CN113122494A - 人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法。本发明提供的人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法，包括：将人前列腺上皮细胞以A培养基和B培养基交替培养。其中A培养基为含有非那雄胺的培养基。在本发明中，通过改良诱导的条件，使耐药的人前列腺上皮细胞性状稳定，可稳定多次传代，也可用于良性前列腺增生患者非那雄胺耐药的分子机制进行深入研究。并且，该构建方法简便易行、建立时间短，并且耐药指数达到100以上。

Description

人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法。
背景技术
良性前列腺增生是一种随年龄增长而逐渐发生的中老年男性疾病，病理上以前列腺上皮和基质组织增生为主，临床上表现为尿频、尿急、尿流细弱、淋漓不尽、进行性排尿困难和急性尿潴留等下尿路症状，严重者甚至可诱发泌尿系统结石、肾功能衰竭及心脑血管疾病。流行病学研究表明，大于50岁的男性群体中良性前列腺增生发生率超过半数，而中重度下尿路症状发生率约占三分之一，因此是目前泌尿男科最为常见的疾病之一。
非那雄胺是唯一特异性作用于前列腺的药物，它通过降低血清双氢睾酮水平来阻断雄激素受体信号传导，从而抑制上皮细胞的增殖和促进凋亡，显著缩小前列腺体积。长期使用非那雄胺可使得前列腺总体积减少20％，并可以显著改善良性前列腺增生患者的尿流率和前列腺症状评分。因此，非那雄胺是决定良性前列腺增生临床疗效的关键性药物。但无法避免的是大部分良性前列腺增生患者会对非那雄胺产生耐药性。
目前关于尚缺乏良性前列腺增生对非那雄胺产生耐药性系统性的研究，其中的分子机制也部清楚。研究非那雄胺耐药机制并探索逆转耐药策略是解决问题的关键，因此急需良好的耐药机制研究模型。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法。
本发明提供的人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法，包括：将人前列腺上皮细胞以A培养基和B培养基交替培养；
所述A培养基为含有非那雄胺的K-SFM完全培养基，其中非那雄胺的浓度依次为0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、8.0μmol/L、16.0μmol/L、32.0μmol/L和64.0μmol/L；
所述B培养基为不含非那雄胺的K-SFM完全培养基。
本发明是以前列腺上皮细胞RWPE-1为亲本细胞，采用非那雄胺模拟治疗过程，采用大剂量冲击结合药物浓度梯度诱导，分别建立获得性耐药的前列腺上皮细胞系RWPE-1，并测定其生物学特性以评价耐药性。
在本发明的方法中，依次以如下培养基对复苏的人前列腺上皮细胞培养：
含0.5μmol/L非那雄胺的K-SFM完全培养基；
不含非那雄胺的K-SFM完全培养基；
含1.0μmol/L非那雄胺的K-SFM完全培养基；
不含非那雄胺的K-SFM完全培养基；
含2.0μmol/L非那雄胺的K-SFM完全培养基；
不含非那雄胺的K-SFM完全培养基；
含4.0μmol/L非那雄胺的K-SFM完全培养基；
不含非那雄胺的K-SFM完全培养基；
含8.0μmol/L非那雄胺的K-SFM完全培养基；
不含非那雄胺的K-SFM完全培养基；
含16.0μmol/L非那雄胺的K-SFM完全培养基；
不含非那雄胺的K-SFM完全培养基；
含32.0μmol/L非那雄胺的K-SFM完全培养基；
不含非那雄胺的K-SFM完全培养基；
含64.0μmol/L非那雄胺的K-SFM完全培养基；
不含非那雄胺的K-SFM完全培养基。
本发明提供的方法中，所述人前列腺上皮细胞为RWPE-1细胞。
本发明所述方法中，所述人前列腺上皮细胞为新鲜分离的细胞，也为冻存的细胞，本发明对此不做限定。在实施例中，其为冻存的初代RWPE-1细胞。冻存的初代RWPE-1细胞在构建耐药细胞前，还包括复苏的步骤。本发明中，人前列腺上皮细胞的复苏包括：将冻存的人前列腺上皮细胞于37℃解冻，离心取细胞沉淀然后以新鲜的K-SFM完全培养重悬，培养至细胞密度为4万细胞/cm2～7万细胞/cm2。
本发明中，所述K-SFM完全培养基包括K-SFM基础培养液、生长因子和1％双抗。
一些实施例中，所述生长因子及其浓度为表皮生长因子(EGF，5μg/L)、牛脑垂体提取物(BPE，70mg/L)、氢化可的松(0.5mg/L)和普通胰岛素(5mg/L)，所述双抗为青霉素和链霉素。
所述培养的接种密度为2万～4万活细胞/cm2；所述培养过程中细胞的密度为4万～7万活细胞/cm2。
所述交替培养中，A培养基培养的作用是诱导细胞产生耐药性。一些实施例中，所述A培养基培养的时长为40～60h。一些具体实施例中，所述A培养基培养的时长为48h。B培养基培养的作用是使细胞稳定的生长和传代。一些实施例中，B培养基培养的时长为48h～72h。
本发明所述交替培养中，A培养基培养后在以B培养基培养之前，还包括收集细胞和清洗细胞的步骤。
所述收集细胞包括以0.05wt％胰蛋白酶消化、以2wt％FBS终止消化和离心去除胰酶的步骤；
所述清洗细胞采用PBS缓冲液，清洗的次数为3次。
在本发明中，所述培养的条件为37℃、CO2体积百分比浓度为5％，饱和湿度。
本发明还提供了所述方法构建获得的人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型。
本发明还提供了构建的非那雄胺耐药人前列腺上皮细胞作为模型在制备增生性疾病的药物筛选试剂中的应用。所述增生性疾病为前列腺增生，具体为
本发明提供的人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法，包括：将人前列腺上皮细胞以A培养基和B培养基交替培养。其中A培养基为含有非那雄胺的培养基。在本发明中，通过改良诱导的条件，使耐药的人前列腺上皮细胞性状稳定，可稳定多次传代，也可用于良性前列腺增生患者非那雄胺耐药的分子机制进行深入研究。并且，该构建方法简便易行、建立时间短，并且耐药指数达到100以上。
附图说明
图1示倒置显微镜下RWPE-1与RWPE-1/非那雄胺耐药的细胞形态；
图2示RWPE-1与RWPE-1/非那雄胺耐药细胞在不同浓度非那雄胺作用下的抑制曲线；
图3示RWPE-1与RWPE-1/非那雄胺耐药细胞对非那雄胺的IC50(半数抑制剂量)；
图4示RWPE-1与RWPE-1/非那雄胺耐药细胞克隆计数情况；
图5示RWPE-1与RWPE-1/非那雄胺耐药细胞克隆形成图像；
图6示RWPE-1与RWPE-1/非那雄胺耐药细胞非那雄胺(5μM)作用后的细胞凋亡情况；
图7示RWPE-1与RWPE-1/非那雄胺耐药细胞非那雄胺(5μM)作用后的细胞周期情况；
图8示WPMY-1、PC3和BPH-1及其非那雄胺耐药细胞对非那雄胺的IC50(半数抑制剂量)。
具体实施方式
本发明提供了人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验技术方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均购买于具备国家资质的常规生物试剂公司。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值，统计学方法为t检验和单因素方差分析，统计差异为P<0.05，统计软件为SPSS 23.0。
K-SFM培养基(Invitrogen公司，货号：17005-042，包含基础培养液1瓶+生长因子)、
DMEM培养基(Gibco公司，货号：11965092)
F12K培养基(Gibco公司，货号：21127030)
RPMI 1640培养基(Gibco公司，货号：A1049101)
胎牛血清(GIBCO公司，货号：26140079)、
0.25％EDTA胰蛋白酶(GIBCO公司，货号：25200-072)
100×青霉素/链霉素(GIBCO公司，货号：R-015-10)。
磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，GIBCO公司，货号：C10010500BT)。
人前列腺上皮细胞RWPE-1购自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，为2017年从美国模式菌种收集中心(ATCC)新引进产品。人前列腺上皮细胞RWPE-1来源于一位54岁白人男性的正常前列腺组织切片的周围区域的上皮细胞用单拷贝的人乳头瘤病毒18(HPV-18)进行转化而建立的。非那雄胺购自于Selleck公司，货号为S1197，规格为200mg装。
K-SFM完全培养基配置方法(500ml)：K-SFM基础培养液495ml+生长因子2管+5ml的100×青霉素/链霉素。
CCK-8工作液的制备方法为：由1体积份CCK-8(MCE公司，货号：HY-K0301)和9体积份K-SFM完全培养基混合而成。
相对抑制率计算公式(％)＝100-(A非那雄胺-A空白/ADMSO-A空白)×100
A非那雄胺：具有细胞、CCK-8溶液和非那雄胺处理样本的吸光度值
A空白：具有CCK-8溶液和K-SFM培养基而无细胞样本的吸光度值
ADMSO：具有细胞、CCK-8溶液和DMSO处理(无非那雄胺处理)样本的吸光度值
耐药指数计算公式＝RWPE-1细胞的IC50/RWPE-1细胞的IC50
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1、非那雄胺耐药的人前列腺上皮细胞的建立
一、非那雄胺耐药的人前列腺上皮细胞的制备方法
采用非那雄胺浓度梯度、间歇作用体外诱导法构建非那雄胺耐药的人前列腺上皮细胞。具体步骤如下：
1、复苏初代RWPE-1细胞
液氮保存的初代RWPE-1于37℃水浴迅速解冻，800rpm/min离心5分钟后，丢弃上层培养基，用新配置的K-SFM完全培养基重悬细胞后，转移至超低吸附细胞培养皿(Corning公司，货号：3261)，然后于置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养24h，直至细胞培养至4万～7万细胞/cm2后开始实验。
2、制备非那雄胺培养体系
用K-SFM完全培养基和非那雄胺混合后得到培养体系，然后用于更换培养好的RWPE-1的培养基，该培养体系中，RWPE-1细胞的接种密度为5万细胞/cm2，初始非那雄胺的浓度为0.5μmol/L。
3、培养
将步骤2得到的培养体系置于37℃、置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养48h，然后弃培养基，使用0.05％胰蛋白酶消化细胞。然后添加2％FBS终止消化并离心去除胰酶，收集RWPE-1细胞。
4、清洗
取步骤3收集的RWPE-1细胞，加入适量PBS缓冲液清洗3次，去除残留非那雄胺对RWPE-1细胞的影响。
5、稳定生长、传代和复苏
取完成步骤4的细胞，加入K-SFM完全培养基，置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养，直至细胞恢复正常生长。
6、非那雄胺浓度梯度处理
重复步骤2～5，将“非那雄胺的浓度为0.5μmol/L”依次替换为“非那雄胺的浓度为1.0μmol/L”、“非那雄胺的浓度为2.0μmol/L”、“非那雄胺的浓度为4.0μmol/L”、“非那雄胺的浓度为8.0μmol/L”、“非那雄胺的浓度为16.0μmol/L”、“非那雄胺的浓度为32.0μmol/L”、“非那雄胺的浓度为64.0μmol/L”其它步骤均相同，获得非那雄胺耐药的人前列腺上皮细胞RWPE-1(记为RWPE-1/非那雄胺耐药细胞)。最后经过检测，在非那雄胺浓度为64.0μmol/L时，非那雄胺耐药的人前列腺上皮细胞RWPE-1可稳定生长、传代和复苏。
在诱导筛选获得非那雄胺耐药的人前列腺上皮细胞RWPE-1的过程中，将初代RWPE-1细胞常规培养并传代，最终使初代细胞和非那雄胺耐药的人前列腺上皮细胞RWPE-1具有大致相同的传代次数。
二、细胞形态学观察
在倒置显微镜下分别观察RWPE-1细胞和RWPE-1/非那雄胺耐药细胞的形态，比较两者细胞形态、大小及内容物等。
实验结果见图1(A为RWPE-1，B为RWPE-1/非那雄胺耐药细胞)。结果表明，RWPE-1细胞呈单层贴壁生长，RWPE-1/非那雄胺耐药细胞呈部分叠加贴壁生长；RWPE-1细胞大小均一、边界清晰、细胞多呈梭形；而RWPE-1/非那雄胺耐药细胞明显变短变圆，且有成团聚集生长趋势，胞质内颗粒样物质增多。
实施例2、检测RWPE-1细胞及RWPE-1/非那雄胺耐药细胞对非那雄胺的敏感性
1、RWPE-1细胞及RWPE-1/非那雄胺耐药细胞对非那雄胺的敏感性
设置实验组，然后进行如下步骤：
(1)在含1％青霉素/链霉素的K-SFM完全培养基中培养待测细胞(RWPE-1细胞及RWPE-1/非那雄胺耐药细胞)，胰蛋白酶消化后获得细胞悬浮液。
(2)取96孔板，每孔接种100μL步骤(1)制备的细胞悬浮液(每孔含待测细胞约1万个)，置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养24h。
(3)完成步骤(2)后，取所述96孔板，加入非那雄胺注处理，处理体系中的非那雄胺的浓度为10-4μM/L、10-3μM/L、10-2μM/L、10-1μM/L、100μM/L、101μM/L、102μM/L和103μM/L，每个非那雄胺浓度设置3个复孔。
(4)完成步骤(3)后，将所述96孔板置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养48h，然后弃掉各孔中培养基，每孔迅速加入100μL CCK-8工作液，置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养2h。最后采用酶标仪检测450nm处的吸光值，按吸光值在1.0～2.0之间的组(按培养时间不同分组的)的数据计算RWPE-1/非那雄胺耐药细胞及RWPE-1细胞的增殖程度。
设置空白对照组：用等体积含“1％青霉素/链霉素的K-SFM完全培养基”代替细胞悬浮液，其它操作同实验组，每个非那雄胺浓度设置3个复孔。
设置细胞对照组：用等体积“DMSO”代替非那雄胺注，其它操作同实验组。细胞悬浮液设置3个复孔。
以非那雄胺在孔中的浓度为横坐标，相对抑制率为纵坐标，比较非那雄胺处理后待测细胞增殖的抑制程度(见图2)。
实验结果表明(见图2及图3)，RWPE-1细胞的IC50为0.46μM/L，RWPE-1/非那雄胺耐药细胞的IC50为86.17μM/L；两组之间具有显著性差异(P<0.01)，耐药指数为187。
上述结果表明，实施例1采用的方法处理的RWPE-1对非那雄胺产生耐药，是一个理想的非那雄胺耐药机制研究模型。
实施例3、检测RWPE-1/非那雄胺耐药细胞及RWPE-1细胞克隆形成能力
(1)在含1％青霉素/链霉素的K-SFM完全培养基中培养待测细胞(RWPE-1/非那雄胺耐药细胞及RWPE-1细胞)，胰蛋白酶消化后获得细胞悬浮液。
(2)取6孔板，每孔接种2mL步骤(1)制备的细胞悬浮液(每孔约含待测细胞200个)，然后置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养，每周换K-SFM完全培养基一次。
(3)待取步骤(2)细胞在光镜下可以看到克隆群后，加入1ml的PBS缓冲液漂洗3次，然后逐滴加入1ml的无水乙醇固定20min，再用1ml的PBS缓冲液漂洗3次。
(4)完成步骤(3)后，每个孔加入1ml结晶紫染色液对细胞进行染色，最后光镜下拍照，分析细胞的克隆形成能力。
实验结果(见图4及图5)表明，与RWPE-1相比，RWPE-1/非那雄胺耐药细胞的克隆数目显著增多(P<0.001)，说明RWPE-1/非那雄胺耐药细胞的增殖能力更强。
实施例4、检测非那雄胺处理后，RWPE-1细胞及RWPE-1/非那雄胺耐药细胞凋亡
(1)在含1％青霉素/链霉素的K-SFM完全培养基中培养待测细胞(RWPE-1及RWPE-1/非那雄胺耐药细胞)，胰蛋白酶消化后获得细胞悬浮液。
(2)取6孔板，每孔接种2mL步骤(1)制备的细胞悬浮液(每孔约含待测细胞30万个)，分别用DMSO或非那雄胺(5μM/L)处理，然后置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养48h。
(3)用不含EDTA胰蛋白酶消化后取细胞悬浮液在室温800rpm/min离心5min，收集沉淀。
(4)取步骤(3)收集的沉淀，加入1mL预冷的PBS缓冲液重悬细胞，然后在室温800rpm/min离心5min，收集细胞沉淀。
(5)取步骤(4)收集的沉淀，加入300μL Binding Buffer重悬，然后加入5μl的Annexin V-FITC混匀后，室温避光后孵育15min。
(6)取步骤(5)收集的细胞悬液加入5μl的PI进行染色，补加200μL BindingBuffer，然后上机用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，最后根据流式结果分析细胞凋亡情况。
实验结果(见图6)表明，用非那雄胺(5μM/L)处理后，与RWPE-1相比，RWPE-1/非那雄胺耐药细胞凋亡细胞比例降低，说明RWPE-1/非那雄胺耐药细胞已对非那雄胺产生耐药。
实施例5、检测RWPE-1细胞及RWPE-1/非那雄胺耐药细胞的细胞周期
(1)在含1％青霉素/链霉素的K-SFM完全培养基中培养待测细胞(RWPE-1及RWPE-1/非那雄胺耐药细胞)，胰蛋白酶消化后获得细胞悬浮液。
(2)取6孔板，每孔接种2mL步骤(1)制备的细胞悬浮液(每孔约含待测细胞30万个)，分别用DMSO或非那雄胺(5μM/L)处理，然后置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养48h。
(3)胰蛋白酶消化后取细胞悬浮液在室温800rpm/min离心5min，收集沉淀。
(4)取步骤(3)收集的沉淀，加入1mL预冷的PBS缓冲液重悬细胞，然后在室温800rpm/min离心5min，收集细胞沉淀。
(5)取步骤(4)收集的沉淀，加入250μL预冷的PBS缓冲液重悬，然后逐滴加入750μL预冷的无水乙醇(边滴加边摇动)，混匀后置于4℃冰箱中过夜固定。
(6)完成步骤(5)后，室温800rpm/min离心5min，收集细胞沉淀。
(7)取步骤(6)收集的沉淀，加入1mL PBS缓冲液重悬，室温800rpm/min离心5min，收集细胞沉淀。
(8)取步骤(7)收集的沉淀，加入300μL PI/RNase缓冲液，室温避光孵育15min；细胞经筛网过滤后用流式细胞仪检测细胞周期，最后根据流式结果分析细胞周期的分布情况。
实验结果(见图7)表明，与RWPE-1相比，RWPE-1/非那雄胺耐药细胞的S期(40.7％vs.30.5％，P＜0.05)与G2/M期细胞(55.3％vs.41.6％，P＜0.05)的比例明显增多；用非那雄胺(5μM/L)处理RWPE-1后，G2/M期细胞比例升高；而用非那雄胺处理RWPE-1/非那雄胺耐药细胞后，细胞周期的变化不大，说明RWPE-1/非那雄胺耐药细胞已对非那雄胺产生耐药。
实施例6、相同方法建立其它非那雄胺耐药前列腺细胞及非那雄胺敏感性的测定
1、以前列腺间质细胞WPMY-1、良性前列腺增生细胞BPH-1以及前列腺癌细胞PC3为材料，以实施例1的方法构建耐药细胞系。
2、细胞培养：
前列腺间质细胞WPMY-1培养基为DMEM+10％的胎牛血清+1％的双抗；
良性前列腺增生细胞BPH-1培养基为RPMI 1640+10％的胎牛血清+1％的双抗；
前列腺癌细胞PC3培养基为F12K+10％的胎牛血清+1％的双抗；
各组细胞置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度的培养箱中培养24h，直至细胞培养至4万～7万细胞/cm2后开始实验。
3、构建非那雄胺耐药前列腺细胞(WPMY-1、PC3和BPH-1)过程同实施例1过程。
4、检测非那雄胺耐药前列腺细胞(WPMY-1、PC3和BPH-1)非那雄胺敏感性过程过程同实施例2方法。
实验结果表明(见图8)，WPMY-1细胞的IC50为14.79μM/L，WPMY-1/非那雄胺耐药细胞的IC50为15.16μM/L；两组之间无显著性差异(P>0.05)；BPH-1细胞的IC50为22.18μM/L，BPH-1/非那雄胺耐药细胞的IC50为20.36μM/L；两组之间无显著性差异(P>0.05)；PC3细胞的IC50为17.30μM/L，PC3/非那雄胺耐药细胞的IC50为16.49μM/L；两组之间无显著性差异(P>0.05)。
上述结果表明，相对于RWPE-1而言，其他前列腺细胞采用本发明提供的方法进行诱导，不能产生非那雄胺耐药性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.人前列腺上皮细胞非那雄胺耐药模型的构建方法，包括：将人前列腺上皮细胞以A培养基和B培养基交替培养；
所述A培养基为含有非那雄胺的K-SFM完全培养基，其中非那雄胺的浓度依次为0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、8.0μmol/L、16.0μmol/L、32.0μmol/L和64.0μmol/L；
所述B培养基为不含非那雄胺的K-SFM完全培养基。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述人前列腺上皮细胞为RWPE-1细胞。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述K-SFM完全培养基包括K-SFM基础培养液和生长因子和1％双抗。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述生长因子及其浓度为表皮生长因子(EGF，5μg/L)、牛脑垂体提取物(BPE，70mg/L)、氢化可的松(0.5mg/L)和普通胰岛素(5mg/L)，所述双抗为青霉素和链霉素。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述培养的接种密度为2万～4万活细胞/cm2；所述培养过程中细胞的密度为4万～7万活细胞/cm2。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述交替培养中，A培养基培养的时长为40～60h，B培养基培养的时长为48h～72h。
7.根据权利要求1或6所述的构建方法，其特征在于，所述交替培养中，A培养基培养后在以B培养基培养之前，还包括收集细胞和清洗细胞的步骤。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述收集细胞包括以0.05wt％胰蛋白酶消化、以2wt％FBS终止消化和离心去除胰酶的步骤；
所述清洗细胞采用PBS缓冲液，清洗的次数为3次。
9.根据权利要求1～8任一项所述的构建方法，其特征在于，所述培养的条件为37℃、CO2体积百分比浓度为5％，饱和湿度。
10.权利要求1～9任一项所述方法构建的非那雄胺耐药人前列腺上皮细胞作为模型在制备增生性疾病的药物筛选试剂中的应用。
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