CN113106069A - iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及皮肤修复技术领域，具体而言，涉及iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用；本发明提供的iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体应用于皮肤损伤修复效果良好，且效果稳定。含有本发明制备方法制备的诱导多能干细胞来源外泌体的iPSC来源外泌体修复剂在皮肤损伤修复的效果佳，且效果稳定。
Description
技术领域
本发明涉及皮肤修复技术领域，具体而言，涉及iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用。
背景技术
干细胞(stemcell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在特定条件下，可以分化为多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能，被称为“万用细胞”。皮肤处于人体的最外层，能够让机体免受病原体的侵害，是人体最大的一个器官。皮肤组织经常发生不同程度的损伤，如机械性损伤、烧伤、烫伤以及糖尿病足引起的溃疡等急性或者慢性的损伤，这不仅影响了个人的身体健康，还给社会带来了巨大的经济负担。相关技术中将干细胞应用于皮肤修复与再生，其主要依靠旁分泌的方式来促进皮肤的损伤后修复。
外泌体作为干细胞的旁分泌因子，其能够促进成纤维细胞的增殖以及迁移、调节炎症反应以及抑制瘢痕形成等方面来促进皮肤损伤后的修复与再生。
但是，相关技术提供的外泌体在皮肤损伤修复中的作用不佳，且效果不稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用，iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体的皮肤损伤修复作用良好，且效果稳定，含有诱导多能干细胞来源外泌体的iPSC来源外泌体修复剂的皮肤损伤修复作用良好，且效果稳定。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种iPSC来源外泌体的制备方法，包括：
用DF12+10％FBS培养基培养间充质干细胞；对培养后的间充质干细胞消化、离心；加入仙台病毒重悬细胞于离心后的间充质干细胞，并离心、培养；之后更换完全培养基继续培养；再更换DF12+10％FBS和Stemflex的混合培养基继续培养；之后再每间隔一段时间更换Stemflex培养基继续培养，以培养出诱导多能干细胞；
将培养出的诱导多能干细胞纯化处理，得到纯化后的诱导多能干细胞；
培养纯化后的诱导多能干细胞，并收集培养后得到的第一上清液；将第一上清液离心，得到第二上清液；收集第二上清液离心，得到第三上清液；将第三上清液离心。
在可选的实施方式中，加入仙台病毒重悬细胞于离心后的间充质干细胞后，将其接种于Matrigel。
在可选的实施方式中，将培养出的诱导多能干细胞纯化处理，包括：将培养出的诱导多能干细胞培养一段时间后，取单克隆至Matrigel中继续培养，在单克隆的密度达到70％-90％时，消化传代培养。
在可选的实施方式中，将第一上清液离心时的温度为3℃-5℃；和/或，
将第二上清液离心时的温度为3℃-5℃；和/或，
将第三上清液离心时的温度为3℃-5℃。
第二方面，本发明提供一种iPSC来源外泌体修复剂，iPSC来源外泌体修复剂的原料包括：羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸、羟乙基纤维素和前述实施方式任一项的iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体。
在可选的实施方式中，iPSC来源外泌体修复剂的制备方法包括：将羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸和水混合、溶解，再添加羟乙基纤维素，混合；灭菌后添加诱导多能干细胞来源外泌体。
在可选的实施方式中，iPSC来源外泌体修复剂的原料按照重量百分比计包括：0.5％-1％的羟丙基壳聚糖、10％-20％的甘油、5％-10％的聚乙二醇和0.1％-1％的山梨酸，余量为水。
在可选的实施方式中，羟乙基纤维素的质量占羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸和水的总重量的2.5-6％。
在可选的实施方式中，诱导多能干细胞来源外泌体的质量占羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸、水和羟乙基纤维素的总重量的1％-3％。
第三方面，本发明提供如前述实施方式任一项的iPSC来源外泌体的制备方法制备的iPSC来源外泌体在皮肤损伤修复中的应用。
本发明的iPSC来源外泌体的制备方法、iPSC来源外泌体修复剂和iPSC来源外泌体的应用的有益效果包括：
本发明实施例提供的iPSC来源外泌体的制备方法包括：用DF12+10％FBS培养基培养间充质干细胞；对培养后的间充质干细胞消化、离心；加入仙台病毒重悬细胞于离心后的间充质干细胞，并离心、培养；之后更换完全培养基继续培养；再更换DF12+10％FBS和Stemflex的混合培养基继续培养；之后再每间隔一段时间更换Stemflex培养基继续培养，以培养出诱导多能干细胞；将培养出的诱导多能干细胞纯化处理，得到纯化后的诱导多能干细胞；培养纯化后的诱导多能干细胞，并收集培养后得到的第一上清液；将第一上清液离心，得到第二上清液；收集第二上清液离心，得到第三上清液；将第三上清液离心。本发明的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体应用于皮肤损伤修复效果良好，且效果稳定。
含有上述制备方法制备的诱导多能干细胞来源外泌体的iPSC来源外泌体修复剂在皮肤损伤修复的效果佳，且效果稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中的iPSC的免疫荧光结果图；
图2为本发明实施例1中的iPSC来源外泌体WB结果图；
图3为本发明实施例1中的iPSC来源外泌体电镜分析结果图；
图4为本发明实施例1中的iPSC来源外泌体促进成纤维细胞的增殖结果图；
图5为本发明实施例1中的iPSC来源外泌体促进成纤维细胞的迁移结果图；
图6为本发明实施例1中的iPSC来源外泌体促进SD大鼠的伤口愈合结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例的iPSC来源外泌体的制备方法包括：
用DF12+10％FBS培养基培养间充质干细胞；对培养后的间充质干细胞消化、离心；加入仙台病毒重悬细胞于离心后的间充质干细胞，并离心、培养；之后更换完全培养基继续培养；再更换DF12+10％FBS和Stemflex的混合培养基继续培养；之后再每间隔一段时间更换Stemflex培养基继续培养，以培养出诱导多能干细胞(iPSC)；将培养出的诱导多能干细胞纯化处理，得到纯化后的诱导多能干细胞；培养纯化后的诱导多能干细胞，并收集培养后得到的第一上清液；将第一上清液离心，得到第二上清液；收集第二上清液离心，得到第三上清液；将第三上清液离心。
本发明的iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体应用于皮肤损伤修复效果良好，且效果稳定。
本发明的iPSC来源外泌体的制备方法可以分为：一、iPSC制备；二、iPSC纯化；三、诱导多能干细胞来源外泌体(iPSC来源外泌体)制备。
可选地，一、iPSC制备包括：
准备Matrigel铺的培养孔板；上述培养孔板可以是96孔板、48孔板等，在此不作具体限定。
在培养孔板培养间充质干细胞至80-95％细胞密度；其中，培养基为DF12+10％FBS，培养温度为36-38℃。上述间充质干细胞可以是脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞；培养孔板可以是6孔板或12孔板等，在此不作具体限定。
将培养后的间充质干细胞进行消化并计数，取出消化后的细胞离心备用。上述消化的方式与相关技术类似，例如使用胰蛋白酶进行消化处理。需要说明的是，在制备iPSC时可以取出2000个细胞离心，或者取出1500个细胞离心，在此不作具体限定。
在离心后弃上清液，加入仙台病毒重悬细胞，并接种至Matrigel，具体地，接种至Matrigel铺的培养孔板中。需要说明的是，在离心后弃上清液，加入的仙台病毒重悬细胞的量与离心并弃上清后留下的部分相适应，例如：离心后剩余的细胞量为2000，相应的可以加入2000滴度的仙台病毒重悬细胞。
将上述接种了含有仙台病毒重悬细胞的Matrigel铺的培养孔板，在室温下离心，离心后在36-38℃条件下培养，培养时间可以为18-24h。其中，离心的转速可以是2250rpm，离心时间可以是30min左右。
上述培养后，更换完全培养基，在36-38℃条件下培养48h左右；再更换DF12+10％FBS：Stemflex＝1:1的培养基，在36-38℃条件下培养24h左右；之后每间隔24h左右更换一次Stemflex培养基，在36-38℃条件下培养；连续更换Stemflex培养基培养5次左右后，克隆开始形成，之后每24h左右更换一次Stemflex培养基，在36-38℃条件下培养。
可选地，二、iPSC纯化包括：将培养出的诱导多能干细胞培养一段时间后，取单克隆至Matrigel中继续培养，在单克隆的密度达到70％-90％时，消化传代培养。
具体地，按照上述方法在克隆开始时，之后每24h左右更换一次Stemflex培养基，在36-38℃条件下培养，大致更换18-32次培养基进行培养后，细胞克隆足够大时可以进行细胞纯化。
在倒置显微镜下挑去单克隆至Matrigel铺的24孔板中，继续培养，培养温度可以为37℃左右。
在单克隆在24孔板中的密度达到70-90％时，消化传代至6孔板中培养，即可得到纯化后的iPSC。
可选地，三、iPSC来源外泌体的制备包括：将纯化后的诱导多能干细胞(iPSC)培养至细胞密度达到90％左右时，收集iPSC配液上清液，既第一上清液到离心管中，在3℃-5℃条件下5000xg离心30min，离心后得到上清液，既第二上清液，并将第二上清液转移至新的离心管中；在3℃-5℃条件下20000xg离心30min，离心后得到上清液，既第三上清液，并将第三上清液转移至新的离心管中；在3℃-5℃条件下120000xg离心1.5h，离心后，弃上清液，用生理盐水重悬沉淀，即可得到iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)。
本发明的iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体能够应用于皮肤损伤修复中。
本发明还提供一种iPSC来源外泌体修复剂，其原料包括羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸、羟乙基纤维素和iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体。
iPSC来源外泌体修复剂的原料按照重量百分比计包括：0.5％-1％的羟丙基壳聚糖、10％-20％的甘油、5％-10％的聚乙二醇和0.1％-1％的山梨酸，余量为水。
进一步地，羟乙基纤维素的质量占羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸和水的总重量的2.5-6％。
再进一步地，诱导多能干细胞来源外泌体的质量占羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸、水和羟乙基纤维素的总重量的1％-3％。
本发明的iPSC来源外泌体修复剂的制备方法包括：将羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸和水混合、溶解；具体地，可以加热至完全溶解，再添加羟乙基纤维素，混合；灭菌后添加诱导多能干细胞来源外泌体，具体地，可以高压灭菌后，冷却至室温，再添加诱导多能干细胞来源外泌体，且边加边搅拌。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一、iPSC制备
1、准备Matrigel铺的96孔板；
2、在6孔板培养脐带间充质干细胞至90％细胞密度；其中，培养基为DF12+10％FBS，培养温度为37℃；
3、对上述培养细胞进行消化并计数，取2000个细胞离心备用；
4、离心后弃上清液，加入相适应量的仙台病毒重悬细胞，并接种于准备Matrigel铺的96孔板；
5、在室温下，转速为2250rpm条件下离心30min后，在37℃培养箱培养24h；
6、再更换新鲜的完全培养基，在37℃下培养，48h；
7、再更换DF12+10％FBS：Stemflex＝1:1的培养基，在37℃下培养24h；
8、之后再每隔24h更换一次新鲜的Stemflex培养基，在37℃下培养；
9，重复步骤8五次后，颗粒开设形成，以后每24h更换一次新鲜的Stemflex培养基，在37℃下培养。
二、iPSC纯化
1、在上述步骤9的基础上，培养至30天，既按照上述方法在克隆开始时，之后每24h左右更换一次Stemflex培养基，在37℃条件下培养，大致更换30次培养基，细胞克隆足够大时可以进行细胞纯化。
2、在倒置显微镜下挑取单克隆至Matrigel铺的24孔板中，继续培养，培养温度为37℃；
3、在单克隆在24孔板中的密度达到80％时，消化传代至6孔板中培养，即可得到纯化后的iPSC。
三、iPSC来源外泌体
将纯化后的诱导多能干细胞(iPSC)培养至细胞密度达到90％左右时，收集iPSC配液上清液，既第一上清液到离心管中，在4℃条件下5000xg离心30min，离心后得到上清液，既第二上清液，并将第二上清液转移至新的离心管中；在4℃条件下20000xg离心30min，离心后得到上清液，既第三上清液，并将第三上清液转移至新的离心管中；在4℃条件下120000xg离心1.5h，离心后，弃上清液，用生理盐水重悬沉淀，即可得到iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)。
用上述iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)制备iPSC来源外泌体修复剂的方法包括：
1、将重量百分比为0.5％的羟丙基壳聚糖、10％的甘油、5％的聚乙二醇和0.1％的山梨酸，余量为去离子水，混合，搅拌，加热至完全溶解，再加入上述混合物总重量的2.5％的羟乙基纤维素，搅拌至混合均匀。
2、将步骤1的混合物高压灭菌，冷却至室温。
3、将上述制得的iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)加入步骤2的混合溶液中，iPSC外泌体占步骤2的重量的2％；边加边搅拌。
实施例2
一、iPSC制备
1、准备Matrigel铺的48孔板；
2、在12孔板培养脐带间充质干细胞至95％细胞密度；其中，培养基为DF12+10％FBS，培养温度为36℃；
3、对上述培养细胞进行消化并计数，取1500个细胞离心备用；
4、离心后弃上清液，加入相适应量的仙台病毒重悬细胞，并接种于准备Matrigel铺的48孔板；
5、在室温下，转速为2200rpm条件下离心35min后，在36℃培养箱培养18h；
6、再更换新鲜的完全培养基，在36℃下培养，49h；
7、再更换DF12+10％FBS：Stemflex＝1:1的培养基，在36℃下培养24h；
8、之后再每隔24h更换一次新鲜的Stemflex培养基，在36℃下培养；
9，重复步骤8五次后，颗粒开设形成，以后每24h更换一次新鲜的Stemflex培养基，在36℃下培养。
二、iPSC纯化
1、在上述步骤9的基础上，培养至20天，既按照上述方法在克隆开始时，之后每24h左右更换一次Stemflex培养基，在36℃条件下培养，大致更换20次培养基，细胞克隆足够大时可以进行细胞纯化。
2、在倒置显微镜下挑取单克隆至Matrigel铺的24孔板中，继续培养，培养温度为36℃；
3、在单克隆在24孔板中的密度达到70％时，消化传代至6孔板中培养，即可得到纯化后的iPSC。
三、iPSC来源外泌体
将纯化后的诱导多能干细胞(iPSC)培养至细胞密度达到88％左右时，收集iPSC配液上清液，既第一上清液到离心管中，在3℃条件下5000xg离心30min，离心后得到上清液，既第二上清液，并将第二上清液转移至新的离心管中；在3℃条件下20000xg离心30min，离心后得到上清液，既第三上清液，并将第三上清液转移至新的离心管中；在3℃条件下120000xg离心1.6h，离心后，弃上清液，用生理盐水重悬沉淀，即可得到iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)。
用上述iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)制备iPSC来源外泌体修复剂的方法包括：
1、将重量百分比为1％的羟丙基壳聚糖、20％的甘油、10％的聚乙二醇和1％的山梨酸，余量为去离子水，混合，搅拌，加热至完全溶解，再加入上述混合物总重量的6％的羟乙基纤维素，搅拌至混合均匀。
2、将步骤1的混合物高压灭菌，冷却至室温。
3、将上述制得的iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)加入步骤2的混合溶液中，iPSC外泌体占步骤2的重量的3％；边加边搅拌。
实施例3
一、iPSC制备
1、准备Matrigel铺的96孔板；
2、在6孔板培养脂肪间充质干细胞至80％细胞密度；其中，培养基为DF12+10％FBS，培养温度为38℃；
3、对上述培养细胞进行消化并计数，取1800个细胞离心备用；
4、离心后弃上清液，加入相适应量的仙台病毒重悬细胞，并接种于准备Matrigel铺的96孔板；
5、在室温下，转速为2250rpm条件下离心28min后，在38℃培养箱培养20h；
6、再更换新鲜的完全培养基，在38℃下培养，46h；
7、再更换DF12+10％FBS：Stemflex＝1:1的培养基，在38℃下培养23h；
8、之后再每隔24h更换一次新鲜的Stemflex培养基，在38℃下培养；
9，重复步骤8五次后，颗粒开设形成，以后每24h更换一次新鲜的Stemflex培养基，在38℃下培养。
二、iPSC纯化
1、在上述步骤9的基础上，培养至24天，既按照上述方法在克隆开始时，之后每24h左右更换一次Stemflex培养基，在38℃条件下培养，大致更换24次培养基，细胞克隆足够大时可以进行细胞纯化。
2、在倒置显微镜下挑取单克隆至Matrigel铺的24孔板中，继续培养，培养温度为38℃；
3、在单克隆在24孔板中的密度达到90％时，消化传代至6孔板中培养，即可得到纯化后的iPSC。
三、iPSC来源外泌体
将纯化后的诱导多能干细胞(iPSC)培养至细胞密度达到90％左右时，收集iPSC配液上清液，既第一上清液到离心管中，在5℃条件下5000xg离心30min，离心后得到上清液，既第二上清液，并将第二上清液转移至新的离心管中；在5℃条件下20000xg离心30min，离心后得到上清液，既第三上清液，并将第三上清液转移至新的离心管中；在5℃条件下120000xg离心1.5h，离心后，弃上清液，用生理盐水重悬沉淀，即可得到iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)。
用上述iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)制备iPSC来源外泌体修复剂的方法包括：
1、将重量百分比为0.8％的羟丙基壳聚糖、16％的甘油、7％的聚乙二醇和0.4％的山梨酸，余量为去离子水，混合，搅拌，加热至完全溶解，再加入上述混合物总重量的4.5％的羟乙基纤维素，搅拌至混合均匀。
2、将步骤1的混合物高压灭菌，冷却至室温。
3、将上述制得的iPSC外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)加入步骤2的混合溶液中，iPSC外泌体占步骤2的重量的1％；边加边搅拌。
试验例
一、对实施例1中制得iPSC(诱导多能干细胞)进行免疫荧光分析
1、将纯化后的iPSC消化接种到24孔板中，培养箱中培养至细胞密度达60％左右；
2、吸弃上清液并用PBS漂洗细胞两遍，并加入4％PFA固定10min；
3、吸走4％PFA，用PBS漂洗细胞两遍，加入封闭液，室温封闭1小时；
4、吸走封闭液，加入一抗，在4℃冰箱过夜孵育；
5、孵育结束后回收抗体，加入PBST漂洗细胞三遍，二抗室温孵育1个小时；
6、孵育结束后回收抗体，加入PBST漂洗细胞三遍，并在荧光显微镜下进行拍照记录。
根据图1的免疫荧光结果可知，使用iPSC标记物抗体对细胞进行染色，可见SOX2以及OCT4有明显的信号，确定了检测的细胞为iPSC。
二、对实施例1的iPSC来源外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)的蛋白免疫印迹(WB)检测。
1、在4℃下解冻iPSC来源外泌体，1:2加入蛋白裂解液，冰上裂解15min；2、裂解结束后，4℃、13000xg离心5min，以充分裂解蛋白；
3、离心结束后，取上清蛋白转移至新的EP管中，使用BCA法检测总蛋白浓度；
4、取50ug总蛋白，1:4加入5X的上样缓冲液，混匀，95℃孵育5min；
5、配置12％的分离胶和5％的积层胶；
6、取30ul变性完成的样品，点在积层胶孔中，进行SDS-PAGE电泳；
7、电泳结束后，使用湿转法将分离的蛋白转移至PVDF膜上；
8、使用5％的BSA进行封闭；
9、一抗TSG101在4℃下孵育过夜，对应的二抗室温下孵育2h；
10、清洗PVDF膜后，滴加ECL进行显影。
根据图2的结果可知，使用外泌体标记物抗体对不同浓度的iPSC来源外泌体进行WB分析，结果可见特异条带并且随着外泌体的浓度增加信号增强。
三、对实施例1的iPSC来源外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)透射电镜分析
1、从-80℃取出iPSC来源外泌体样品，在4℃下解冻；
2、上机前准备样品：吸取样品8-10ul小心滴加于铜网上，等待沉淀1min，滤纸吸去浮液；
3、负染样品：吸取2％的醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上，沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥1min；
4、将铜网放于样品杆中，上机检测，80kv成像拍照记录。
根据图3的结果可知，在电镜下对iPSC来源外泌体进行形态的观察，外泌体直径大多分布在5-200nm，形态完整，磷脂双分子层结构清晰，立体结构明显。
四、对实施例1的iPSC来源外泌体(诱导多能干细胞来源外泌体)的功能分析
1、iPSC来源外泌体对成纤维细胞增殖的影响：
1)从37℃，5％CO2的培养箱中取出皮肤成纤维细胞，细胞密度约为90％左右；
2)在超净工作台，吸弃培养基，加入PBS漂洗细胞1次；
3)吸弃PBS，加入0.25％的胰蛋白酶消化细胞，消化结束后加入等量的完全培养基终止消化，并将细胞悬液转移到离心管，1000rpm，离心5min；
4)离心完成后，去掉上清液，加入完全培养基重悬细胞，并进行细胞计数；
5)接种细胞到96孔板中，每孔3000个细胞，并标记7天的细胞数量，培养箱中培养过夜；
6)更换新鲜培养基，并加入不同浓度的外泌体继续培养过夜；
7)消化外泌体处理1天的细胞，并对细胞数量进行计数，余下培养孔则更换新鲜培养基培养过夜；
8)消化外泌体处理2天的细胞，并对细胞数量进行计数，余下培养孔则更换新鲜培养基培养过夜，其他细胞孔进行类似操作直到实验结束。
根据图4的结构可知，在成纤维细胞中加入不同量的iPSC来源外泌体，连续观察7天并每天对细胞数量进行统计，在第3天开始外泌体量为0.75μg以及7.5μg的实验组与对照组相比，成纤维细胞的增值速度明显提高。
2、iPSC来源外泌体对成纤维细胞迁移的影响：
1)从37℃，5％CO2的培养箱中取出皮肤成纤维细胞，细胞密度约为90％左右；
2)在超净工作台，吸弃培养基，加入PBS漂洗细胞1次；
3)吸弃PBS，加入0.25％的胰蛋白酶消化细胞，消化结束后加入等量的完全培养基终止消化，并将细胞悬液转移到离心管，1000rpm，离心5min；
4)离心完成后，去掉上清液，加入完全培养基重悬细胞，并进行细胞计数；
5)接种细胞到24孔板中，每孔40000个细胞，培养过夜；
6)使用吸头尖端部位在细胞表面划一道痕，更换含有不同外泌体浓度的完全培养基，并在显微镜下进行拍照记录；
7)培养箱中培养24h后，再次对细胞划痕处进行拍照记录。
根据图5的结果可知，在成纤维细胞中加入不同量的iPSC来源外泌体，观察细胞的迁移情况，可见在加入外泌体量为0.75μg以及7.5μg的实验组与对照组相比，成纤维细胞的迁移速度明显提高。右图是对成纤维细胞的迁移率进行统计。
3、iPSC来源外泌体对SD大鼠伤痕修复的影响：
1)购买的SD大鼠来自广东省医学实验动物中心(合格证号：SCXK(粤)2013-0002)，体重为130±10g，清洁级环境饲养，正常饮食、饮水，随机编号；
2)按照4ml/Kg腹腔注射12％的水合氯醛进行麻醉；
3)待动物进入深麻状态后，选取背部腰腹部进行脱毛，脱毛面积大于2cm2；
4)在脱毛区，用皮肤打孔器打出直径1cm的圆形印迹，沿着印迹边缘剪出全层皮肤伤口，深至筋膜层，左右各一，两伤口间距离约2cm；
5)对伤口处进行给药：选取背部左侧伤口为实验组，右侧伤口为对照组。左侧伤口给予iPSC来源外泌体，右侧伤口给予生理盐水，并将不溶性贴片贴于伤口周围以确保药品不外泄，两天后再次给药；
6)进行拍照记录伤口情况。
根据图6的结果可知，在SD大鼠伤口处涂抹iPSC来源外泌体，随着时间的迁移，涂抹外泌体的实验组与对照组相比，伤口愈合时间更快，创伤面更加平整以及形成更少的瘢痕。说明iPSC来源外泌体能够促进皮肤的愈合。
综上所述，本发明的iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体应用于皮肤损伤修复效果良好，且效果稳定；本发明的制备方法制备的诱导多能干细胞来源外泌体能够应用于皮肤损伤修复，且含有诱导多能干细胞来源外泌体的修复剂在皮肤损伤修复的效果佳，且效果稳定。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种iPSC来源外泌体的制备方法，其特征在于，包括：
用DF12+10％FBS培养基培养间充质干细胞；对培养后的所述间充质干细胞消化、离心；加入仙台病毒重悬细胞于离心后的所述间充质干细胞，并离心、培养；之后更换完全培养基继续培养；再更换DF12+10％FBS和Stemflex的混合培养基继续培养；之后再每间隔一段时间更换Stemflex培养基继续培养，以培养出诱导多能干细胞；
将培养出的所述诱导多能干细胞纯化处理，得到纯化后的诱导多能干细胞；
培养所述纯化后的诱导多能干细胞，并收集培养后得到的第一上清液；将所述第一上清液离心，得到第二上清液；收集所述第二上清液离心，得到第三上清液；将所述第三上清液离心。
2.根据权利要求1所述的iPSC来源外泌体的制备方法，其特征在于，加入所述仙台病毒重悬细胞于离心后的所述间充质干细胞后，将其接种于Matrigel。
3.根据权利要求1所述的iPSC来源外泌体的制备方法，其特征在于，将培养出的所述诱导多能干细胞纯化处理，包括：将培养出的所述诱导多能干细胞培养一段时间后，取单克隆至Matrigel中继续培养，在所述单克隆的密度达到70％-90％时，消化传代培养。
4.根据权利要求1所述的iPSC来源外泌体的制备方法，其特征在于，将所述第一上清液离心时的温度为3℃-5℃；和/或，
将所述第二上清液离心时的温度为3℃-5℃；和/或，
将所述第三上清液离心时的温度为3℃-5℃。
5.一种iPSC来源外泌体修复剂，其特征在于，所述iPSC来源外泌体修复剂的原料包括：羟丙基壳聚糖、甘油、聚乙二醇、山梨酸、羟乙基纤维素和权利要求1-4任一项所述的iPSC来源外泌体的制备方法制备出的诱导多能干细胞来源外泌体。
6.根据权利要求5所述的iPSC来源外泌体修复剂，其特征在于，所述iPSC来源外泌体修复剂的制备方法包括：将所述羟丙基壳聚糖、所述甘油、所述聚乙二醇、所述山梨酸和水混合、溶解，再添加所述羟乙基纤维素，混合；灭菌后添加所述诱导多能干细胞来源外泌体。
7.根据权利要求5所述的iPSC来源外泌体修复剂，其特征在于，所述iPSC来源外泌体修复剂的原料按照重量百分比计包括：0.5％-1％的所述羟丙基壳聚糖、10％-20％的所述甘油、5％-10％的所述聚乙二醇和0.1％-1％的所述山梨酸，余量为水。
8.根据权利要求7所述的iPSC来源外泌体修复剂，其特征在于，所述羟乙基纤维素的质量占所述羟丙基壳聚糖、所述甘油、所述聚乙二醇、所述山梨酸和所述水的总重量的2.5-6％。
9.根据权利要求8所述的iPSC来源外泌体修复剂，其特征在于，所述诱导多能干细胞来源外泌体的质量占所述羟丙基壳聚糖、所述甘油、所述聚乙二醇、所述山梨酸、所述水和所述羟乙基纤维素的总重量的1％-3％。
10.如权利要求1-4任一项所述的iPSC来源外泌体的制备方法制备的iPSC来源外泌体在皮肤损伤修复中的应用。
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