CN113121623A - 一种利用工业色谱技术同时制备两种二氢黄酮苷类单体化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用工业色谱技术同时制备两种二氢黄酮苷类单体化合物的方法，二氢黄酮苷类单体化合物为柚皮苷、新橙皮苷，纯度均在99.5％以上。本发明的方法可实现分离过程实时在线监测，工艺重现性好、操作简单、制备过程短，且有机溶剂用量少、经济环保，经济效益高，可大批量工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于中药活性成分分离纯化技术领域，特别涉及一种利用工业色谱技术同时制备两种二氢黄酮苷类单体的方法，具体为一种利用工业动态轴向压缩柱系统同时制备柚皮苷及新橙皮苷的方法。
背景技术
枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrussinensis Osbeck的干燥幼果,具有破气消积、化痰散痞的功效,用于积滞内停、痞满胀痛、泻痢后重、大便不通、痰滞气阻、胸痹、结胸、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等症。文献报道，枳实中主要含有黄酮类、生物碱类、挥发油类、香豆素类等成分。药理作用方面，包括对胃肠道的作用、抗氧化作用、抗炎作用、抗菌作用等。对胃肠道的作用，主要的活性成分为黄酮类和挥发油类。研究表明，枳实中的几种二氢黄酮类成分(如新橙皮苷、柚皮苷等)可改善功能性消化不良大鼠的胃排空和小肠推进，能够改善由吲哚美辛诱导的大鼠胃溃疡症状，适合于开发治疗功能性消化不良的药物。但对于二氢黄酮类成分来说存在分离过程繁琐复杂，有机溶剂用量大等问题，导致目前二氢黄酮类成分标准品数量较少且昂贵，这严重限制枳实/枳壳及其相关产品质量控制，影响枳实/枳壳进一步的研究开发。因而开发一种简单、快速分离纯化高纯度二氢黄酮类成分的方法是当前研究的重点。
单体活性成分分离纯化是中药材研究的最主要内容之一，为药材开展研究的前期基础也是影响研究速度的关键环节，传统分离纯化方法和技术有很多，包括有机溶剂萃取法、重结晶法、沉淀法和色谱法等，以上方法均存在有机溶剂用量大，制备过程繁琐，生产周期长，制备单体纯度不高及难以工业化推广等缺陷。目前新橙皮苷和柚皮苷成分无法大量制备，这严重限制了含新橙皮苷和柚皮苷成分的药材及其相关产品质量控制。因而开发一种简单、快速分离纯化高纯度新橙皮苷和柚皮苷成分的方法是当前研究的重点。
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发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用工业色谱技术同时制备两种二氢黄酮苷类单体的方法，该方法包括将总黄酮苷提取物样品溶液注入动态轴向压缩柱系统纯化分离得到柚皮苷、新橙皮苷两个单体化合物，具备有机溶剂用量少、制备过程简单、生产周期短、易于工业化、环境友好等特点。
本发明提供一种利用工业色谱技术同时制备两种二氢黄酮苷类单体化合物的方法，所述二氢黄酮苷类单体化合物为柚皮苷及新橙皮苷，包括以下步骤：
取总黄酮苷提取物，加入适量溶剂1将其溶解并配成一定浓度的溶液，过滤，制得样品溶液；将样品溶液按一定进样量注入工业动态轴向压缩柱系统中，再用溶剂2进行洗脱，用双波长紫外在线检测器检测分离各成分情况，收集各成分的洗脱液，再分别进行浓缩、干燥。
作为优选，总黄酮苷提取物为枳实和/或枳壳的总黄酮苷提取物；和/或，总黄酮苷提取物中柚皮苷含量为10.0％-40.0％(W/W)，优选为15.0％-40.0％(W/W)；新橙皮苷含量为15.0％-50.0％(W/W)，优选20.0％-45.0％(W/W)。
作为优选，溶剂1为2.0％-10.0％(V/V)乙醇水溶液；优选5.0％-8.0％(V/V)乙醇水溶液。
作为优选，所述溶液浓度为85-110mg/mL；优选为90-105mg/mL。
作为优选，工业动态轴向压缩柱系统填料为反相填料，优选UniSil 30-100(C18)或CG161M填料。
作为优选，所述溶剂2为乙醇、水、三氟乙酸的一种或多种；优选乙醇、水、三氟乙酸的混合溶液；三者体积比优选为35-45:65-55:0.3，例如35:65:0.3、40:60:0.3、45:55:0.3。
作为优选，洗脱流速为5.0-10.0CV/h；优选7.5-10.0CV/h；和/或，进样量为100-120L；和/或，柚皮苷及新橙皮苷两个单体化合物洗脱液的收集起止时间分别为145-175min和225-260min。
作为优选，紫外在线检测器的检测波长283nm，参比波长为210nm。
作为优选，浓缩为减压浓缩；和/或，浓缩的温度为60-70℃，优选65℃；和/或，干燥为真空干燥；和/或，干燥温度为40-50℃，优选45℃。
作为优选，总黄酮苷提取物的制备方法为：
取含总黄酮苷的药材适量，水煎煮后过滤，滤液通过非极性大孔树脂，依次用水、乙醇、氢氧化钠洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥。
更为优选，用乙醇洗脱步骤，可先用低浓度乙醇(如20％(V/V)以下)，再用较高浓度乙醇(如25％-90％(V/V))；和/或，氢氧化钠的浓度为0.5％-2％(W/W)。
更为优选，浓缩为减压浓缩，更优选为减压浓缩至相对密度为1.20-1.40的流浸膏；和/或，浓缩温度为50-70℃。
更为优选，干燥为减压干燥；和/或，干燥温度为60-80℃。
更为优选，进一步包含粉碎步骤。
更为优选，其制备方法为：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加4-15倍重量的水，煎煮数次(如1、2、3次等)，每次煎煮1-3小时，合并煎煮液，过滤，滤液通过非极性大孔树脂，依次用水、20％(V/V)以下的乙醇洗脱除去杂质，再用25％-90％(V/V)乙醇、0.5-2％氢氧化钠洗脱，收集25％-90％(V/V)乙醇洗脱液，50℃-70℃减压浓缩至相对密度约1.20-1.40的流浸膏，60-80℃减压干燥，粉碎。
本发明的有益技术效果：
1.本发明将总黄酮苷提取物(如枳实或枳壳总黄酮苷提取物)直接通过工业动态轴向压缩柱系统进行分离纯化，得到柚皮苷及新橙皮苷两个单体化合物，其纯度均可达99.5％以上，可解决制备难、价格昂贵等问题。
2.本发明利用工业色谱技术，即采用动态轴向压缩柱系统同时制备柚皮苷及新橙皮苷单体化合物的方法，其可实现分离过程实时在线监测，具有重复性好、操作简单、制备过程短，有机溶剂用量少，该方法经济效益高，可以大批量工业化制备。
3.本发明采用工业动态轴向压缩柱系统制备技术，从一种药材中同时制备多个单体化合物，提高了药材利用率，节约了成本，可以推广至其他同类品种中。
附图说明
图1：枳实总黄酮苷提取物HPLC色谱图；
图2：制备新橙皮苷和柚皮苷工艺流程图；
图3：柚皮苷HPLC色谱图；
图4：新橙皮苷HPLC色谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，通过以下实施例对本发明的技术方案进行进一步描述和说明。
实施例1
取枳实，切成饮片或粉碎，加4倍量水，煎煮3次，每次煎煮提取3小时，合并煎煮液，过滤，滤液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇(19％)洗脱除去杂质，再用25％乙醇、2％氢氧化钠洗脱，收集25％乙醇洗脱液，50-70℃减压浓缩至相对密度约1.40的流浸膏，80℃减压干燥，粉碎，即得枳实总黄酮提取物(其HPLC色谱图见图1)。
实施例2
取枳壳，切成饮片或粉碎，加15倍量水，煎煮1次，每次煎煮提取1小时，合并煎煮液，过滤，滤液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、20％以下的乙醇(15％)洗脱除去杂质，再用90％乙醇、0.5％氢氧化钠洗脱，收集90％乙醇洗脱液，50-70℃减压浓缩至相对密度约1.20的流浸膏，60℃减压干燥，粉碎，即得枳实总黄酮提取物。
实施例3
一种利用工业色谱技术同时制备两种二氢黄酮苷类单体化合物的方法(工艺流程见图2)，所述二氢黄酮苷类单体化合物为柚皮苷及新橙皮苷，包括以下步骤：
取实施例1所得枳实总黄酮苷提取物(其HPLC色谱图见图1)，其中柚皮苷含量约为15.0％(W/W)，新橙皮苷含量约为20.0％(W/W)，加入5.0％(V/V)乙醇水溶液将其溶解并配制成105mg/ml浓度溶液，过滤，得样品溶液。
将样品溶液100L注入工业动态轴向压缩柱系统中，工业色谱填料为UniSil30-100(C18)，乙醇:水:三氟乙酸溶液(35:65:0.3,V/V/V)为洗脱剂，洗脱流速为10.0CV/h，紫外检测波长283nn，参比波长为210nm。分别根据新橙皮苷和柚皮苷成分出峰时间及色谱峰的高度，确定所制柚皮苷的洗脱液收集起止时间为145-175min，确定所制新橙皮苷的洗脱液收集起止时间为225-260min，并将含目标成分纯化高的洗脱液在65℃减压浓缩至干后45℃真空干燥24h，得到纯度99.69％的柚皮苷单体化合物1338.75g(其HPLC色谱图见图3；得到纯度99.65％的新橙皮苷单体化合物1836.47g(其HPLC色谱图见图4)。
实施例4
一种利用工业色谱技术同时制备两种二氢黄酮苷类单体化合物的方法(工艺流程见图2)，所述二氢黄酮苷类单体化合物为柚皮苷及新橙皮苷，包括以下步骤：
取实施例2所得总黄酮苷提取物，其中柚皮苷含量约为40.0％(W/W)，新橙皮苷含量约为45.0％(W/W)，加入8.0％(V/V)乙醇水溶液将其溶解并配制成90mg/ml浓度溶液，过滤，得样品溶液。
样品溶液120L注入工业动态轴向压缩柱系统中，工业色谱填料为CG161M，乙醇:水:三氟乙酸溶液(45:55:0.3,V/V/V)为洗脱剂，洗脱流速为7.5CV/h，紫外检测波长283nn，参比波长为210nm。分别根据新橙皮苷和柚皮苷成分出峰时间及色谱峰的高度，确定所制柚皮苷的洗脱液收集起止时间为145-175min，确定所制新橙皮苷的洗脱液收集起止时间为225-260min，并将含目标成分纯化高的洗脱液在65℃减压浓缩至干后45℃真空干燥24h，得到纯度99.58％的柚皮苷单体化合物3672.13g；得到纯度99.65％的新橙皮苷单体化合物4106.25g。
以上较佳实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域的普通技术人员应当理解，凡对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应包含在本发明保护的范围内。
Claims (10)
1.一种利用工业色谱技术同时制备两种二氢黄酮苷类单体化合物的方法，所述二氢黄酮苷类单体化合物为柚皮苷及新橙皮苷，包括以下步骤：
取总黄酮苷提取物，加入适量溶剂1将其溶解并配成一定浓度的溶液，过滤，制得样品溶液；将样品溶液按一定进样量注入工业动态轴向压缩柱系统中，再用溶剂2进行洗脱，用双波长紫外在线检测器检测分离各成分情况，收集各成分的洗脱液，再分别进行浓缩、干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，总黄酮苷提取物为枳实和/或枳壳的总黄酮苷提取物；和/或，总黄酮苷提取物中柚皮苷含量为10.0％-50.0％(W/W)，优选为15.0％-40.0％(W/W)；新橙皮苷含量为15.0％-50.0％(W/W)，优选20.0％-45.0％(W/W)。
3.根据权利要求1所述的方法，溶剂1为2.0％-10.0％(V/V)乙醇水溶液；优选5.0％-8.0％(V/V)乙醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，所述溶液浓度为85-110mg/mL；优选90-105mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，工业动态轴向压缩柱系统填料为反相填料，优选UniSil30-100(C18)或CG161M填料。
6.根据权利要求1所述的方法，所述溶剂2为乙醇、水、三氟乙酸的一种或多种；优选乙醇、水、三氟乙酸的混合溶液；三者体积比优选为35-45:65-55:0.3，例如35:65:0.3、40:60:0.3、45:55:0.3。
7.根据权利要求1所述的方法，洗脱流速为5.0-10.0CV/h；优选7.5-10.0CV/h；和/或，进样量为100-120L；和/或，柚皮苷及新橙皮苷两个单体化合物洗脱液的收集起止时间分别为145-175min和225-260min。
8.根据权利要求1所述的方法，紫外在线检测器的检测波长283nm，参比波长为210nm。
9.根据权利要求1所述的方法，浓缩为减压浓缩；和/或，浓缩的温度为60-70℃，优选65℃；和/或，干燥为真空干燥；和/或，干燥温度为40-50℃，优选45℃。
10.根据权利要求1所述的方法，总黄酮苷提取物的制备方法为：
取含总黄酮苷的药材适量，水煎煮后过滤，滤液通过非极性大孔树脂，依次用水、乙醇、氢氧化钠洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥。
作为优选，用乙醇洗脱步骤，可先用低浓度乙醇(如20％(V/V)以下)，再用较高浓度乙醇(如25％-90％(V/V))；和/或，氢氧化钠的浓度为0.5％-2％(W/W)。
作为优选，浓缩为减压浓缩，更优选为减压浓缩至相对密度为1.20-1.40的流浸膏；和/或，浓缩温度为50-70℃。
作为优选，干燥为减压干燥；和/或，干燥温度为60-80℃。
作为优选，进一步包含粉碎步骤。
作为优选，其制备方法为：取枳实或枳壳，切成饮片或粉碎，加4-15倍重量的水，煎煮数次(如1、2、3次等)，每次煎煮1-3小时，合并煎煮液，过滤，滤液通过非极性大孔树脂，依次用水、20％(V/V)以下的乙醇洗脱除去杂质，再用25％-90％(V/V)乙醇、0.5％-2％(W/W)氢氧化钠洗脱，收集25％-90％(V/V)乙醇洗脱液，50℃-70℃减压浓缩至相对密度约1.20-1.40的流浸膏，60-80℃减压干燥，粉碎。
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