CN117581867B - 一种柑橘黄酮微胶囊的制备方法和生防应用 - Google Patents

一种柑橘黄酮微胶囊的制备方法和生防应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种柑橘黄酮微胶囊的制备方法和生防应用。本发明通过超声辅助浸提法提取茶枝柑果皮中的柑橘黄酮化合物，体外抑菌试验结果表明柑橘黄酮对尖孢镰刀菌、灰葡萄孢菌、大豆核盘菌具有良好的抗真菌活性。以海藻酸钠和明胶为壁材，采用锐孔法对柑橘黄酮进行微胶囊化，制备的柑橘黄酮微胶囊在黄瓜盆栽实验中表现出良好的抗病效果。冷冻干燥的柑橘黄酮微胶囊有良好的缓释性能和储存性能。本发明的柑橘黄酮微胶囊对于植物病害防治具有经济环保、无二次污染的优势，同时所用物料成本低廉，制备方法简单，不涉及高温高压更加安全和适用于工业化生产。

Description

一种柑橘黄酮微胶囊的制备方法和生防应用
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种柑橘黄酮微胶囊的制备方法和生防应用。
背景技术
由病原真菌引起的植物病害在田间和储存期间对重要经济作物的产量和品质造成严重损失。一直以来，化学农药是防治植物真菌病原体的主要手段，但化学农药的广泛使用也导致农药残留、环境污染及微生物抗药性等一系列危害环境健康和生态安全的问题。鉴于化学农药的弊端和当前建设生态文明的重大战略需求，病害防治的发展趋势开始转向生物农药的开发和利用。
植物自身在防御病原物侵染的过程中，能够诱导或组成型合成对抗病原菌的具有抑菌活性的小分子化合物，即植物次生代谢产物。这些代谢产物往往具有活性好、易降解、特异性强和不易诱导田间抗药性等优点，因此是开发植物源杀菌剂的重要筛选来源。如植物中生物碱类、萜类、黄酮类化合物等都在前期的机制研究中被证实具有防御病原微生物的作用。
柑橘是世界产量第一的水果种类，其年贸易额在国际贸易农产品中居第三，仅次于小麦和玉米。柑橘皮渣作为柑橘生产加工的废弃物，占柑橘总量的40％～50％，这些柑桔果皮除少量地用于中成药配方之外，绝大部分都被作为废料丢弃，造成极大的资源浪费与环境污染。柑橘皮渣含有丰富的类黄酮、果胶和精油等多种活性成分，尤其是甲氧基黄酮，为柑橘特有的黄酮类活性物质。但在自然条件下直接施用，柑橘黄酮容易受到氧、水、热、光、pH值和金属离子等因素的影响，不稳定易降解，且黄酮在生物体内容易与大分子相互作用，导致其生物利用度降低。
微胶囊技术是通过高分子材料对某类物质进行包裹，一方面实现芯材的有效递送，提高生物利用率；另一方面可提高芯材的稳定性，延长其活性保留期。
发明内容
针对化学农药对环境的危害和植物次生代谢产物尤其是柑橘黄酮在自然条件下不稳定的问题，本发明提供了一种抑菌的柑橘黄酮微胶囊的制备方法及应用。
本发明通过筛选柑橘黄酮对不同植物病原真菌的抑制活性表明了柑橘黄酮可以作为生物农药防治的有效成分。进一步采用锐孔法对柑橘黄酮进行微胶囊包埋并进行室内盆栽试验，提供适宜于实际应用的植物源杀菌剂。
本发明的柑橘黄酮是由茶枝柑果皮中提取，对植物病原真菌灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌、大豆核盘菌的抑菌率可达60.77％-69.03％。通过锐孔法进行微胶囊制备并优化壁材比、氯化钙浓度、柑橘黄酮浓度等参数，得到的壁材对柑橘黄酮提取物的包埋效率高，在各种参数条件下包埋率都较为稳定，在最佳参数下获得最佳包埋率为86.1233％。采用冷冻干燥技术得到柑橘黄酮微胶囊并分析其在不同温度下的释放动力学，本发明所制备的柑橘黄酮微胶囊呈现良好的缓释性能和储存稳定性，在盆栽施用过程中展现了对黄瓜枯萎病良好的抗病效果。
本发明的第一个目的是提供一种柑橘黄酮微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
S1.将茶枝柑果皮洗净取皮，干燥后粉碎得柑橘果皮粉末，用乙醇超声浸提后离心，取上清液并浓缩后得到柑橘黄酮提取物；
S2.将海藻酸钠与明胶按质量比2.926：1混合，按海藻酸钠与明胶的总质量与水的质量比为2.167％的比例加入到去离子水中，50℃条件下充分溶解直至形成黏稠混合物，室温放置至气泡消失；然后加入一定量的柑橘黄酮提取物，充分搅拌，得到柑橘黄酮浓度为0.63mg/mL的乳液；
S3.取步骤S2制备的乳液缓缓滴入保持搅拌状态的质量分数3％CaCl2溶液中，其中所述的乳液与CaCl2溶液的体积比为2：10；然后放置在4℃条件下交联固化24h，将反应后的混合体系经真空抽滤去除滤液后，收集微胶囊并用水冲洗，得到柑橘黄酮微胶囊。
所述的柑橘黄酮包括柚皮素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮和4',5,6,7-四甲氧基黄酮。
优选，所述的步骤S1的干燥为50℃烘干。
优选，所述的步骤S1的用乙醇超声浸提后离心，是按照柑橘果皮粉末：乙醇为1g：10mL的比例混合，30℃超声振荡30min后，5000rpm离心10min。
优选，所述的步骤S3的保持搅拌状态为置于磁力搅拌器上并调节搅拌转速为600rpm。
本发明的第二个目的是提供利用所述的制备方法制备得到的柑橘黄酮微胶囊。
本发明的第三个目的是提供所述的柑橘黄酮微胶囊在防治植物病害中的应用。
优选，所述的植物病害是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型、灰葡萄孢菌、大豆核盘菌引起的植物病害。
优选，所述的植物为黄瓜。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
利用本发明所制备的柑橘黄酮在平板生长测试中可有效抑制尖孢镰刀菌黄瓜专化型、灰葡萄孢菌和大豆核盘菌；制备的柑橘黄酮微胶囊在盆栽应用中有效防治由尖孢镰刀菌引起的黄瓜枯萎病。
本发明制备的柑橘黄酮通过微胶囊包埋后极大地提升了储存稳定性，且具有良好的缓释效果。
本发明制备的柑橘黄酮微胶囊原料天然，充分利用柑橘果皮，在环境中施用具有低毒、易降解、不诱导田间抗药性等优势，且制作过程简单稳定，经济成本低，为植物农药抑菌剂的筛选和制备提供了非常重要的理论依据，具有重要的应用价值。
本发明通过锐孔法进行柑橘黄酮微胶囊制备，与其他微胶囊制备方法(喷雾干燥法、复合凝聚法及冷冻干燥法)相比，锐孔法装置设备简单、操作方便、经济成本较少。
附图说明
图1是柑橘果皮中主要黄酮类化合物的定量分析；注：数据以三个重复的平均值±标准误差(SE)表示，不同字母表示具有统计学差异(p＜0.05)。
图2是植物病原真菌在含柑橘黄酮(133μg/mL)的PDA平板上和对照平板上的生长形态图。
图3是冻干前微胶囊图片(A)和冻干后微胶囊扫描电镜图(B)。
图4是不同壁材浓度条件下柑橘黄酮微胶囊的包埋率；注：每个浓度三次重复，不同字母表示具有统计学差异(p＜0.05)。
图5是不同壁材比条件下柑橘黄酮微胶囊的包埋率；注：每个浓度三次重复，不同字母表示具有统计学差异(p＜0.05)。
图6是不同柑橘黄酮浓度条件下柑橘黄酮微胶囊的包埋率；注：每个浓度三次重复，不同字母表示具有统计学差异(p＜0.05)；其中黄酮浓度指柑橘黄酮浓度。
图7是不同氯化钙浓度条件下柑橘黄酮微胶囊的包埋率；注：每个浓度三次重复，不同字母表示具有统计学差异(p＜0.05)。
图8是各个因素相互作用的响应面图和等高线图；其中，图A、C、E为壁材比与壁材浓度(A)、黄酮浓度与壁材浓度(C)、壁材比与黄酮浓度(E)之间的相互作用对微胶囊封装效率的响应面图；图B、D、F为壁材比与壁材浓度(B)、黄酮浓度与壁材浓度(D)、壁材比与黄酮浓度(F)之间的等高线图；其中黄酮浓度指柑橘黄酮浓度。
图9是柑橘黄酮微胶囊的释放曲线；注：数据以三个重复的平均值±标准误差(SE)表示(p＜0.05)
图10是在4℃、25℃、37℃的条件下柑橘黄酮微胶囊的保留率；注：数据以三个重复的平均值±标准误差(SE)表示(p＜0.05)。
图11是不同处理下的黄瓜盆栽实验图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中所用的海藻酸钠购买于上海麦克林生化科技股份有限公司，化学纯(CP)，粘度200±20MPa·s，CAS号：9005-38-3；明胶购买于北京索莱宝科技有限公司，CAS：9000-70-8，From bovine skin，Type b approx.225Bloom，溶解度：40mg/mL in water。
实施例1：柑橘黄酮提取检测
茶枝柑(Citrus reticulata'Chachiensis')果皮洗净取皮，50℃烘干至恒重后粉碎过筛，获得的柑橘果皮粉末装入自封袋，置于干燥器中备用。通过超声辅助浸提法对干燥后的柑橘果皮粉末进行提取：称取干燥柑橘果皮粉末2g，加入20mL无水乙醇，30℃超声(福洋牌超声波清洗机，型号：F-100SD，最大容量：30L，超波功率：600N，加热功率：600w，超声频率：40KHz)振荡30min后，5000rpm离心10min，吸取上清液得到柑橘黄酮提取物，放入离心浓缩仪中进行真空干燥浓缩。1μL浓缩后的柑橘黄酮提取物稀释1000倍，0.22μm滤膜过滤后通过液相色谱质谱联用法(LC-MS)检测浓度，根据测得的色谱图峰面积、标准曲线以及稀释倍数，算出每g干重果皮中各黄酮化合物的浓度(图1)。结果测得浓缩后的柑橘黄酮提取物主要黄酮化合物(柑橘黄酮)总浓度为13.3mg/mL。
LC-MS条件如下：HPLC条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm)；流动相：0.1％甲酸-水溶液(A)，0.1％甲酸-乙腈(B)(梯度：0-1min 90％A；1-5min 60％A；5-10min 35％A；10-11min 0％A；11-12min 100％A)；柱温：30℃；流速：0.3mL/min；进样量：1μL。Waters Xevo TQ-XS分析柑橘黄酮质谱条件如表1所示。
表1 Waters Xevo TQ-XS分析柑橘黄酮质谱条件
化合物名称 [M+H]+ 碎片离子 碰撞电压 保留时间
柚皮素 273 153 20 6.18
芸香柚皮苷 581 153 50 3.91
柚皮苷 581 153 50 4.03
橙皮苷 611 153 22 4.15
新橙皮苷 611 153 20 4.28
川陈皮素 403 373 25 7.27
桔皮素 373 297 30 7.98
3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮 433 403 28 6.41
4',5,6,7-四甲氧基黄酮 343 282 25 6.12
实施例2：柑橘黄酮的抑菌活性
抑菌活性测定采用抑制菌丝生长速率法。将浓缩后的柑橘黄酮提取物(柑橘黄酮浓度为13.3mg/mL)加入PDA培养基平板中(分别将柑橘黄酮提取物按照200倍及100倍用溶剂进行稀释，然后加入培养基中使柑橘黄酮终浓度分别为66μg/mL和133μg/mL)，并以添加等量溶剂的PDA培养基平板作对照。打孔器从尖孢镰刀菌黄瓜专化型、灰葡萄孢菌、大豆核盘菌的菌丝生长边缘取菌饼接种至含有柑橘黄酮提取物或对照溶剂的平板。每个处理含三次重复，将各平板倒置放入25℃恒温培养箱中观察其生长情况。每隔24h采用十字交叉法记录菌落生长直径，并根据下列公式测定抑菌率。菌落直径＝(横向直径+纵向直径)/2；抑制率＝[(对照平板菌落直径-处理平板菌落直径)/(对照平板菌落直径-5mm)]×100％。结果见图2和表2。结果表明，柑橘黄酮对植物病原真菌灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌、大豆核盘菌均表现出较好的抑制活性，表明柑橘黄酮可以作为生物农药防治的有效成分。
表2不同浓度下对三种病原菌的抑制率
实施例3：柑橘黄酮微胶囊的制备
(1)溶解：海藻酸钠与明胶按质量比3:1混合，按海藻酸钠与明胶的总质量与水的质量比为2％的比例加入到20mL去离子水中，50℃水浴使其充分溶解，直至形成黏稠混合物。室温下放置30min至气泡消失，将柑橘黄酮提取物加到海藻酸钠/明胶混合物中，搅拌30min，得到柑橘黄酮含量为0.4mg/mL的乳液。
(2)交联：将100mL质量分数2％CaCl2溶液置于磁力搅拌器上并调节转速为600rpm，5mL注射器抽取上述步骤(1)制备得到的乳液20mL，缓缓滴入CaCl2溶液中。由于海藻酸根阴离子与阳离子的相互吸引迅速成型而制得凝胶微胶囊。
(3)持续固化：乳液滴加完毕后，放置在4℃冰箱中交联固化24h。让CaCl2进入到微胶囊内部，固化内部游离的海藻酸根。
(4)清洗和干燥：将反应后的混合体系倒入漏斗中，通过真空泵装置抽滤，收集滤液后，将微胶囊用无菌水冲洗三次，得到柑橘黄酮微胶囊，制备所得湿囊呈乳白色光滑球状。然后放入冻干机中冷冻干燥，干燥后的微胶囊为表面褶皱的颗粒状(图3)。
实施例4：柑橘黄酮微胶囊制备单因素分析
(1)最佳壁材浓度筛选：在壁材比[海藻酸钠(g)∶明胶(g)]为3:1、柑橘黄酮浓度为0.4mg/mL、CaCl2浓度为质量分数2％的条件下，考察壁材浓度为质量分数0.5％、1％、2％、3％、4％时，对微胶囊包埋率的影响；在该筛选条件下，通过LC-MS测定按照实施例3的制备方法制备微胶囊时收集的滤液的柑橘黄酮含量。每次实验重复三次。结果表明当壁材浓度为质量分数2％时，柑橘黄酮微胶囊的包埋率为79.08％(图4和表3)。包埋率计算公式如下：包埋率(％)＝(1-C游离/C总)×100％；式中C游离为滤液的柑橘黄酮浓度，C总为反应初始时添加的总柑橘黄酮浓度。
表3柑橘黄酮微胶囊不同壁材浓度下的包埋率
浓度％ 包埋率(％)
0.5 73.51143
1 75.24808
2 79.08115
3 76.24485
4 74.68353
(2)最佳壁材比[海藻酸钠(g)∶明胶(g)]筛选：在壁材浓度为质量分数2％、柑橘黄酮浓度为0.4mg/mL、CaCl2浓度为质量分数2％的条件下，考察壁材比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1时，对微胶囊包埋率的影响；在该筛选条件下，通过LC-MS测定按照实施例3的制备方法制备微胶囊时收集的滤液的柑橘黄酮含量。每次实验重复三次。结果表明当壁材比为3：1时，柑橘黄酮微胶囊的包埋率为84.02％(图5和表4)。包埋率计算公式如下：包埋率(％)＝(1-C游离/C总)×100％；式中C游离为滤液的柑橘黄酮浓度，C总为反应初始时添加的总柑橘黄酮浓度。
表4柑橘黄酮微胶囊不同壁材比下的包埋率
(3)最佳柑橘黄酮浓度筛选：在壁材浓度为质量分数2％、壁材比[海藻酸钠(g)∶明胶(g)]为3:1、CaCl2浓度为质量分数2％的条件下，考察柑橘黄酮浓度为0.2、0.4、0.6、0.8和1mg/mL时，对微胶囊包埋率的影响；在该筛选条件下，通过LC-MS测定按照实施例3的制备方法制备微胶囊时收集的滤液的柑橘黄酮含量。每次实验重复三次。结果表明当柑橘黄酮浓度为0.6mg/mL时，柑橘黄酮微胶囊的包埋率为84.79％(图6和表5)。包埋率计算公式如下：包埋率(％)＝(1-C游离/C总)×100％；式中C游离为滤液的柑橘黄酮浓度，C总为反应初始时添加的总柑橘黄酮浓度。
表5柑橘黄酮微胶囊不同黄酮浓度下的包埋率
柑橘黄酮浓度 包埋率(％)
0.2 77.68154
0.4 81.00784
0.6 84.78628
0.8 82.40331
1 82.09343
(4)最佳氯化钙浓度筛选：在壁材浓度为质量分数2％、壁材比[海藻酸钠(g)∶明胶(g)]为3:1、柑橘黄酮浓度为0.4mg/mL的条件下，考察CaCl2浓度为质量分数1％、2％、3％、4％、5％时，对微胶囊包埋率的影响；在该筛选条件下，通过LC-MS测定按照实施例3的制备方法制备微胶囊时收集的滤液的柑橘黄酮含量。每次实验重复三次。结果表明当氯化钙浓度为质量分数3％时，柑橘黄酮微胶囊的包埋率为81.85％(图7和表6)。包埋率计算公式如下：包埋率(％)＝(1-C游离/C总)×100％；式中C游离为滤液的柑橘黄酮浓度，C总为反应初始时添加的总柑橘黄酮浓度。
表6柑橘黄酮微胶囊不同氯化钙浓度下的包埋率
实施例5：柑橘黄酮微胶囊响应面优化
在单因素实验的基础上，以壁材浓度、壁材比、柑橘黄酮浓度3个因子为自变量(分别以A、B、C表示)，以微胶囊包埋率为响应值，设计3因素3水平的响应面实验(表7)。采用Design-Expert13软件对实验结果进行分析，确定柑橘黄酮微胶囊最佳制备工艺，并进行验证实验。结果表明柑橘黄酮微胶囊的最佳工艺参数：壁材浓度为质量分数2.167％，壁材比为2.926:1，柑橘黄酮浓度为0.63mg/mL，柑橘黄酮微胶囊的封装效率为86.1233％。各个因素相互作用的响应面图和等高线图见图8。
表7三组分三水平优化微胶囊包埋工艺的Box-behnken设计
实施例6：柑橘黄酮微胶囊释放性能和储存稳定性分析
称取三份500mg制备好的冷冻干燥的柑橘黄酮微胶囊(按照优化后的最佳工艺参数制备得到的，其中壁材浓度为质量分数2.167％，壁材比[海藻酸钠(g)∶明胶(g)]为2.926:1，柑橘黄酮浓度为0.63mg/mL，CaCl2浓度为质量分数3％)分别加入至200mL超纯水中，在振荡器中震荡(200rpm/25℃)，分别在0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h取500μL液体样品直至释放平衡。取样后立即使用0.22μm的滤膜过滤并保存滤液，待所有时间点样品取完后通过LC-MS测定柑橘黄酮含量。以时间为横坐标、以释放效率为纵坐标绘制释放曲线(图9)。结果表明柑橘黄酮微胶囊72小时才能完全释放，具有良好的缓释性能。释放效率计算公式如下：释放效率(％)＝释放期间柑橘黄酮浓度/柑橘黄酮总浓度×100％。
将冷冻干燥的柑橘黄酮微胶囊(按照优化后的最佳工艺参数制备得到的，其中壁材浓度为质量分数2.167％，壁材比[海藻酸钠(g)∶明胶(g)]为2.926:1，柑橘黄酮浓度为0.63mg/mL，CaCl2浓度为质量分数3％)分别置于4℃、25℃和37℃条件下储存90天，分别在0、10、20、30、60和90天时进行评估。评估方法：将等分的500mg柑橘黄酮微胶囊研磨后加入50mL甲醇中，超声120分钟，使胶囊壁材料破碎，黄酮类化合物溶解在溶剂中。离心(5000rpm，10min)后，上清液通过0.22μm注射器过滤器，通过LC-MS分析微胶囊提取物中柑橘黄酮剩余量，计算保留率并绘制柑橘黄酮微胶囊不同条件下储存稳定性图表(图10)。结果表明在4℃时储存90天后柑橘黄酮微胶囊的保留率为97.07％，在25℃时储存90天后柑橘黄酮微胶囊的保留率为88.61％，在37℃时储存90天后柑橘黄酮微胶囊的保留率为78.83％。保留率计算公式如下：保留率(％)＝保存期间柑橘黄酮浓度/柑橘黄酮初始浓度×100％。
实施例7：柑橘黄酮微胶囊对黄瓜盆栽实验的生物防治作用
向培养好的尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原体中加入无菌水，静置2min后用无菌刀片刮取菌落表面；将平板中含孢子的悬浊液收集到无菌离心管中，2000rpm离心5min，去掉上清液后用无菌水稀释，制成病原真菌孢子悬浮液(5x 105CFU/mL)。分别将2g柑橘黄酮微胶囊(按照优化后的最佳工艺参数制备得到的，其中壁材浓度为质量分数2.167％，壁材比[海藻酸钠(g)∶明胶(g)]为2.926:1，柑橘黄酮浓度为0.63mg/mL，CaCl2浓度为质量分数3％)或空白微胶囊与5mL病原真菌孢子悬浮液一起均匀地与100g土壤混合，选择在饱和水分条件下发芽的黄瓜种子进行育苗。此外，未经任何处理或仅混合了病原真菌孢子的土壤分别用作阴性对照和阳性对照。每个处理有8-15个重复，整个实验重复三次。
黄瓜枯萎病分级标准见表8，病情指数和防治效果的计算公式如下：
病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高病级数)×100；
防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％。
结果表明使用柑橘黄酮微胶囊处理的黄瓜幼苗的病情指数为22.71％，明显低于其他处理，且柑橘黄酮微胶囊的防治效果为60.26％，也显著高于其他处理(图11和表9)。
表8黄瓜枯萎病分级标准
分级 分级标准
0 无任何症状
1 真叶、子叶黄化或萎蔫面积不超过总叶面积的50％
2 真叶、子叶黄化或萎蔫面积超过总叶面积的50％
3 叶片萎蔫或枯死，仅生长点存活
4 病株枯死
表9柑橘黄酮微胶囊对黄瓜枯萎病的防治作用
处理 病情指数(％) 防治效果(％)
病原菌 57.16±5.22a -
病原菌+空白微胶囊 44.81±4.43a 19.66±6.02b
病原菌+柑橘黄酮微胶囊 22.71±2.29b 60.26±4.00a
注：数据以三个重复的平均值±标准误差(SE)表示，不同字母表示具有统计学差异(p＜0.05)。

Claims (8)

1.一种柑橘黄酮微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将茶枝柑果皮洗净取皮，干燥后粉碎得柑橘果皮粉末，用乙醇超声浸提后离心，取上清液并浓缩后得到柑橘黄酮提取物；
S2.将海藻酸钠与明胶按质量比2.926：1混合，按海藻酸钠与明胶的总质量与水的质量比为2.167％的比例加入到去离子水中，50℃条件下充分溶解直至形成黏稠混合物，室温放置至气泡消失；然后加入一定量的柑橘黄酮提取物，充分搅拌，得到柑橘黄酮浓度为0.63mg/mL的乳液；
S3.取步骤S2制备的乳液缓缓滴入保持搅拌状态的质量分数3％CaCl2溶液中，其中所述的乳液与CaCl2溶液的体积比为2：10；然后放置在4℃条件下交联固化24h，将反应后的混合体系经真空抽滤去除滤液后，收集微胶囊并用水冲洗，得到柑橘黄酮微胶囊。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤S1的干燥为50℃烘干。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤S1的用乙醇超声浸提后离心，是按照柑橘果皮粉末：乙醇为1g：10mL的比例混合，30℃超声振荡30min后，5000rpm离心10min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤S3的保持搅拌状态为置于磁力搅拌器上并调节搅拌转速为600rpm。
5.利用权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到的柑橘黄酮微胶囊。
6.权利要求5所述的柑橘黄酮微胶囊在防治植物病害中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物病害是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型、灰葡萄孢菌、大豆核盘菌引起的植物病害。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物为黄瓜。
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