CN113201559B - 一种人源胰腺炎相关cel-hyb1基因变异敲入小鼠的构建方法与应用 - Google Patents

一种人源胰腺炎相关cel-hyb1基因变异敲入小鼠的构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物模型构建领域，具体是一种人源胰腺炎相关CEL‑HYB1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法与应用，将CEL‑HYB1人源化基因敲入小鼠，采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，定点敲入人源化CEL‑HYB1基因，模拟人慢性胰腺炎的发病过程。本发明在国际上首次构建CEL‑HYB1人源化基因小鼠，也是第一次为CEL‑HYB1变异致病提供体内证据，本发明构建的动物模型具有诱导胰腺内质网应激与自噬及自发产生慢性胰腺炎病变的特点，有望发展成为一种可替代传统动物模型的新型实验动物模型，为慢性胰腺炎的药物与基因治疗提供新的理论依据和动物模型。

Description

一种人源胰腺炎相关CEL-HYB1基因变异敲入小鼠的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及动物模型构建领域，具体地说，是一种人源胰腺炎相关CEL-HYB1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法与应用。
背景技术
慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是指各种病因引起胰腺组织和功能损害的进行性慢性炎症性疾病，其病程较长甚至伴随终身，临床以腹痛、营养吸收不良、糖尿病和胰腺钙化为主要表现，严重影响患者的生活质量。过去20余年，遗传因素在CP病因学中的作用越来越得到重视。胰腺除了分泌胰蛋白酶外，还可分泌另一种非常重要的酶-脂肪酶。其中，羧基酯脂肪酶(carboxyl ester lipase，CEL)在十二指肠内经胆盐激活参与胆固醇和脂溶性维生素的水解和吸收，是一种主要在胰腺腺泡细胞内表达的糖蛋白，约占胰液中总蛋白量的4％。一部分酶也在细胞浆中存在，与胞浆内胆固醇和氧化脂蛋白发生相互作用。
人CEL基因位于染色体9q34.3的位置，共有11个外显子，在其下游是一种随机排列的假基因-CELP，两者序列高度相似。2015年，挪威Fjeld等在《Nature Genetics》上在欧洲人群中首先报道了一个新的CP易感致病基因变异：CEL–HYB1(Fjeld K,Weiss FU,LasherD,et al.A recombined allele of the lipase gene CEL and its pseudogene CELPconfers susceptibility to chronic pancreatitis.Nat Genet 2015；47:518-22.)，该杂合变异由CEL基因和其相邻的假基因CELP发生非等位基因同源重组形成(图1)。细胞实验发现CEL–HYB1存在脂肪酶活性下降，分泌受损，蛋白胞内累积，并诱发自噬。体外实验高度提示变异蛋白存在细胞毒性并引起内质网应激，但目前尚无动物模型验证其潜在致病机制。传统的CP动物模型，存在操作复杂、周期长、表型不稳定、不能模拟人体情况等缺点，因此CP基因模型逐渐成为近年来的研究热点。目前国际上有报道CP相关的点突变模型，如验证胰酶激活通路的PRSS1 R122H突变小鼠，验证内质网应激通路的CPA1 p.N256K突变小鼠，但尚无相关小鼠模型阐明内质网应激-自噬通路在CP发生发展中的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人源胰腺炎相关CEL-HYB1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法与应用，将CEL-HYB1人源化基因(SEQ ID NO.1)敲入小鼠，采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，定点敲入人源化CEL-HYB1基因，模拟人慢性胰腺炎(CP)的发病过程。
尽管人CEL基因和小鼠Cel基因序列上高度相似，由于CEL-HYB1是大片段结构变异，目前无法直接在小鼠上进行突变模拟，因此我们拟扩增人CEL-HYB1变异，在小鼠Cel基因合适的位置进行替换，一方面能够沉默小鼠Cel基因表达，另一方面使其正常表达人的CEL-HYB1基因。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种人源胰腺炎相关CEL-HYB1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
A、通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和guideRNA(gRNA)，其中guideRNA的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
SEQ ID NO.2：AAGAAGCTCAGTCTCTTGGGTGG，
SEQ ID NO.3：AACAAGAAGCTCAGTCTCTTGGG；
B、通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体，所述的同源重组载体包含3.0kb 5’同源臂、hCEL-HYB1-3xFlag-mCel 3’UTR-polyA和3.0kb 3’同源臂，质粒进行酶切鉴定(5’同源臂的序列如SEQ ID NO.4所示，3’同源臂的序列如SEQ ID NO.5所示)；
C、将Cas9 mRNA、guideRNA和载体(donor vector)显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠，并进行鉴定；
进一步的，所述的步骤C中，将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的小鼠为F0代小鼠，通过PCR扩增及测序对其进行基因型鉴定，长片段PCR鉴定电泳结果，所使用鉴定引物的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示：
SEQ ID NO.6：CCTCCTGCCCCCACCCCCACTCAT，和
SEQ ID NO.7：CCCACCTTCTCAGCCACCTTTTTG。
反应体系：
Reaction Component Volume(μl)
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 13.2
GXL PCR Buffer 2
2.5mM dNTP 2
Primer I(10pmol/μl) 0.5
Primer II(10pmol/μl) 0.5
GXL DNA Polymerase* 0.8
genomic DNA 1
Total 20
*PrimeStar GXL(TaKaRa，Code No：R050A)
反应条件：
Step# Temp(℃) Time Note
1 94 3min -
2 98 15sec -
3 60 15sec -
4 68 3min repeat steps 2-4for 35cycles
5 68 5min -
6 12 - hold
D、PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得F1代小鼠；
由于受精卵早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的F1代小鼠；后续小鼠交配繁殖过程中，当母鼠哺育子代鼠到3周龄时，收集鼠尾粗提DNA进行鉴定。
E、通过短片段PCR的方式对小鼠基因型进行鉴定，鉴别纯合、杂合和野生型小鼠；使用引物对(P1+P2)，(P3+P4)分别扩增，突变型产物为402bp，野生型为697bp(野生型：P1+P2扩增出697bp条带，且P3+P4无条带；杂合子：P1+P2扩增出697bp条带，且P3+P4扩增出小条带402bp；纯合子：P1+P2无条带，且P3+P4扩增出小条带402bp)。
P1：GCGGTGGGAAAGTGCGGGGATAGT(Forward)(SEQ ID NO.8)
P2：CTTGCCAGCCAGGGTGACG(Reverse)(SEQ ID NO.9)
P3：GCTAGAGCTTGGCGTAATCAT(Forward)(SEQ ID NO.10)
P4：CAGTCTTCTTGCCCATAGGTGT(Reverse)(SEQ ID NO.11)。
F、利用Flag标签抗体(货号：CMCTAG(AT0022))，通过Western blot和免疫组化对8周龄小鼠胰腺组织目标基因hCEL-HYB1的表达情况进行分析。
本发明的第二方面，提供一种如上所述的人源胰腺炎相关CEL-HYB1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法构建得到的动物模型在慢性胰腺炎机理研究和治疗药物筛选中的应用。
进一步的，所述的应用中，取不同年龄段小鼠胰腺组织，通过HE染色评价CEL-HYB1小鼠的胰腺病理改变，免疫组化检测CEL-HYB1小鼠胰腺炎症细胞浸润情况。
进一步的，所述的应用中，利用real-time qPCR与Western Blotting对CEL-HYB1小鼠胰腺组织的Chop，Bip和LC3b进行检测，探索潜在的致病通路。
本发明优点在于：
本发明在国际上首次构建CEL-HYB1人源化基因小鼠，也是第一次为CEL-HYB1变异致病提供体内证据，本发明构建的动物模型具有诱导胰腺内质网应激与自噬及自发产生慢性胰腺炎病变的特点，有望发展成为一种可替代传统动物模型的新型实验动物模型，为慢性胰腺炎的药物与基因治疗提供新的理论依据和动物模型。
附图说明
图1.CEL及其假基因CELP结构图。
图2.小鼠Cel和人源CEL编码氨基酸对比。
图3.hCEL-HYB1小鼠构建策略示意图。
图4.采用CRISPR/Cas9技术构建CEL-HYB1人源化基因敲入小鼠的具体流程。
图5.同源重组质粒图谱。
图6.同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳图；数字：F0代小鼠编号；M为1kb DNAmarker。
图7：F1代小鼠5’同源臂(Marker左侧)和3’同源臂(Marker右侧)PCR鉴定电泳图；(数字：F1代小鼠编号；M：1kb DNA ladder)。
图8.PCR鉴定小鼠基因型。
图9.野生型、杂合和纯合CEL-HYB1小鼠的CEL-HYB1表达情况。
图10.野生型、杂合和纯合CEL-HYB1小鼠的Cel表达情况。
图11.小鼠胰腺组织HE染色结果。
图12.小鼠胰腺组织CD45、F4/80检测。
图13.CEL-HYB1小鼠胰腺组织内质网应激与自噬通路检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：CEL-HYB1人源化基因敲入小鼠的构建方法与鉴定
由于人CEL基因和小鼠Cel基因(Cel-201)序列上高度相似，Cel-201(Ensembl号：ENSMUSG00000026818)转录本结构内有11个exons，蛋白翻译起始于exon1，终止于exon11。首先扩增人CEL-HYB1序列，选择Cel-201的合适位置，采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式进行基因导入。
为真实体现人CEL-HYB1在体内的作用，构建过程中一方面需要沉默小鼠本身Cel的表达，插入位置需要在靠前的外显子；另一方面为有效保证人CEL-HYB1的正常表达，我们借用小鼠本身的Cel的信号肽序列(exon1)；因此，我们最终选择在小鼠exon2的位置插入人源CEL-HYB1，mCel-201的3’UTR及SV40-pA(图2)。
在Cel基因exon2位点定点敲入hCEL-HYB1-3xFlag-mCel 3’UTR-polyA表达框(简要过程如图3、图4)。
1)通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和guideRNA(gRNA)，使用crispr.mit.edu来设计guideRNA，选取其中得分较高的结果：
SEQ ID NO.2：AAGAAGCTCAGTCTCTTGGGTGG，和
SEQ ID NO.3：AACAAGAAGCTCAGTCTCTTGGG。
2)通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体(图5)，该载体包含3.0kb 5’同源臂、hCEL-HYB1-3xFlag-mCel 3’UTR-polyA和3.0kb 3’同源臂，质粒进行酶切鉴定；
3)将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠，并进行鉴定：将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的小鼠为F0代小鼠，通过PCR扩增及测序对其进行基因型鉴定，双臂同源重组阳性的F0代小鼠为9、10、14、23、32号，长片段PCR鉴定电泳结果，所使用鉴定引物为(图6)：
SEQ ID NO.6：CCTCCTGCCCCCACCCCCACTCAT，和
SEQ ID NO.7：CCCACCTTCTCAGCCACCTTTTTG。
4)PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得F1代小鼠；由于受精卵早期卵裂速度快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的F1代小鼠；后续小鼠交配繁殖过程中，当母鼠哺育子代鼠到3周龄时，收集鼠尾粗提DNA进行鉴定(图7)，PCR鉴定阳性小鼠为9、10、11、13、17号，经测序确认均为阳性；F1代阳性小鼠PCR鉴定产物测序，共进行了4个测序反应，其中，5’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应，3’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应。
5)通过短片段PCR的方式对小鼠基因型进行鉴定，鉴别纯合、杂合和野生型小鼠(图8)；使用引物对(P1+P2)，(P3+P4)分别扩增，突变型产物为402bp，野生型为697bp(野生型：P1+P2扩增出697bp条带，且P3+P4无条带；杂合子：P1+P2扩增出697bp条带，且P3+P4扩增出小条带402bp；纯合子：P1+P2无条带，且P3+P4扩增出小条带402bp)。
P1：GCGGTGGGAAAGTGCGGGGATAGT(Forward)(SEQ ID NO.8)；
P2：CTTGCCAGCCAGGGTGACG(Reverse)(SEQ ID NO.9)；
P3：GCTAGAGCTTGGCGTAATCAT(Forward)(SEQ ID NO.10)；
P4：CAGTCTTCTTGCCCATAGGTGT(Reverse)(SEQ ID NO.11)。
6)利用标签抗体(图9)，通过Western blot和免疫组化对8周龄小鼠胰腺组织目标基因hCEL-HYB1的表达情况进行分析，发现纯合子和杂合子均存在hCEL-HYB1蛋白的表达，野生型小鼠中无hCEL-HYB1蛋白表达；利用Cel抗体(图10)，通过Western blot和免疫组化对8周龄小鼠胰腺组织原Cel基因的表达情况进行分析，发现杂合小鼠表达量低于野生型的50％，纯合小鼠基本无表达，符合预期情况。
实施例2：CEL-HYB1人源化基因敲入小鼠的表型及致病机制
1)解剖不同年龄段小鼠获取胰腺组织，通过HE染色评价CEL-HYB1小鼠的胰腺病理改变：与野生C57BL/6小鼠相比，3月龄小鼠胰腺尚无明显变化；部分6月龄CEL-HYB1小鼠胰腺出现小叶间隙扩大、炎症细胞浸润，部分12月龄小鼠出现局灶性CP改变，包括腺泡破坏，炎症细胞浸润，萎缩和纤维化等(图11)，同时，免疫组化检测发现与野生C57BL/6J小鼠相比，CEL-HYB1小鼠胰腺CD45、F4/80阳性细胞增多，提示炎症细胞浸润(图12)。
2)real-time qPCR提示CEL-HYB1小鼠胰腺组织的Chop，Bip(内质网应激指标)表达升高，Western Blotting提示LC3b(自噬指标)表达水平增高，提示异常蛋白蓄积激发内质网应激是其潜在的致病通路，并且诱导腺泡细胞自噬增强(图13)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军海军军医大学第一附属医院
<120> 一种人源胰腺炎相关CEL-HYB1基因变异敲入小鼠的构建方法与应用
<130> /
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2078
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
tccataaata cccgaggccc agggggaggg ccacccagag gctgatgctc accatggggc 60
gcctgcaact ggttgtgttg ggcctcacct gctgctgggc agtggcgagt gccgcgaagc 120
tgggcgccgt gtacacagaa ggtgggttcg tggaaggcgt caataagaag ctcggcctcc 180
tgggtgactc tgtggacatc ttcaagggca tccccttcgc agctcccacc aaggccctgg 240
aaaatcctca gccacatcct ggctggcaag ggaccctgaa ggccaagaac ttcaagaaga 300
gatgcctgca ggccaccatc acccaggaca gcacctacgg ggatgaagac tgcctgtacc 360
tcaacatttg ggtgccccag ggcaggaagc aagtctcccg ggacctgccc gttatgatct 420
ggatctatgg aggcgccttc ctcatggggt ccggccatgg ggccaacttc ctcaacaact 480
acctgtatga cggcgaggag atcgccacac gcggaaacgt catcgtggtc accttcaact 540
accgtgtcgg cccccttggg ttcctcagca ctggggacgc caatctgcca ggtaactatg 600
gccttcggga tcagcacatg gccattgctt gggtgaagag gaatatcgcg gccttcgggg 660
gggaccccaa caacatcacg ctcttcgggg agtctgctgg aggtgccagc gtctctctgc 720
agaccctctc cccctacaac aagggcctca tccggcgagc catcagccag agcggcgtgg 780
ccctgagtcc ctgggtcatc cagaaaaacc cactcttctg ggccaaaaag gtggctgaga 840
aggtgggttg ccctgtgggt gatgccgcca ggatggccca gtgtctgaag gttactgatc 900
cccgagccct gacgctggcc tataaggtgc cgctggcagg cctggagtac cccatgctgc 960
actatgtggg cttcgtccct gtcattgatg gagacttcat ccccgctgac ccgatcaacc 1020
tgtacgccaa cgccgccgac atcgactata tagcaggcac caacaacatg gacggccaca 1080
tcttcgccag catcgacatg cctgccatca acaagggcaa caagaaagtc acggaggagg 1140
acttctacaa gctggtcagt gagttcacaa tcaccaaggg gctcagaggc gccaagacga 1200
cctttgatgt ctacaccgag tcctgggccc aggacccatc ccaggagaat aagaagaaga 1260
ctgtggtgga ctttgagacc gatgtcctct tcctggtgcc caccgagatt gccctagccc 1320
agcacagagc caatgccaag agtgccaaga cctacgccta cctgttttcc catccctctc 1380
ggatgcccgt ctaccccaaa tgggtggggg ccgaccatgc agatgacatt cagtacgttt 1440
tcgggaagcc cttcgccacc cccacgggct accggcccca agacaggaca gtctctaagg 1500
ccatgaccgc ctactggacc aactttgcca aaacagggga ccccaacatg ggcgactcgg 1560
ctgtgcccac acactgggaa ccctacacta cggaaaacag cggctacctg gagatcacca 1620
agaagatggg cagcagctcc atgaagcgga gcctgagaac caacttcctg cgctactgga 1680
ccctcaccta tctggcgctg cccacagtga ccgaccagga ggccagttcc atgccctcca 1740
caggggactc tgaggccact cccgtctccc ccgacaggca actccgagtc tgcccccgtc 1800
cctgcaacgg gtgactctca ggatgcccct gtgcccctca caagtgactc tgaggctgcc 1860
cccgtgcccc cctcaggtga ctctgaggct cccccgtacc ctacgggtga ctctgaggcc 1920
cgtgcccacc ttgggtgaca ctgaggctgc cccatccccg ctacgggtga ctctgaggcc 1980
gcccctgtgt cccccacaga tgactccgag gaagctcaga tgctgcagtc attagtttct 2040
agtgtcccat cagccttggt ctcaagaggc cgagaggg 2078
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
aagaagctca gtctcttggg tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
aacaagaagc tcagtctctt ggg 23
<210> 4
<211> 3000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
ttacctccag gtccagtcct ttcccccccc ctccctctgt cattctgtgc ctccattcct 60
tctgggcttt gtctctttct gcctggtatt ctcagggagc cctatccacc cctagtgagg 120
ctcagacatg aaacactacc ctttctctga agaggccacc aagccctggt aagtgagcca 180
tgccaggttt ggctcaggga gctcaccttc catctgtgcc actatgtcct cccctgccag 240
ggcagcctgc actgccccat accctagtgc attacttggg tcctctctct ctcttctctc 300
tctctcttct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctcctctc 360
ccccctcccc tcccctcccc ctccccctcc tcctcctcct ccttcttctc tctctctctc 420
tctccctctc tctctctctc tctctctctc tctcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcacgc 480
aggagtcctt catagattcc ccactgagat aaggggcatt cagtacctca agatgaagcc 540
cacccatttt tctgaaggtg acactaactg aaccctgata aaacagggtt ctatgcggaa 600
cacccagcca gagttggccc tgggaggcac cccctcgaca atatccatgc cacctgcctc 660
tgctcccagg tgggcagtaa cccacacagg tgcactgtgg gcaccactcc ggatgctcag 720
ggccagcctg acctgggaaa aaatggacca tcccacacct gtgtgtctgt gtatacatgg 780
tatgcacaca catgaccttg gccccagctc cataaatact ggagaagagg agagaaggcc 840
gcctagaggc agacactcac catggggcgc ctggaggttc tatttcttgg cctcacctgc 900
tgcttggcag cggcttgtgc tgcaaaggta agccggaacc ctacaaggga ctacagccct 960
ctctcattca ctaagatctg ggaactggga cagagcctgg agggtgggag acagagtaca 1020
gaaagacaag aaaaggccag cgagcccact agcactccaa gctctggtcc tgcctgagac 1080
acccagtttg tcttattcac atgaagccca gtgcaacatg caaaactgca ctggagtctc 1140
acaccaggag cagttttatg taagaatgtc ccatgcactg tttgaaagat ttatactaga 1200
agcccactag tgctctgtgg tttcaggtat gcctaagtct ggcaagcctc cccacagacc 1260
ctggcttttc cttttctaga ggggtctcct gccaacagag aagcagtttg cttggcatta 1320
cacagcaacc atatcctgtt cttaaatagg aacctgaaat gtctgttcca aatcagggct 1380
ctggctccca agtgccctcc atttcctgct ccccctgaga aggggtgaga cctacccata 1440
cccgctgtgt gccctgagga gctgcaccag ctcttctggg gcgcctacaa catctgccct 1500
ttaaccaccc ttcttgggag tgtgaggacg agtcacagaa agctcaacag atgcaggaag 1560
agggcatagg tctctgcaca ggggccccag caactcaccc aaacgctcca gccttagttc 1620
tctggccctt gtcttgtttt cttggaccct ggagaccatc ctggagaatc ctcagtgtca 1680
ccctcctgga gcctggatgt tacagttcgg tccggggctc ttgccatggg aaggaagttg 1740
ttttctttct tggaagaggt tttttttttt ttttgtgggg ggtggttaga aggacctaac 1800
tgtcccacta ctgctccacc accagcacca gcacactgtc ctgccactgg ccaggatcat 1860
tgcatctggc ccagccctgg gcactcaagt caaccactac cgcacagaca cacttctgag 1920
aggtggcatc acactcacac acacacacac acacacacac actatcgcac agacacactt 1980
ctgagaggtg gcatcacact cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 2040
cacacacaca cacatcccta agctggcttt ctgactcctc ccagtaacca agaaccttag 2100
ataccccaat gatctgtgtt gtctctctgg ctcttctctt cagtttcctt acacagtata 2160
gtagggagtc aatcagcctg gacttagagg gcttctggga tgccagcttg ggcttgcagc 2220
tacaggccac ctacttcccc ctacctgaaa ccttgcacag aggagaagca ggaggccata 2280
ctatcaccac tgccaagtaa gcggagctgc tcctgcatgt gccctggact gatgcaggca 2340
ggacaggagg ggacatgcac tgcacagagg ttagacagcc tcatctcaac aaaacaactc 2400
gcggtgggaa agtgcgggga tagtgggcag atgaggacct gactccagac cttgggttga 2460
gctggacacc aaatagcagt actgattggc cctgtgaaga tccgggcatg gggccaccag 2520
ttccatgccc atctaggaag gcagtgggga gaggtggggg caggagagag agatctcaga 2580
aacctatggc aatgttagaa accctctgga agcactgagc atccaccact gtctgtagtt 2640
ggacaggcct tccctctgac agccatcaag ccttagagga aggtgcggtg gcccatctta 2700
cctatgggga aattgaggcc ccaggtctca gccgagatct agactgtcac tccagcttag 2760
cagacgtggg cggaagtagc ctcagctacc tgaaggagga tgtgccaggg tctgggagga 2820
aagggaatca gcccctccag cacttggcag aggacctgct agcaccctgg agcccgctcc 2880
atcagccact ctggattcag gctagccatg cagaagccca tctgacctgc cctgtctcac 2940
ctacagttgg gggctgtgta cacagaaggc ggtttcgtgg agggcgtcaa caagaagctc 3000
<210> 5
<211> 3000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
agtctcttgg gtggtgactc tgttgacatc ttcaagggca tcccctttgc cactgccaag 60
accttggaga atcctcagcg tcaccctggc tggcaaggtg ggtgctgagt gctgggtgct 120
gggtgctggg tgctgggtga tgggctggcc ctggctggtt ctctttacac cttgcccttc 180
tctcactgta gggacgctga aggctacaaa cttcaagaaa cgatgcctac aggccaccat 240
cacccaggac aacacctatg ggcaagaaga ctgcctctac ctcaatatct gggtgcccca 300
gggcaggaag cagggtatgg atcccagttt cccagagaac cccaccccac ccccacccca 360
gaacttcaag ccctggtcta ggatccattt ggtgtcgtca agctcaacag ccctgaaatc 420
agcactgagg cgaggagggg gtgccaactg ctgatcctca cagccctgcc tgagtacctg 480
ctccaacagg gctactgagc tgtctgggga gaggacctgt tggtgtctga agtccctgtc 540
tgcccctttc agtgtcccac aacctgcctg tgatggtctg gatctatgga ggtgccttcc 600
tcatgggatc tggccaaggg gccaattttc tcaaaaacta cctgtatgac ggggaggaga 660
tcgccactcg gggcaacgtc attgtggtca ccttcaacta ccgtgttgga cccttgggtt 720
tccttagcac cggggatgct aaccttccag gtatgtcgga gcctccgact gtaagagcgg 780
gaatagtgaa tgcacaggac cctgtgcgga gagacgcact tcagaagctt ctaagttgac 840
agccgagggg aggcaccttc ttcacagagt tgggggacta aagctaaact atgggacagg 900
ggagcctgag gcagccgccg ggaaatgaga gaggccaaga aacagacaga atggcagaga 960
ttcaagttga gccctgaaaa gataccatag gaaagatgcc aaagggaaga cagacagtag 1020
gaggaaatgt gcagaatgga gtcaggccga gccactggtg gctgtgcctc ccacgcctcc 1080
caccttcctg acccactccc cacccccatc ccaccgctac tcccctttaa actcagcctc 1140
ctgaagatct accatttgcc ctcctgggaa tgggcacatt gactgttaat ctctaggtca 1200
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cagaagaacc cacttttctg ggccaaaacg gtgagcacag cagggcagga gtaggcaggg 1680
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gggagatagg gaggggcaga gagaagccta acatgagtcc cagacagcag aaacgcacac 2340
acggtttcag ggagatgtgt agacccagac ccagggccac tgtgctggaa ggtaactctt 2400
aagcttcctt gtaaatgtgt caatcacttg taaatttcca aatatttggt ccttccggct 2460
ggagctgcca ccagcaaaca tgtagaacca gcctgctagc ctaggacatt ggattttttc 2520
tttgcttacc cttccaaagc aaatctagca gtctgagcat gatctgtgcg catgatagtt 2580
agacactcta ccactgagca cctctgccac tcaaacagat aattttattt ggagagccac 2640
tgaagaaagc ctggctgtgc tgggccgaag gaaagccagg gtctctgcct gctgagctag 2700
agcacagacc agctggcaag cctgggggac aggcaggcct tacccacggc agccagcagg 2760
ccacctcatc cctggtggag gtgtaacaag gaaagaggga gggcacaggg atgctcaggc 2820
agaccagaca gtcacagtct acggagcagt ggactcttca tgtgctcatg agacagtctg 2880
cgaatgcttt ggcctggcat acccagaagg gcgccacact gctcagcatc ccacattcag 2940
gacagtcacc cctatcacta gctgattgtg gccaaaggtc cctggggcta gggttgagga 3000
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
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<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
cccaccttct cagccacctt tttg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
gcggtgggaa agtgcgggga tagt 24
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
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<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
gctagagctt ggcgtaatca t 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
cagtcttctt gcccataggt gt 22

Claims (6)

1.一种人源胰腺炎相关CEL-HYB1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和guideRNA，其中guideRNA的序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示；
B、通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体，所述的同源重组载体包含3.0kb 5’同源臂、hCEL-HYB1-3xFlag-mCel 3’UTR-polyA和3.0 kb 3’同源臂，质粒进行酶切鉴定；5’同源臂的序列如SEQ ID NO.4所示，3’同源臂的序列如SEQ ID NO.5所示；hCEL-HYB1的序列如SEQ ID NO.1所示；
C、将Cas9 mRNA、guideRNA和载体显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠，并进行鉴定；
D、PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得F1代小鼠；
E、通过短片段PCR的方式对小鼠基因型进行鉴定，鉴别纯合、杂合和野生型小鼠；使用引物对P1+P2，P3+P4分别扩增，突变型产物为402bp，野生型为697bp；所述的P1、P2、P3、P4的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；
F、利用Flag标签抗体，通过Western blot和免疫组化对8周龄小鼠胰腺组织目标基因hCEL-HYB1的表达情况进行分析。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤C中，将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的小鼠为F0代小鼠，通过PCR扩增及测序对其进行基因型鉴定，长片段PCR鉴定电泳结果，所使用鉴定引物的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的纯合型小鼠：P1+P2扩增无条带，且P3+P4扩增出小条带402 bp。
4.一种如权利要求1-3任一所述的人源胰腺炎相关CEL-HYB1杂合变异敲入小鼠动物模型的构建方法构建得到的动物模型在慢性胰腺炎机理研究和治疗药物筛选中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用中，取不同年龄段小鼠胰腺组织，通过HE染色评价CEL-HYB1小鼠的胰腺病理改变，免疫组化检测CEL-HYB1小鼠胰腺炎症细胞浸润情况。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用中，利用real-time qPCR和Western Blotting 对CEL-HYB1小鼠胰腺组织的Chop，Bip和LC3b进行检测，探索潜在的致病通路。
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