CN113087766A - 18f标记的靶向激活型化合物及其制备方法以及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种18F标记的靶向激活型化合物，其具有式I所示结构。本发明还公开了这种化合物的制备方法，并公开了其在生物素受体靶向与谷胱甘肽响应激活的肿瘤PET显像剂中的应用。本发明公开的18F标记的靶向激活型化合物是一种生物素受体靶向与谷胱甘肽响应激活的化合物，在PBS和血清中均有良好的稳定，同时其在体内的滞留能力强，可以改善肿瘤成像效果。该化合物标记时间短，制备步骤简单，显著提高了标记效率。该化合物作为显像剂应用时，肿瘤摄取高，肌肉摄取低，靶本比高、显像灵敏度高，具有更加精准的成像能力。

Description

18F标记的靶向激活型化合物及其制备方法以及应用
技术领域
本发明属于放射性药物标记领域，具体涉及一种18F标记的靶向激活型化合物及其制备方法以及应用。
背景技术
如今，癌症仍然是人类健康的主要威胁，由于晚期癌症几乎无法治愈，癌症的早期诊断对提高患者生存率至关重要。分子影像学被认为是诊断癌症的一种有效方法，利用各种成像技术诊断癌症，如磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、光学成像等。其中PET因其灵敏度高，在临床中应用广泛，通过使用放射性标记探针(放射性示踪剂)，PET可以提供非侵入性活体成像，可用于诊断癌症或评估治疗效果。18F是PET成像中最常用的放射性核素，具有合适的半衰期时间(110分钟)，成像性能优异。放射性示踪剂在PET成像中起着重要的作用。PET的成像效果与示踪剂密切相关。目前，已开发出了多种肿瘤靶向探针用于PET成像。提高探针的靶向性通常采用两种策略：(1)将肿瘤特异性配体与成像探针结合；(2)利用肿瘤微环境激活成像探针。
探针大致可以分为两类：小分子探针和纳米探针。小分子探针可以很容易地通过细胞膜传输，但它们的代谢速度往往很快。而纳米探针在肿瘤中的停留时间很长，但是与小分子探针相比，纳米探针更难穿过细胞膜。2010年Rao等报道了2-氰基苯并噻唑(CBT)的氰基与半胱氨酸(Cys)的1,2-氨基硫醇基之间的生物相容性点击缩合(click)反应。该反应可用来设计具有自主装能力的小分子探针，这类探针可以根据响应相应的肿瘤标记物自组装成纳米颗粒，该系统结合了小分子探针和纳米探针的优点，也可以通过探针在肿瘤中的自组装来放大检测信号。
另一方面，到目前为止，已有多种肿瘤靶向配体用于增强药物和探针的肿瘤特异性，维生素介导的肿瘤靶向已经成为一种常用策略。生物素，也被称为维生素H，是细胞生长的必需营养素。由于快速增殖的细胞需要更多的生物素，与正常组织相比，癌症对生物素的需求更高，生物素受体(BR)在许多人类实体肿瘤中过度表达。因此，生物素受体靶向被广泛应用于开发各种癌症选择性药物或探针。同时，某些癌细胞细胞内谷胱甘肽(GSH)浓度升高，维持了一个还原的微环境。基于此特征，人们设计出多种还原响应探针或药物用于肿瘤的诊断和治疗。
但是现有技术中，还并没有探针同时结合生物素受体靶向和谷胱甘肽响应激活两种方式的优点，应用于PET成像中。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中探针肿瘤代谢快，靶本比低，成像时间短,稳定性差，制备复杂等缺陷，从而提供一种18F标记的靶向激活型化合物及其制备方法以及其作为生物素受体靶向与谷胱甘肽响应激活的肿瘤PET显像剂的应用。
为此，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种18F标记的靶向激活型化合物，具有如下式I所示结构：
Figure BDA0003049843810000021
本发明还提供上述18F标记的靶向激活型化合物的制备方法，将具有如下式II所示结构的前体化合物与50-500mCi的18F离子溶液，在pH为2.5的缓冲液中，于80-100℃反应10-40min，洗涤分离纯化后得到所述式I所示结构；
Figure BDA0003049843810000022
进一步地，式II所示结构的前体化合物的制备包括如下步骤：
S1：将式II-1所示结构的化合物和生物素式III以及苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯混合后，使用四氢呋喃溶解，加入N,N-二异丙基乙胺在氮气保护下反应1-2h，旋干纯化，得到式II-2所示结构的化合物；
S2：将极性溶剂与三氟乙酸混合，然后加入式II-2所示结构的化合物溶解，加入三异丙基硅烷反应0.5-1h，旋干后通过乙醚沉淀，真空干燥得到式II-3所示结构的化合物；
S3：将式II-3所示结构的化合物溶解于甲醇，加入式IV所示结构的化合物在氮气保护下反应1-2h，旋干纯化，得到式II-4所示结构的化合物；
S4：取式II-4所示结构的化合物、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和三氟硼酸盐溶于N,N-二甲基甲酰胺与超纯水的混合溶液中，然后加入六氟磷酸四乙腈铜(I)在氮气保护下于40-50℃反应45-90min，纯化后得到式II所示结构的前体化合物；
Figure BDA0003049843810000031
进一步地，式II-1所示结构的化合物、生物素式III、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1-1.2:1-1.2:2.2-2.7；
步骤S3中，式II-3所示结构的化合物与式IV所示结构的化合物的摩尔比为1:1.2-2；
步骤S4中，式II-4所示结构的化合物、三氟硼酸盐、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和六氟磷酸四乙腈铜(I)的摩尔比为1:3-6:0.05-0.2:0.5-2。
步骤S2中，式II-2所示结构的化合物质量为300重量份，加入2-4体积份的三氟乙酸和0.05-0.15体积份的三异丙基硅烷，所述重量份与体积份的关系为mg/mL。
进一步地，步骤S2中，极性溶剂为CH2Cl2、CHCl3、THF或CH3CN中的一种。
优选地，步骤S1-S3中，反应温度为室温；
步骤S1和S3中，所述纯化为通过柱层析纯化；
步骤S4中，所述纯化为通过半制备HPLC纯化。
本发明还提供上述18F标记的靶向激活型化合物的应用，具体应用于肿瘤PET显像剂。
进一步地，所述肿瘤PET显像剂为生物素受体靶向与谷胱甘肽响应激活的肿瘤PET显像剂。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明提供的18F标记的靶向激活型化合物，具有式I所示的结构，可通过生物素受体(BR)介导的胞吞作用选择性地在BR阳性肿瘤细胞中积累，然后二硫键被细胞内过量谷胱甘肽(GSH)裂解，裸露出半胱氨酸，半胱氨酸通过2-氰基-6-氨基苯并噻唑(CBT)-半胱氨酸点击缩合反应形成疏水环化二聚体，二聚体可进一步自组装成纳米粒子，从而降低探针从肿瘤细胞中泵出，增强了探针在肿瘤组织中滞留时间，纳米聚集可增强放射性信号，从而提高PET成像性能。该化合物是一种生物素受体靶向与谷胱甘肽响应激活的化合物。
(2)本发明提供的18F标记的靶向激活型化合物在PBS和血清中均有很高的稳定性。在计算与体外实验中，证明该化合物可以有效响应谷胱甘肽，发生还原自组装形成纳米颗粒，粒径约为138.2±16.3nm，有效提高探针在体内的滞留能力，改善肿瘤成像效果。在细胞摄取实验中，该标记物在生物素受体阳性肿瘤细胞中的摄取值是生物素受体抑制组的2-5倍。在小动物PET成像中，该18F标记的靶向激活型化合物在肿瘤组织中具有明显摄取。以上均证明了本发明提供的18F标记的靶向激活型化合物对于生物素受体阳性的肿瘤细胞具有特异的靶向性且具有谷胱甘肽还原响应能力，可以形成纳米颗粒增强PET显像效果。
(3)本发明提供的18F标记的靶向激活型化合物的制备方法，基于其结构中的有机三氟硼酸盐基团可用于一步18F标记方法，标记过程仅需要30min，标记时间短，制备步骤简单，显著提高了标记效率；所获得的18F标记的靶向激活型化合物比活度为1.0Ci/μmol，放化纯大于95％，其标记产物的放射化学产率能够达到43％，放射化学产率高，更加有利于放射性标记化合物的临床推广。
(4)本发明提供的18F标记的靶向激活型化合物可作为肿瘤PET显像剂，应用于显像剂时该化合物的浓度为0.3-2mCi/mL。在小动物PET成像中，相比于抑制组与单靶向探针组的肿瘤部位摄取，该显像剂的肿瘤摄取更高，在肌肉中摄取更低，具备靶本比高、显像灵敏度高的特点以及更加精准的成像能力。该显像剂具有标记产率高、稳定性好和肿瘤特异性靶向等优势，可以确保精确、实时的体内检测，从而进一步提高肿瘤成像精度，为肿瘤的早期诊断、监测、预后评价和新治疗方案的开发提供借鉴。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1-3中得到的式I所示的18F标记的靶向激活型化合物的结构式；
图2是本发明实施例1中中间产物式II-2所示的化合物的高效液相图谱；
图3是本发明实施例1中中间产物式II-2所示的化合物的质谱分析图谱；
图4是本发明实施例1中中间产物式II-3所示的化合物的高效液相图谱；
图5是本发明实施例1中中间产物式II-3所示的化合物的质谱分析图谱；
图6是本发明实施例1中中间产物式II-4所示的化合物的高效液相图谱；
图7是本发明实施例1中中间产物式II-4所示的化合物的质谱分析图谱；
图8是本发明实施例1中中间产物式II-4所示的化合物的1H-NMR图谱；
图9是本发明实施例1中中间产物式II-4所示的化合物的13C-NMR图谱；
图10是本发明实施例1中得到的式II所示的前体化合物的高效液相图谱；
图11是本发明实施例1中得到的式II所示的前体化合物的质谱分析图谱；
图12是本发明实施例1中得到的式II所示的前体化合物的1H-NMR图谱；
图13是本发明实施例1中得到的式II所示的前体化合物的13C-NMR图谱；
图14是本发明实施例1中得到的式I所示的18F标记的靶向激活型化合物的放射性高效液相图谱；
图15是本发明实施例1中得到的式I所示的18F标记的靶向激活型化合物以及对比例1,2得到的化合物的纯化检测图谱；
图16是本发明实施例1中得到的式II所示的前体化合物以及对比例1,2得到的化合物的前体化合物在不同浓度的下Hela细胞的细胞生存率柱状图；
图17是本发明实施例1中得到的式II所示的前体化合物以及对比例1,2得到的化合物的前体化合物在不同浓度的下A549细胞的细胞生存率柱状图；
图18是本发明实施例1中得到的式I所示的18F标记的靶向激活型化合物所示的化合物在PBS中孵育不同时间的放射性化学纯度图；
图19是本发明实施例1中得到的式I所示的18F标记的靶向激活型化合物在Hela细胞与A549细胞中的摄取图；
图20是本发明对比例1得到的化合物在Hela细胞与A549细胞中的摄取图；
图21是本发明对比例2得到的化合物在Hela细胞与A549细胞中的摄取图；
图22是本发明实施例1中得到的式II所示的前体化合物的分子间点击化学反应路线图(A)以及形成的二聚体1-Dimer的高效液相图谱(B)、动态光散射图谱(C)与透射电镜图(D)；
图23是本发明实施例1中得到的式I所示的18F标记的靶向激活型化合物在Hela肿瘤小鼠(实验组)PET成像结果图(A)和用游离生物素抑制肿瘤小鼠(对照组)中的PET成像结果图(B)、肿瘤与肌肉的摄取(C、D)以及靶本比(E)；
图24是本发明实施例1中得到的式I所示的18F标记的靶向激活型化合物和对比例1-2得到的化合物在Hela肿瘤小鼠中的PET成像结果图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。
二甲亚砜、N,N-二异丙基乙胺、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、三氟乙酸、三异丙基硅烷、N,N-二甲基甲酰胺、三氟硼酸盐、三(2-苯并咪唑基甲基)胺、六氟磷酸四乙腈铜(I)、四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇。所有试剂均为分析纯，使用前无需纯化，购置于阿拉丁试剂公司。
Hela与A549细胞购自上海中科院细胞库；DMEM与RPMI-1640培养基购自以色列BI公司；MTT购自碧云天；胰酶消化液购自碧云天；BALB/c裸鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司。
式II-1所示结构的化合物为按照文献(Jianguo Lin,Wei Wang,Ke Li,HongboHuang,Gaochao Lv,Shineng Luo and Ling Qiu.Development of a kit-likeradiofluorinated biomolecule leading to a controlled self-assembly of 18Fnanoparticles for a smart PET imaging application.ChemicalCommunication.2017,53(48),6476-6479.)中方法合成。
下述实施例中涉及到的仪器如下：
核磁共振仪(Bruker DRX-500)、高效液相色谱仪(Waters 2445)、γ计数仪(Perkin-Elmer1470)、元素分析仪(Perkin-Elmer 240C)、酶联免疫检测(美国Bio-Rad)、高速离心机(美国贝克曼库尔特J2-HS)。
以下具体实施例是对本发明的进一步说明，所举案例并不能列举出本发明的全部实施方式，仅以其中部分实施方式为例进行说明，具体实施例如下：
实施例1
本实施例提供一种具有如图1中所示的式I结构18F标记的靶向激活型化合物的制备方法；
该化合物还具有如式II所示结构的前体化合物，合成路线为：
Figure BDA0003049843810000071
具体合成步骤如下：
(1)将式II-1所示的化合物185mg(0.22mmol)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)96mg(0.25mmol)和生物素式III 64mg(0.26mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，加入干燥的四氢呋喃(THF)3mL溶解，再加入和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)110μL(0.66mmol)，氮气保护下于室温反应2h后，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.7，判定反应结束后旋干溶剂，将所得粗产品通过硅胶柱层析分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×19mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→35min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；35min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20。控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃，检测波长为254nm。通过质谱验证，27.6min处的峰为产物峰，其高效液相色谱图如图2所示。收集27.6min处的流出液，干燥，得到式II-2所示的化合物，为白色固体(136mg，58％)。将所得式II-2所示的化合物进行电喷雾质谱分析，质谱结果如图3所示。实际测得，m/z＝1070.36的信号峰对应式II-2所示的化合物的分子离子峰[M+H]+，与目标式II-2所示的化合物(ExactMass:1069.40)的分子量相符。
(2)将式II-2所示的化合物136mg(0.13mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL的CH2Cl2溶解，再加入3mL的TFA与0.1mL的三异丙基硅烷(TIPS)，室温下反应1h，旋干溶剂，使用无水乙醚沉淀，得到的固体真空干燥，得到式II-3所示的化合物，为白色固体(86mg，产率：93％)，通过质谱验证，12.1min处的峰为产物峰，其高效液相色谱图如图4所示。将所得式II-3所示的化合物进行电喷雾质谱分析，式II-3所示的化合物的质谱结果如图5所示。实际测得，m/z＝728.26的信号峰对应式II-3所示的化合物的分子离子峰[M+H]+，与目标式II-3所示的化合物(Exact Mass:727.24)的分子量相符。
(3)将式II-3所示的化合物40mg(0.055mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL的CH3OH溶解，随后加入式IV所示结构的化合物14mg(0.0825mmol)，氮气保护下室温搅拌0.5h，再加入1％体积的TIPS继续搅拌0.5h。通过TLC监测反应完全，旋干溶剂并通过乙醚沉淀真空干燥得到式II-4所示的化合物，为白色固体(35mg，产率：95％)，通过质谱验证，16.2min处的峰为产物峰，其高效液相色谱图如图6所示。将所得式II-4所示的化合物进行电喷雾质谱分析，式II-4所示的化合物的质谱结果如图7所示。实际测得，m/z＝788.35的信号峰对应式II-4所示的化合物的分子离子峰[M+H]+，与目标式II-4所示的化合物(ExactMass:787.24)的分子量相符。
将所得式II-4所示的化合物进行核磁共振氢谱分析：以d6-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振氢谱对式II-4所示的化合物的结构进行表征，其1H-NMR结果如图8所示。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.57(s,1H),8.93(d,J＝8.9Hz,1H),8.70(d,J＝2.0Hz,1H),8.58(d,J＝7.8Hz,1H),8.40–8.31(m,2H),8.20(d,J＝9.1Hz,1H),7.80(d,J＝9.0Hz,1H),7.76–7.69(m,1H),6.36(d,J＝12.0Hz,2H),4.61(q,J＝7.1Hz,1H),4.57–4.47(m,1H),4.47–4.38(m,1H),4.30(dd,J＝7.7,5.0Hz,1H),4.15–4.12(m,1H),3.15(dd,J＝14.1,5.1Hz,1H),3.08(d,J＝13.3Hz,1H),3.02(d,J＝5.9Hz,2H),3.00–2.97(m,1H),2.92(t,J＝2.6Hz,1H),2.83(d,J＝5.1Hz,1H),2.76(d,J＝24.2Hz,1H),2.66(q,J＝7.2Hz,2H),2.61–2.59(m,1H),2.56(s,1H),2.02(t,J＝7.4Hz,2H),1.81–1.68(m,2H),1.51–1.45(m,2H),1.43–1.39(m,2H),1.34–1.28(m,2H),1.25(d,J＝8.9Hz,2H),1.15(t,J＝7.3Hz,3H)。其中，δ3.42ppm对应氘代试剂d6-DMSO中水的信号峰；δ2.50ppm对应氘代试剂d6-DMSO上氢的信号峰；δ10.57ppm对应2-氰基-6-氨基苯并噻唑(2-cyanobenzothiazole,CBT)旁羰基上氢的信号峰；δ8.30,8.21,7.80ppm对应苯环上3组氢的信号峰；δ2.83ppm对应炔基上氢的信号峰。
将所得式II-4所示的化合物进行核磁共振碳谱分析：以d6-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振碳谱对式II-4所示的化合物的结构进行表征，其13C-NMR结果如图9所示。13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.35,171.61,169.46,167.28,163.19,148.18,139.82,137.12,135.52,125.29,121.30,113.99,111.83,80.34,74.00,61.53,59.70,55.87,54.03,52.26,51.66,38.66,35.68,32.06,31.72,29.34,28.68,28.49,25.76,23.22,22.76,14.46。所有碳均找到对应的归属，其中，δ40.0ppm对应氘代试剂d6-DMSO上碳的信号峰；δ172.35,171.61,169.46,167.28,163.19ppm对应羰基上碳的信号峰；δ148.18,139.82,137.12,135.52,125.29,121.30,113.99ppm对应苯并噻唑环上7组碳的信号峰；δ74.00ppm对应炔基上碳的信号峰。
综上所述，电喷雾质谱结果与目标化合物分子量一致；氢谱、碳谱证实氢元素和碳元素的个数与位置均能与目标化合物相吻合，所有表征结果均表明所得化合物即为目标化合物式II-4所示的化合物。
(4)将式II-4所示的化合物35mg(0.044mmol)、三氟硼酸盐(AmBF3)43mg(0.22mmol)和三(2-苯并咪唑基甲基)胺1.9mg(0.0044mmol)溶于3mL的DMF：H2O体积比为1：1的溶液中；将六氟磷酸四乙腈铜(I)16mg(0.044mmol)快速加入上述混合溶液中，在氮气保护下于45℃反应45min，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.4，判定反应结束，停止反应，通过半制备型HPLC分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×19mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。检测波长为254nm。通过质谱验证，14.8min处的峰为产物峰，其高效液相色谱图如图10所示，收集14.8min处的流出液，干燥，得到式II所示的前体化合物为白色固体(24mg，产率：55％)。将所得式II所示的前体化合物进行液质联用质谱分析：式II所示的前体化合物的质谱结果如图11所示。实际测得，m/z＝984.62的信号峰对应式II所示的前体化合物的分子离子峰[M+H]+，m/z＝1006.47的信号峰对应式II所示的前体化合物的分子离子峰[M+Na]+，均与式II所示的前体化合物(Exact Mass:983.35)的分子量基本一致。
将所得式II所示的前体化合物进行核磁共振氢谱分析：以d6-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振氢谱对式II所示的前体化合物的结构进行表征，其1H-NMR结果如图12所示。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.91(d,J＝8.0Hz,1H),8.70(d,J＝2.1Hz,1H),8.44(d,J＝7.9Hz,1H),8.30(d,J＝5.0Hz,2H),8.20(d,J＝9.0Hz,1H),7.96(s,1H),7.79(dd,J＝9.1,2.1Hz,1H),7.71(t,J＝5.6Hz,1H),6.36(s,2H),4.85(t,J＝7.1Hz,2H),4.74(q,J＝7.3Hz,3H),4.30(dd,J＝7.7,4.9Hz,1H),4.12(dd,J＝7.8,4.4Hz,2H),3.74(t,J＝7.1Hz,2H),3.17(dd,J＝14.0,5.0Hz,1H),3.10–3.05(m,2H),2.99(d,J＝8.2Hz,2H),2.66(q,J＝7.2Hz,2H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.44–2.37(m,2H),2.02(t,J＝7.4Hz,2H),1.79–1.61(m,2H),1.57(dd,J＝13.7,7.4Hz,2H),1.49–1.43(m,2H),1.41–1.33(m,2H),1.28(q,J＝5.0,2.9Hz,2H),1.25–1.18(m,2H),1.15(t,J＝7.3Hz,3H)。其中，δ3.80ppm对应氘代试剂d6-DMSO中水的信号峰，其中有2个氢的信号峰处于水峰的位置而被掩盖；δ2.50ppm对应氘代试剂d6-DMSO上氢的信号峰；δ8.44～7.96ppm对应酰胺上氢的信号峰；δ4.85～4.30ppm对应叔丁基上氢的信号峰；δ7.96ppm对应三氮唑上氢的信号峰，表明点击化学反应成功。
将所得式II所示的前体化合物进行核磁共振碳谱分析：以d6-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振碳谱对式II所示的前体化合物的结构进行表征，其13C-NMR结果如图13所示。13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.39,171.58,170.24,167.18,163.17,158.67,148.19,143.23,139.79,137.12,125.29,124.20,121.32,111.85,63.73,61.52,59.70,55.86,53.99,53.75,53.30,51.74,44.04,38.66,35.66,31.99,31.71,29.32,28.66,28.47,25.75,23.13,14.47。其中，δ40.0ppm对应氘代试剂d6-DMSO上碳的信号峰；δ148.19,143.23,139.79,137.12,125.29,111.85ppm对应苯并噻唑环上碳的信号峰；δ124.4,121.32ppm对应三氮唑上碳的信号峰，而炔基处的信号峰消失，表明点击化学反应成功。
综上所述，电喷雾质谱结果与目标化合物分子量一致；氢谱、碳谱证实氢元素和碳元素的个数与位置均能与目标化合物相吻合，证明点击化学反应成功，所有表征结果均表明所得化合物即为目标化合物式II所示的前体化合物。
式II所示结构的前体化合物制得式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的步骤为：
用300μL的哒嗪-盐酸-N,N-二甲基甲酰胺(pH＝2.5)缓冲液洗脱QMA柱，收集得到300mCi的F-18离子溶液，然后转移到1mL的标记反应管中，将式II所示的前体化合物溶于DMF中配制成浓度为25mmol/L的溶液，取所述溶液10-20μL加至所述标记反应管中，80℃下反应30min，反应结束后，取微量所得反应液稀释，通过放射性HPLC检测标记率，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。检测结果如图14所示，所述式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的保留时间与式II所示结构的前体化合物在紫外吸收下的保留时间(tR＝14.8min)一致，证明标记反应成功。经衰变校正后，式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的放射化学产率为43％，比活度约为1.0Ci/μmol。
向所得反应液中加入20mL去离子水稀释，通过C18柱(C18 Sep-Pak小柱)吸附标记产物，用去离子水10mL洗涤C18柱三次，最后用0.5mL无水乙醇将式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物淋洗到西林瓶中，即得到最终产品，以备使用。
取少量上述所得溶液进行稀释，通过放射性HPLC检测放化纯，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。标记产物纯化后检测结果如图15所示，式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的保留时间为15min，放化纯大于95％。
实施例2
本实施例提供一种具有如图1中所示的式I结构18F标记的靶向激活型化合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将式II-1所示的化合物180mg(0.22mmol)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)95mg(0.25mmol)和生物素式III 60mg(0.25mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，加入干燥的四氢呋喃(THF)3mL溶解，再加入和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)110μL(0.66mmol)，氮气保护下于室温反应2h后，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.7，判定反应结束后旋干溶剂，将所得粗产品通过硅胶柱层析分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×19mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→35min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；35min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20。控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃，检测波长为254nm。通过质谱验证，27.6min处的峰为产物峰，收集干燥，得到式II-2所示的化合物，为白色固体(135mg，58％)。
(2)将式II-2所示的化合物135mg(0.13mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL的CH2Cl2溶解，再加入3mL的TFA与0.1mL的三异丙基硅烷(TIPS)，室温下反应1h，旋干溶剂，使用无水乙醚沉淀，得到的固体真空干燥，得到式II-3所示的化合物，为白色固体(86mg，产率：93％)。
(3)将式II-3所示的化合物45mg(0.060mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL的CH3OH溶解，随后加入式IV所示结构的化合物15mg(0.085mmol)，氮气保护下室温搅拌0.5h，再加入1％体积的TIPS继续搅拌0.5h。通过TLC监测反应完全，旋干溶剂并通过乙醚沉淀真空干燥得到式II-4所示的化合物，为白色固体(38mg，产率：95％)。
(4)将式II-4所示的化合物38mg(0.050mmol)、三氟硼酸盐(AmBF3)45mg(0.25mmol)和三(2-苯并咪唑基甲基)胺2.1mg(0.005mmol)溶于3mL的DMF：H2O体积比为1：1的溶液中；将六氟磷酸四乙腈铜(I)18mg(0.048mmol)快速加入上述混合溶液中，在氮气保护下于45℃反应45min，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.4，判定反应结束，停止反应，通过半制备型HPLC分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×19mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。检测波长为254nm。通过质谱验证，14.8min处的峰为产物峰，收集14.8min处的流出液，干燥，得到式II所示的前体化合物为白色固体(25mg，产率：55％)。
(5)用300μL的哒嗪-盐酸-N,N-二甲基甲酰胺(pH＝2.5)缓冲液洗脱QMA柱，收集得到300mCi的F-18离子溶液，然后转移到1mL的标记反应管中，将式II所示的前体化合物溶于DMF中配制成浓度为25mmol/L的溶液，取所述溶液10-20μL加至所述标记反应管中，80℃下反应30min，反应结束后，取微量所得反应液稀释，通过放射性HPLC检测标记率，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。所述式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的保留时间与式II所示结构的前体化合物在紫外吸收下的保留时间(tR＝14.8min)一致，证明标记反应成功。经衰变校正后，式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的放射化学产率为43％，比活度约为1.0Ci/μmol。
向所得反应液中加入20mL去离子水稀释，通过C18柱(C18 Sep-Pak小柱)吸附标记产物，用去离子水10mL洗涤C18柱三次，最后用0.5mL无水乙醇将式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物淋洗到西林瓶中，即得到最终产品，以备使用。
取少量上述所得溶液进行稀释，通过放射性HPLC检测放化纯，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。标记产物纯化后进行检测，式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的保留时间为15min，放化纯大于95％。
实施例3
本实施例提供一种具有如图1中所示的式I结构18F标记的靶向激活型化合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将式II-1所示的化合物186mg(0.225mmol)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)98mg(0.255mmol)和生物素式III 65mg(0.30mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，加入干燥的四氢呋喃(THF)3mL溶解，再加入和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)115μL(0.68mmol)，氮气保护下于室温反应2h后，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.7，判定反应结束后旋干溶剂，将所得粗产品通过硅胶柱层析分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×19mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→35min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；35min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20。控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃，检测波长为254nm。通过质谱验证，27.6min处的峰为产物峰，收集干燥，得到式II-2所示的化合物，为白色固体(138mg，58％)。
(2)将式II-2所示的化合物138mg(0.13mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL的CH2Cl2溶解，再加入3mL的TFA与0.1mL的三异丙基硅烷(TIPS)，室温下反应1h，旋干溶剂，使用无水乙醚沉淀，得到的固体真空干燥，得到式II-3所示的化合物，为白色固体(88mg，产率：93％)。
(3)将式II-3所示的化合物45mg(0.060mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL的CH3OH溶解，随后加入式IV所示结构的化合物15mg(0.085mmol)，氮气保护下室温搅拌0.5h，再加入1％体积的TIPS继续搅拌0.5h。通过TLC监测反应完全，旋干溶剂并通过乙醚沉淀真空干燥得到式II-4所示的化合物，为白色固体(39mg，产率：95％)。
(4)将式II-4所示的化合物39mg(0.050mmol)、三氟硼酸盐(AmBF3)45mg(0.25mmol)和三(2-苯并咪唑基甲基)胺2.0mg(0.005mmol)溶于3mL的DMF：H2O体积比为1：1的溶液中；将六氟磷酸四乙腈铜(I)18mg(0.048mmol)快速加入上述混合溶液中，在氮气保护下于45℃反应45min，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.4，判定反应结束，停止反应，通过半制备型HPLC分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×19mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。检测波长为254nm。通过质谱验证，14.8min处的峰为产物峰，收集14.8min处的流出液，干燥，得到式II所示的前体化合物为白色固体(23mg，产率：54％)。
(5)用300μL的哒嗪-盐酸-N,N-二甲基甲酰胺(pH＝2.5)缓冲液洗脱QMA柱，收集得到300mCi的F-18离子溶液，然后转移到1mL的标记反应管中，将式II所示的前体化合物溶于DMF中配制成浓度为25mmol/L的溶液，取所述溶液10-20μL加至所述标记反应管中，80℃下反应30min，反应结束后，取微量所得反应液稀释，通过放射性HPLC检测标记率，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。所述式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的保留时间与式II所示结构的前体化合物在紫外吸收下的保留时间(tR＝14.8min)一致，证明标记反应成功。经衰变校正后，式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的放射化学产率为43％，比活度约为1.0Ci/μmol。
向所得反应液中加入20mL去离子水稀释，通过C18柱(C18 Sep-Pak小柱)吸附标记产物，用去离子水10mL洗涤C18柱三次，最后用0.5mL无水乙醇将式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物淋洗到西林瓶中，即得到最终产品，以备使用。
取少量上述所得溶液进行稀释，通过放射性HPLC检测放化纯，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。标记产物纯化后进行检测，如图15所示，式I所示结构的18F标记的靶向激活型化合物的保留时间为15min，放化纯大于95％。
对比例1
本对比例1为采用实施例1相似方法制得的具有谷胱甘肽响应剪切能力的单靶向18F化合物，具有式I-1所示结构：
Figure BDA0003049843810000151
标记产物纯化后进行检测，如图15所示，保留时间为22.1min，放化纯大于95％。
对比例2
本对比例2为采用实施例1相似方法制得的具有生物素受体靶向能力的单靶向18F化合物，具有式I-2所示结构：
Figure BDA0003049843810000161
标记产物纯化后进行检测，如图15所示，保留时间为13.8min，放化纯大于95％。
试验例1
本试验例为对实施例1中得到的式II所示的前体化合物以及对比例1和2所得化合物的前体化合物进行细胞毒性实验。
通过MTT实验测定式II所示的前体化合物在Hela与A549细胞中的细胞毒性，包括如下步骤：
(1)以每孔5×103个细胞/100μL的密度将Hela细胞接种于96孔板中，培养基为DMEM，在37℃下含5％的CO2的恒温培养箱中培养过夜；
(2)将实施例1制备的式II所示的前体化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度为0.1mol/L的母液，用DMEM培养基稀释成含式II所示的前体化合物的浓度分别为100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L和0μmol/L的溶液，备用；
(3)将步骤(1)中的96孔板中原有培养基更换为上述步骤(2)中配制的药浓度分别为0μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的DMEM培养基，每孔200μL，每个药物浓度设置6个复孔。随后将96孔板放入37℃下含5％的CO2恒温培养箱中分别孵育3h、6h、12h和24h。孵育结束后，向每孔中加入20μL的MTT(5mg/mL)继续培养4h。培养结束后，吸去培养基，向每孔中加入150μL的DMSO，并在摇床上震荡10min，直至结晶完全溶解。用酶标记测定490nm下每孔的吸光度值，实验结果为至少三次独立实验的平均值。在A549细胞中的测试方法与Hela细胞中相同。
对比例1-2得到的化合物的前体化合物的实验方法和上面相同。
不同药物浓度与孵育时间下，式II所示的前体化合物对Hela和A549细胞生存率折线图如图16和图17所示。随着药物作用时间延长与化合物浓度的增大，细胞生存率变化并不明显，且在24h内，细胞生存率均大于90％，所以可以判定式II所示的前体化合物对Hela与A549细胞是安全低毒的，具有良好的生物兼容性。由于式I所示的18F标记的靶向激活型化合物与式II所示的前体化合物结构相同，则预示着式I所示的18F标记的靶向激活型化合物可以安全地用于进一步的细胞摄取实验，对比例1-2得到的化合物与其相同。
试验例2
本试验例为实施例1中得到的式I结构18F标记的靶向激活型化合物的稳定性实验：
取4份800μL的PBS(pH＝7.4)缓冲液和200μL的实施例1制备的式I结构18F标记的靶向激活型化合物溶液分别混合，在37℃下加热0.5h、1h、2h、3h、4h。取上述少量溶液稀释，通过放射性高效液相检测标记产物的稳定性，高效液相条件：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH3CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→30min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；30min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。
结果如图18所示为式I结构18F标记的靶向激活型化合物在PBS中孵育不同时间的放射性化学纯度。随着孵育时间的增加，在4h的时候，PBS中的放化纯仍大于95％。这表明该式I结构18F标记的靶向激活型化合物在体外具有良好的稳定性，有利于进一步的体内实验研究。
试验例3
本试验例为实施例1中得到的式I结构18F标记的靶向激活型化合物以及对比例1-2得到的化合物的脂水分配系数测定：
取PBS缓冲液与等体积的正辛醇混合后充分振荡，使两相相互饱和，在室温下静置一天以上，用分液漏斗将两相分离。取1mL正辛醇、0.95mL PBS缓冲液、0.05mL实施例1制备的式I结构18F标记的靶向激活型化合物溶液混合，用涡旋混合器振荡5min，充分混匀，按照4000g离心5min。在有机相和水相中分别平行取3个样(100μL)于放免管中，用γ计数仪测定其放射性活度，每个样品测定3次，计算脂水分配系数的log P值。
对比例1-2得到的化合物的实验方法和上面相同。
根据公式log P＝log(CPM水相/CPM有机相)计算得到实施例1、对比例1和对比例2的化合物的Log P值分别为0.91±0.01，1.3±0.10和1.10±0.03，说明实施例1得到的化合物具有更好的亲水性，便于用生理盐水稀释后进行体内注射，这预示着其在脂肪等其他软组织的摄取可能较低，组织靶向性可能较好，有利于动物体内PET显像。
试验例4
本试验例为实施例1中得到的式I结构18F标记的靶向激活型化合物以及对比例1-2得到的化合物在Hela与A549细胞中的细胞摄取实验：
将细胞消化、计数后，以100μL 1×106个/管的细胞密度于放免管中。将细胞分为两组，一组加入100μL无血清培养基，另一组加入100μL浓度为80μM的生物素，孵育10分钟后，每管加入100μL含1μCi放射性计量的探针，分别培养0.5h、1h、2h和4h。培养结束后，吸去培养基，将细胞用冷的PBS冲洗3次后，收集细胞裂解液，用γ计数仪测量放射性量，计算式I结构18F标记的靶向激活型化合物在细胞中的摄取比值。
对比例1-2得到的化合物的实验方法和上面相同，区别在于对比例1-2得到的化合物没有进行添加了生物素的实验。
结果如图19-21所示，从图中可以看出实施例1中得到的式I结构18F标记的靶向激活型化合物在Hela与A549细胞的摄取明显高于对比例1-2得到的化合物，具有较好的特异选择性。
试验例5
本试验例为实施例1中得到的式II所示结构的前体化合物的分子识别、剪切与聚合反应：
通过三-(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)对式II所示结构的前体化合物的响应进行体外还原，随后调节pH使发生分子自组装实验，其化学反应路线图如图22(A)所示。取一定量的实施例1制备的式II所示结构的前体化合物溶解在TCEP的缓冲液(250μL，pH＝3)中，得到浓度为250μmol/L的式II所示的前体化合物混合液。在37℃下反应0.5h后，向其中加入饱和碳酸氢钠溶液调至弱碱性(pH＝7.4)，继续在37℃下反应0.5h。反应结束后，将所得反应液于室温在4000g下离心5min，收集沉淀，再将沉淀物加水洗涤3次后冻干，并通过高效液相图谱、动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)等手段进行表征。
结果如图22所示，这是由于式II所示结构的前体化合物发生了化学反应，形成了二聚体，粒径约为138.2±16.3nm。首先式II所示结构的前体化合物中的二硫键被TCEP还原为巯基。在水环境中，β位的氨基巯基可以与腈基发生点击化学反应，但是由于式II所示结构的前体化合物切断产物的空间位阻效应，使得其在分子内不能发生点击化学反应，所以一分子式II所示结构的前体化合物切断还原产物中的氨基巯基与另一分子式II所示结构的前体化合物切断还原产物中的腈基发生点击化学反应，进行分子间成环，得到环状的二聚体产物。在PET显像中，放射性纳米粒子的形成有利于探针在肿瘤处的信号聚集、形成持久稳定的放射性信号，从而灵敏度增强、靶本比增大可有效提高显像效果，为肿瘤的检测提供一种更加精准有效的方法。
试验例6
本试验例为实施例1中得到的式I结构18F标记的靶向激活型化合物以及对比例1-2得到的化合物的小动物PET成像：
Hela模型鼠构建：将处于对数生长期的Hela细胞配成细胞悬液107个/mL，备用；取18-20g、6-8周龄的雌性BALB/c裸鼠，用酒精棉将背部靠近右后肢处消毒，皮下注射上述细胞悬液50μL，约15天后肿瘤长出。实验方法：待肿瘤直径为8-10mm时，取所述肿瘤直径为8-10mm的Hela模型鼠3只，将其放入预麻装置中，用异氟烷麻醉，而后将其转移至PET扫描床上，将小鼠的四肢用医用胶布固定住，用异氟烷体积为2.0％的异氟烷-氧气的混合气体维持小鼠麻醉状态。通过尾静脉对其中一只小鼠注射0.1mL实施例1制备的放射性药物式I结构18F标记的靶向激活型化合物，另外一只提前注射生物素受体抑制剂后再注射0.1mL实施例1制备的放射性药物式I结构18F标记的靶向激活型化合物，然后进床，对荷瘤小鼠进行动态扫描，动态图像连续采集60min。通过对图像的感兴趣区(ROI)进行勾画，将摄取表述为％ID/g(每克组织放射性计数百分数)，并计算肿瘤肌肉比。
对比例1-2得到的化合物的实验方法和上面相同。
实验结果如下，式I结构18F标记的靶向激活型化合物在肿瘤小鼠(实验组)中和用抑制剂处理过的肿瘤小鼠(对照组)中的PET成像结果如图23所示，图中圈出的区域即为肿瘤区域，从图中可以看出，实验组(A)的肿瘤区域呈亮红色，表明此处摄取较高，在对照组(B)的肿瘤处部分几乎没有显像效果，表明此处基本没有摄取。通过对显像数据进行处理，随时间变化式I结构18F标记的靶向激活型化合物在肿瘤与肌肉中摄取值变化如图23(C)所示，实验组的肿瘤摄取值在10min左右达到6％ID/mL，并且在1h内，肿瘤摄取值几乎保持不变，相应的肌肉中的摄取在初始阶段较高，并随时间迅速清除，肿瘤/肌肉比例保持一个较高水平；游离生物素处理的对照组(D)的肿瘤摄取值在达到的最大值仅为3.5％ID/mL，并且在1h内，肿瘤摄取值随时间延长不断降低，与肌肉摄取值相近，肿瘤/肌肉比例也显著降低，表明式I结构18F标记的靶向激活型化合物的主要摄取途径是通过BR介导的胞吞作用。式I结构18F标记的靶向激活型化合物在A549荷瘤小鼠的PET成像结果与Hela荷瘤小鼠相似。同时，使用对比例1-2所得到的化合物进行了小动物PET成像，实验结果如图24所示，式I结构18F标记的靶向激活型化合物组的小鼠肿瘤部位有明显较高的摄取，而使用对比例1-2所得到的化合物组的小鼠肿瘤部位有着较弱的PET信号。以上结果说明式I结构18F标记的靶向激活型化合物的通过BR介导的过程与还原自组装的过程有效改善了显像效果，证明本发明的式I结构18F标记的靶向激活型化合物是一种良好的PET显像剂，能够进一步提高成像精度。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种18F标记的靶向激活型化合物，其特征在于，具有如下式I所示结构：
Figure FDA0003049843800000011
2.权利要求1所述的18F标记的靶向激活型化合物的制备方法，其特征在于，将具有如下式II所示结构的前体化合物与50-500mCi的F-18离子溶液，在pH为2.5的缓冲液中，于80-100℃反应10-40min，洗涤分离纯化后得到所述式I所示结构；
Figure FDA0003049843800000012
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式II所示结构的前体化合物的制备包括如下步骤：
S1：将式II-1所示结构的化合物和生物素式III以及苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯混合后，使用四氢呋喃溶解，加入N,N-二异丙基乙胺在氮气保护下反应1-2h，旋干纯化，得到式II-2所示结构的化合物；
S2：将极性溶剂与三氟乙酸混合，然后加入式II-2所示结构的化合物溶解，加入三异丙基硅烷反应0.5-1h，旋干后通过乙醚沉淀，真空干燥得到式II-3所示结构的化合物；
S3：将式II-3所示结构的化合物溶解于甲醇，加入式IV所示结构的化合物在氮气保护下反应1-2h，旋干纯化，得到式II-4所示结构的化合物；
S4：取式II-4所示结构的化合物、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和三氟硼酸盐溶于N,N-二甲基甲酰胺与超纯水的混合溶液中，然后加入六氟磷酸四乙腈铜(I)在氮气保护下于40-50℃反应45-90min，纯化后得到式II所示结构的前体化合物；
Figure FDA0003049843800000021
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，式II-1所示结构的化合物、生物素式III、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1-1.2:1-1.2:2.2-2.7；
步骤S3中，式II-3所示结构的化合物与式IV所示结构的化合物的摩尔比为1:1.2-2；
步骤S4中，式II-4所示结构的化合物、三氟硼酸盐、三(2-苯并咪唑基甲基)胺和六氟磷酸四乙腈铜(I)的摩尔比为1:3-6:0.05-0.2:0.5-2。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，式II-2所示结构的化合物质量为300重量份，加入2-4体积份的三氟乙酸和0.05-0.15体积份的三异丙基硅烷，所述重量份与体积份的关系为mg/mL。
6.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，极性溶剂为CH2Cl2、CHCl3、THF或CH3CN中的一种。
7.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S1-S3中，反应温度为室温；
步骤S1和S3中，所述纯化为通过柱层析纯化；
步骤S4中，所述纯化为通过半制备HPLC纯化。
8.权利要求1所述的18F标记的靶向激活型化合物或权利要求2-7任一项所述的制备方法制得的18F标记的靶向激活型化合物的应用，其特征在于，应用于肿瘤PET显像剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤PET显像剂为生物素受体靶向与谷胱甘肽响应激活的肿瘤PET显像剂。
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