CN113122462A - 一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法，属于生物工程技术领域。本发明利用含高渗盐的培养基培养带荚膜细菌，以得到感受态细胞，再利用电击转化方法使外源DNA或转座复合体进入带荚膜细菌的细胞内，提高带荚膜细菌的遗传转化效率，获得转化子或突变株。与现有技术相比，本发明通过适当提高普通LB培养基中的NaCl浓度来达到提高转化效率的目的。实验结果表明，这种处理能有效提高转座突变株得率，是一种性价比高、简单有效的处理方法，在具荚膜细菌的遗传转化和基因工程操作中将有广泛应用前景。

Description

一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法。

背景技术

非豆科植物来源的固氮菌(如联合固氮菌)的应用开发是近年来微生物固氮领域的研究热点，国内外研究者从水稻、草坪草、小麦等植物中分离鉴定了许多固氮菌株，其中一些固氮菌对农作物还有明显的促进生长作用，在农业生产及农田生态系统的保护方面显示了良好的应用前景。由于固氮菌能固定空气中的氮气，并转化成氨，可以增加土壤中的氮素含量，提高肥力，减少对化学氮肥的依赖，减轻甚至消除由于过量施用化学氮肥而造成的土壤盐碱化、水体富营养化等环境污染危害。为了能更好地利用固氮菌，将之开发成菌肥或生物菌剂，需要采用遗传转化等方法进行定向改造。由于一些固氮菌外被很厚的荚膜，这造成了遗传转化的很大困难。应用质粒采用通常的化学转化法(氯化钙热击转化法)对这类菌来说根本无效，只能采用电击转化的方法来进行遗传改造，比如转座插入突变、同源重组基因敲除等。如何减少荚膜的产生，增加细菌细胞和外源遗传物质的接触机会，提高转化率或突变率是固氮菌基因工程领域的一个难题。联合固氮菌GXGL-4A分离自玉米，该菌为兼性厌氧菌，有着很好的固氮活性，对玉米、黄瓜和水稻的生长都有着很好的促进作用，但是该菌细胞外被一层较厚的荚膜紧紧覆盖，遗传转化十分困难。采用传统的细菌结合转移、氯化钙化学转化法等均难以实现质粒转化，进行遗传突变株的构建更为困难，转化率很低，难以制备大量的突变体，这限制了此菌在农业上的开发利用。因此，从抑制荚膜生成，消除转化过程中这一物理障碍，提高细菌的转化效率十分必要，这方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种提高带荚膜细菌(如固氮菌GXGL-4A)的遗传转化率的方法。

采用本发明的方法可以很方便地获得大量转化子。这种方法适用于所有同样带有厚荚膜的其他细菌，方便进行质粒转化、Tn5转座插入突变、转座复合体的电击转化等，简单有效。本发明的方法也适用于快速构建带荚膜细菌的突变体库，在短时间内获得大量突变株。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明首先提供一种制备带荚膜细菌感受态细胞的方法，利用含高渗盐的培养基培养带荚膜细菌，以得到感受态细胞。

在本发明的一个实施方式中，所述带荚膜细菌包括固氮菌，所述固氮菌包括固氮菌GXGL-4A。

在本发明的一个实施方式中，所述含高渗盐的培养基指含有15g/L NaCl的培养基。

本发明通过适当提高LB培养基中的NaCl浓度，创造一定的渗透势，在此胁迫逆境下细菌细胞被迫失水，荚膜结构将遭到一定的破坏，变得更加蓬松，甚至部分脱落，粘多糖层厚薄不一，在荚膜较窄的区域或者有裂隙的部位遗传物质更易通过荚膜层进入胞内，以完成遗传转化或同源重组突变、转座插入突变等过程，提高了转化效率。如图1所示。

在本发明的一个实施方式中，制备带荚膜细菌感受态细胞的方法，具体包括以下步骤：

A、普通LB培养基过夜培养带荚膜细菌，活化细菌，

B、再以1-2％接种量接种于含高渗盐的培养基中培养到对数前期，

C、低温下离心收集细菌沉淀，PEB电击缓冲液洗去杂质和菌体碎片，得到细菌感受态细胞。

步骤A中，普通LB培养基过夜培养带荚膜细菌，活化细菌的具体方法为：菌条件下接种带荚膜细菌野生株，培养基采用普通的LB培养基(NaCl终浓度为10g/L)，37℃，180rpm摇菌，过夜培养。

在本发明的一个实施方式中，步骤B中，培养到对数前期是指当OD₆₀₀为0.6时。当细菌培养至对数期前期(OD₆₀₀为0.6)时，可收获较多的细菌细胞，由于细胞处于生长旺盛阶段，因此细胞活性好，在进行电击转化时不易被杀死，且电击后恢复生长快。

在本发明的一个实施方式中，步骤B的具体方法为，将过夜培养细菌按1-2％接种量接种到高渗LB培养基中(NaCl终浓度为15g/L)，在37℃下培养，当OD₆₀₀达到0.6时停止培养，冰浴。

在本发明的一个实施方式中，步骤C的具体方法为，在4℃下4000rpm离心10min收集细菌，弃去上清液，采用事先冰浴过的PEB电击缓冲液重悬细胞，重复离心、重悬2次，最后细菌细胞重悬在PEB电击缓冲液中，冰浴。

在本发明的一个实施方式中，步骤C中所述PEB电击缓冲液为：含272mmol/L蔗糖、1mmol/L MgCl₂、7mmol/L K₂HPO₄，用磷酸调节pH值至7.4，8磅压力下灭菌20min，于4℃保存备用。

本发明还提供一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法，基于上述方法制备的感受态细胞，再利用电击转化方法使外源DNA或转座复合体进入带荚膜细菌的细胞内，提高带荚膜细菌的遗传转化效率，获得转化子或突变株。

本发明通过电击转化体系可保证获得大量的转化子，从而方便突变株库的构建和目标突变株的创制。

在本发明的一个实施方式中，所述电击转化方法包括以下步骤：含有细菌的感受态细胞的PEB溶液中，加入待转入的外源DNA或转座复合体至一定终浓度，轻轻混匀后冰浴，使细菌细胞和外源DNA充分接触；取混合液加入到0℃预冷过的电击杯中，冰浴，电击转化后立即加入SOC培养基，摇床上慢速恢复生长。最后，涂布含抗生素的平板，培养后挑取单菌落进行鉴定。转化子长出后采用PCR方法筛选突变体。

在本发明的一个实施方式中，所述电击转化方法具体包括以下步骤：

(1)电击转化：含有细菌的感受态细胞的PEB溶液中，加入质粒DNA或转座复合体，使其终浓度为2.5μg/mL，冰浴5分钟，然后，取此混合液200μL加入到0℃预冷过的电击杯中，电极距离0.2cm，冰上放置，在电压2.0Kv的Bio-Rad MicroPulser电击转化仪上电击，电击时间一般为2-3ms。

(2)电击细菌细胞的恢复生长：电击结束后，立即加入800μL SOC培养基，37℃，150rpm培养1h。

(3)涂布平板，筛选转化子的步骤：取100μL恢复生长细胞涂布含抗生素的平板，37℃培养箱中培养16-24h，挑取转化子，纯培养后进行鉴定。

在本发明的一个实施方式中，所述SOC恢复培养基：含0.5％(W/V)酵母抽提物、2％(W/V)胰蛋白胨、10mmol/L NaCl、2.5mmol/L KCl、10mmol/L MgCl₂、20mmol/L MgSO₄、20mmol/L葡萄糖。8磅压力下灭菌20min，于4℃保存备用。

在本发明的一个实施方式中，所述外源DNA包括质粒，所述转座复合体包括Tn5转座复合体。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)通过合适浓度的高渗培养基培养获得荚膜层变疏松，甚至产生裂隙的感受态细胞，再结合优化的电击转化体系，可迅速获得大量的转化子，方法简单有效。现有的技术一般是通过细菌结合转移、提高电击转化时的电压强度或者对细菌培养时间进行控制等来提高转化效率，但这些方法对于有荚膜的细菌来说收效甚微，很难短时间内得到大量的转化子，无法构建突变株库。

(2)合适浓度的NaCl处理不会引起细菌细胞死亡，细胞只是部分脱水，菌体表面会产生一定程度的皱褶，有利于外源DNA进入，从而提高转化率。

本发明首次明确了采用特定的高渗LB培养基即将常规的LB培养基中的NaCl浓度由10g/L精确提高到15g/L，即可显著提高固氮菌GXGL-4A的遗传转化效率，获得大量转化子或突变株。NaCl浓度高于或低于此浓度都不利于转化，不能取得理想的转化率。

本发明通过适当提高普通LB培养基中的NaCl浓度来达到提高转化效率的目的。实验结果表明，这种处理能有效提高转座突变株得率，是一种性价比高、简单有效的处理方法，在具荚膜细菌的遗传转化和基因工程操作中将有广泛应用前景。

本发明的方法可以用于大量制备固氮菌突变体，尤其是具荚膜细菌的遗传转化中十分有效，可以通过定向筛选目标突变株，用于农业生产或生态环境保护领域。

附图说明

图1是高渗LB和普通LB培养后的固氮菌GXGL-4A细菌电镜图，示荚膜形态差异；

图1左边是普通LB培养后的固氮菌GXGL-4A细菌电镜图，右边是高渗LB培养后的固氮菌GXGL-4A细菌电镜图；采用的是TALOS F200X场发射透射电子显微镜，放大倍数17500×。

图2是质粒pKMS1物理图谱；

图3-A是引物对Screen 1-F/Screen 1-R筛选出突变株；

图3-A，PCR产物大小922bp，所用DNA marker为TaKaRa公司的DL2000；

图3-B：泳道自左至右1-6为引物对Screen 2-F/Screen 2-R筛选出突变株，PCR产物大小602bp；泳道7-8、10-11、13-21为引物对Screen 3-F/Screen 3-R筛选出突变株，PCR产物大小656bp，所用DNA marker为TaKaRa公司的DL2000；

图4是采用固氮菌GXGL-4A特定引物对anfD-F/anfD-R筛选突变株；

图4利用特定引物对anfD-F/anfD-R，以筛选出的突变株总DNA为模板，通过PCR法确认GXGL-4A突变株，目标产物大小为655bp，结果表明所筛选出的突变株全部来自固氮菌GXGL-4A，没有杂菌污染；

图5示意采用普通LB培养基培养固氮菌GXGL-4A至OD₆₀₀约为0.6时电击转化，挑选抗性平板上的转化子检测是否为转座突变株；

图5所用引物对Screen 3-F/Screen 3-R，未能扩增出预期大小为656bp的目标条带，这一结果表明平板上长出的单菌落均为杂菌，不是转座突变株，DNA marker：DL2000；

图6示意采用超高渗LB培养基(18g/L NaCl)培养固氮菌GXGL-4A至OD₆₀₀约为0.6时电击转化，挑选抗性平板上的转化子检测是否为转座突变株；

图6所用引物对Screen 2-F/Screen 2-R，未能扩增出预期大小为602bp的目标条带，这一结果表明平板上长出的单菌落均为杂菌，不是转座突变株，DNA marker：DL2000。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

质粒pKMS1转化固氮菌GXGL-4A

1、提取pKMS1质粒(质粒图谱见图2)

采用上海生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，操作步骤如下：

a.过夜培养含质粒pKMS1的DH5α菌株，取3mL过夜培养的菌液，8000rpm离心2min，收集菌体，弃除培养基。

b.在沉淀中加入250μL Buffer P1，彻底悬浮菌体。

c.加入250μL Buffer P2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4分钟。

d.加入350μL Buffer P3，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。12000rpm离心5-10min，上清液移入吸附柱，8000rpm离心30s，倒掉收集管中液体。

e.加入500μL Wash solution，9000rpm离心30s，倒掉收集管中液体。重复此步骤1次。

f.空吸附柱于9000rpm离心1min，将吸附柱放入一个无菌的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50-100μL Elution Buffer，室温静置1min后，离心1min，保存管中DNA溶液。

2.无菌条件下接种固氮菌GXGL-4A野生株，培养基采用普通的LB培养基(NaCl终浓度为10g/L)，37℃，180rpm摇菌，过夜培养，活化细菌，将过夜培养细菌按2％接种量接种到高渗LB培养基中(NaCl终浓度为15g/L)，或将过夜培养细菌按2％接种量接种到超高渗LB培养基中(NaCl终浓度为18g/L)，在37℃下培养，当OD₆₀₀达到0.6时停止培养，冰浴，制备出具有较好感受性且荚膜层受到破坏的细胞。参考图1，此时的细胞处于脱水状态，菌体表面变得皱褶，胞外荚膜厚薄不一，结构不再致密，甚至出现裂隙。收集菌体，冰浴15-30min，于4℃、4000rpm离心10min，弃去上清液，无菌加入等体积的PEB电击缓冲液悬浮，离心，重复2次，最后悬浮于1.0mL的PEB溶液中，置于冰上。

加入质粒pKMS1，使其终浓度为2.5μg/mL，冰浴5min后分装5个冰浴过的Bio-Rad电击杯(电极距离0.2cm)，每个电击杯约0.2mL。

3.冰上放置，在电压2.0Kv的Bio-Rad MicroPulser电击转化仪上电击，电击时间为2-3ms，电击后迅速加入0.8mL SOC培养基，于37℃慢速(120rpm)恢复生长1h。取100μL涂布含50μg/mL卡那霉素LB平板。37℃下培养16h后挑取单菌落，PCR筛选鉴定阳性转化子。

4.pKMS1质粒转化子鉴定PCR正向引物5′-GCCTACATACCTCGCTCTGC-3'，反向引物序列5′-GTTTTCCCAGTCACGACGTT-3′，PCR产物大小为899bp。PCR反应条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后在72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，用胶回收试剂盒(Omega)回收目的片段，测序确认。质粒pKMS1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

固氮菌GXGL-4A Tn5转座插入突变株的构建

1.菌液培养及电击转化方法

将固氮菌GXGL-4A接入20mL LB培养基中，37℃180rpm振荡培养过夜。以2％的接种量转接至50mL高渗LB培养基或LB培养基中，180rpm摇菌，每15min测一次OD₆₀₀值，使其OD₆₀₀至0.6，冰浴15min，以4000rpm离心10min，弃去上清液。无菌加入等体积的PEB电击缓冲液悬浮，离心，重复2次。最后将菌液悬浮于0.8mL PEB溶液中。加入1μL转座复合体，冰浴5min。然后，取此混合液200μL加入到0℃预冷的电击杯中(电极距离0.2cm)，冰上放置，在2.0kV电压下电击。电击结束后，立即加入800μL SOC培养基，37℃、120rpm培养1h。取200μL菌液涂布含50μg/mL卡那霉素LB平板，37℃培养箱中培养16-24h，挑菌培养后进行鉴定。

2.突变株鉴定

以固氮菌GXGL-4A的anfD基因和Tn5基因序列为模板，设计4套引物进行PCR验证。

PCR程序：94℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共进行35个循环，最后在72℃延伸7min。

其中，引物对anfD-F/anfD-R用于鉴定转化子是否是固氮菌GXGL-4A，引物序列为anfD-F:5′-CGGGCAATCTCTTCATCAAT-3′，anfD-R:5′-ATACCTTCGCGACCGATATG-3′，产物大小为655bp。

其余3对引物用来鉴定是否转座突变株。序列分别为：

Screen 1-F 5′-CAGGGATCTGCCATTTCATT-3′

Screen 1-R 5′-GCCTGAGCGAGACGAAATAC-3′

Screen 2-F 5′-GGACGCGATGGATATGTTCT-3′

Screen 2-R 5′-GCCTGAGCGAGACGAAATAC-3′

Screen 3-F 5′-ATTCAACGGGAAACGTCTTG-3′

Screen 3-R 5′-ATTCCGACTCGTCCAACATC-3′

产物大小分别为922bp、602bp和656bp。

3对引物筛选固氮菌GXGL-4A的Tn5转座突变株结果如图3-A、图3-B所示。采用固氮菌GXGL-4A特定引物对anfD-F/anfD-R通过PCR法筛选突变株结果如图4所示。图3-A为利用引物对Screen 1-F/Screen 1-R来筛选突变株，PCR产物大小922bp，所用DNAmarker为TaKaRa公司的DL2000。此图显示有15株转化子扩增出预期大小条带，表明这些都是转座突变株。在图3-B中，泳道(自左至右)1-6为引物对Screen 2-F/Screen 2-R筛选出的突变株，PCR产物大小为602bp；泳道7-8、10-11、13-21为引物对Screen 3-F/Screen 3-R筛选出的突变株，PCR产物大小656bp。所用DNA marker为TaKaRa公司的DL2000。

为确保筛选到的突变株来自固氮菌GXGL-4A，采用特定引物对anfD-F/anfD-R作进一步的PCR鉴定。从图4可看出供检的18个突变株均扩增出大小为655bp的目标条带，产物大小与预期相符，证实这些突变株真实来自GXGL-4A。通过3对转座特定引物对可以确认Tn5转座突变株，再进一步结合固氮菌GXGL-4A特定引物对anfD-F/anfD-R即可快速筛选和鉴定出固氮菌的转座突变株。需要特别说明的是图3、图4中所检测出的转座突变株均为采用高渗LB培养基(15g/L NaCl)培养固氮菌GXGL-4A至OD₆₀₀约为0.6时制备和遗传转化得到。

采用普通LB培养基培养固氮菌GXGL-4A至OD₆₀₀约为0.6时电击转化，挑选抗性平板上的转化子检测是否为转座突变株，结果表明平板上菌落生长极为缓慢，在卡那霉素抗性平板(终浓度50μg/mL)上超过24小时后才出现菌落，随机挑选这些单菌落，培养后采用特定引物对Screen 3-F/Screen 3-R经PCR检验，未能扩增出目标条带(656bp)，转化子均为假阳性，无转座突变株(参考图5)。实验经多次重复，未能获得转座突变株，证明普通LB培养带荚膜固氮菌GXGL-4A难以进行遗传转化。

当采用超高渗LB培养基(18g/L NaCl)培养固氮菌GXGL-4A，其他条件和操作均与高渗LB培养基遗传转化实验相同，在卡那霉素抗性平板(终浓度50μg/mL)上超过36小时才长出菌落，挑取单菌落培养后作疑似突变株的PCR鉴定，所用引物对为Screen 2-F/Screen2-R，未能扩增出预期大小为602bp的目标条带，这一结果表明平板上长出的单菌落均为杂菌，不是转座突变株(参考图6)。实验经多次重复，未能获得转座突变株，证明超高渗LB培养基(18g/L NaCl)培养带荚膜固氮菌GXGL-4A同样难以进行遗传转化。

比较高渗LB处理组、普通LB培养空白组，以及超高渗LB培养基处理组间的转化率及转座突变株得率。普通LB培养的固氮菌GXGL-4A电击后，重复3次，随机挑取单菌落142个，经鉴定转座突变株为0；高渗LB处理的固氮菌重复3次实验，随机挑取单菌落172个，共鉴定出47个转座突变株；超高渗LB培养基培养的固氮菌GXGL-4A电击后，重复3次，随机挑取单菌落100个，经鉴定转化子均为假阳性，无转座突变株。这一结果表明高渗LB培养固氮菌GXGL-4A可以有效地提高细菌遗传转化效率，从而有利于遗传操作，得到大量阳性转化子或突变株。但是同时，NaCl浓度也不能太高，当NaCl浓度为18g/L时并不能获得转座突变株。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6475

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

cgataagcta gcttcacgct gccgcaagca ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg 60

gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg 120

ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct 180

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cgattatcat caccgaatac ggcgtggata cgttagccgg gctgcactca atgtacaccg 3540

acatgtggag tgaagagtat cagtgtgcat ggctggatat gtatcaccgc gtctttgatc 3600

gcgtcagcgc cgtcgtcggt gaacaggtat ggaatttcgc cgattttgcg acctcgcaag 3660

gcatattgcg cgttggcggt aacaagaaag ggatcttcac tcgcgaccgc aaaccgaagt 3720

cggcggcttt tctgctgcaa aaacgctgga ctggcatgaa cttcggtgaa aaaccgcagc 3780

agggaggcaa acaatgaatc aacaactctc ctggcgcacc atcgtcggct acagcctcgg 3840

gaattgctac cgagctccga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat 3900

ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc 3960

ctcgcggacg tgctcatagt ccacgacgcc cgtgattttg tagccctggc cgacggccag 4020

caggtaggcc gacaggctca tgccggccgc cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc 4080

gtctggaagg cagtacacct tgataggtgg gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc 4140

agccatccgc ttgccctcat ctgttacgcc ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg 4200

attcccgttg agcaccgcca ggtgcgaata agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc 4260

gggtgggcct acttcaccta tcctgccccg ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc 4320

tacacgaacc ctttggcaaa atcctgtata tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa 4380

aatcgctata atgaccccga agcagggtta tgcagcggaa aagcgctgct tccctgctgt 4440

tttgtggaat atctaccgac tggaaacagg caaatgcagg aaattactga actgagggga 4500

caggcgagag acgatgccaa agagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg 4560

gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc 4620

attttcgcca aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt 4680

attctgcgaa gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg 4740

ctgccaactt actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt 4800

tctatcagct cctgaaaatc tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc 4860

attatggtga aagttggaac ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt 4920

ggcccagggc ttcccggtat caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc 4980

ttccgtcaca ggtatttatt cggcgcaaag tgcgtcgggt gatgctgcca acttactgat 5040

ttagtgtatg atggtgtttt tgaggtgctc cagtggcttc tgtttctatc agggctggat 5100

gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaaaa ggatctaggt 5160

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 5220

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 5280

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 5340

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 5400

tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 5460

atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 5520

taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 5580

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 5640

gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 5700

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 5760

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 5820

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 5880

cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 5940

ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 6000

cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 6060

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 6120

gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 6180

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 6240

ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag tcgacctgca 6300

ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 6360

ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 6420

aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcg 6475

Claims (10)

1.一种制备带荚膜细菌感受态细胞的方法，其特征在于，利用含高渗盐的培养基培养带荚膜细菌，以得到感受态细胞。

2.根据权利要求1所述一种制备带荚膜细菌感受态细胞的方法，其特征在于，所述带荚膜细菌包括固氮菌，所述固氮菌包括固氮菌GXGL-4A。

3.根据权利要求1所述一种制备带荚膜细菌感受态细胞的方法，其特征在于，所述含高渗盐的培养基指含有15g/L NaCl的培养基。

4.根据权利要求1所述一种制备带荚膜细菌感受态细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、普通LB培养基过夜培养带荚膜细菌，活化细菌，

B、再以1-2％接种量接种于含高渗盐的培养基中培养到对数前期，

C、低温下离心收集细菌沉淀，PEB电击缓冲液洗去杂质和菌体碎片，得到细菌感受态细胞。

5.根据权利要求4所述一种制备带荚膜细菌感受态细胞的方法，其特征在于，步骤B中，培养到对数前期是指当OD₆₀₀为0.6时。

6.一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法，其特征在于，基于权利要求1-5中任一项所述方法制备的感受态细胞，再利用电击转化方法使外源DNA或转座复合体进入带荚膜细菌的细胞内，提高带荚膜细菌的遗传转化效率，获得转化子或突变株。

7.根据权利要求6所述的一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法，其特征在于，所述电击转化方法包括以下步骤：

含有细菌的感受态细胞的PEB溶液中，加入待转入的外源DNA或转座复合体至一定终浓度，轻轻混匀后冰浴，使细菌细胞和外源DNA充分接触；取混合液加入到0℃预冷过的电击杯中，冰浴，电击转化后立即加入SOC培养基，摇床上慢速恢复生长。

8.根据权利要求7所述的一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法，其特征在于，所述电击转化方法具体包括以下步骤：

(1)电击转化：含有细菌的感受态细胞的PEB溶液中，加入质粒DNA或转座复合体，使其终浓度为2.5μg/mL，冰浴5分钟，然后，取此混合液加入到0℃预冷过的电击杯中，电极距离0.2cm，冰上放置，在电压2.0Kv的Bio-Rad MicroPulser电击转化仪上电击，电击时间为2-3ms。

(2)电击细菌细胞的恢复生长：电击结束后，立即加入SOC培养基，37℃，150rpm培养1h。

9.根据权利要求7或8所述的一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法，其特征在于，所述电击转化方法还包括涂布平板，筛选转化子的步骤：取恢复生长细胞涂布含抗生素的平板，37℃培养箱中培养16-24h，挑取转化子，纯培养后进行鉴定。

10.根据权利要求7所述的一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法，其特征在于，所述外源DNA包括质粒，所述转座复合体包括Tn5转座复合体。

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