CN113088512A - 一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用 - Google Patents

一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113088512A
CN113088512A CN202110406980.5A CN202110406980A CN113088512A CN 113088512 A CN113088512 A CN 113088512A CN 202110406980 A CN202110406980 A CN 202110406980A CN 113088512 A CN113088512 A CN 113088512A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
enzyme
complex enzyme
formaldehyde
mixed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110406980.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113088512B (zh
Inventor
熊燕飞
陈跃锋
余卜举
刘兴波
王雪冰
毛志强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University of Technology WUT
Original Assignee
Wuhan University of Technology WUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University of Technology WUT filed Critical Wuhan University of Technology WUT
Priority to CN202110406980.5A priority Critical patent/CN113088512B/zh
Publication of CN113088512A publication Critical patent/CN113088512A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113088512B publication Critical patent/CN113088512B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/18—Multi-enzyme systems
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D53/00—Separation of gases or vapours; Recovering vapours of volatile solvents from gases; Chemical or biological purification of waste gases, e.g. engine exhaust gases, smoke, fumes, flue gases, aerosols
    • B01D53/34—Chemical or biological purification of waste gases
    • B01D53/38—Removing components of undefined structure
    • B01D53/44—Organic components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D53/00—Separation of gases or vapours; Recovering vapours of volatile solvents from gases; Chemical or biological purification of waste gases, e.g. engine exhaust gases, smoke, fumes, flue gases, aerosols
    • B01D53/34—Chemical or biological purification of waste gases
    • B01D53/46—Removing components of defined structure
    • B01D53/72—Organic compounds not provided for in groups B01D53/48 - B01D53/70, e.g. hydrocarbons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D53/00—Separation of gases or vapours; Recovering vapours of volatile solvents from gases; Chemical or biological purification of waste gases, e.g. engine exhaust gases, smoke, fumes, flue gases, aerosols
    • B01D53/34—Chemical or biological purification of waste gases
    • B01D53/74—General processes for purification of waste gases; Apparatus or devices specially adapted therefor
    • B01D53/84—Biological processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/096—Polyesters; Polyamides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/20—Air quality improvement or preservation, e.g. vehicle emission control or emission reduction by using catalytic converters

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用，该复合酶的制备方法，包括以下步骤：提供生物材料；将生物材料粉碎后提取得到生物酶；将生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用缓冲液悬浮，然后加入NAD+、精氨酸或赖氨酸，混合均匀得到混合液；将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定。本发明的复合酶的制备方法，利用海藻酸钠对酶进行包埋固定，相比未固定，甲醛清除率和降解率没有受到影响，甚至有所提高；本发明制备得到的复合酶，经长期使用酶活性下降后，经再生处理，其除甲醛活性可恢复至甲醛清除率达80％，降解率达70％左右。

Description

一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，尤其涉及一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用。
背景技术
家居和办公环境空气污染直接危害着人体健康，受到人们的严重关切。特别是办公室已成为空气污染重灾区，空气质量不合格率高达90％以上(2019中国室内空气污染状况白皮书，弗里曼检测，2019-04-8 09)。室内空气污染主要来自悬浮颗粒物和挥发性有机物(Volatile Organic Compounds，VOCs)两大类，挥发性有机物已被世界卫生组织认定为室内污染的重要组分，涵盖了广泛的化学物质，以分子形式分散在空气中，难以治理和防范，污染最为严和普遍。室内空气中已发现超过350种VOC，其中，常见有毒有害物质80多种，致癌物质20多种，以甲醛、苯系物、氨、酯及三氯乙烯等的危害较大。甲醛因其高度危险性和广泛性更受关注，特别在我国，甲醛高居室内常见挥发性有机污染物榜首。
甲醛暴露对健康的影响主要包括感官刺激和诱发肿瘤的潜在风险，甲醛因其反应性较其它挥发性有机化合物更容易引起感觉刺激。空气中甲醛浓度超过1ppm，就会引起轻度到中度的眼睛刺激，超过2ppm时，轻度到中度的呼吸道刺激。长期的甲醛暴露会引起头晕、免疫力降低、呼吸功能障碍、肝中毒性病变等严重健康损害。慢性吸入甲醛可致小鼠精子畸形、卵巢损伤等生殖毒性。甲醛能与体内的蛋白质，DNA发生非特异性反应，对人体产生巨大的危害。
目前，室内空气甲醛污染净化主要采用物理吸附、化学转化和光催化降解、低温等离子技术以及空气负离子技术等。物理吸附是目前市场上室内空气器除甲醛的主要手段，技术工艺简单，但单靠物理吸附并不能真正去除甲醛，实际应用是物理吸附与化学吸收或氧化降解技术结合。所有以上技术都归属物理或化学范畴，无论清除效果如何，有两个问题无法回避，一是清除不能彻底，二是存在二次污染风险，化学法引入了新的化学试剂，光催化和低温等离子体等技术处理时，降解产物无法控制，可能产生新的有毒物质。对包括吸附过滤，紫外光催化氧化(UV PCO)，臭氧氧化，空气电离和植物净化等在内的15种空气净化技术空气VOC净化效果的比较研究显示，带有HEPA过滤器和/或离子发生装置的净化器，最佳单程去除甲醛效率只有4％，对甲苯和十二烷的去除效率分别为32％和39％，已经商用的紫外光催化氧化净化器和臭氧发生器没有一个能有效去除任何经过测试的VOC成分，有些甚至释放出超出安全极限浓度的臭氧。利用光催化剂催化氧化甲醛甚至释放更具毒性的一氧化碳。
基于目前室内空气中甲醛的去除存在的技术缺陷，有必要对此进行改进。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用，以解决或部分解决现有技术中存在的技术问题。
第一方面，本发明提供了一种复合酶的制备方法，包括以下步骤：
提供生物材料；
将所述生物材料粉碎后提取得到生物酶；
将所述生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用缓冲液悬浮，然后加入NAD+、精氨酸或赖氨酸，混合均匀得到混合液；
将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述的复合酶的制备方法，将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定具体包括：将多孔载体使用钙离子溶液中浸泡，然后将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后铺展在多孔载体上，静置；
其中，所述多孔载体包括尼龙布、无纺布、硅藻土、硅胶、分子筛、陶瓷、高岭土、氧化铝、海藻酸钙、纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺和酚醛树脂中的一种或几种。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述的复合酶的制备方法，将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定具体包括：将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后再加入至钙离子溶液中，静置；
和/或，所述生物材料包括菠菜叶、水葫芦叶和藻类植物中的一种或几种。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述的复合酶的制备方法，将所述生物材料粉碎后提取得到生物酶具体包括：将所述生物材料置于NaCl溶液中，搅碎，过滤后得到滤液，将滤液使用离心机离心，离心后得到上清液，将上清液继续离心得到第一沉淀，将第一沉淀加入至Tris缓冲液中，再加入蔗糖溶液进行梯度离心，将梯度离心后的中间层冻融后，离心得到第二沉淀，将第二沉淀加入至Tris缓冲液中，继续离心分离得到第三沉淀，即为生物酶。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述的复合酶的制备方法，将所述生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用缓冲液悬浮，然后加入NAD+、精氨酸和/或赖氨酸，混合均匀得到混合液；其中，缓冲液的pH为6～7，加入的NAD+浓度为0.05～0.1mmol.L-1，加入的精氨酸或赖氨酸浓度为1～5umol.L-1。
进一步优选的，所述的复合酶的制备方法，所述钙离子溶液为CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为0.5～1mol.L-1。
进一步优选的，所述的复合酶的制备方法，海藻酸钠溶液的质量浓度为1～3％；
和/或，所述混合液与所述海藻酸钠溶液的体积比为1:(1～3)。
第二方面，本发明还提供了一种复合酶，采用所述的制备方法制备得到。
第三方面，本发明还提供了一种所述的复合酶的再生方法，包括以下步骤：将所述复合酶置于活化再生液中浸泡15～30min，其中，所述活化再生液的制备方法为：将Tris缓冲液、NAD+溶液、精氨酸溶液、MnCl2溶液混合均匀，即得活化再生液。
第四方面，本发明还提供了一种所述的复合酶在除去空气中甲醛、苯系物中的应用。
本发明的一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用相对于现具有以下有益效果：
(1)本发明的复合酶的制备方法，利用海藻酸钠对酶进行包埋固定，相比未固定，甲醛清除率和降解率没有受到影响，甚至有所提高；本申请的复合酶，储运稳定性得到大幅提高，一般室温条件下(10℃-20℃)，密封，固定化酶储存180天，复合酶对甲醛的清除果没有明显变化，便于储运存放；本申请利用生物材料制备得到复合酶催化去除甲醛等挥发性空气污染物，效率高，适用浓度范围广；所用的材料主要来源于生物材料，安全无毒，酶催化反应定向进行，无二次污染；制备得到的复合酶具有自循环再生机制，能延长酶的使用时效，并可再生循环使用；酶作用条件温和，居室、办公环境和公共室内环境使用，无需特别设备和提供能源；
(2)本发明制备得到的复合酶，使用便利，可固定成膜状、颗粒状、或其他所需形状，方便空气中或水体中循环使用；
(3)本发明制备得到的复合酶，经长期使用酶活性下降(如对甲醛降解率低于25％)后，经再生处理，其除甲醛活性可恢复至甲醛清除率达80％，降解率达70％左右；
(4)本发明制备得到的复合酶，除用于空气甲醛清除外，对水体甲醛污染同样具有良好的清除效果，甲醛降解率可达65％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中制备得到的复合酶在3.5L含1.1mg.m-3甲醛的空气中对甲醛的清除效果与时间的关系图；
图2为本发明实施例1中制备得到的复合酶依次连续作用于8个3.5L甲醛起始浓度为1.1mg.m-3的空气对甲醛的清除效果图；
图3为本发明实施例1中制备得到的复合酶以及对比例2中制备得到的复合酶，对3.5L甲醛起始浓度为1.1mg.m-3的污染空气中的甲醛清除效果图；
图4为本发明实施例1中制备得到的复合酶再生前后对空气中的甲醛清除效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本申请实施例提供了一种复合酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供生物材料；
S2、将生物材料粉碎后提取得到生物酶；
S3、将生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用缓冲液悬浮，然后加入NAD+、精氨酸或赖氨酸，混合均匀得到混合液；
S4、将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定。
需要说明的是，本申请实施例中生物材料指的是生长旺盛的植物叶肉组织，通过将生物材料经细胞破碎、分级分离、低温离心、冻融等过程，提取得到生物酶；NADH为是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，即还原型辅酶Ⅰ，NAD+是其氧化形式。
在一些实施例中，将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定具体包括：将多孔载体使用钙离子溶液中浸泡，然后将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后铺展在多孔载体上，静置；
其中，所述多孔载体包括尼龙布、无纺布、硅藻土、硅胶、分子筛、陶瓷、高岭土、氧化铝、海藻酸钙、纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺和酚醛树脂中的一种或几种。在本申请实施例中，将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后铺展在多孔载体上，静置后，在多孔载体上固定形成酶膜，多孔载体起到支撑的作用。
在一些实施例中，将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后铺展在多孔载体之前还包括：将多孔载体置于0.5～2mol.L-1的CaCl2溶液中浸泡润湿。
在一些实施例中，将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定具体包括：将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后再加入至钙离子溶液中，静置；在本申请实施例中，将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后再加入至CaCl2溶液中，静置后形成酶颗粒。具体的，可采用滴加或喷洒/分散将混合后的物料加入至CaCl2溶液中。
在一些实施例中，生物材料包括菠菜叶、水葫芦叶和藻类植物中的一种或几种。具体的，藻类植物包括黑藻、绿藻等。
在一些实施例中，将所述生物材料粉碎后提取得到生物酶具体包括：将生物材料置于NaCl溶液中，搅碎，过滤后得到滤液，将滤液使用离心机离心，离心后得到上清液，将上清液继续离心得到第一沉淀，将第一沉淀加入至Tris缓冲液中，再加入蔗糖溶液进行梯度离心，将梯度离心后的中间层冻融后，离心得到第二沉淀，将第二沉淀加入至Tris缓冲液中，继续离心分离得到第三沉淀，即为生物酶。
具体的，将生物材料用去离子水洗净后，置于0.3～0.4mol.L-1的NaCl溶液中，搅碎，过滤后得到滤液，将滤液于4℃下、以1500～2000rpm在离心机中离心5～8min，离心后得到上清液，将上清液于4℃下、以6000～7000rpm在离心机离心20～25min，离心后得到第一沉淀；将第一沉淀加入至Tris缓冲液中，再加入质量浓度为30～52％的蔗糖溶液，于4℃下、以6000～7000rpm下梯度离心，将梯度离心后的中间层转移至离心管中，然后经过冻融，再于6000～7000rpm下离心20～25min，得到第二沉淀，将第二沉淀加入至Tris缓冲液中，于6000～7000rpm下离心20～25min，分离得到第三沉淀，即为生物酶。
需要说明的是，本申请实施例中Tris缓冲液又称Tris-HCl缓冲液，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。本申请中梯度离心采用蔗糖密度梯度离心法。
在一些实施例中，将生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用缓冲液悬浮，然后加入NAD+、精氨酸和/或赖氨酸，混合均匀得到混合液；其中，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，其pH为6～7，加入的NAD+浓度为0.05～0.1mmol.L-1，加入的精氨酸或赖氨酸浓度为1～5umol.L-1。
具体的，生物酶与缓冲液悬浮之间的质量体积比为(1～2)mg:1ml；NADH氧化还原酶与生物酶之间的质量比为(1～2):10。在本申请实施例中加入的NAD+、精氨酸和/或赖氨酸，均指的是其水溶液。
在一些实施例中，CaCl2溶液的浓度为0.5～1mol.L-1。
在一些实施例中，海藻酸钠溶液的质量浓度为1～3％。
在一些实施例中，混合液与所述海藻酸钠溶液的体积比为1:(1～3)。
基于同一发明构思，本申请实施例还提供了一种复合酶，采用上述的制备方法制备得到。
基于同一发明构思，本申请实施例还提供了一种复合酶的再生方法，包括以下步骤：将上述制备得到的复合酶置于活化再生液中浸泡15～30min，其中，活化再生液的制备方法为：将Tris缓冲液、NAD+溶液、精氨酸溶液、MnCl2溶液混合均匀，即得活化再生液。
具体的，活化再生液中Tris缓冲液的pH为6～7，NAD+溶液的浓度为0.05～0.15mmol.L-1，精氨酸溶液的浓度为0.8～2umol.L-1、MnCl2溶液的浓度为0.05～0.15mmol.L-1。
基于同一发明构思，本申请实施例还提供了上述制备得到的复合酶在除去空气中甲醛、苯系物中的应用。
以下进一步以具体实施例说明本申请的复合酶的制备方法、再生方法和应用。
实施例1
本申请实施例提供了一种复合酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供菠菜叶，并将其用去离子水洗净；取80目尼龙布，并将其置于1mol.L-1的CaCl2溶液中浸泡润湿，取出后晾干，备用；
S2、将洗净后的菠菜叶置于0.35mol.L-1的NaCl溶液中，搅碎，过滤后得到滤液，将滤液于4℃下、以2000rpm在离心机中离心5min，离心后得到上清液，将上清液于4℃下、以6000rpm在离心机离心20min，离心后得到第一沉淀；将第一沉淀加入至Tris缓冲液中，再加入质量浓度为30％和50％的蔗糖溶液，于4℃下、以6000rpm下梯度离心，将梯度离心后的中间层转移至离心管中，然后经过冻融，再于6000rpm下离心20min，得到第二沉淀，将第二沉淀加入至Tris缓冲液中，于6000rpm下离心20min，分离得到第三沉淀，即为生物酶；
S3、将生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用Tris-HCl缓冲液悬浮，然后加入NAD+、精氨酸，混合均匀得到混合液；其中，Tris-HCl缓冲液的pH为6.5，加入的NAD+浓度为0.05mmol.L-1，加入的精氨酸浓度为1umol.L-1；生物酶与缓冲液之间的质量体积比为1mg:1ml；NADH氧化还原酶与生物酶之间的质量比为1:12；
S4、将混合液与质量浓度为2％的海藻酸钠溶液按体积比为1:1混合均匀并铺展在尼龙布上，静置10min，去离子水清洗3遍，沥干表面水分，即得复合酶。
实施例2
本申请实施例提供了一种复合酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供菠菜叶，并将其用去离子水洗净；取80目尼龙布，并将其置于1mol.L-1的CaCl2溶液中浸泡润湿，取出后晾干，备用；
S2、将洗净后的菠菜叶置于0.35mol.L-1的NaCl溶液中，搅碎，过滤后得到滤液，将滤液于4℃下、以2000rpm在离心机中离心5min，离心后得到上清液，将上清液于4℃下、以6000rpm在离心机离心20min，离心后得到第一沉淀；将第一沉淀加入至Tris缓冲液中，再加入质量浓度为30％和50％的蔗糖溶液，于4℃下、以6000rpm下梯度离心，将梯度离心后的中间层转移至离心管中，然后经过冻融，再于6000rpm下离心20min，得到第二沉淀，将第二沉淀加入至Tris缓冲液中，于6000rpm下离心20min，分离得到第三沉淀，即为生物酶；
S3、将生物酶与NADH混合并使用Tris-HCl缓冲液悬浮，然后加入NAD+、赖氨酸，混合均匀得到混合液；其中，Tris-HCl缓冲液的pH为6.5，加入的NAD+浓度为0.1mmol.L-1，加入的赖氨酸浓度为1umol.L-1；生物酶与缓冲液悬浮之间的质量体积比为0.5mg:1ml；NADH氧化还原酶与生物酶之间的质量比为2:10；
S4、将混合液与质量浓度为2％的海藻酸钠溶液按体积比为1:1混合均匀并铺展在尼龙布上，静置10min，去离子水清洗3遍，沥干表面水分，即得复合酶。
实施例3
本申请实施例提供了一种复合酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供水葫芦叶，并将其用去离子水洗净；取80目尼龙布，并将其置于1mol.L-1的CaCl2溶液中浸泡润湿，取出后晾干，备用；
S2、将洗净后的菠菜叶置于0.35mol.L-1的NaCl溶液中，搅碎，过滤后得到滤液，将滤液于4℃下、以2000rpm在离心机中离心5min，离心后得到上清液，将上清液于4℃下、以6000rpm在离心机离心20min，离心后得到第一沉淀；将第一沉淀加入至Tris缓冲液中，再加入质量浓度为30％和50％的蔗糖溶液，于4℃下、以6000rpm下梯度离心，将梯度离心后的中间层转移至离心管中，然后经过冻融，再于6000rpm下离心20min，得到第二沉淀，将第二沉淀加入至Tris缓冲液中，于6000rpm下离心20min，分离得到第三沉淀，即为生物酶；
S3、将生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用Tris-HCl缓冲液悬浮，然后加入NAD+、精氨酸，混合均匀得到混合液；其中，Tris-HCl缓冲液的pH为6.5，加入的NAD+浓度为0.1mmol.L-1，加入的精氨酸浓度为1umol.L-1；生物酶与缓冲液悬浮之间的质量体积比为1mg:1ml；NADH氧化还原酶与生物酶之间的质量比为1:10；
S4、将混合液与质量浓度为2％的海藻酸钠溶液按体积比为1:1混合均匀并铺展在尼龙布上，静置10min，去离子水清洗3遍，沥干表面水分，即得复合酶。
实施例4
本申请实施例提供了一种复合酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供水葫芦叶，并将其用去离子水洗净；取80目尼龙布，并将其置于1mol.L-1的CaCl2溶液中浸泡润湿，取出后晾干，备用；
S2、将洗净后的菠菜叶置于0.35mol.L-1的NaCl溶液中，搅碎，过滤后得到滤液，将滤液于4℃下、以2000rpm在离心机中离心5min，离心后得到上清液，将上清液于4℃下、以6000rpm在离心机离心20min，离心后得到第一沉淀；将第一沉淀加入至Tris缓冲液中，再加入质量浓度为30％和50％的蔗糖溶液，于4℃下、以6000rpm下梯度离心，将梯度离心后的中间层转移至离心管中，然后经过冻融，再于6000rpm下离心20min，得到第二沉淀，将第二沉淀加入至Tris缓冲液中，于6000rpm下离心20min，分离得到第三沉淀，即为生物酶；
S3、将生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用Tris-HCl缓冲液悬浮，然后加入NAD+、赖氨酸，混合均匀得到混合液；其中，Tris-HCl缓冲液的pH为6.5，加入的NAD+浓度为0.1mmol.L-1，加入的赖氨酸浓度为1umol.L-1；生物酶与缓冲液悬浮之间的质量体积比为0.5mg:1ml；NADH氧化还原酶与生物酶之间的质量比为2:10；
S4、将混合液与质量浓度为2％的海藻酸钠溶液按体积比为1:1混合均匀并铺展在尼龙布上，静置10min，去离子水清洗3遍，沥干表面水分，即得复合酶。
实施例5
本申请实施例提供了上述复合酶的再生方法，包括以下步骤：
将复合酶置于活化再生液中浸泡25min，其中，活化再生液的制备方法为：将Tris缓冲液、NAD+溶液、精氨酸溶液、MnCl2溶液混合均匀，即得活化再生液；具体的，上述四种溶液混合后得到的活化再生液的pH为6.5，其中混合后的溶液中NAD+的浓度为0.1mmol.L-1、精氨酸的浓度为1umol.L-1、MnCl2的浓度为0.1mmol.L-1。
对比例1
本对比例提供了一种空白膜的制备方法，包括以下步骤：将pH为6.5的Tris-HCl缓冲液与质量浓度为2％的海藻酸钠溶液按体积比为1:1混合均匀并铺展在尼龙布上，静置10min，去离子水清洗3遍，沥干表面水分，即得空白膜。
对比例2
本对比例提供了一种复合酶的制备方法，同实施例1，不同在于，本申请的酶不经过海藻酸钠和钙离子固定，具体的，经过步骤S3得到的混合液即为本申请制备得到的复合酶。
性能测试
参照国家标准GB/T18204.2-2014甲醛检测方法，共设计酶清除甲醛实验组和两个对照组，按如下方法进行。
A组：酶清除甲醛实验组，在大玻璃三角瓶中(3.4L)，加入一定量的稀释甲醛溶液，密闭瓶口，模拟甲醛污染空气，迅速在瓶内悬挂ф6cm的本申请制备得到的酶膜，密封瓶口，30min后，取出酶膜，用8mL酚试剂吸收酶膜中残留的甲醛，测膜中残留甲醛量，记为maA。瓶中加入8mL酚试剂，封瓶口，转动瓶身使瓶内残留甲醛充分被酚试剂吸收，检测吸收液中甲醛量，记为mrA。
B组：空白膜对照组，以同样规格但不含酶的空白膜(等量缓冲液代替酶制剂固定的膜)代替酶膜，其它同A组，膜中残留甲醛量记为maB，瓶中残留甲醛量记为mrB，用于检测酶固定基质吸收的甲醛。
C组：空白对照组，不加酶膜处理，其它同A组，瓶中残留甲醛量记为mrC，用于校正实验中酚试剂吸收甲醛不完全和泄露的甲醛。
按下述公式计算酶对甲醛的清除效率和降解效率：
甲醛清除率％＝(mrC-mrA)/mrC*100％
甲醛降解率％＝(mrC-mrA-maA)/mrC*100％
测试实施例1中制备得到的复合酶在3.5L含1.1mg.m-3甲醛的空气中对甲醛的清除效果与时间的关系，结果如图1所示。其中，甲醛清除率和甲醛降解率的计算方法参考上述公式。
从图1中甲醛清除率和甲醛降解率两条曲线清晰地说明，酶对甲醛的清除作用有一个吸收、扩散和酶促降解的过程。复合酶对甲醛的吸收很快，10min吸收81.2％的甲醛，其后对甲醛的吸收量增加缓慢，30min后几乎达到吸收平衡，对应着复合酶对甲醛的清除率随时间的变化。复合酶对甲醛的降解作用前30min随时间急速增加，随反应体系中甲醛浓度下降，酶促甲醛降解率增速逐渐减缓，但降解率的增加幅度大于清除率的增加幅度，说明甲醛的酶促降解继续进行，直至膜内外甲醛的吸收、扩散和降解达平衡。
将实施例1中制备得到的复合酶，依次连续作用于8个3.5L甲醛起始浓度为1.1mg.m-3的污染空气中的甲醛，每个反应瓶中作用30min，测试复合酶每次对空气中甲醛的清除效果，结果如图2所示。其中，总降解指连续使用8次后，酶对甲醛总量的平均清除率。
从图2中可以看出，随着使用次数增加，酶对甲醛的清除率逐渐下降，但依然有效，其总的甲醛清除率4h达到48％以上，即每1g酶蛋白每小时降解甲醛7.7mg，酶对甲醛的降解作用非常有效。
测试本申请实施例1中制备得到的复合酶以及对比例2中制备得到的复合酶(未固定)，对3.5L甲醛起始浓度为1.1mg.m-3的污染空气中的甲醛清除效果，结果如图3所示。图3中固定代表实施例1中制备得到的复合酶、未固定代表对比例2中制备得到的复合酶。
从图3中可知，实施例1中制备得到的复合酶与对比例2中制备得到的复合酶甲醛清除率基本相同，但实施例1中制备得到的复合酶对甲醛的降解率明显提高，这是由于固定化基质具有吸附富集甲醛的作用。
实施例1中制备得到的复合酶经过使用后，当其对甲醛降解率下降至25％以后，按照实施例5中的再生方法再生，并测试复合酶再生前后对3.5L甲醛起始浓度为1.1mg.m-3的污染空气中的甲醛清除效果，结果如图4所示。
从图4中可以看出，经过再生处理后复合酶对甲醛清除率和降解率分别恢复到80％多和70％左右，复合酶活性恢复良好。
综上，本申请利用生物材料制备得到复合酶催化去除甲醛等挥发性空气污染物，效率高，适用浓度范围广；所用的材料主要来源于生物材料，安全无毒，酶催化反应定向进行，无二次污染；制备得到的复合酶具有自循环再生机制，能延长酶的使用时效，并可再生循环使用，酶作用条件温和，居室、办公环境和公共室内环境使用，无需特别设备和提供能源；本申请的利用海藻酸钠对酶进行包埋固定，相比未固定，甲醛清除率和降解率没有受到影响，甚至有所提高；本申请的复合酶，储运稳定性得到大幅提高，一般室温条件下(10℃-20℃)，密封，固定化酶储存180天，复合酶对甲醛的清除果没有明显变化，便于储运存放；本申请的复合酶使用便利，可固定成膜状、颗粒状、或其他所需形状，方便空气中或水溶液中循环使用；本申请的复合酶，除用于空气甲醛清除外，对水体甲醛污染同样具有良好的清除效果，甲醛降解率可达65％以上。
本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供生物材料；
将所述生物材料粉碎后提取得到生物酶；
将所述生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用缓冲液悬浮，然后加入NAD+、精氨酸或赖氨酸，混合均匀得到混合液；
将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定。
2.如权利要求1所述的复合酶的制备方法，其特征在于，将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定具体包括：将多孔载体使用钙离子溶液中浸泡，然后将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后铺展在多孔载体上，静置；
其中，所述多孔载体包括尼龙布、无纺布、硅藻土、硅胶、分子筛、陶瓷、高岭土、氧化铝、海藻酸钙、纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺和酚醛树脂中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的复合酶的制备方法，其特征在于，将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后使用钙离子固定具体包括：将混合液与海藻酸钠溶液混合均匀后再加入至钙离子溶液中，静置；
和/或，所述生物材料包括菠菜叶、水葫芦叶和藻类植物中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的复合酶的制备方法，其特征在于，将所述生物材料粉碎后提取得到生物酶具体包括：将所述生物材料置于NaCl溶液中，搅碎，过滤后得到滤液，将滤液使用离心机离心，离心后得到上清液，将上清液继续离心得到第一沉淀，将第一沉淀加入至Tris缓冲液中，再加入蔗糖溶液进行梯度离心，将梯度离心后的中间层冻融后，离心得到第二沉淀，将第二沉淀加入至Tris缓冲液中，继续离心分离得到第三沉淀，即为生物酶。
5.如权利要求1所述的复合酶的制备方法，其特征在于，将所述生物酶与NADH氧化还原酶混合并使用缓冲液悬浮，然后加入NAD+、精氨酸和/或赖氨酸，混合均匀得到混合液；其中，缓冲液的pH为6～7，加入的NAD+浓度为0.05～0.1mmol.L-1，加入的精氨酸或赖氨酸浓度为1～5umol.L-1。
6.如权利要求2或3所述的复合酶的制备方法，其特征在于，所述钙离子溶液为CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为0.5～1mol.L-1。
7.如权利要求3所述的复合酶的制备方法，其特征在于，海藻酸钠溶液的质量浓度为1～3％；
和/或，所述混合液与所述海藻酸钠溶液的体积比为1:(1～3)。
8.一种复合酶，其特征在于，采用如权利要求1～7任一所述的制备方法制备得到。
9.一种如权利要求8所述的复合酶的再生方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述复合酶置于活化再生液中浸泡15～30min，其中，所述活化再生液的制备方法为：将Tris缓冲液、NAD+溶液、精氨酸溶液、MnCl2溶液混合均匀，即得活化再生液。
10.一种如权利要求8所述的复合酶在除去空气中甲醛、苯系物中的应用。
CN202110406980.5A 2021-04-15 2021-04-15 一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用 Active CN113088512B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110406980.5A CN113088512B (zh) 2021-04-15 2021-04-15 一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110406980.5A CN113088512B (zh) 2021-04-15 2021-04-15 一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113088512A true CN113088512A (zh) 2021-07-09
CN113088512B CN113088512B (zh) 2023-04-07

Family

ID=76678080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110406980.5A Active CN113088512B (zh) 2021-04-15 2021-04-15 一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113088512B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116764157A (zh) * 2023-01-12 2023-09-19 苏州盛仓生物环保科技有限公司 一种酶氧化降解甲苯的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914516A (zh) * 2010-07-13 2010-12-15 昆明理工大学 一种固定甲醛分解途径关键酶及辅因子的方法及其应用
CN110052133A (zh) * 2019-05-24 2019-07-26 广州市可达环保科技有限公司 一种甲醛净化剂及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101914516A (zh) * 2010-07-13 2010-12-15 昆明理工大学 一种固定甲醛分解途径关键酶及辅因子的方法及其应用
CN110052133A (zh) * 2019-05-24 2019-07-26 广州市可达环保科技有限公司 一种甲醛净化剂及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTINA SUDAR 等: "Coenzyme regeneration catalyzed by NADH oxidase from Lactococcus lactis", 《BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL》, vol. 88, 16 April 2014 (2014-04-16), pages 12 - 18 *
徐梦秋: "利用交联酶聚集体技术共固定化NADH氧化酶构建NAD+再生系统", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》, no. 11, 15 November 2019 (2019-11-15), pages 006 - 102 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116764157A (zh) * 2023-01-12 2023-09-19 苏州盛仓生物环保科技有限公司 一种酶氧化降解甲苯的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113088512B (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2011213300A1 (en) A buoyant multifunctional composite material for effective removal of organic compounds in water and wastewater
CN206660923U (zh) 一种用于有机废气净化的活性炭吸附‑光降解联用装置
CN105688660B (zh) 以二氧化钛光触媒为基材的空气净化材料及其制备方法
CN113088512B (zh) 一种复合酶及其制备方法、再生方法和应用
CN106861642A (zh) 一种具有高吸附能力的生物质基水凝胶的制备与应用
CN201399313Y (zh) 一种室内空气净化装置
CN111729654A (zh) 一种改性槐树叶生物炭的制备方法及其应用
CN103159260A (zh) 一种分子级厚度的HNb3O8纳米片的制备方法和应用
CN201445893U (zh) 过滤器以及空气净化器
CN108499524A (zh) 一种用于纯化过氧化氢的吸附剂制备方法及其应用
CN108434956A (zh) 生活垃圾焚烧烟气超净处理工艺及系统
CN105217715B (zh) 一种活性炭材料去除处理抗生素乙酰磺胺的方法
CN211936308U (zh) 一种污水处理场废气超净排放处理系统
CN206082107U (zh) 一种工业有机废气净化装置
CN111977873A (zh) 一种光活海泡石Si-OH用于水溶性有机污染物吸附与光降解的方法
CN102698734B (zh) 一种降解苯系污染物的无定形钽酸光催化剂及其制备方法
CN103071399B (zh) 一种具有再生能力的复合平板膜及其制备方法
CN108607521A (zh) 一种除甲醛的改性氧化铝基净化材料及其制备方法
CN108554042A (zh) 立式室内空气臭氧净化器
CN115253587A (zh) 一种有机废气电催化-生化联用净化的方法及装置
CN115121232A (zh) 一种二氧化钛自清洁膜及其制备方法与应用
CN103551137A (zh) 一种骨架为污泥基活性炭的固体催化剂的制备及其应用
CN108554388A (zh) 含纳米催化粒子的介微孔壳聚糖颗粒及其应用
CN108579223B (zh) 一种空气净化器用甲醛滤网材料及其制备方法
CN107804946B (zh) 处理饮用水中亚硝胺类消毒副产物的工艺

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant