐标，测得的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程：y＝0.0057x-0.0023，相关系数R²＝0.9997，线性良好。以此对14种柑橘果皮的总黄酮含量进行计算。即，以芦丁为标准物，选用高效液相色谱法(紫外检测器)来测样品中的总黄酮及黄酮成分。

(2)、高效液相色谱(HPLC)分析柑橘皮黄酮类化合物组分及含量。

(2.1)、称取含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物0.1g，充分溶解于2mL甲醇-水(1:1，V/V)溶液，使用一次性0.22μm针头式过滤器过滤至液相进样瓶中待用；

选择Sun Fire^TM C18柱(5μm，4.6×150mm)，流动相A(0.1％乙酸-水)，流动相B纯乙腈，流量0.7mL/min，柱温25℃，进样量20μL，在检测波长283nm(黄烷酮)和330nm(多甲氧基黄酮)建立HPLC分析柑橘果皮黄酮组分和含量的方法：0～5min，A 85％～75％；5～15min，A75％～70％；15～25min，A 70％～60％；25～35min，A 60％～45％；35～40min，A 45％～40％；40～45min，A 40％～85％。

(2.2)、称取11种黄酮类化合物标准品(圣草次苷、芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、枸橘柑、柚皮素、橙皮素、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、去甲基川陈皮素)各2mg，转移至10mL容量瓶中，加入70％乙醇溶液定容，得到200μg/mL的标准溶液，按照上述(2.1)所述方法并在283nm和330nm波长下对11种标准溶液进行检测，检测得到的HPLC色谱图如图1a、1b所示，由图1可知，这11种黄酮类化合物标准物质在45min内可以较好的分离，峰形良好，满足有效检测黄酮类化合物的条件，可以用来定性。

(2.3)、将(2.2)制得的11种黄酮类化合物的标准溶液稀释成3.125μg/mL～100μg/mL范围内不同质量浓度的标准溶液，取1mL标准溶液于10mL比色管，加入1mL 60％乙醇溶液，再加入0.3mL亚硝酸钠溶液，震荡混匀，反应6min，加入0.3mL硝酸铝溶液，震荡混匀，静置6min，最后向各管加入2mL氢氧化钠溶液，混匀后静置10min，取200μL于510nm测定OD值，平行试验3次。以11种黄酮类化合物浓度为横坐标，测得的OD值为纵坐标，绘制标准曲线。表1列出了11种黄酮类化合物标准品回归方程、相关系数及保留时间，各标准品含量与相应峰面积线性关系良好，满足定量要求。

表1、黄酮类化合物标准曲线的回归方程和相关系数

(3)、将实施例2所得的14种含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物(以下简称冻干粉末)分别进行如下检测，

(3.1)、称取冻干粉末2mg，转移至10mL容量瓶中，加入70％(体积％)乙醇溶液定容，得到200μg/mL的标准溶液。稀释成3.125μg/mL～100μg/mL范围内不同质量浓度的标准溶液，取1mL标准溶液于10mL比色管，加入1mL 60％(体积％)乙醇溶液，再加入0.3mL亚硝酸钠溶液，震荡混匀，反应6min，加入0.3mL硝酸铝溶液，震荡混匀，静置6min，最后向各管加入2mL氢氧化钠溶液，混匀后静置10min，取200μL于510nm测定OD值，再根据上述得到的芦丁标准曲线对黄酮总含量进行测定，得出各柑橘果皮总黄酮含量在103.48±0.68mg/g～27.62±1.25mg/g之间，以柠檬样品中最多，佛手样品中最少，如下表2所述。采用超声辅助提取结合大孔树脂纯化的方法可实现柑橘副产物果皮中黄酮类化合物的有效提取分离，同时，桑叶、金银花叶总黄酮经此工艺流程也可实现富集。

(3.2)、称取通过实施例2所制得的14种含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物(以下简称冻干粉末)各0.1g，充分溶解于2mL甲醇-水(1:1)溶液，使用一次性0.22μm针头式过滤器过滤至液相小瓶中待用。按上述步骤(2)中建立的HPLC分析柑橘果皮黄酮组分和含量的方法，结合步骤(2)中得到的11种黄酮类化合物标准品HPLC色谱图和回归方程，于283nm和330nm波长下分析样品中黄烷酮和多甲氧基黄酮组分含量。得到的结果如表2所示，表2中列出了供试柑橘果皮中7种黄烷酮类物质的含量，其中圣草次苷、芸香柚皮苷和橙皮苷在14个品种的柑橘果皮中均能检测到，不同供试样品中黄烷酮类化合物的组分含量存在显著性差异(p<0.05)。供试样品柠檬的圣草次苷含量显著高于其他品类样品(p<0.05)，为26.103±0.218mg/g DW，橘类、杂柑类和金柑类果皮中的圣草次苷含量显著高于橙类、柚类；温州蜜柑中芸香柚皮苷的含量最高(85.262±1.229mg/g DW)，其次为茶枝柑、不知火、椪柑、沃柑和胡柚，含量变化在44.054±0.257～73.703±0.414mg/g DW之间，2种柚类果皮中检测到的含量较少；柠檬果皮中橙皮苷含量(53.791±0.273mg/g DW)显著高于其他柑橘果皮样品(p<0.05),橙类果皮样品的含量次之，含量在36.520±0.806～42.484±1.352mg/g DW范围内，其余样品中橙皮苷含量相对较低；供试样品中金柑类柑橘果皮中检测到的香蜂草苷含量相对较高，与其它样品之间存在显著性差异(p<0.05)；枸橘苷仅在金柑类样品中检出；柚皮素含量最多的是马家柚(6.520±0.079mg/g DW)；检测到的橙皮素的含量变化在0.024±0.002～1.300±0.090mg/g DW范围内，以血橙含量最高，柠檬含量最低。

表2、14种不同地区的柑橘皮黄酮类化合物组分及含量

将实施例2所得的14种含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物(以下简称冻干粉末)分别进行如下实验。

实验1：柑橘皮黄酮抗氧化能力测定

一、抗氧化试验所需要溶液的配制

0.2mM DPPH溶液：称取0.0394g DPPH粉末无水乙醇溶解后转移至500mL棕色容量瓶，无水乙醇定容，注意避光，现用现配。

0.01M CuCl₂·2H₂O：称取0.4262g CuCl₂·2H₂O固体少量超纯水溶解后转移至250mL容量瓶中，加水定容。

1M乙酸铵缓冲液：称取19.27g乙酸铵固体加超纯水溶解，调pH＝7，转移至250mL容量瓶定容。

0.075M Neocuproine溶液：称取0.039g Neocuproine粉末加入少许96％乙醇溶液溶解，定容至25mL容量瓶。

二、抗氧化试验四种方法

DPPH法：取80μL样品液(5mg/mL)与1mL DPPH(0.2mM)涡旋震荡混匀，室温避光反应30min，517nm下测定OD值。

ABTS法：参考购买于南京建成生物工程研究所的ABST试剂盒提供的试验方法，在96孔板中加入混合后的ABTS工作液180μL，再加入10μL样品液(5mg/mL)，室温反应6min，405nm处测定OD值。

FRAP法：参考购买于南京建成生物工程研究所的FRAP试剂盒提供的试验方法，在96孔板上依次加入FRAP工作液180μL、样品液(5mg/mL)5μL，37℃恒温水浴5min，593nm处测定OD值。

CUPRAC法：依次取500μL CuCl₂·2H₂O(0.01M)、500μL Neocuproine溶液(0.075M)、500μL乙酸铵缓冲液(1M)和60μL样品液(5mg/mL)加入试管，涡旋震荡混匀，室温暗处反应1h取200μL加入96孔板于450nm测OD值。

采用DPPH、ABTS、FRAP、CUPRAC方法对14种由实施例2制得的柑橘果皮冻干粉沫(温州蜜柑、茶枝柑、椪柑、伦晚脐橙、血橙、苹果柚、马家柚、遂川金柑、龙岩金柑、不知火、胡柚、沃柑、柠檬、佛手)中的总黄酮进行抗氧化活性评价，结果如图2a、2b、2c、2d所示。

由DPPH自由基清除试验可知不同品种的柑橘果皮黄酮类化合物的抗氧化能力存在显著性差异(p<0.05)，供试样品中DPPH清除能力最高的是温州蜜柑(55.12±0.08mg TE/g DW)，是最低值佛手的3.15倍。橙类、橘类、杂柑类和金柑类的DPPH清除能力显著高于柚类。在ABTS方法中测得柚类的抗氧化能力较高，马家柚的ABTS值为22.35±0.11mg TE/gDW，是供试样品中ABTS自由基清除能力最强的，其次是苹果柚、椪柑、胡柚和伦晚脐橙，ABTS测定值的变化范围在21.04±0.16～21.42±0.08mg TE/g DW之间，其抗氧化能力不存在显著性差异(p>0.05)，抗氧化能力最弱的是佛手，仅有15.85±0.09mg TE/g DW。FRAP铁离子还原能力试验可以看出14种柑橘果皮黄酮的FRAP值的变化范围在23.78±0.56～88.84±1.13mg TE/g DW内，其中茶枝柑的铁离子还原能力最强，佛手的铁离子还原能力最弱，橘类、橙类和杂柑类样品的铁离子还原能力要强于柚类和金柑类样品。CUPRAC铜离子还原能力试验结果表明，柠檬样品对铜离子还原能力最强，达到了29.35±0.13mg TE/g DW，其次是胡柚、茶枝柑等橘类、杂柑类和橙类样品，铜离子还原能力变化范围为18.87±0.12～27.04±0.35mg TE/g，不足柠檬样品的三分之一。

在DPPH、ABTS、FRAP、CUPRAC四种方法评价14种柑橘果皮总黄酮抗氧化能力强弱的基础上，利用抗氧化活性综合APC指数(Antioxidant potency composite index)，APC指数＝(测定值/测定最大值)×100％，对供试样品总黄酮的抗氧化活性进行评价，结果如图2e所示。14种供试样品综合APC指数在92.19％～39.69％之间，其中，胡柚果皮DPPH、ABTS、FRAP和CUPRAC综合APC指数均大于84％，平均综合APC指数排名第一，表明其综合抗氧化能力在供试样品中最强，佛手综合APC指数最低，表明综合抗氧化活性最弱。

实验2：柑橘果皮黄酮降血糖能力测定

一、α-葡萄糖苷酶抑制试验所需溶液的配制

0.1M PB(pH＝6.8)的配制：称取31.20g NaH₂PO₄·2H₂O粉末加800mL超纯水溶解，定容至1L，得到0.2M NaH₂PO₄·2H₂O溶液(A液)；称取71.63g Na₂HPO₄·12H₂O粉末，加入800mL超纯水溶解，转移到1L容量瓶中并定容(B液)。量取A液51mL，B液49mL，加水稀释至200mL，即为0.1M PB(pH＝6.8)。

5mM pNPG溶液：称取150.63mg pNPG粉末，加入少许0.1M PB(pH＝6.8)溶解后转移至100mL容量瓶定容。

0.2M Na₂CO₃溶液：称取Na₂CO₃粉末2.12g加入少量超纯水溶解，转移至100mL容量瓶加水定容至刻度。

0.01M阿卡波糖母液：称取阿卡波糖64.6mg,0.1M PB(pH＝6.8)定容至10mL容量瓶，置于4℃冰箱备用。

二、柑橘果皮黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制能力

称取通过实施例2所制得的14种柑橘果皮黄酮粉末各20mg，充分溶解于2mL甲醇-水(1:1)溶液，使用一次性0.22μm针头式过滤器过滤至液相小瓶中待用，即得黄酮样品液。取50μL黄酮样品液(10mg/mL)与250μLα-葡萄糖苷酶(2U，溶于0.1M PBS，pH＝6.8)混匀，37℃水浴10min，加入250μL pNPG(5mM)，37℃水浴10min，最后加入450μL Na₂CO₃溶液(0.2mM)终止反应。取200μL加入96孔板于405nm处测定OD值，以阿卡波糖(12.5μM)为阳性对照，按公式(3-1)计算α-葡萄糖苷酶抑制率，重复试验3次。

式中，

OD样品：样品+α-葡萄糖苷酶+pNPG+Na₂CO₃反应后的OD值；

OD背景：样品+α-葡萄糖苷酶+PB缓冲液+Na₂CO₃反应后的OD值；

OD阿卡波糖：阿卡波糖+α-葡萄糖苷酶+pNPG+Na₂CO₃反应后的OD值。

结果如图3所示，14种柑橘果皮黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，不同品种的柑橘样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性存在差异。以阿卡波糖为阳性对照，茶枝柑对α-葡萄糖苷酶抑制活性最强，抑制率达到59.87％，其次是不知火(53.38％)，沃柑、柠檬和温州蜜柑之间无显著性差异，抑制率变幅为46.20％～42.21％，遂川金柑、龙岩金柑样品对α-葡萄糖苷酶抑制活性较弱，抑制率分别为15.05％、14.69％。由此可见，茶枝柑果皮黄酮可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的重要来源。

实验3：柑橘果皮黄酮降脂能力测定

一、胆酸盐结合能力试验所需溶液配制

0.1M PB(pH＝6.3)的配制：称取31.20g NaH₂PO₄·2H₂O粉末加800mL超纯水溶解，定容至1L，得到0.2M NaH₂PO₄·2H₂O溶液，此为A液；称取71.63g Na₂HPO₄·12H₂O粉末，加入800mL超纯水溶解，转移到1L容量瓶中并定容，此为B液。量取A液77.5mL，B液22.5mL，加水稀释至200mL，即为0.1M PB(pH＝6.3)溶液。

1mM胆酸盐母液的配制：称取胆酸钠43.06mg，牛磺胆酸钠53.77mg，甘胆酸钠48.76mg，0.1M PB(pH＝6.3)分别定容至100mL，即得3种1mM胆酸盐母液。

10mg/mL胃蛋白酶溶液：称取1g胃蛋白酶粉末加适量0.01M HCl溶解，定容到100mL容量瓶。

10mg/mL胰蛋白酶溶液：称取1g胰蛋白酶粉末，量取适量0.1M PB(pH＝6.3)溶解，最后定容到100mL容量瓶。

二、胆酸盐结合能力测定

依次将1mL实验二中通过步骤(二)所制得的黄酮样品液(10mg/mL)、1mL胃蛋白酶(10mg/mL)加入10mL具塞试管，37℃恒温摇床120r/min震荡模拟胃部消化1h。NaOH(0.1M)调pH至6.3，随后加入4mL胰蛋白酶(10mg/mL)，继续震荡消化1h。向每个具塞试管中分别加入4mL 3种胆酸盐(1mM)，37℃震荡1h，反应结束后4000r/min离心20min，取上清，取胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠母液，0.1M PB缓冲液(pH＝6.3)稀释成不同梯度，取上述不同梯度的胆酸盐标准溶液2.5mL于10mL具塞试管，加入7.5mL 60％的H2SO4，置于70℃恒温水浴锅水浴25min，随后置于冰上5min，待完全冷却后，取200μL加入96孔板，3次平行试验，387nm处测定OD值。重复试验3次，按公式计算胆酸盐结合能力。

胆酸盐结合量(μmol/mg)＝C₁-C₂

式中，C₁为原始胆酸盐摩尔浓度；C₂为残留的胆酸盐摩尔浓度。

14种柑橘果皮黄酮对胆酸盐的结合能力测定结果如图4a、4b、4c所示。供试样品对胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘胆酸钠具有一定的吸附能力，吸附量变幅分别为0.272±0.010～0.395±0.005μmol/mg、0.303±0.007～0.437±0.004μmol/mg和0.357±0.012～0.440±0.001μmol/mg，总体来看，样品对后两种胆酸盐的吸附能力相对较好。

供试样品中胡柚对胆酸钠的结合量最大，可达0.395±0.005μmol/mg，并且对牛磺胆酸钠和甘胆酸钠也表现出较好的结合能力，结合量分别为0.431±0.004μmol/mg和0.436±0.007μmol/mg；牛磺胆酸钠结合能力最强的样品是苹果柚，椪柑样品结合甘胆酸钠的能力最强；胆酸钠和牛磺胆酸钠结合能力最弱的样品是遂川金柑，柠檬样品对甘胆酸钠结合量最小。由此可见，胡柚果皮黄酮类化合物或可在胆酸盐结合过程中发挥重要作用。

实验4：柑橘皮黄酮类化合物对肠道微生态的影响

一、VIS培养基、粪便悬液配制

血红素溶液：准确称取血红素粉末0.50g，溶于1mL 1mol/L NaOH中，超纯水定容至100mL，4℃避光保存待用。

VIS培养基：准确称取淀粉5g，胰蛋白胨3g，蛋白胨3g，酵母提取物4.5g，粘液素0.5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.8g，3#胆盐0.4g，NaCl 4.5g，KCl 2.5g，MgCl₂·6H₂O 4.5g，CaCl₂·6H₂O0.2g，KH₂PO₄ 0.4g，刃天青0.1g，吐温80 1mL溶于1L超纯水中，添加微量元素溶液2mL(微量元素溶液成分：MgSO₄·7H₂O 3g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，MnCl₂·4H₂O 0.32g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，CoSO₄·7H₂O 0.18g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L，CuSO₄·5H₂O 0.01g/L，NiCl₂·6H₂O 0.092g/L)，调节pH至6.8，121℃高压灭菌，待培养基冷却至50℃左右，加入氯化血红素溶液10mL，分装至10mL西林瓶，每个西林瓶中加入5mL培养基，转移至厌氧工作站过夜厌氧预处理，而后压盖密封待用。

粪便悬浊液：粪便样品由7名志愿者(3男4女)提供，近1内年均居住于中国浙江杭州，年龄在20～40岁之间，BMI(Body mass index)指数在正常范围18.5～23.9之间。志愿者均符合中国传统膳食习惯，无素食主义者，生活作息规律，无烟酒嗜好，身体健康，无糖尿病、高血压、结肠炎等慢性疾病，采样前至少三个月内未服用过抗生素或益生菌制剂。取志愿者晨起新鲜粪便1g/人，置于灭菌后的粪便采样管中，加入高压灭菌且经过厌氧预处理的PBS 10mL(pH＝6.8)，封口膜密封，涡旋震荡器混匀，制成10％(wt/vol)粪便悬浊液，0.24mm滤网过滤至15mL离心管中备用。

二、人体粪便悬浮液分组发酵

1mL注射器吸取0.5mL粪便悬浊液依次接种至实验4步骤(一)中配制的5mL VIS培养基，再向培养基中加入0.5mL实施例一所制得的柑橘黄酮提取液(0.1g/mL)，剩余菌悬液分装至2mL灭菌离心管中，-80℃保存，作为16S rDNA高通量测序和短链脂肪酸检测的原始样品。将接种完成培养基放置在厌氧工作站，37℃培养24h后，取发酵悬液1.5mL×2份，于-80℃冰箱保存。

分为A～N、Ori、P十六个组，每组中7个重复样本，即7位志愿者提供的样本，每个样本3组平行。

A～N代表柑橘果皮黄酮在志愿者提供的肠道菌群发酵后的样品：取实验4步骤(一)制得的0.5mL的粪便悬浊液、5mL的VIS培养基、0.5mL的柑橘黄酮提取液；A代表为温州蜜柑，B代表为茶枝柑，C代表为椪柑，D代表为伦晚脐橙，E代表为血橙，F代表为苹果柚，G代表为马家柚，H代表为遂川金柑，I代表为龙岩金柑，J代表为不知火，K代表为胡柚，L代表为沃柑，M代表为柠檬，N代表为佛手。

Ori代表未经发酵的原始粪便样品组。

P代表空白组：0.5mL的粪便悬浊液、5mL的VIS培养基。

将接种完成培养基放置在厌氧工作站，37℃培养24h后，取发酵悬液1.5mL×2份。

三、粪便悬浮液发酵样品DNA提取及16S rDNA测序分析

采用凯杰的QI Aamp Power Fecal DNA Kit试剂盒对粪便原样和粪便发酵液样品(即，实验4步骤二所得的粪便发酵前样品和粪便发酵后样品)进行DNA提取。

16S rDNA V3-V4区高通量测序采用Illumina MiSeq平台，扩增上游引物为338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)，下游引物为806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)，目的片段长度为480bp，测序策略采用Miseq-PE250。对各样本(组)在不同分类水平的具体组成进行分析(并检验组间是否具有统计学差异)。通过多种多变量统计学分析工具，进一步衡量不同样本(组)间的菌群结构差异及与差异相关的物种。

图5列出了发酵前后样品在“门”水平上相对丰度排名前10位，其中，以拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为主要类群，两者比例占据总体的绝大多数，经过体外发酵后，二者仍是肠道菌群中的优势菌群。发酵后，放线菌门(Actinobacter)相对丰度在空白组P中占比10.53％，在试验组中以K组(17.76％)和L组(17.66％)相对丰度增加较为明显，说明柑橘果皮黄酮或可促进放线菌门(Actinobacter)菌群的生长。

根据试验结果，7名志愿者肠道菌群在“属”水平上，有3名志愿者为肠型1(enterotype1，ET B)：以普雷沃氏菌属(Prevotella)为肠道菌群优势菌；4名志愿者为肠型2(enterotype2，ET P)：以普雷沃氏菌属(Prevotella)为肠道菌群优势菌。如图6a所示为3名肠型1志愿者粪便样本发酵前后组间菌群相对丰度柱状图，优势菌属为拟杆菌属(Bacteroides)，在原始粪便样本Ori组中的相对丰度占32.78％，发酵后其相对丰度略微降低，空白组P占比30.58％，其余试验组A～N组平均占比的26％左右。与空白组P相比，A～N组的拟杆菌属(Bacteroides)占比有所下降，双歧杆菌属(Bifidobacterium)和乳杆菌属(Lactobacillus)所占比例相对升高。粪便样本添加柑橘果皮黄酮发酵后，双歧杆菌属(Bifidobacterium)在B组占据比例最高(23.09％)，相比空白组P高出9.41％；J组中乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度比例较高(14.08％)，比空白组P高出6.10％。图6b为4名肠型2志愿者粪便样本发酵前后组间菌群相对丰度柱状图，图中列出了相对丰度靠前30个属，其优势菌属为普雷沃氏菌属(Prevotella),在发酵前Ori组中相对丰度占总体的35.89％，发酵后相对丰度升高，可占总体的50％左右。发酵后，A～N组中双歧杆菌属(Bifidobacterium)相对丰度占比均高于空白组P(6.84％)，其中，K组(14.86％)、L组(14.78％)双歧杆菌属(Bifidobacterium)相对丰度占比较高。空白组P乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度仅占据总体的1.24％，添加柑橘果皮黄酮发酵后各试验组相对丰度有所升高，以A组乳杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度最高(5.54％)。

柑橘果皮黄酮与肠道菌群体外发酵后的菌落结构和丰度不完全一致。肠型1相对丰度靠前的5个属分别为：拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)和萨特氏菌属(Sutterella)。在肠型2中，丰度前5的是普雷沃氏菌属(Prevotella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、戴阿利斯特杆菌属(Dialister)和埃希氏菌属(Escherichia)。肠型2中乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度占比在总体的第7位，而在肠型1的菌群丰度排名中，乳杆菌属(Lactobacillus)占据第4位。

综上，添加柑橘果皮黄酮发酵后的肠道菌群有益菌相对丰度增加，并且对部分个体肠道菌群丰度和结构的调节较为明显。由此可见，柑橘果皮黄酮对参加试验的志愿者的肠道菌群具有一定的调节作用，而不同的肠型结构，或可作为肠道微生态紊乱分类治疗的依据。

经LefSe(Line Discriminant Analysis effect size)线性判别分析后，如图7所示，试验组B组、K组与其他组别存在显著差异菌属，从“门”的水平上看，B组样本中差异最大的是变形菌门(Proteobacteria)，K组样本起显著差异的是放线菌门(Actinobacteria)；从“纲”的水平上看，B组样本中γ-变形杆菌纲(Grammproteobacteria)起显著差异，K组样本放线菌纲(Actinobacteria)起显著差异作用；从“目”水平分析，K组样本双歧杆菌目(Bifidobacteriales)起显著差异作用，B组在该水平上差异不显著；“科”水平上，K组样本双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)起显著差异作用，其它组别在该水平上不存在显著差异；“属”水平上，K组样本存在显著差异的是双歧杆菌属(Bifidobacterium)；“种”水平上，B组样本在短双歧杆菌种(Bifidobacterium_breve)与其他组别存在差异。

B组为添加茶枝柑果皮黄酮发酵的试验组，结合试验结果，或可推测是果皮中的黄酮类物质对肠道菌群结构起到了调节作用，增加了有益菌的相对丰度，促使肠道维持健康稳态。K组为添加胡柚果皮黄酮发酵的试验组，双歧杆菌在“门”至“属”水平上与其它组别存在差异菌落，说明胡柚果皮黄酮对肠道菌群结构的也具有一定的调节作用。

四、气相色谱检测粪便悬浮液发酵样品中短链脂肪酸

短链脂肪酸含量是人体肠道内微生物通过代谢生成的产物，是衡量肠道菌群生长及代谢情况的一个重要指标，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等。取500μL发酵前后悬浊液于1.5mL离心管中，随后加入100μL巴豆酸偏磷酸溶液，-30℃冷冻24h，解冻后8000rpm、4℃离心3min去除蛋白质等杂质，取上清，用0.22μm水系针筒式过滤器过滤后检测。

色谱柱：Agilent FFAP30 m×0.25mm×0.25μm；柱温：75℃，20℃/min升至180℃保持1min，50℃/min升至220℃保持1min；进样口温度：250℃；进样量：1.0μL；分流比：5:1；载气：高纯氮；流速：2.5mL/min保持6.5min，2.8mL/min升至2.8mL/min保持2min；检测器：FID；温度：250℃；尾吹：20mL/min；氢气：30mL/min；空气：300mL/min。

7名志愿者粪便样本体外发酵后总酸的含量，试验组总酸含量均值普遍高于空白组(图8a)为，说明柑橘果皮黄酮对短链脂肪酸的产生存在积极作用。并且，B组、K组中的乙酸含量显著增加(图8b)，与空白组P之间存在显著差异，分析原因或可与普雷沃氏菌属(Prevotella)相对丰度有关，其主要发酵产物是乙酸，除此之外，双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)等有益菌属相对丰度占比升高，它们也可产生乙酸，帮助宿主调节肠道pH，还有助于粪杆菌属(Faecalibacterium)等产丁酸盐的细菌的生长。

对比例1-1、将实施例1步骤(2)中的料液比(g:mL)由“1:42”改成“1:25”，其余等同于实施例1。并按照实施例2所述制备获得相应的冻干粉。

对比例1-2、将实施例1步骤(2)中“加入52％(体积％)的乙醇溶液”改成“加入80％(体积％)的乙醇溶液”，其余等同于实施例1。并按照实施例2所述制备获得相应的冻干粉。

对比例1-3、将实施例1步骤(2)中超声辅助提取的功率由“325W”改成“300W”，其余等同于实施例1。并按照实施例2所述制备获得相应的冻干粉。

对比例2-1、将实施例2步骤(2)中的“非极性XAD-16大孔树脂”改成“非极性D-101大孔树脂”，其余等同于实施例2。

对比例2-2、将实施例2步骤(2)中的“上样体积为2倍柱体积，1.5mL/min的流速动态吸附2.5h”改成“上样体积为2倍柱体积，1.0mL/min的流速动态吸附2h”，其余等同于实施例2。

对比例2-3、将实施例2步骤(2)中的“加入5倍柱体积的50％(体积％)乙醇溶液，洗脱2h”改成“加入1.6倍柱体积的80％(体积％)乙醇溶液，洗脱1.8h”，其余等同于实施例2。

将上述对比例所得的冻干粉，按照上述方法进行检测，以温州蜜柑为例，提取的黄酮组分中芸香柚皮苷含量和黄酮性能数据如下表3所示。

表3

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江工商大学

<120> 超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actcctacgg gaggcagca 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (8)

1.超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、原材料预处理：

新鲜的柑橘皮经干燥、粉碎，得柑橘皮粉；

2)、利用超声辅助法提取柑橘皮中黄酮类化合物：

2.1)、称取柑橘皮粉1g，按照1g/40～45mL的料液比，加入体积浓度为50～55％的乙醇溶液，充分混匀；

2.2)、混合液超声处理：

将步骤2.1)所得的混合液超声提取后，离心，离心所得上清液用滤膜抽滤，得滤液；

超声提取的功率为325±25W，超声时间17±2min；

2.3)、定容：

在步骤2.2)所得的滤液中加入体积浓度为58～62％的乙醇溶液定容至100mL，得到黄酮粗提液；

3)、使用大孔树脂纯化柑橘皮中的黄酮类化合物：

3.1)、柑橘果皮黄酮粗提液前处理：

先将黄酮粗提液进行浓缩，再加入体积浓度≥95％的乙醇溶液或乙醇，从而使所得液中乙醇浓度≥80％，接着静置，弃沉淀，取上清，将上清液减压浓缩至无醇味，得前处理后黄酮粗提液；

3.2)、大孔树脂湿法装柱，将前处理后黄酮粗提液用超纯水配成100～120μg/mL浓度后上样，动态吸附，然后利用体积浓度48～52％的乙醇溶液进行洗脱，得洗脱液；

3.3)、将洗脱液经减压浓缩至无醇味后，真空冷冻干燥，得含有黄酮类化合物的柑橘果皮提取物。

2.根据权利要求1所述的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法，其特征是所述步骤1)还包括将柑橘皮粉进行冷冻干燥：

取柑橘皮粉-80±10℃预冻6±0.5h，然后进行真空冷冻干燥，得冻干处理后柑橘皮粉；以冻干处理后柑橘皮粉代替柑橘皮粉进行后续的步骤2)。

3.根据权利要求2所述的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法，其特征是，所述步骤1)的真空冷冻干燥为：先于主冻干隔板温度-5℃、真空度0.1mbar冻干14h，再于隔板温度5℃、真空度为0.01mbar解析干燥10h，得冻干处理后柑橘皮粉。

4.根据权利要求1～3任一所述的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法，其特征是：所述步骤2.2)中，用0.22μm滤膜进行抽滤，10000±1000r/min室温离心15±5min。

5.根据权利要求4所述的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法，其特征是：

所述步骤3.2)中，大孔树脂为XAD-16，上样量为2±0.5倍柱体积，洗脱时，体积浓度48～52％的乙醇溶液的用量是4.5～5.5倍柱体积。

6.根据权利要求5所述的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法，其特征是所述步骤3.3)的真空冷冻干燥为：先于主冻干隔板温度-5℃、真空度0.1mbar冻干14h，再于隔板温度5℃、真空度为0.01mbar解析干燥10h。

7.根据权利要求6所述的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法，其特征是：所述步骤1)为：新鲜的柑橘皮经40±5℃烘干48±2h、粉碎过40目筛，得柑橘皮粉。

8.根据权利要求1～7任一所述的超声辅助提取柑橘果皮中黄酮类化合物的方法，其特征是：

所述步骤2.1)中，乙醇溶液的体积浓度为52％，料液比为1g/42mL；

所述步骤2.2)中，超声提取的功率为325W，超声时间17min；

所述步骤2.3)中，乙醇溶液的体积浓度为60％；

所述步骤3.2)中，黄酮粗提液的浓度为107μg/mL，上样体积为2倍柱体积，1.5mL/min的流速动态吸附2.5h，利用5倍柱体积的50％乙醇溶液进行洗脱，洗脱时间为2h。

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